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Microbiología. Grado BCB Tema 10 Tema 10. Reacciones de abastecimiento en autótrofos. 1. Generación de metabolitos precursores: diversidad de rutas autotróficas. 2. Generación de ATP y poder reductor en fotoautótrofos: fotosíntesis oxig...

Microbiología. Grado BCB Tema 10 Tema 10. Reacciones de abastecimiento en autótrofos. 1. Generación de metabolitos precursores: diversidad de rutas autotróficas. 2. Generación de ATP y poder reductor en fotoautótrofos: fotosíntesis oxigénica y anoxigènica. 4. Generación de ATP y poder reductor en quimiolitótrofos El proceso biológico más importante en la Tierra es la fotosíntesis, la conversión de energía lumínica en energía química. Los organismos que llevan a cabo la fotosíntesis se llaman fotótrofos. Dichos organismos son también autótrofos, capaces de crecer con CO2 como única fuente de carbono. La energía de la luz se utiliza en la reducción de CO2 a compuestos orgánicos (fotoautotrofía). Algunos fotótrofos pueden usar compuestos orgánicos como fuente de carbono: su forma de vida se llama fotoheterotrofía. Para la fotosíntesis son necesarios pigmentos fotosensibles, los principales son las clorofilas, que se encuentran en las plantas, algas y cianobacterias, y las bacterioclorofilas, presentes en las bacterias rojas y verdes. Las cianobacterias y las bacterias rojas y verdes son todas procariotas fotótrofas. El proceso de conversión fotosintética de la energía empieza con la absorción de la energía lumínica por parte de las clorofilas y las bacterioclorofilas, y el resultado neto es la obtención de ATP. En la fotoautotrofía operan en paralelo dos grupos distintos de reacciones: (1) la producción de ATP y (2) la reducción de CO2 a material celular. La energía para el crecimiento autótrofo procede del ATP, y los electrones para la reducción del CO2 vienen del NADH (o NADPH). Este último se origina a partir de la reducción de NAD(P+) por donadores de electrones presentes en el ambiente. Generación de metabolitos precursores: diversidad de rutas autotróficas. El ciclo de Calvin El ciclo de Calvin está presente en las bacterias rojas, las cianobacterias, las algas, las plantas verdes, la mayoría de las bacterias quimiolitótrofas y algunas arqueas. Este ciclo necesita CO2 y una molécula aceptora de CO2, NAD(P)H, ATP y dos enzimas clave, la ribulosa-carboxilasa difosfato y la fosforribulocinasa. El primer paso del ciclo de Calvin está catalizado por la enzima ribulosa-carboxilasa difosfato, o rubisco. La rubisco cataliza la formación de dos moléculas de ácido 3-fosfoglicérico a partir de ribulosa difosfato y CO2. A continuación, el PGA es fosforilado y reducido a un intermediario fundamental en la glicolisis, el gliceraldehído 3-fosfato. A partir de este se puede formar glucosa. La etapa final del ciclo de Calvin es la fosforilación de cada una de estas moléculas por la enzima fosforribulocinasa para regenerar 6 moléculas de aceptor, la ribulosa difosfato. En total, para sintetizar una glucosa a partir de 6 CO2 en el ciclo de Calvin son necesarios 12 NADPH y 18 ATP. Ciclo TCA reductivo (inverso) Las bacterias verdes del azufre como Chlorobium fijan CO2 mediante los pasos inversos del ciclo del ácido cítrico, una ruta llamada ciclo del ácido cítrico inverso. Esta ruta requiere la actividad de dos enzimas unidas a ferredoxina que catalizan la fijación reductora de CO2; la ferredoxina se produce en las reacciones luminosas. La ferredoxina es un donador de electrones con un potencial de reducción muy electronegativo. Las dos reacciones con ferredoxina catalizan (1) la carboxilación de succinil- CoA a α-cetoglutarato, y (2) la carboxilación de acetil-CoA a piruvato. La mayoría de las reacciones restantes del ciclo del ácido cítrico inverso son catalizadas por enzimas que trabajan en sentido inverso al ciclo oxidativo normal. Una excepción es la citrato-liasa, una enzima 1 Profesor: José Juan Mateo Tolosa Microbiología. Grado BCB Tema 10 dependiente de ATP que corta el citrato en acetil-CoA y oxalacetato. En el sentido oxidativo del ciclo, el citrato es producido por la citrato-sintasa. El ciclo del ácido cítrico inverso opera también en algunos autótrofos no fotótrofos. Por ejemplo, los hipertermófilos Thermoproteus y Sulfolobus y Aquifex usan el ciclo del ácido cítrico inverso, al igual que algunas bacterias quimiolitótrofas como Thiomicrospira. Ciclo del hidroxipropionato El fotótrofo verde no del azufre Chloroflexus crece autotrofiamente con hidrógeno o sulfuro de hidrógeno como donadores de electrones. Sin embargo, ni el ciclo de Calvin ni el ciclo del ácido cítrico inverso funcionan en este organismo. En cambio, dos moléculas de CO2 se reducen a glioxilato en la ruta del hidroxipropionato. Esta ruta tiene este nombre porque el hidroxipropionato, un compuesto de tres átomos de carbono es un intermediario fundamental. El acetil-CoA se carboxila y reduce generando hidroxipropionil-CoA, el cual se reduce a propionil-CoA. Éste se carboxila dando metilmalonilCoA, que posteriormente se convierte en sucinil-CoA y malil-CoA. La escisión de malil- CoA regenera acetil-CoA y produce glioxilato, a partir del cual se sintetiza material celular. El poder reductor empleado en esta ruta es estrictamente NADPH +, que proviene de fotosíntesis Entre las bacterias fotótrofas, la ruta del hidroxipropionato se ha encontrado en Chloroflexus, del que se piensa que fue uno de los primeros fotótrofos de la Tierra. Esto sugiere que la ruta del hidroxipropionato podría haber sido uno de los primeros mecanismos, si no el primero, de autotrofia en los fotótrofos anoxigénicos. Además de Chloroflexus, la ruta del hidroxipropionato funciona en varias arqueas hipertermófilas como Metallosphaera, Acidianus y Sulfolobus, que son todos quimiolitótrofos que se encuentran cerca de la base del árbol filogenético de Archaea. Ruta del acetil-CoA A diferencia de otras rutas autotróficas, la ruta de la acetil-CoA de fijación de CO2 no es un ciclo. Lo que hace es catalizar la reducción de CO2 a lo largo de dos rutas lineales, una en la que una molécula de CO2 se reduce a grupo metilo del acetato y otra en la que la segunda molécula de CO2 se reduce a grupo carbonilo del acetato. Estas dos unidades C1 se combinan después para formar acetil-CoA. Una enzima clave en la ruta de la acetil-CoA es la monóxido de carbono-deshidrogenasa (CO- deshidrogenasa). La CO-deshidrogenasa contiene Ni, Zn y Fe como cofactores y cataliza la reacción El monóxido de carbono producido por la CO-deshidrogenasa se convierte en el carbono carbonílico del acetato. El grupo metilo del acetato se origina en la reducción de CO2 a través de una serie de reacciones en las que la coenzima tetrahidrofolato tiene una función primordial. El grupo metilo se transfiere a continuación del tetrahidrofolato a una enzima que contiene vitamina B12 como cofactor, y en la etapa final de la ruta el grupo metilo se combina con CO por acción de la CO-deshidrogenasa para formar acetil-CoA. La conversión de acetil-CoA a acetato y ATP completa la serie de reacciones. La obtención de la energía se produce por fosforilación a nivel de sustrato y por acción de una bomba de iones. Durante la conversión de cada acetil-CoA a acetato se produce una molécula de ATP. No obstante, además, la síntesis de acetil-CoA a partir de sus componentes, CO y CH3, libera energía libre, parte de la cual es captada por una bomba de sodio que se acopla a la formación de fuerza sodiomotriz. Este estado energético de la membrana impulsa la síntesis de ATP por parte de una ATPasa transportadora de sodio. Se necesita el ATP resultante de esta reacción para tener una ganancia neta de energía, porque el único ATP sintetizado por fosforilación a nivel de sustrato es consumido en la primera etapa de la ruta de la acetil-CoA. 2 Profesor: José Juan Mateo Tolosa Microbiología. Grado BCB Tema 10 Generación de ATP y poder reductor en fotoautótrofos: fotosíntesis oxigénica y anoxigènica. Los microorganismos no sólo obtienen energía de la oxidación de compuestos orgánicos e inorgánicos, sino también de la energía de la luz, que capturan y usan para sintetizar ATP y poder reductor. El proceso por el cual la energía de la luz es capturada y convertida en energía química se llama fotosíntesis. Generalmente los organismos fotótrofos reducen e incorporan CO2. La fotosíntesis es uno de los procesos metabólicos más importantes en la Tierra, porque casi toda nuestra energía se deriva en último término de la energía solar. Proporciona a los organismos fotosintéticos ATP y poder reductor para sintetizar el material orgánico necesario para el crecimiento. A su vez, estos organismos son la base de la mayoría de las cadenas tróficas de la biosfera. Además, un tipo de fotosíntesis es responsable de reponer nuestro suministro de O2. un proceso destacable realizado por una variedad de organismos, tanto eucariotas como bacterianos. Más de la mitad de la fotosíntesis en la Tierra es realizada por microorganismos, aunque la mayoría de la gente asocia la fotosíntesis con las plantas. La fotosíntesis en conjunto está dividida en dos partes. En las reacciones lumínicas la energía de la luz es capturada y convertida en energía química. Esta energía se usa entonces para reducir o fijar CO2 y sintetizar componentes celulares en las reacciones independientes de la luz. Pigmentos y organización. Clorofila y bacterioclorofila La clorofila y la bacterioclorofila están relacionadas con los tetrapirroles, que son la estructura madre de los citocromos. Pero, a diferencia de los citocromos, que contienen hierro, las clorofilas contienen magnesio en el centro del anillo. Las clorofilas también contienen sustituyentes específicos en el anillo tetrapirrólico y un alcohol hidrófobo que ayuda a anclar la clorofila a las membranas fotosintéticas. La clorofila a es verde porque absorbe luz roja y azul y transmite luz verde; su espectro de absorción presenta una fuerte absorbancia cerca de los 680 nm y los 430 nm. Se conocen varias clorofilas, que se distinguen por sus espectros de absorción particulares. Las cianobacterias contienen clorofila a, mientras que sus parientes los proclorófitos producen clorofilas a y b. Las bacterias fotótrofas rojas y verdes producen una o más bacterioclorofilas. La bacterioclorofila a, presente en la mayoría de las bacterias rojas, tiene su rango de absorción máximo entre 800 nm y 925 nm (díferentes bacterias rojas sintetizan fotocomplejos ligeramente diferentes, y los máximos de absorción de la bacterioclorofila a en un organismo determinado dependen, en cierta medida, de la disposición de las proteínas de los fotocomplejos en la membrana fotosintética). Otras bacterioclorofilas, distribuidas en distintas líneas filogenéticas, absorben en otras regiones del espectro. La existencia de diferentes formas de clorofila o bacterioclorofila que absorben luz de diferentes longitudes de onda permite a los fotótrofos aprovechar la energía disponible en el espectro electromagnético. La utilización de diversos pigmentos con propiedades de absorción distintas permite que fotótrofos diferentes puedan coexistir en el mismo hábitat, absorbiendo cada uno las longitudes de onda que otros no pueden absorber. Centros de reacción y pigmentos antena En los fotótrofos oxigénicos y los fotótrofos rojos anoxigénicos, las moléculas de clorofila/bacterioclorofila no existen de forma libre en la célula, sino que están unidas a proteínas que, a su vez, están alojadas en membranas formando fotocomplejos constituidos por entre cincuenta y trescientas moléculas de clorofila/bacterioclorofila. Solo un pequeño número de estas moléculas de pigmento, llamadas centros de reacción, participan directamente en reacciones que conducen a la 3 Profesor: José Juan Mateo Tolosa Microbiología. Grado BCB Tema 10 síntesis de ATP. Las clorofilas/bacterioclorofilas de los centros de reacción están rodeadas por un número mayor de clorofilas/bacterioclorofilas que captan la luz. Estos llamados pigmentos antena (o pigmentos captadores de luz) absorben la luz y canalizan parte de la energía hacia el centro de reacción. Esta disposición para concentrar la energía permite a los centros de reacción recibir energía lumínica, que de otro modo se perdería, en las bajas intensidades de luz que se suelen encontrar en la naturaleza. Membranas fotosintéticas, cloroplastos y clorosomas Los pigmentos clorofílicos y todos los demás componentes del aparato de captación de luz se encuentran en sistemas membranosos celulares. La ubicación de estas membranas fotosintéticas es diferente en procariotas y eucariotas. En los eucariotas fotótrofos la fotosíntesis tiene lugar en orgánulos intracelulares, los cloroplastos, donde las clorofilas están unidas a membranas de aspecto laminado. Estos sistemas fotosintéticos membranosos se llaman tilacoides, y se apilan formando grana. Los tilacoides se disponen de manera que el cloroplasto queda dividido en dos regiones, el espacio matricial que rodea los tilacoides, llamado estroma, y el espacio interior dentro de la formación de los tilacoides. Esta disposición permite la generación de una fuerza protonmotriz impulsada por la luz que se utiliza para sintetizar ATP. Los procariotas fotótrofos carecen de cloroplastos. En las bacterias rojas los pigmentos fotosintéticos están integrados en sistemas de membranas internas que se forman por invaginación de la membrana citoplasmática que se denominan clorosomas. En las bacterias rojas las disposiciones normales son vesículas de membrana. En los tapetes microbianos se da un acusado gradiente de luz, de manera que incluso a pocos milímetros de la superficie del tapete el nivel de luz se aproxima a la oscuridad. Por tanto, los clorosomas permiten a las bacterias verdes no del azufre crecer fototrofamente con las mínimas intensidades lumínicas disponibles. Carotenoides Los pigmentos accesorios más abundantes en los fotótrofos son los carotenoides. Se trata de pigmentos hidrófobos integrados firmemente en la membrana fotosintética. Los carotenoides son normalmente amarillos, rojos, marrones o verdes y absorben luz en la región azul del espectro. Como suelen enmascarar el color de las bacterioclorofilas, los carotenoides son los responsables de los colores brillantes, rojo, morado, rosa, verde, amarillo o marrón, que se observan en diferentes especies de fotótrofos anoxigénicos. Los carotenoides están estrechamente asociados con la clorofila o la bacterioclorofila en los complejos fotosintéticos, y parte de la energía que absorben se puede transferir al centro de reacción. No obstante, los carotenoides actúan principalmente como agentes fotoprotectores. La luz brillante puede ser perjudicial para las células porque puede catalizar reacciones de fotooxidación que pueden generar formas tóxicas de oxígeno. Al igual que el superóxido y otras formas de oxígeno tóxico, el singulete de oxígeno puede oxidar espontáneamente los fotocomplejos, que dejan de ser funcionales. Los carotenoides extinguen las especies tóxicas de oxígeno absorbiendo gran parte de esta luz perjudicial y evitan así estas peligrosas fotooxidaciones. Esta fotoprotección que proporcionan los carotenoides es una gran ventaja, porque los organismos fotótrofos tienen que vivir expuestos a la luz debido a su propia naturaleza. Ficobiliproteínas y ficobilisomas Las cianobacterias y los cloroplastos de las algas rojas (que son descendientes de las cianobacterias) contienen pigmentos llamados ficobiliproteínas, que son los principales sistemas de captación de la luz de estos fotótrofos. Las ficobiliproteínas están formadas por tetrapirroles lineales de color rojo o azul verdoso, llamados bílinas, unidos a proteínas, y dan a las cianobacterias y a las algas rojas su color 4 Profesor: José Juan Mateo Tolosa Microbiología. Grado BCB Tema 10 característico. La ficobiliproteína roja, llamada ficoeritrina, absorbe principalmente longitudes de onda alrededor de los 550 nm, mientras que la ficobiliproteína azul, o ficocianina absorbe principalmente longitudes de onda de 620 nm. Una tercera ficobiliproteína, la aloficocianina, absorbe las de aproximadamente 650 nm. Las ficobiliproteínas se ensamblan formando agregados llamados ficobilisomas, que se disponen de manera que las moléculas de aloficocianina están en contacto directo con la membrana fotosintética. La aloficocianina está rodeada de ficocianina o ficoeritrina (o de ambas, según el organismo). La ficocianína y la ficoeritrina absorben luz de longitud de onda más corta y transfieren parte de la energía a la aloficocianina, que está situada más cerca de la clorofila del centro de reacción y le transfiere dicha energía. Así, de manera similar a cómo funcionan las bacterioclorofilas antena en los fotótrofos anoxigénicos, la transferencia de energía se produce “cuesta abajo”, de los ficobilisomas al centro de reacción. Los ficobilisomas facilitan la transferencia de energía a los centros de reacción de las cianobacterias, lo que permite a estas crecer a intensidades lumínicas menores de las que, de otra manera, necesitarían. Fotosíntesis oxigénica Los eucariotas fotótrofos y las cianobacterias realizan la fotosíntesis oxigénica, denominada así porque se genera oxígeno al convertir la energía de la luz en energía química. En este proceso, y en el resto de los procesos fotótrofos, son fundamentales los pigmentos que absorben la luz. En los fotótrofos oxigénicos. los pigmentos más importantes son las clorofilas. En los fotótrofos oxigénicos los electrones fluyen a través de dos fotosistemas distintos llamados fotosistema I (PSI o P700) y fotosistema II (PSII o P680). Las reacciones luminosas en la fotosíntesis oxigénica se producen en fotocomplejos embebidos en membranas. En las células eucariotas, las membranas están en el cloroplasto, mientras que en las cianobacterias están apiladas en el citoplasma. Flujo de electrones y síntesis de ATP en la fotosíntesis oxigénica El PSI y el PSII interaccionan siguiendo el “esquema Z” de la fotosíntesis, llamado así porque la ruta recuerda a la letra Z tumbada. El potencial de reducción de la molécula de clorofila a del P680 en el PSII es muy electropositivo. Esto es necesario para que se pueda dar el primer paso del flujo de electrones, que es la escisión del agua en oxígeno y electrones. La energía lumínica convierte el P680 en un reductor fuerte que reduce la feofitina a (clorofila a sin el átomo de magnesio), que es una molécula con un potencial de reducción aproximado de -0,5 V. A continuación, el H2O dona un electrón a la molécula oxidada de P680 y lo devuelve a su poder de reducción basal. El electrón viaja desde la feofitina a través de varios transportadores de membrana de potencial de reducción positivo creciente que son quinonas, citocromos y una proteína que contiene cobre llamada plastocianina; esta última dona el electrón al centro de reacción PSI. El electrón es aceptado por el P700 del PSI, que previamente ha absorbido energía lumínica y ha donado un electrón que, con el tiempo, provocará la reducción de NADP+. Los electrones viajan a través de varios intermediarios en PSI y terminan con la reducción de NADP+ a NADPH. Además de la síntesis neta de NADPH, tienen lugar otros procesos importantes mientras los electrones fluyen del PSII al PSI. Las reacciones de transporte electrónico generan una fuerza protonmotriz que utiliza la ATPasa para producir ATP. Este mecanismo de síntesis de ATP recibe el nombre de fotofosforilación no cíclica, porque los electrones no completan el ciclo para reducir el P680 oxidado, sino que se usan en la reducción de NADP+. No obstante, cuando hay mucho poder de reducción, los fotótrofos oxigénicos también pueden producir ATP mediante fotofosforilación cíclica. Esto ocurre cuando, en lugar de reducir NADP+ los electrones del PSI que normalmente reducirían la ferredoxina vuelven a la cadena de transporte de electrones que conecta el 5 Profesor: José Juan Mateo Tolosa Microbiología. Grado BCB Tema 10 PSII con el PSI. De esta manera, estos electrones también generan una fuerza protonmotriz que favorece la síntesis de más ATP. Fotosíntesis anoxigénica Los centros de reacción de las bacterias rojas contienen tres polipéptidos designados como L, M y H. Estas proteínas, junto con una molécula de citocromo e, están firmemente embebidas en la membrana fotosintética y la atraviesan varias veces. Los polipéptidos L, M y H unen dos moléculas de bacterioclorofila a llamadas el par especial, dos moléculas más de bacterioclorofila a que actúan en el flujo fotosintético de electrones, dos moléculas de bacteriofeofitina (bacterioclorofila a sin el átomo de magnesio), dos moléculas de quinona y un carotenoide. Todos los componentes del centro de reacción están integrados de manera que pueden interaccionar en reacciones de transferencia de electrones muy rápidas en las primeras etapas de la conversión de energía fotosintética. Flujo de electrones en las bacterias rojas Las reacciones luminosas de la fotosíntesis empiezan cuando la energía lumínica absorbida por los sistemas antena se transfiere al par especial de moléculas de bacterioclorofila a. La luz excita el par especial y lo convierte de donador de electrones relativamente débil a uno muy fuerte. Una vez que se ha generado este donador fuerte, los pasos restantes del flujo fotosintético de electrones son muy parecidos a los que hemos visto anteriormente, es decir, los electrones fluyen a través de la membrana, de los portadores con potencial de reducción bajo a los de potencial de reducción alto, y en el proceso se genera fuerza protonmotriz. Antes de la excitación, el centro de reacción de las bacterias rojas, llamado P870, tiene un E0' aproximado de +0,5 V; tras la excitación el potencial es de -1,0 V, aproximadamente. Un electrón excitado de P870 reduce una molécula de bacterioclorofila a del centro de reacción. Esta transición tiene lugar con rapidez, en solamente tres billonésimas de segundo. Una vez reducida, la bacterioclorofila a reduce la bacteriofeofitina a, y esta reduce las moléculas de quinona de la membrana. Estas transiciones también son muy rápidas, ocurren en menos de una milmillonésima de segundo. Desde la quinona, los electrones se transportan más lentamente (en cuestión de milisegundos) a través de una serie de ferrosulfoproteínas y citocromos y finalmente vuelven al centro de reacción. Entre las proteínas fundamentales para el transporte de electrones hay muchas que también participan en el flujo respiratorio de electrones, en concreto el citocromo bc1 y el citocromo c2. El citocromo c2 es un citocromo periplasmático que actúa como lanzadera de electrones entre el complejo bc1 unido a la membrana y el centro de reacción. El flujo de electrones se completa cuando el citocromo c2 dona un electrón al par especial de bacterioclorofilas y las devuelve a su potencial de reducción basal original. Entonces el centro de reacción puede absorber nueva energía lumínica y repetir el proceso. El ATP se sintetiza durante el flujo fotosintético de electrones mediante la actividad de la ATPasa, que acopla la fuerza protonmotriz a la síntesis de ATP. Este mecanismo de síntesis de ATP recibe el nombre de fotofosforilacíón cíclica, porque los electrones se mueven en un ciclo cerrado. A diferencia de la respiración, donde existe un consumo neto de electrones, en la fotofosforilación cíclica no hay entrada o consumo neto de electrones; los electrones simplemente viajan por un circuito cerrado, y regresan al lugar de donde partieron. Generación de poder reductor Para que una bacteria roja crezca como un organismo fotoautótrofo, no es suficiente con la formación de ATP. También es necesario poder reductor (NADH) para reducir el CO2 a material celular. El poder reductor de las bacterias rojas puede proceder de muchas fuentes, en particular de compuestos de azufre reducidos como el sulfuro de hidrógeno. Cuando el sulfuro de hidrógeno es el donador de electrones 6 Profesor: José Juan Mateo Tolosa Microbiología. Grado BCB Tema 10 en las bacterias rojas del azufre, los glóbulos de azufre elemental (S0) se almacenan en el interior de la célula. Cuando se forma S0, los electrones terminan en el “reservorio de quinonas”. No obstante, el potencial de reducción de las quinonas no es lo bastante electronegativo para reducir el NAD+, de manera que los electrones del reservorio de quinonas deben volver atrás (en contra del gradiente electroquímico) para reducir NAD+ a NADH. Este proceso, llamado transporte inverso de electrones, está impulsado por la energía de la fuerza protonmotriz. Generación de ATP y poder reductor en quimiolitótrofos Desde un punto de vista evolutivo, la quimiolitotrofia puede haber sido la primera forma de fijación de la energía que se desarrolló en la Tierra, hallándose entre linajes que se encuentran en la base de los árboles filogenéticos tanto de Bacteria como de Archaea. Los organismos que obtienen la energía de la oxidación de los compuestos inorgánicos se llaman quimiolitótrofos. La mayoría de las bacterias quimiolitótrofas son también autótrofas. Como ya hemos apuntado con los fotótrofos, para crecer con CO2 como única fuente de carbono, un organismo necesita (1) ATP y (2) poder reductor. Algunos quimiolitótrofos crecen como mixótrofos, lo que significa que, si bien pueden obtener energía de la oxidación de un compuesto inorgánico, necesitan compuestos orgánicos como fuente de carbono (es decir, que no son autótrofos). En términos generales, la generación de ATP en los quimiolitótrofos es similar a la de los quimioorganótrofos respiradores excepto en que el donador de electrones es inorgánico en lugar de orgánico. Los electrones procedentes de donadores inorgánicos entran en las cadenas de transporte electrónico y generan una fuerza protonmotriz. A continuación, las ATPasas activan la síntesis de ATP. El poder reductor de los quimiolitótrofos se obtiene de dos maneras: directamente del compuesto inorgánico (si tiene un potencial de reducción suficientemente negativo) o a partir de las reacciones de transporte inverso de electrones, si el donador inorgánico de electrones es más electropositivo que el NADH. La mayoría de los quimiolitótrofos necesitan el transporte inverso de electrones, ya que sus donadores de electrones son electroquímicamente negativos. Oxidación del hidrógeno (H2) El hidrógeno es un producto habitual del metabolismo microbiano, especialmente de algunas fermentaciones, y algunos quimiolitótrofos aerobios son capaces de usarlo como donador de electrones en el metabolismo energético; se trata de las clásicas “bacterias del hidrógeno”. Además, se conocen muchas bacterias y arqueas anaerobias oxidadoras de hidrógeno que se diferencian en el aceptor de electrones que utilizan (por ejemplo, nitrato, sulfato, hierro férrico, CO2) pero nos centraremos en las bacterias aerobias que oxidan hidrógeno, organismos que acoplan la oxidación de hidrógeno a la reducción de oxígeno para formar agua. Energética de la oxidación del hidrógeno La síntesis de ATP durante la oxidación de hidrógeno por parte del oxígeno es el resultado de las reacciones de transporte electrónico que generan una fuerza protonmotriz. La reacción total es muy exergónica y se puede acoplar a la síntesis de ATP. En esta reacción, catalizada por la enzima hidrogenasa, los electrones del hidrógeno son transferidos inicialmente a una quinona aceptora. Desde allí, los electrones viajan a través de una serie de citocromos para generar una fuerza protonmotriz y reducen el oxígeno. 7 Profesor: José Juan Mateo Tolosa Microbiología. Grado BCB Tema 10 Algunas bacterias del hidrógeno sintetizan dos hidrogenasas distintas, una citoplasmática y la otra integrada en la membrana. Esta última participa en la obtención de energía, mientras que la hidrogenasa soluble tiene una función diferente. En lugar de unirse al hidrógeno para usarlo como donador de electrones en el metabolismo energético, la hidrogenasa citoplasmática se une al hidrógeno para catalizar la reducción de NAD+ a NADH (el potencial de reducción del hidrógeno es lo bastante electronegativo, de manera que las reacciones del flujo inverso de electrones sean innecesarias). El organismo Ralstonia eutropha se ha utilizado como modelo para estudiar la oxidación aerobia del hidrógeno por parte de especies que sintetizan dos hidrogenasas. Las especies con una sola hidrogenasa sintetizan solamente la enzima integrada en la membrana, que actúa tanto en la obtención de energía como en la autotrofia de la célula. Autotrofia en las bacterias del hidrógeno Aunque la mayoría de las bacterias del hidrógeno pueden crecer también como quimioorganótrofas, cuando crecen de manera quimiolitótrofa fijan CO2 mediante el ciclo de Calvin. Sin embargo, cuando disponen de compuestos orgánicos fáciles de usar como la glucosa, las bacterias del hidrógeno reprimen la síntesis de las enzimas del ciclo de Calvin y de las hidrogenasas. Por tanto, estas bacterias son quimiolitótrofos facultativos. Esto, obviamente, tiene un valor ecológico. En la naturaleza, los niveles de hidrógeno en ambientes óxicos son transitorios y bajos en el mejor de los casos, por dos motivos como mínimo: (1) la mayor parte del hidrógeno de producción biológica procede de fermentaciones, que son procesos anóxicos, y (2) el hidrógeno puede ser utilizado por varios procariotas anaerobios diferentes, de manera que se consume totalmente antes de alcanzar las regiones óxicas de un hábitat. Así pues, las bacterias aerobias del hidrógeno deben tener un metabolismo alternativo a la oxidación de H2, y en la naturaleza probablemente alternan los estilos de vida quimioorganótrofo y quimiolitótrofo según se lo permitan los nutrientes presentes en su hábitat. Además, muchas bacterias aerobias del hidrógeno crecen mejor microaerobiamente y probablemente sean más competitivas como bacterias del hidrógeno en interfases óxicas-anóxicas en las que pueden tener un mayor y más continuo aporte de hidrógeno que en los hábitats completamente óxicos. Oxidación de compuestos reducidos del azufre Muchos compuestos reducidos de azufre pueden ser donadores de electrones para las bacterias incoloras del azufre, llamadas incoloras para distinguirlas de las bacterias del azufre pigmentadas verdes y rojas. Energética de la oxidación del azufre Los compuestos de azufre más utilizados como donadores de electrones son el sulfuro de hidrógeno (H2S), el azufre elemental (S0) y el tiosulfato (S2O32-); el sulfito (SO32-) también se puede oxidar. En la mayoría de los casos, el producto final de la oxidación es el sulfato (SO42-). La oxidación del sulfuro se produce por etapas; el primer producto de oxidación es el azufre elemental. Algunas bacterias que oxidan el sulfuro, como Beggiatoa, depositan este azufre elemental en el interior de la célula, donde permanece como posible reserva de energía. Cuando se agota el suministro de sulfuro, se puede obtener más energía a partir de la oxidación del azufre a sulfato. Cuando el S0 está presente externamente, el organismo debe unirse a la partícula de azufre por que el azufre elemental es bastante insoluble. Al adherirse a la partícula, el organismo puede tomar átomos de azufre para oxidarlos a sulfato. Esto ocurre gracias a proteínas de membrana o periplasmáticas que solubilizan el S0 al reducirlo a HS-; a continuación, éste es transportado a la célula y entra en el metabolismo quimiolitótrofo. Un producto de la oxidación de los compuestos reducidos de azufre son los protones; el resultado de la 8 Profesor: José Juan Mateo Tolosa Microbiología. Grado BCB Tema 10 quimiolitotrofia del azufre es la acidificación del entorno. A causa de ello, muchas bacterias del azufre han desarrollado la tolerancia al ácido o incluso son acidófilas. Bioquímica de la oxidación del azufre Existen diversas vías para conservar la energía a partir de la oxidación de los compuestos de azufre. Una de las mejores caracterizadas es la vía del sistema Sox que se ha descrito en la bacteria Paracoccus pantotrophus. El sistema Sox contiene más de 15 genes que codifican para varios citocromos y otras proteínas necesarias para la oxidación de los compuestos reducidos de azufre directamente a sulfato. Se han encontrado elementos del sistema Sox en distintos quimiolitotrofos del azufre y también en algunas bacterias fototróficas del azufre, organismos que oxidan el sulfito para obtener poder reductor para fijar el CO2. El hecho de que este sistema bioquímico se distribuya entre bacterias que oxidan el sulfuro por distintas razones es un buen indicador de que estos genes que participan en el sistema Sox se encuentran muy distribuidos en la naturaleza mediante transferencia horizontal de genes. Hay cuatro proteínas clave en el sistema Sox: SoxXA, SoxYZ, Sox B y SoxCD. Todas estas proteínas se encuentran en el periplasma. La vía comienza cuando la enzima SoxXA forma un puente heterodisulfuro entre el compuesto de azufre que va a ser oxidado y la proteína transportadora SoxYZ. El compuesto de azufre permanece unido al transportador a través de todo el sistema, siendo liberado finalmente como sulfato por la actividad de SoxB. La enzima SoxCD (sulfuro deshidrogenasa) es una enzima clave y actúa como un intermediario para eliminar 6 electrones del compuesto de azufre unido al transportador. Los electrones que se obtienen del sistema Sox se dirigen hacia la cadena de transporte de electrones mientras que los protones generados se liberan y acidifican el medio. Los microorganismos que oxidan el azufre pueden almacenar granos de azufre dentro de la célula para lo cual también usan los componentes del sistema Sox, pero carecen de la sulfuro deshidrogenasa SoxCD. En ausencia de esta enzima, un átomo de azufre unido a SoxYZ se adiciona a un gránulo de azufre que está formándose en él periplasma. El azufre de este granulo puede ser reducido y transportado al citoplasma donde se oxidará a sulfito por la acción inversa de DsrAB, una enzima homóloga a la enzima sulfito reductasa encontrado en las bacterias reductoras del azufre. El sulfito entonces es oxidado a sulfato y se obtiene en dos electrones a través de una de las dos vías. La vía más utilizada usa la acción inversa de la sulfito reductasa. Esta enzima oxida el sulfito y transfiere los electrones a la cadena de transporte de electrones. Por el contrario, algunas bacterias quimiolitotrofas oxidan el sulfito a sulfato vía una actividad inversa de la enzima adenosín fósforo sulfato reductasa. Esta oxidación produce un enlace rico en fosfato que se puede utilizar para la fosforilación a nivel de sustrato. Los electrones de la oxidación de compuestos reducidos de azufre entran finalmente en la cadena de transporte de electrones. Según sea el potencial de reducción del par donador de electrones, los electrones entran a nivel de la flavoproteína (E0' = -0,2 V), la quinona (E0' = 0 V) o el citocromo c (E0 ' = +0,3 V) y son transportados por la cadena hasta el O2 para generar una fuerza protonmotriz. Los electrones para la fijación autótrofa de CO2 proceden del flujo inverso de electrones y producen NADH. La autótrofía está impulsada por reacciones del ciclo de Calvin o por alguna otra ruta autótrofa. Si bien los quimiolitótrofos del azufre son principalmente un grupo aerobio, algunas especies pueden crecer anaerobiamente usando nitrato como aceptor de electrones. Un ejemplo clásico es la bacteria del azufre Thiobacillus denitrificans, que reduce nitrato a nitrógeno molecular. Oxidación del hierro (Fe2+) La oxidación aerobia de hierro ferroso (Fe2+) a hierro férrico (Fe3+) sustenta el crecimiento de las “bacterias del hierro” quimiolitótrofas. A pH ácido, de esta reacción solo se obtiene una pequeña 9 Profesor: José Juan Mateo Tolosa Microbiología. Grado BCB Tema 10 cantidad de energía, por lo que las bacterias del hierro tienen que acoplar la oxidación de grandes cantidades para producir solo cantidades muy pequeñas de material celular. En ambientes acuáticos, el hierro férrico producido forma espontáneamente hidróxido férrico insoluble (Fe3+ + 3 H2O → Fe(OH)3 + 3 H+) y otros precipitados de hierro; y esto hace bajar el pH. Esta reacción química explica por qué muchas bacterias que oxidan el hierro han evolucionado para ser muy acidófilas. Bacterias oxidadoras de hierro Las bacterias del hierro mejor conocidas, Acidothiobacillus ferrooxídans y Leptospíríllum ferrooxídans, pueden crecer autototroficamente usando el hierro ferroso como donador de electrones incluso a pH l; el crecimiento es óptimo a pH entre 2 y 3. Estas bacterias son habituales en ambientes contaminados por ácido como las aguas de escorrentía de las minas de carbón. Ferroplasma, una especie de arquea, es un oxidador de hierro extremadamente acidófilo y puede crecer a valores de pH por debajo de 0. A pH neutro, el Fe2+ se oxida espontáneamente a Fe3+, de modo que las oportunidades para las bacterias del hierro se restringen a ubicaciones en las que el Fe2+ esté en transición de condiciones anóxicas a óxicas. Por ejemplo, las aguas subterráneas anóxicas contienen a menudo Fe2+, y cuando se libera queda expuesto al O2. En estas interfases, las bacterias del hierro oxidan el Fe2+ a Fe3+ antes de que se oxide espontáneamente. Gallionella ferruginea, Sphaerotilus natans y Leptothrix discophora son ejemplos de bacterias que viven en estas interfases; se suelen ver entremezcladas en los característicos depósitos de hierro férrico que forman. Energía procedente de la oxidación del hierro La bioenergética de la oxidación de hierro ferroso por Acidothiobacillus ferrooxidans y otros oxidadores del hierro acidófilos tiene un interés considerable a causa del potencial de reducción tan electropositivo del par Fe3+/Fe2+ a pH ácido (E0' = +0,77 V a pH 2). La cadena respiratoria de A. ferrooxidans contiene citocromos de los tipos c y aa3 y una proteína periplasmática con cobre llamada rusticianina. También hay una proteína que oxida hierro situada en la membrana externa de la célula. Al ser tan alto el potencial de reducción del par Fe3+/Fe2+, los pasos del transporte de electrones hasta el oxígeno (O2/H2O E0'= +0,82 V) es evidente que no pueden ser muchos. La oxidación del hierro empieza en la membrana externa, donde los organismos están en contacto con Fe2+ soluble o con minerales de hierro ferroso insoluble. El Fe2+ es oxidado a Fe3+, una transición de un solo electrón por un citocromo c de la membrana externa que transfiere electrones al periplasma, donde el aceptor de electrones es la rusticianina (E0'= +0,68 V). Se piensa que esta reacción ligeramente desfavorable desde el punto de vista termodinámico está impulsada por el consumo inmediato de Fe3+ en la formación de Fe(OH)3. Después, la rusticianina reduce un citocromo c que transfiere los electrones al citocromo aa3, y esta última proteína reduce el O2 a H2O. Resulta interesante conocer la naturaleza de la fuerza protonmotriz en A. ferrooxidans. En un ambiente fuertemente ácido existe ya un gran gradiente de protones a través de su membrana (el periplasma de la célula tiene un pH de entre 1 y 2, mientras que el del citoplasma está entre 5,5 y 6). Esta situación podría hacernos pensar que A. ferrooxidans puede producir ATP sin costo energético, pero no es el caso; el organismo no puede producir ATP de esta fuerza protonmotriz natural si no hay un donador de electrones, ya que los iones H+ que entran en el citoplasma a través de la ATPasa se deben consumir para mantener el pH interno dentro de límites aceptables. El consumo de protones se produce durante la reducción de O2 en la cadena de transporte electrónico, y esta reacción requiere electrones, que vienen de la oxidación de Fe2+ a Fe3+. 10 Profesor: José Juan Mateo Tolosa Microbiología. Grado BCB Tema 10 La autotrofía en A. ferrooxidans está sustentada por el ciclo de Calvin y a causa del gran potencial del donador de electrones es necesario consumir mucha energía en las reacciones del transporte inverso de electrones para obtener el poder reductor (NADH) requerido para la fijación de CO2. El NADH se forma por reducción de NAD+ con electrones obtenidos del Fe2+ que son forzados a volver atrás hacia el citocromo bc1, y el reservorio de quinonas se forma a expensas de la fuerza protonmotriz. El rendimiento energético relativamente escaso de la oxidación del hierro ferroso, unido a la gran demanda energética del ciclo de Calvin, implica que A. ferrooxidans debe oxidar grandes cantidades de Fe2+ para producir incluso una pequeña cantidad de material celular. Por tanto, en ambientes en los que las bacterias acidófilas que oxidan hierro crecen bien, su presencia no está marcada por la formación de grandes cantidades de células, sino por la presencia de las grandes cantidades de precipitados de hierro férrico que generan. Oxidación del hierro ferroso en condiciones anóxicas El hierro ferroso puede ser oxidado en condiciones anóxícas por algunas bacterias quimiolitótrofas y fotótrofas anoxigénicas. En estos casos, el Fe2+ se puede usar como donador de electrones en el metabolismo energético (quimiolitótrofos), como reductor para la fijación del CO2 (fotótrofos) o para ambas cosas. Un detalle importante que hay que tener en cuenta es que, a pH neutro, donde estos organismos crecen mejor, el potencial de reducción del par Fe3+/Fe2+ es significativamente más electronegativo que a pH ácido (+ 0,2 V frente a +0,77 V, respectivamente). Por tanto, los electrones del Fe2+ pueden reducir el citocromo c para iniciar las reacciones de transporte de electrones. Para los quimiolitótrofos, el aceptor de electrones es el nitrato (NO3-), y el producto final de esta respiración anaerobia puede ser el nitrito (NO2-) o el nitrógeno molecular (N2). Para las bacterias rojas y verdes que oxidan el Fe2+, el donador de electrones puede ser el Fe2+ o bien el sulfuro de hierro (FeS). En el caso del FeS se oxidan tanto el Fe2+ como el S2-. Nitrificación y anamox Los compuestos inorgánicos de nitrógeno reducido, amoniaco (NH3) y nitrito (NO2- ), son oxidados en condiciones aerobias por las bacterias nitrificantes quimiolitótrofas en el proceso de nitrificación. En condiciones anóxicas el amoniaco también es oxidado por un grupo muy especial de bacterias en el proceso llamado anamox. Las bacterias nitrificantes y las bacterias anamox están ampliamente distribuidas en suelos, agua, aguas residuales y en el mar. En condiciones óxicas, las bacterias y arqueas nitrificantes oxidan el amoniaco, pero únicamente a nitrito, mientras un grupo distinto de bacterias oxida el nitrito a nitrato. La oxidación completa de amoniaco a nitrato, que es una transferencia de ocho electrones, se lleva a cabo gracias a la actividad cooperativa de dos grupos fisiológicos de organismos, los oxidadores de amoniaco y los oxidadores de nitrito. Bioenergética y enzimología de la oxidación de amoniaco y nitrito Los donadores de electrones para las bacterias nitrificantes no son especialmente fuertes. El potencial de reducción del par NO2-/NH3 (el primer paso en la oxidación del NH3) es +0,34 V, y el potencial de reducción del par NO3-/NO2- es todavía más positivo, unos +0,43 V. Por fuerza, estos potenciales de reducción obligan a las bacterias nitrificantes a donar electrones a aceptores de potencial bastante alto, y esto limita la cantidad de energía que se puede conservar. Hay varias enzimas fundamentales que participan en la oxidación de compuestos de nitrógeno reducidos. En las bacterias que oxidan amoniaco, como Nitrosomonas, la oxidación es catalizada por la amoniaco-monooxigenasa, que produce hidroxilamina (NH2OH) y agua. Una segunda enzima, la hidroxilamina-oxidorreductasa, oxida la hidroxilamina a nitrito y libera cuatro electrones. La 11 Profesor: José Juan Mateo Tolosa Microbiología. Grado BCB Tema 10 amoniaco-monooxigenasa es una proteína de membrana, mientras que la hidroxilamina- oxidorreductasa es periplasmática. En la reacción catalizada por la amoniaco-monooxigenasa NH3 + O2 + 2H+ + 2e- NH2OH + H2O son necesarios dos protones y dos electrones para reducir un átomo de O2 a H2O. Estos electrones proceden de la oxidación de la hidroxilamina y son suministrados a la amoniaco-monooxigenasa desde la hidroxilamina-oxidorreductasa a través del citocromo c y la ubiquinona. Por tanto, por cada cuatro electrones generados en la oxidación de nitrato a nitrito, solo dos llegan realmente al citocromo aa3, que es la oxidasa terminal que interacciona con el oxígeno para formar agua. Las bacterias que oxidan nitrito a nitrato catalizan la reacción mediante la enzima nitrito- oxidorreductasa, y los electrones recorren una cadena de transporte electrónico muy corta hasta la oxidasa terminal. Los citocromos de tipo a y c están presentes en la cadena de transporte electrónico de los oxidadores de nitrito, y la actividad del citocromo aa3 genera fuerza protonmotriz. Al igual que en el caso de las bacterias del hierro, la oxidación del nitrito libera solo pequeñas cantidades de energía, de modo que se obtiene muy poco material celular incluso aunque se oxiden grandes cantidades de nitrito. Metabolismo del carbono y ecología de las bacterias nitrificantes Al igual que los quimiolitótrofos oxidadores de azufre y de hierro, las bacterias nitrificantes aerobias utilizan el ciclo de Calvin para fijar CO2. Las necesidades de ATP y poder reductor del ciclo de Calvin suponen obstáculos adicionales para un sistema de generación de energía cuyo rendimiento ya es relativamente escaso (el NADH para el ciclo de Calvin en los nitrificantes se forma por flujo inverso de electrones). Las restricciones energéticas son particularmente fuertes para los oxidadores de nitrito y, quizás por este motivo, la mayoría de los oxidadores de nitrito tienen mecanismos alternativos de obtención de energía, ya que pueden crecer de manera quimioorganótrofa con glucosa y otros pocos sustratos orgánicos. Por otra parte, las especies de bacterias oxidantes de amoniaco son quimiolitótrofas estrictas o mixótrofas. La autotrofia de las arqueas oxidadoras de amoniaco está sustentada por el ciclo del hidroxipropionato. Anamox Aunque los procariotas oxidadores de amoniaco que acabamos de estudiar son aerobios estrictos, el amoniaco también se puede oxidar en condiciones anóxicas. Este proceso se llama anamox y está catalizado por un grupo inusual de bacterias anaerobias estrictas. Como los oxidadores de amoniaco aerobios, las bacterias anamox también son autótrofas, pero no fijan CO2 usando las rutas que utilizan los oxidadores de amoniaco aerobios, sino que lo fijan a través de la ruta de la acetil-CoA. El anamoxosoma es una estructura envuelta por una membrana unitaria; por tanto, técnicamente es un orgánulo en el sentido eucariota del término. Los lípidos que forman la membrana del anamoxosoma no son los lípidos típicos de las bacterias, sino que consisten en ácidos grasos formados por múltiples anillos de ciclobutano unidos a glicerol por enlaces éster y éter. Estos lípidos escalera se agregan en la membrana y forman una estructura de membrana inusualmente densa que impide la difusión de sustancias del anamoxosoma hacia el citoplasma. La fuerte membrana del anamoxosoma es necesaria para proteger la célula de compuestos intermedios tóxicos producidos durante las reacciones anamox, especialmente de la hidrazina (N2H4), un reductor muy potente. En la reacción anamox primero el nitrito es reducido a óxido nítrico (NO) por la nitritoreductasa y después el óxido nítrico reacciona con amonio (NH4+) para dar hidrazina en presencia de la enzima 12 Profesor: José Juan Mateo Tolosa Microbiología. Grado BCB Tema 10 hidrazinahidrolasa. La hidrazina es oxidada a nitrógeno molecular más electrones por acción de la hidrazina-deshidrogenasa. Algunos de los electrones generados en esta etapa entran en la cadena de transporte de electrones del anamoxosoma y las reacciones de dicho transporte generan fuerza protonmotriz; otros electrones vuelven al sistema para impulsar las primeras reacciones anamox. Gracias a la fuerza protonmotriz, en la membrana del anamoxosoma se forma ATP. Ecología de la anamox En la naturaleza, el nitrito para la reacción anamox procede, presumiblemente, de bacterias y arqueas aerobias oxidadoras de amoniaco. Estos organismos coexisten con las bacterias anamox en hábitats donde abunda el amoniaco, como aguas fecales y otras aguas residuales. Las partículas suspendidas que se forman en estos hábitats contienen zonas óxicas y otras anóxicas en las que los oxidadores del amoniaco, con diferentes tipos de fisiología pueden coexistir en estrecha asociación. En cultivos mixtos de laboratorio, concentraciones altas de oxígeno inhiben la anamox y favorecen la nitrificación clásica, de manera que probablemente en la naturaleza la oxidación de amoniaco catalizada por las bacterias anamox esté regulada por la concentración de oxígeno en el hábitat. Desde un punto de vista ambiental, la anamox es un proceso muy beneficioso en el tratamiento de las aguas residuales. La eliminación anóxica de amoniaco y aminas y la formación de nitrógeno molecular ayudan a reducir el aporte a los ríos y corrientes de nitrógeno fijado procedente de las instalaciones de tratamiento de aguas residuales, y mantienen así una calidad del agua mejor de lo que sería posible de otro modo. La actividad de los organismos anamox marinos es probablemente la causa de la fracción significativa (más del 50 %) de amoniaco que se sabe que desaparece de los sedimentos marinos, un proceso que previamente no tenía explicación. Como mínimo, algunos sedimentos ricos en amoniaco de lagos de agua dulce también experimentan anamox, de modo que parece que la anamox se puede producir en cualquier ambiente anóxico en el que coexistan amoniaco y nitrito. 13 Profesor: José Juan Mateo Tolosa