Tema 2. Introduccion al transporte mediado PDF

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Tema 2: INTRODUCCIÓN AL TRANSPORTE MEDIADO Sistemas de transporte: cinética y clasificación Técnicas de estudio Ionóforos Poros 1  Sistemas de transporte: clasificación Composición elemental Introducción  La composición elemental de un organismo es una función dinámica y depende de las necesidades metabólicas.  Conseguir una distribución espacio‐temporal adecuada de los elementos (beneficiosos y tóxicos) y de los nutrientes es crucial.  En organismos unicelulares o a nivel celular, se controla su principalmente a nivel de la entrada o incorporación (influx/uptake) y la salida o extrusión (efflux) mediada por transportadores en los diferentes tipos de membranas celulares.  En organismos pluricelulares, a nivel de todo el organismo (nivel sistémico) hay células especializadas en la incorporación y en distribución que están polarizadas y existen diferentes rutas de transporte: transcelular y paracelular.  Las concentraciones demasiado bajas (deficiencia nutricional) o excesivamente altas (toxicidad) se regulan de las concentraciones óptimas por mecanismos de homeostasis Influx and efflux (positivos y negativos) (feedback loops). Homeostasis _ Cu COPT + Tema 2: Introducción al transporte mediado 2  Sistemas de transporte: clasificación Transporte mediado  La barrera se puede atravesar a través de Los mediadores del transporte pueden ser: transportadores que median el movimiento de: ‐Ionóforos ‐Iones (Na+, Ca2+, H+, K+, Cl‐, ) HCO3‐ ‐Porinas ‐Agua (arrastre del disolvente) ‐Conexiones entre células ‐Nutrientes (glucosa, aminoácidos…) ‐Canales iónicos ‐Metabolitos, señales (péptidos, hormonas…) ‐Acuaporinas ‐Compuestos tóxicos (incorporación inadvertida) ‐Transportadores ‐Bombas 3 Tema 2: Introducción al transporte mediado  Sistemas de transporte: clasificación Transporte mediado  La solubilidad de iones en la membrana es insignificante (energía de activación de 335 kJ/mol).  Hay sistemas de transporte mediado que permiten rebajar la energía de activación.  Muchas proteínas integrales de membrana cumplen esta función actuando bien a favor (pasivo) o incluso en contra del gradiente electroquímico (activo).  Los transportadores ayudan a vencer la barrera hidrofóbica que ralentiza el paso a través de la bicapa creando un camino alternativo.  El objeto de la maquinaria de transporte es ejercer un control sobre el tráfico de metabolitos a través de la membrana. El transporte mediado sigue estos pasos (entrada): 1. Unión selectiva del sustrato (sustancia que atraviesa la membrana) fuera (out/1). 2. Transporte o translocación (cambio conformacional). 3. Disociación y liberación del sustrato dentro (in/2). 4. Recuperación del estado inicial, si el transportador ha sufrido cambios durante el transporte. 4 Tema 2: Introducción al transporte mediado  Sistemas de transporte: clasificación conformation conformation change change Cinética del transporte mediado Carrier-mediated solute transport Características del transporte mediado: 1) Velocidad y especificidad  Los transportadores favorecen el paso de solutos de forma selectiva mediante la unión específica en un punto de reconocimiento que el soluto ha de atravesar.  Los mecanismos de discriminación más habituales son la desolvatación o los cambios conformacionales inducidos por la unión del soluto correcto. 2) Cinética de saturación  El transporte mediado requiere la unión del soluto transportado al menos a un sitio (sitio activo) del transportador.  La cinética del transporte es igual que la enzimática pues responde globalmente al mismo esquema: S1 + T S‐T S2 + T J1→2 + transportador  La Km indica la afinidad del transportador por el metabolito transportado y el rango de concentraciones Jmax en que cabe esperar que actúe in vivo. diferencia Jmax/2 J1→2 = Jmax∙S1/(Km + S1) - transportador Tema 2: Introducción al transporte mediado Km S1 5  Sistemas de transporte: clasificación Cinética del transporte mediado baja afinidad  Cinética saturable. La función de saturación tiene forma hiperbólica y se define Km como la concentración de la sustancia cuando el flujo alcanza la mitad de su valor máximo (Jmáx/2). alta afinidad  Con las medidas cinéticas se puede demostrar que en el transporte de sustancias pueden participar diferentes transportadores con distintas afinidades (Km) por el sustrato.  Inhibición competitiva por análogos del soluto.  Inactivación química por agentes que modifican las cadenas laterales de residuos esenciales en el proceso.  El transporte admite también regulación por formación de oligomeros (cooperatividad). J1→2 monómero oligómero coop + Tema 2: Introducción al transporte mediado S1 6  Sistemas de transporte: clasificación Clasificación del transporte mediado 1. Canal 1) Mecanismo Canales o poros 2. Electroneutro Transportadores Translocación de grupo 1. Transportador 2) Efecto sobre el potencial de membrana Electroneutro Electrogénico 3) Estequiometría Uniporte 2. Electrogénico Cotransporte Paralelo o simporte 1. Translocación de grupo Antiparalelo o antiporte 4) Energética del proceso Pasivo Activo Primario Secundario 3. Estequiometría 4. Activo Primario y secundario 7 Tema 2: Introducción al transporte mediado  Sistemas de transporte: clasificación Clasificación del transporte mediado Clasificación de la IUBMB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology) Recogido en la TCDB: 1. Canales/Poros 2. Transportadores conducidos por el potencial electroquímico (secundarios) 3. Transportadores activos primarios 4. Translocadores de grupo 5. Transportadores electrónicos transmembrana 6. 7. 8. Factores accesorios implicados en transporte 9. Sistemas de transporte de caracterización incompleta. 8 Tema 2: Introducción al transporte mediado Técnicas de estudio Estudios farmacológicos  Históricamente se han usado algunos compuestos por sus efectos en humanos, pero con desconocimiento de la causa molecular/estructural de su acción.  El ser humano ha recurrido a compuestos naturales de su entorno, principalmente plantas y animales para conseguir esos compuestos.  Muchos compuestos químicos se unen y modifican la actividad de los transportadores (actúan como agonistas, antagonistas, potenciadores, inhibidores, moduladores, bloqueantes…).  Algunos se han usado para aislar transportadores y/o para caracterizarlos a nivel molecular.  También se han usado para el estudio farmacológico de los transportadores y sus aplicaciones clínicas (antidepresivos, analgésicos…).  Los efectos de algunos compuestos (neurotoxinas) beneficiosos (como fármacos) o perniciosos (como tóxicos) dependen de la dosis y características particulares del individuo o de su aplicación junto a otros compuestos. Sauce blanco (Salix alba) Anguila eléctrica (Electrophorus electricus) 9 Tema 2: Introducción al transporte mediado Técnicas de estudio Estudios electrofisiológicos Calamar (Loligo pealei) Voltage clamp = Pinzamiento de voltaje  El contenido del interior del axón gigante (axoplasma) del calamar puede eliminarse y sustituirse por una disolución de sales de composición conocida. 1 mm  Mediante inserción de electrodos en el interior y exterior se puede forzar un determinado voltaje (técnica de “voltage‐clamp”).  Esta técnica permite registrar las variaciones de conductividad (g) de http://naukas.com/2013/01/22/el‐ la membrana al cambiar el voltaje impuesto o la composición de las axon‐gigante‐del‐pequeno‐calamar/ disoluciones iónicas internas y externas.  Mediante la utilización de distintas disoluciones se puede determinar a qué iones es permeable cada tipo de canal. Premio Nobel de Medicina y Fisiología 1963 Andrew Huxley Alan Hodgkin "for their discoveries concerning the ionic mechanisms involved in excitation and inhibition in the peripheral and central portions of the nerve cell membrane” 10 Tema 2: Introducción al transporte mediado Técnicas de estudio Estudios electrofisiológicos Registro de fluorescencia de cambios rápidos del Voltage clamp potencial transmembrana en fibras musculares Modelos matemáticos (Hodgkin y Huxley) Tema 2: Introducción al transporte mediado 11 Técnicas de estudio Estudios electrofisiológicos Premio Nobel de Medicina Patch clamp=Pinzamiento de membrana y Fisiología 1991  Sellado de alta resistencia (gigaohmios) de la punta circular de la micropipeta (patch).  La técnica de patch‐clamp permite aislar y estudiar un único canal.  El movimiento de iones hacia dentro y hacia fuera a través de la membrana puede ser cuantificado como la cantidad de corriente eléctrica necesaria para mantener el potencial de membrana a un valor designado de pinzamiento (clamped). Erwin Neher Bert Sakmann Inside‐out "for their discoveries concerning the On‐cell Outside‐out Whole‐cell function of single ion channels in cells" Tema 2: Introducción al transporte mediado 12 Técnicas de estudio Estudios electrofisiológicos Patch clamp in outside inside out Respecto a la célula outside in inside retracción Respecto a la punta de la pipeta inside out succión -out in outside retracción -out out 13 Tema 2: Introducción al transporte mediado Técnicas de estudio Estudios electrofisiológicos Canal óhmico (gramicidina A) Patch clamp=Pinzamiento de membrana Corriente positiva  Con esta técnica es posible determinar: = hacia fuera; La especificidad del canal por un ion. El tiempo que el canal permanence abierto (ej 0.7 ms para canales de Na+). El flujo iónico a través de un único canal (ej 9900 iones Na+/ms). Corriente negativa = hacia dentro.  El análisis de la cinética de apertura y cierre permite identificar diversas situaciones. ka CERRADO ABIERTO kc Ley de Ohms: I=V x g g=I / V (Siemens) ka =1/tc y kc = 1/ta I El cociente entre los tiempos de residencia en cada estado es la constante de equilibrio (Ke=ka/kc=ta/tc), que refleja la estabilidad estructural relativa de los dos estados. pendiente=g = conductancia V Intensidades (pA) de las corrientes de K+ a diferentes potenciales eléctricos (mV) y g (pS) Tema 2: Introducción al transporte mediado 14 Técnicas de estudio Estudios electrofisiológicos Corrientes de K+ g = conductancia alta Canal rectificador para un único canal Canal rectificador hacia dentro (inward rectifyer) g g = conductancia baja para células enteras [K+]i = 105 mM [K+]e = 11 mM Corriente de K+ Ba2+= inhibidor canales de K+ en un único canal 15 Tema 2: Introducción al transporte mediado Técnicas de estudio Estudios electrofisiológicos Potencial de reversión  Dos direcciones: corriente de entrada (inward) o de salida (outward).  El término reversión hace referencia al hecho de que los cambios en el potencial de membrana hacia cada uno de los lados del potencial de equilibrio revierten la dirección global del flujo de iones. ΔΨrev = (R∙T/z∙F) ∙ ln (Cex/Cin) ΔΨK = EK Tema 2: Introducción al transporte mediado 16 Técnicas de estudio Estudios electrofisiológicos Potencial de acción  En ausencia de señal, el potencial de reposo se mantiene por la bomba Na+/K+ y los canales de K+ (no regulados) que permiten la salida de K+, lo que contribuye a la diferencia de potencial.  En las condiciones de reposo, las concentraciones iónicas intra y extracelulares son muy distintas (ΔΨ = ‐50 a ‐70 mV).  Todos los organismos tienen canales para Na+, K+, Ca2+ y Cl‐  La especificidad del canal iónico regulado por voltaje determina el tipo de ion que se transporta y la dirección del flujo de la corriente está determinada por el gradiente electroquímico del ion. Apertura canales Ca2+ o Na+ → despolarizació n Apertura canales K+ o Cl‐ → fuerzas de difusió n y arrastre contrarias (despolarización/ hiperpolarización ?) Na+ Ca2+ Ext + + + Int ‐ ‐ ‐ ‐ Cl‐ K+ Tema 2: Introducción al transporte mediado 17 Técnicas de estudio Estudios funcionales Rana africana de uñas Oocitos de Xenopus (Xenopus laevis)  Se pueden purificar transportadores y reconstituirlos en liposomas para estudios electrofisiológicos.  Los oocitos (u ovocitos) de Xenopus laevis (rana africana de uñas) se utilizan para estudios funcionales. Son los precursores de las células huevo maduras y se pueden recolectar en diferentes estadios de desarrollo (se usan los estadios V y VI).  Los oocitos de Xenopus se usan comúnmente para medidas electrofisiológicas por su gran tamaño (1 mm de diámetro) que hace fácil su manipulación.  Permiten su transformación con cDNAs de canales (ausentes en el oocito), su expresión y estudio de la función en este sistema heterólogo y con ellos permiten la conexión entre la secuencia del gen de un canal iónico y las propiedades funcionales del mismo, combinando métodos moleculares y fisiológicos en un sistema unicelular. 18 Tema 2: Introducción al transporte mediado Técnicas de estudio Estudios funcionales Modelos murinos  Existen modelos funcionales en ratón de muchas enfermedades, incluidas diferentes canalopatías. Ratón  Los análisis funcionales son complicados en algunos casos (ej: NaV) ya que la (Mus musculus) expresión de los cDNAs es inestable en cultivos bacterianos.  Hay líneas de ratones transgénicos con varias mutaciones en canales de sodio con epilepsia inducible específica de tejido (líneas transgénicas Q54).  Probablemente los datos fisiológicos más relevantes se obtengan de medidas de corrientes neuronales en ratones modelos knock‐in portadores de mutaciones humanas.  Los cDNAs también se pueden producir en células HEK‐293 (Human Embryonic Kidney). 19 Tema 2: Introducción al transporte mediado Técnicas de estudio Estudios de respuestas espaciales  Optogenética es una técnica biológica para controlar la actividad de las neuronas con luz, mediante la expresión de enzimas, canales o bombas sensibles a la luz específicamente en células diana.  Indicadores de voltaje codificados genéticamente (GEVI). Son proteínas que perciben el potencial de membrana y acoplan el cambio de voltaje a un output (normalmente fluorescente). Es una herramienta que sirve para grabar y exportar las señales electrofisiológicas desde células en cultivo a cerebros en organismos vivos.  Quimiogenética. Se refiere a receptores modificados genéticamente para responder a pequeñas moléculas (ligandos) previamente no reconocidas y que no afectan a la señalización endógena. Se pueden dirigir a poblaciones específicas de neuronas que pueden ser activadas o inhibidas mediante la aplicación del ligando. 20 Tema 2: Introducción al transporte mediado Magnus et al., Science 364,146 (2019) Técnicas de estudio https://www.hugo‐international.org Estudios ómicos y estructurales  La secuenciación masiva de genomas y el uso de herramientas bioinformáticas (algoritmos para la identificación de genes, de splicing alternativo, predicción de secuencias codificantes) ha permitido que conozcamos las familias y sus miembros de la mayoría de proteínas implicadas en el transporte (en humanos HUGO).  Según la International Union of Basic and Clinical Pharmacology (IUPHAR) hay más de 200 canales catiónicos en humanos. https://www.rcsb.org/pages/about‐us/index  El término ionoma se utiliza para describir la composición de iones en diferentes tejidos y condiciones.  El término canaloma se utiliza para describir mediante técnicas ómicas los >300 miembros de la familia de canales iónicos ensamblados en ∼500 proteínas de canales que se predice que existen en el genoma humano.  Técnicas como la difracción de rayos X y la resonancia magnética nuclear han permitido la resolución de muchas proteínas transportadoras (Protein Data Bank). 21 Tema 2: Introducción al transporte mediado  Ionóforos Generalidades  No son constituyentes naturales de las  Los transportadores son de dos clases generales : membranas biológicas (se usan en lucha Acarreadores (lanzaderas). Pueden atravesar la biológica), pero son muy importantes como membrana (1000 iones/s), Suelen mostrar bastante herramientas de investigación. discriminación en el ion que transportan. Ej: Valinomicina  Son compuestos orgánicos: una gran variedad de antibióticos sintetizados por Canales. Normalmente el ion se transporta en forma microorganismos y algunos compuestos hidratada (107 iones/s). Presentan escasa sintéticos. discriminación en el ion que transportan.  Son compuestos de entre 500 a 2000 Da, con Ej: Gramicidina un exterior hidrofóbico y un interior hidrofílico para unir o dejar pasar el ion. 22 Tema 2: Introducción al transporte mediado  Ionóforos Lanzaderas o acarreadores (carriers): Valinomicina  Antibiótico natural de Streptomyces. Depsipéptido formado por aminoácidos (Val) e hidroxácidos alternados y constituido por tres repeticiones de 4 residuos que forman una molécula circular. Valinomycin O O O + K O O O Hydrophobic  El K+ se coordina octaédricamente con los O carbonilo de las 6 valinas. Es un ionóforo neutro que compleja el catión en el agujero del donuts. Debido al radio iónico del K+, este catión se coordina mejor y la selectividad para el K+ es 10.000 veces más que para el Na+.  Ambas formas: la cargada con el ion y la descargada pueden atravesar la membrana. Transporta carga y permite calcular el potencial de Nernst para el K+. Val-K+ Val-K+ K+ K+ Val Val membrane 23 Tema 2: Introducción al transporte mediado N  Ionóforos Lanzaderas o acarreadores (carriers): Nigericina y Monensina  La nigericina es un antibiótico derivado de Streptomyces hygroscopicus. En el pasado se utilizó como un antibiótico activo contra las bacterias Gram positivas.  La nigericina actúa como un ionóforo de H+, K+, Pb2+ y mayoritariamente como un antiportador de H+ y K+. No es electrogénico pero disipa pH.  La monensina es un antiportador Na+ y H+. No es electrogénico pero disipa pH. La H+‐ATPasa de tipo V (rojo) bombea H+ desde el citosol al lumen de la vesícula, bajando el pH del lumen y creando un potencial de membrana (positivo‐dentro). El potencial de membrana es parcialmente compensado por el influjo de contraiones Cl‐ (no mostrado). La monensina o nigericina (verde) intercambia H+ accumulados en el lumen de la vesícula por K+ presente en el citosol. Esto aumenta el pH del pH lumen pero no disipa el potencial de membrana. Cuando ambas monensina (o   nigericina) y valinomicina (azul) están presentes, no hay una salida neta de K+ del lumen al citosol, lo que conduce a la disipación del potencial de membrana. Tema 2: Introducción al transporte mediado Malecki et al., EMBO J, 2002 24  Ionóforos Lanzaderas o acarreadores (carriers): Protonóforos DNP (dinitrofenol)  Moléculas artificiales (o naturales) capaces de difundir a través de la membrana llevando un protón se llaman desacopladores o protonóforos.  Suelen ser ácidos débiles que pueden atravesar la membrana tanto en forma protonada como desprotonada (aniónica), tienden a llevar a los H+ a su equilibrio electroquímico.  Suelen ser compuestos aromáticos y son por una parte hidrofóbicos y por otra son capaces de deslocalizar la carga negativa sobre un número de átomos de la molécula.  El coenzima Q o ubiquinona transporta H+ en la forma FCCP [carbonyl reducida y no en la oxidada. Este hecho le permite actuar cyanide p- como factor de acoplamiento (entre la energía libre (trifluoromethoxy) redox favorable y el transporte de H+ contra gradiente). phenyl-hydrazone] Tema 2: Introducción al transporte mediado 25  Ionóforos Canales: Gramicidina A  Es un ionóforo producido por bacterias (Bacillus brevis) que muestra escasa especificidad.  Es un oligopéptido de 15 aminoácidos hidrofóbicos (se alternan L‐ y D‐ aminoácidos), por lo que no puede formar una hélice a sino una más ancha (15 aa dan tres vueltas, luego 5 aa/vuelta). Todas las cadenas laterales son hidrofóbicas o anfipáticas (Trp).  Forma un canal muy estrecho (sólo caben iones pequeños como H+ e iones de metales alcalinos como Li+, K+ y Na+ pero se bloquea con Ca2+). Deja pasar H2O.  El “gating” o activación de la apertura del canal es la asociación y disociación de los monómeros. Cuando se unen, se produce una deformación o curvatura reversible de la membrana.  Se puede medir la conductancia (inversa de la resistencia) como corriente de iones dividido por la diferencia de potencial eléctrico. Se expresa en Siemens (Amperios/Voltios). Asociación cabeza‐cabeza Tema 2: Introducción al transporte mediado 26  Poros Porinas  Proteínas de la membrana externa de bacterias Gram negativas y mitocondria con estructura en barril‐ con canal central acuoso (600 Da) y baja selectividad de sustrato. Ej: OmpF de E. coli. Perforinas  Proteínas liberadas por linfocitos T citotóxicos en células diana infectadas por microorganismos. Crean túbulos transmembrana con actividad citolítica. A través de ellas se vierten enzimas hidrolíticas (granzima) que inducen la apoptosis de la célula diana. Conexiones entre células Perforina  Uniones comunicantes o nexus (gap junctions) (animales)  Plasmodesmos (vegetales). 27 Tema 2: Introducción al transporte mediado