Tema 2. Conceptos básicos en Genómica II (1).pdf

Tema 2 TEMA 2. CONCEPTOS BÁSICOS EN GENÓMICA (II) De los genomas a las células: el transcriptoma y el proteoma Variaciones en el transcriptoma: edición del RNA y procesado alternativo Variaciones en el proteoma Otros anál...

Tema 2 TEMA 2. CONCEPTOS BÁSICOS EN GENÓMICA (II) De los genomas a las células: el transcriptoma y el proteoma Variaciones en el transcriptoma: edición del RNA y procesado alternativo Variaciones en el proteoma Otros análisis a nivel genómico: rastreos de modificadores, interacciones entre proteínas Papel y origen de los intrones espliceosomales (video) 1  Tema 2 1. De los genomas a las células: el transcriptoma y el proteoma GENÓMICA FUNCIONAL: Descifrar el patrón de expresión génica de un genoma Identificar y describir los procesos y rutas implicados en el desarrollo del organismo ¿Qué genes se expresan en un tejido particular o en un momento del desarrollo? ¿Cuál es el nivel de expresión de esos genes? ¿Qué diferencias en la expresión génica existen entre el estado sano y el patológico? 2  Tema 2 1. De los genomas a las células: el transcriptoma  EL TRANSCRIPTOMA La transcriptómica permite estudiar la expresión génica de una célula, tejido u organismo analizando los transcritos Se estudia la expresión de los genes a nivel cualitativo y cuantitativo Se pueden usar microarrays o chips de DNA Solo se puede analizar la expresión de genes anotados 3  Tema 2 1. De los genomas a las células: el transcriptoma Se pueden identificar los transcritos de los genes que se A expresan en diferentes condiciones experimentales (A, B) o en diferentes tipos celulares (C) B Expresión génica en levadura a diferentes tiempos de cultivo C Comparación del transcriptoma del cromosoma 11 humano en ocho tipos celulares 4  Tema 2 1. De los genomas a las células: el transcriptoma Las técnicas de secuenciación masiva (NGS/TGS) permiten caracterizar el transcriptoma global (lo que incluye también ncRNAs (siRNAs, miRNAs, etc.)  RNA-seq 5  Tema 2 1. De los genomas a las células: el transcriptoma Permite obtener información cualitativa y cuantitativa de la expresión génica: (A) qué genes se expresan y cuánto se expresan, (B) variantes de splicing. A Mills y Janitz 2011 B Curry-Hyde et al. 2018 6  1. De los genomas a las células: el proteoma Tema 2  EL PROTEOMA La expresión génica global de un genoma se puede estudiar mediante el análisis cualitativo y cuantitativo del conjunto de proteínas de una célula, tejido u organismo  Proteómica Proteoma de plaquetas humanas La electroforesis 2D permite separar proteínas con diferentes propiedades bioquímicas 7  1. De los genomas a las células: el proteoma Tema 2 Se pueden identificar las proteínas que se expresan en diferentes condiciones experimentales o tipos celulares La identificación de las proteínas se realiza por espectrometría de masas 8  2. Variaciones en el transcriptoma Tema 2 La edición del RNA y el procesado alternativo hacen que un mismo pre-mRNA se convierta en varios mRNAs maduros que codifican proteínas distintas Diferencias en el transcriptoma y en el proteoma 9  2. Variaciones en el transcriptoma: edición del RNA Tema 2 EDICIÓN DEL RNA Modificaciones químicas de las bases (desaminaciones) Enzimas responsables: (a) APOBECs (C>U, G>A) y (b) ADARs (A>I) En regiones codificantes, secuencias de splicing, secuencias de unión de miRNAS (diapo 11) También hay ejemplos de desaminaciones generalizadas  control infección de virus a) Gen APOB (apolipoproteína B) APOBEC1 (Apolipoprotein B editing enzyme, catalytic polypeptide I): citosina desaminasa b) ADARs  Adenosine deaminases that act on RNA 10  2. Variaciones en el transcriptoma: edición del RNA Tema 2 Kung et al. 2018 11  2. Variaciones en el transcriptoma: procesado alternativo Tema 2 PROCESADO ALTERNATIVO * Un pre-mRNA es procesado en transcritos maduros que codifican proteínas distintas * Promotores alternativos o sitios de poliadenilación alternativos  ↑ diversidad de RNAs Zhao 2019 Diferencias en el transcriptoma y en el proteoma Muchos de los sucesos son raros y ocurren solo en un tejido, en un momento específico del desarrollo y/o bajo ciertas condiciones fisiológicas 12  Tema 2 2. Variaciones en el transcriptoma: procesado alternativo Elementos implicados: secuencias reguladoras y factores proteicos (activadores o represores) Matera y Wang 2014 Las secuencias reconocidas por esos factores pueden estar en exones (ESE, ESS) o en intrones (ISS, ISE)  (ESE /ESS: exonic splicing enhancers/suppresors; ISE /ISS: intronic splicing enhancers/suppresors) 13  2. Variaciones en el transcriptoma: procesado alternativo Tema 2 Funcionamiento de los factores de procesado 14  Tema 2 2. Variaciones en el transcriptoma: procesado alternativo Por tanto, el procesado alternativo puede afectar la expresión génica de dos formas: 1. Creando diversidad estructural y funcional en las proteínas codificadas por un gen (esto puede explicar parte de la discrepancia que existe entre el número de genes y la complejidad de los organismos) Se estima que más del 90% de los genes de mamíferos sufren splicing alternativo CaMKIIδ: calmodulin-dependent ser/thr kinase 2. Pero también, incluyendo u omitiendo elementos reguladores que pueden alterar la vida media del RNAm Diferencias en el transcriptoma y en el proteoma 15  3. Variaciones en el proteoma Tema 2 La expresión génica también se puede regular a nivel de la traducción o a nivel postraduccional Vogel y Marcotte 2012 Regulación a nivel de la traducción o estabilidad del RNAm Degradación de proteínas Corte proteolítico Diferencias en el proteoma 16  3. Variaciones en el proteoma Tema 2 Modificaciones postraduccionales en las proteínas Diferencias en el proteoma (afectan a las propiedades y función de las proteínas) 17  4. Otros análisis funcionales a nivel genómico: rastreo de modificadores Tema 2 Objetivo: Identificar genes relacionados funcionalmente con uno dado en Drosophila (ruta de patogénesis de una enfermedad, biomarcadores, dianas terapéuticas, etc.) Fácil manejo y abundante descendencia Potentes técnicas genéticas Conservación de rutas de señalización y de genes implicados en enfermedades humanas (70%) Moulton y Letsou 2016 18  Tema 2 4. Otros análisis funcionales a nivel genómico: rastreo de modificadores Moscas modelo de una enfermedad humana  fenotipo visible (REP: rough eye phenotype) por sobreexpresión (SE) o RNAi de un gen A implicado en una enfermedad P moscas mutantes modelo genes ≠ X SE-A x- x- Rastreo genético de modificadores (modifier screen): Se cruzan las moscas modelo con colecciones de mutantes (cada cepa contiene una mutación en un solo gen) La reducción de la dosis de genes relacionados aumentará o suprimirá el fenotipo inicial F1 SE-A x+ Prüßing et al. 2013 x- Si el fenotipo ↓ entonces A activa a x Si el fenotipo ↑ entonces A reprime a x Si el fenotipo no se modifica: no relación 19  Tema 2 4. Otros análisis funcionales a nivel genómico: interacciones entre proteínas Objetivo: Identificar proteínas que interaccionan físicamente o que forman parte de complejos 1. Sistema de dos híbridos (levadura): Factor de transcripción: dominio de unión a DNA + dominio activador bait (cebo) Reporter gene Reporter gene prey (presa) * Para identificar interacciones entre parejas de proteínas candidatas * Para estudios a gran escala, el dominio activador se puede clonar con colecciones de fragmentos de cDNA 20  Tema 2 4. Otros análisis funcionales a nivel genómico: interacciones entre proteínas 2. Cromatografía de afinidad * Permite identificar los componentes de un complejo multiprotéico * Se parte de una proteína problema (test protein) que se une a una matriz de cromatografía (resina) Desventajas: * Hay que purificar la proteína problema * Se usa una sola proteína del complejo, por lo que exclusivamente se identificarán las que interaccionan de forma directa con ella 21  Tema 2 5. Papel y origen de los intrones esplicesosomales Papel de los intrones: hay teorías que dicen que facilitaron la evolución de los metazoos * Se encuentran en eucariotas (más frecuentes en organismos multicelulares) * No son esenciales para la vida (raros en procariotas) pero podrían facilitar la aparición de organismos más complejos (diversidad proteica) Origen de los intrones * Desde el descubrimiento de los intrones ha habido controversias sobre su origen (presentes en eucariotas y ausentes en bacterias y arqueas) * Hay dos teorías opuestas respecto al origen de los intrones 1) Introns early 2) Introns late Jeffares et al. 2006 22  Tema 2 5. Origen de los intrones esplicesosomales 1) Teoría exónica de los genes: * Genomas iniciales compuestos por minigenes * Codifican proteínas de pequeño tamaño (dominio funcional) que se asociaban para formar complejos * Reordenaciones del genoma para aproximar esas regiones codificantes: - Minigenes originales  exones - Secuencias que los separan  intrones Apoyaría Introns early Supone que los intrones se perderían en bacterias y arqueas… 23  Tema 2 5. Origen de los intrones esplicesosomales 2) No hay intrones en procariotas y sí en eucariotas: Adquisición de intrones (en genes que codifican proteínas) durante la evolución de los eucariotas  introns late * En algunos genes parálogos de eucariotas no se conserva la posición de los intrones (varias invasiones) Los intrones de estos genes podrían tener su origen en los intrones del grupo II Rogozin et al. 2012 Sverdlof et al. 2007 24  Tema 2 5. Papel y origen de los intrones esplicesosomales Ver Video 3.1: Introns early or introns late? (MOOC: How genomes evolved) Dr. Francisco J. Novo, Universidad de Navarra https://www.youtube.com/watch?v=kahZ7JjIaXY Teoría unificadora (1 + 2): Combina aspectos de las dos teorías Self-splicing introns, present since the earliest stages of life’s evolution, invaded the genome of the emerging eukaryote during eukaryogenesis. Subsequently, lineage-specific loss and gain of introns occurred. 25  Tema 2 Bibliografía Capítulos de libros Capítulos 12 y 13: Transcriptomes; Proteomes. Brown TA. (2017, 2023). Genomes 4 y Genomes 5. Garland Science y CRC Press. Capítulo 20: Genomics and proteomics. Pierce B. A. (2020). Genetics: A conceptual approach, 7th edition. Mcmillan Learning. Capítulo 21: Genomics, Bioinformatics, and Proteomics. Klug WS, Cummings MR, Spencer CA y Palladino MA. (2015). Concepts of Genetics, 11th edition. Pearson Inc. Capítulos 3 y 19: The interrupted gene; RNA splicing and Processing. Krebs JE, Goldstein ES y Kilpatrick ST. (2017). Lewin’s Genes XII. Jones & Barlett Publishers. Capítulo 7: Analyzing the structure and expression of genes and genomes. Strachan T y Read A. (2018). Human Molecular Genetics, 5th Edition. CRC Press, Taylor & Francis Group. Capítulos 11 y 14: Expresión de genes clonados y análisis de la función génica; Análisis función de genomas. Real M.D., Latorre A. y Rausell C. (2017). Técnicas de Ingeniería Genética. Editorial Síntesis. Artículos Bumgarner R (2013). DNA microarrays: types, applications and their future. Curr Protoc Mol Biol 101: 22.1.1-22.1.11. Curry-Hyde A, Chen BJ, Ueberham U, Arendt T, Janitz M. (2018). Multiple System Atrophy: Many Lessons from the Transcriptome. Neuroscientist 24(3):294-307. Deracinois B, Flahaut C, Duban-Deweer S, Karamanos Y. (2013). Comparative and Quantitative Global Proteomics Approaches: An Overview. Proteomes 1(3):180-218. Jeffares DC, Mourier T, Penny D. (2006). The biology of intron gain and loss. Trends Genet 22: 16-22. Kung CP, Maggi LB Jr, Weber JD. (2018). The Role of RNA Editing in Cancer Development and Metabolic Disorders. Front Endocrinol 9: 762. Matera AG, Wang Z. (2014). A day in the life of the spliceosome. Nat Rev Mol Cell Biol 15: 108-21. Mills JD, Janitz M. (2012). Alternative splicing of mRNA in the molecular pathology of neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging 33: 1012.e11-24 Moulton MJ, Letsou A. (2016). Modeling congenital disease and inborn errors of development in Drosophila melanogaster. Dis Model Mech 9: 253-69. Prüßing K et al. (2013). D. melanogaster as a model organism for Alzheimer’s disease. Mol Neurodegener 8: 35 Rogozin IB, Carmel L, Csuros M, Koonin EV. (2012). Origin and evolution of spliceosomal introns. Biol Direct 7: 11 Sverdloz AV, Csuros M, Rogozin IB, Koonin EV. (2007). A glimpse of a putative pre-intron phase of eukaryotic evolution. Trends Genet 23: 105- 108. Vogel C, Marcotte EM. (2012). Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Rev Genet 13: 329-342. Wang Z, Gerstein M, Snyder M. (2009). RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet 10: 57-63. Zhao S. (2019). Alternative splicing, RNA-seq and drug discovery. Drug Discov Today 24(6):1258-1267. 26