Tema 1 Membranas y Transporte PDF

Tema 1: BIOMEMBRANAS Y TRANSPORTE  Bicapas lipídicas.  Liposomas y sus aplicaciones clínicas.  Proteínas de membrana.  Dinámica de membranas.  Permeabilidad de las membranas.  Termodinámica del transporte a través de membrana....

Tema 1: BIOMEMBRANAS Y TRANSPORTE  Bicapas lipídicas.  Liposomas y sus aplicaciones clínicas.  Proteínas de membrana.  Dinámica de membranas.  Permeabilidad de las membranas.  Termodinámica del transporte a través de membrana. 1 Tema 1. Biomembranas y transporte Bicapas lipídicas Modelo del mosaico fluido (Singer & Nicholson, 1972) Membranas biológicas  Las membranas biológicas son estructuras dinámicas que delimitan el interior y exterior de la célula y de sus compartimentos. Membrana = disolución bidimensional asimétrica de proteínas, lípidos y carbohidratos.  Modelo mosaico fluido con modificaciones. Autoensamblaje espontáneo no-covalente (inserción vectorial de proteínas).  Además de constituir una barrera física, desempeñan un papel importante en la regulación del transporte Lipidoma (http://www.lipidmaps.org/) de sustancias a través de ellas, el almacenamiento de Wenk (2010) Cell 143 energía libre, la recepción y transducción de señales y el reconocimiento entre células.  Están compuestas fundamentalmente de lípidos y proteínas en proporción variable (de 4:1 a 1:4 en masa; ej: cerebro humano 60% del peso seco son lípidos) con una cantidad menor de carbohidratos (unidos a lípidos o a proteínas).  Las principales clases de lípidos de membrana son los glicerofosfolípidos, esfingolípidos y esteroles. Los dos primeros contienen ácidos grasos (de 14-24 C) esterificados con un polialcohol, que puede ser glicerol o esfingosina. 2 Tema 1. Biomembranas y transporte Bicapas lipídicas Heterogeneidad lipídica  Se pueden definir dos tipos de heterogeneidad de lípidos: Diversidad química: Propiedades específicas de los lípidos. Comprenden una gran variedad (>1000 en una célula; entre 104-105 totales) de sustancias orgánicas que se caracterizan por su solubilidad en disolventes orgánicos y Porcentaje de distintos lípidos en diversas membranas celulares su carácter anfipático. Diversidad composicional: Comportamiento colectivo de los lípidos de una membrana. Existe una gran heterogeneidad en la composición lipídica que es característica de cada organismo (estado desarrollo), de cada membrana y/o subdominios de membrana, tanto en bacterias como en eucariotas. -Algunos orgánulos están enriquecidos en ciertos lípidos (ej: cardiolipina en mitocondria). -En células vectorialmente polarizadas, la composición lipídica cambia en las distintas caras (apical-basal) de la membrana -Determinados lípidos son claves en algunos procesos Marinko et al., Chem Rev. 2019 como la división celular (separación de las células hijas). 3 Tema 1. Biomembranas y transporte Bicapas lipídicas Asimetría de distribución de lípidos  Existe asimetría en la distribución de los lípidos entre las monocapas interna y externa. Abundan en la monocapa externa: -Los fosfolípidos con colina y esfingomielina (SM). -Los glicolípidos como cerebrósidos y gangliósidos. Predominan Abundan en la monocapa interna o citosólica: -Fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS) y distintos fosfatidilinositoles (PI).  El colesterol se distribuye de forma más o menos equilibrada en las dos monocapas sobretodo en las balsas de lípidos.  La asimetría se establece durante la biosíntesis de las membranas en el ER.  La asimetría es dinámica con una tendencia lenta a la distribución homogénea entre bicapas (flip). Tema 1. Biomembranas y transporte 4 Bicapas lipídicas Autoensamblaje de lípidos  El carácter anfipático de los lípidos les hace formar espontáneamente estructuras ordenadas en un medio acuoso.  Se trata de un proceso de autoensamblaje entrópicamente dirigido, causado por el efecto hidrofóbico y el grado de desorden que pueden adquirir las moléculas de agua del disolvente.  Los fosfolípidos en disolución acuosa forman 3 agrupaciones principales: micelas, micelas invertidas y bicapas, dependiendo de: características (tipo de fosfolípido, longitud y grado de saturación de los ácidos grasos constituyentes, tipo de cabeza polar) y protocolo (pH, temperatura, concentración de lípidos y modo de dispersión en la disolución acuosa). Monocapa lipídica Gota lipídica Bicapa G>0 G>0) lipídica vesicular Tema 1. Biomembranas y transporte (liposoma) 5 Bicapas lipídicas Transición de fase  La fluidez adecuada de las membranas es fundamental para las funciones biológicas.  Las membranas muestran una transición de fase térmica brusca entre una disposición rígida (fase gel o seudocristalina) y otra relajada (fase fluída) que influye en su espesor.  En la transición de fase o punto de fusión (30-40ºC), el estado se denomina cristal líquido o estado semilíquido y depende de la composición de las membranas.  En la adaptación a bajas temperaturas (frostbite= quemadura por frío) los seres vivos aumentan la proporción de ácidos grasos insaturados y disminuyen la longitud de las cadenas hidrocarbonadas y al revés para altas temperaturas (adaptación homeoviscosa).  La heterogeneidad lipídica y, sobre todo, la presencia de colesterol suaviza dicha transición de fase en las membranas biológicas. Fluidez Adaptación homeoviscosa Grado de insaturación Con colesterol Temperatura de transición Temperatura de transición Temperatura Tema 1. Biomembranas y transporte 6 Liposomas y sus aplicaciones clínicas Liposomas  La bicapa lipídica posee un espesor de unos 5-6 nm (dos moléculas lipídicas).  Las bicapas forman hojas que son inestables en sus extremos y que espontáneamente se curvan formando vesículas. 3 nm  Los liposomas son vesículas fabricadas en el laboratorio a partir de lípidos (puros, sintéticos…).  Los liposomas contienen fase acuosa en su interior por lo que pueden utilizarse como vehículo para transportar sustancias, tanto Bicela Unilamelar hidrofílicas como hidrofóbicas, que quieran ser Multilamelar (MLV) introducidas en células (con cuya membrana puede fundirse el liposoma) y así se utilizan en aplicaciones clínicas y cosméticas.  Los discos de bicapas estabilizados en los extremos con detergentes se denominan bicelas. Tipos de liposomas: MLV, Multilamellar vesicle; MVV, Multivesicular vesicle; Lípidos GUV, Giant unilamellar vesicle; polares LUV, Large unilamellar vesicle; SUV, Small unilamellar vesicle. Tema 1. Biomembranas y transporte 7 Liposomas y sus aplicaciones clínicas Liposomas como vehículos de agentes terapéuticos Evolución de los liposomas usados en el transporte de fármacos: A) Liposomas planares con drogas hidrofílicas (a) e hidrofóbicas (b). B) Inmunoliposomas con anticuerpos covalentemente unidos (c) o hidrofóbicamente anclados (d). C) Liposomas de larga duración en circulación con polímeros protectores como el PEG (e) (pegilación) que hacen de escudo contra la opsonización. D) Inmunoliposomas de larga duración en circulación. Nanopartículas teranósticas E) Liposomas de nueva generación con unión de polímeros protectores (i) más Nanopartículas: anticuerpos (j), etiquetas de diagnóstico (k), lípidos de carga positiva (l) que permiten la unión de DNA (m), lípidos sensibles a estímulos (n), péptidos que -Contenido -Cápsula penetran las células (p), componentes virales (q), cargados con partículas -Marcador magnéticas (r) o de plata u oro coloidal (s). -Conductor La doxorrubicina encapsulada en liposomas pegilados (para evitar la unión de opsoninas= liposomas sigilosos) es el primer medicamento aprobado (doxil). Stealth liposomes Torchilin (2005) Nature Rev. 4, 145 Opsonina Tema 1. Biomembranas y transporte 8 Proteínas de membrana Características generales 6 - 10 nm  Las proteínas pueden variar las propiedades físicas de las bicapas (fluidez, grosor, carga de la superficie, curvatura intrínseca…).  Las proteínas pueden ejercer también función estructural constituyéndose en puntos de anclado para la matriz extracelular (en el exterior) o el citoesqueleto (en el interior).  Algunas de las funciones de las proteínas de membrana: Canales iónicos Transportadores (o permeasas) Bombas Transportadores electrónicos Receptores Reconocimiento e inmunidad Enzimas adicionales  Muchos fármacos tienen como dianas proteínas de membrana (70% fármacos actuales son para receptores acoplados a proteínas G).  Las proteínas de transporte poseen especificidad para los solutos que transportan y de ahí la gran diversidad de proteínas de transporte en los seres vivos. En Haemophilus influenzae (1743 genes) posee más de 200 proteínas transportadoras (>10% del genoma). Aunque una proteína de transporte sea altamente específica para la sustancia que transporta su especificidad no suele ser absoluta. Tema 1. Biomembranas y transporte 9  Proteínas de membrana Mecanismos de unión de proteínas de membrana 1. Integral (penetrando la zona hidrofóbica). PIM (Proteína Integral de Membrana) (a) Ancladas a lípidos i. Glucosilfosfatidilinositol (GPI) y otras lipidaciones ii. Acilación grasa iii. Isoprenilación (b) Autoanclada i. Segmento transmembrana único: hélice (monotópica) ii. Segmento transmembrana múltiple: hélices (politópicas) iii. Barril- 2. Periférica (ancladas a la superficie de forma permanente) 3. Transitoria (ancladas a la superficie de forma transitoria) Esquema de diferentes modificaciones con lípidos de las proteínas: a) farnesilación; s b) geranilgeranilación; c) palmitoilación; d) adición de un ácido graso nitrado; e) adición de una prostaglandina ciclopentenona Tema 1. Biomembranas y transporte 10 Proteínas de membrana Perfil hidropático  Las proteínas transmembrana poseen dominios (TMD= TransMembrane Domain) característicos de interacción con la bicapa lipídica.  Algunas proteínas atraviesan reiteradamente la membrana mediante varios TMDs separados por vueltas o lazos (loops).  Los TMDs pueden predecirse a partir de la secuencia de la proteína mediante gráficos de hidropatía (tendencia de los residuos a interaccionar con el medio acuoso).  El índice de hidropatía (Kyte-Doolittle) de un aminoácido es un número que indica las propiedades hidrofóbicas (Ile 4,5, Val 4,2) o hidrofílicas (Arg -4,5, Lys -3,9) de su cadena lateral.  Si en una hélice  la media de hidropatía de 20 aa (1 aa=0,15 nm y membrana=3 nm) es superior a 1,6 se considera que el segmento podría ser una hélice transmembrana. PERFIL HIDROPÁTICO KYTE‐DOOLITTLE http://gcat.davidson.edu/DGPB/kd/kyte‐doolittle.htm segmento transmembrana Tema 1. Biomembranas y transporte 11 Proteínas de membrana Estructura secundaria de proteínas transmembrana  La estructura secundaria de proteínas transmembrana con múltiples segmentos puede ser en -hélice o -hoja plegada (barril-).  Las -hojas plegadas se producen mayoritariamente en proteínas bacterianas y mitocondriales (porinas). Estas estructuras permiten crear canales o conductos a través de la bicapa en los que los residuos hidrofílicos alternan con hidrofóbicos.  En algunas hélices transmembrana hay residuos polares (incluso cargados) y residuos apolares (hélices anfipáticas). En estos casos, los lados hidrofílicos se asocian para crear un canal polar interno por el que se transporta el sustrato. Ej: transportador de glucosa (GLUT1) Estructura en haz de α- Marinko et al., Chem Rev. 2019 hélices anfipáticas Tema 1. Biomembranas y transporte 12  Proteínas de membrana Expresion de proteínas de membrana  Los estudios funcionales requieren la reconstitución de las proteínas de membrana (MP) en proteoliposomas.  La purificación de MP requiere la rotura y dispersión de las membranas para aislar la proteína a purificar.  Detergentes como el SDS se usan para disolver las membranas celulares, pero causa desnaturalización. Se usan detergentes más suaves como el Triton X-100.  Los detergentes lipopeptídicos (LPDs) consisten en un esqueleto peptídico en -hélice que lleva ancladas cadenas alquilo.  La resolución de la estructura de las proteínas de membrana es un proceso complejo por las siguientes razones: Complejidad para sobreexpresar. Obtener la proteína funcional. Dificultad de cristalizar. Fosfolípido Detergente LPD LPD McGregor CL et. al. Nature Biotech, 2003 Tema 1. Biomembranas y transporte 13 Dinámica de membranas Movimiento de lípidos  Difusión lateral no catalizada (b) está permitida y es muy rápida (excepto restricciones de anclaje y polarización). La difusión de los componentes de la membrana se puede observar mediante la técnica de recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo (FRAP): Marcaje fluorescente de la superficie de la membrana (A). Blanqueo mediante luz (B). Recuperación de la zona fotoblanqueada por difusión (C).  Difusión transversal no catalizada (a) (flip-flop) restringida (lípidos) o prohibida (proteínas) produce asimetría estructural y funcional.  Difusión transversal catalizada (c) de lípidos participan flipasas, flopasas y escramblasas (se activan por calcio durante la apoptosis). En la imagen de la derecha (A) se muestra una molécula (lípido o proteína) unida a un fluoróforo (bola naranja) e insertada en la membrana y se puede seguir su movimiento browniano (B) que se observa al tomar imágenes de fluorescencia de las que se puede sacar doble información: la constante de difusión y si el movimiento está restringido en un área concreta o si es completamente libre. Tema 1. Biomembranas y transporte 14 Dinámica de membranas Citoesqueleto unido a la membrana del eritrocito Movimiento de proteínas e interacción lípido-proteína  La velocidad de difusión lateral de las proteínas es muy variable (miles de veces) y depende de la proteína en concreto y de su anclaje o no al citoesqueleto (en la cara citosólica de la membrana).  Las funciones celulares de la bicapas se basan en las interacciones mutuas lípido-proteína.  Las proteínas de membrana inmovilizan un anillo de fosfolípidos alrededor de la proteína, aumentando la viscosidad de la membrana fluida en la zona del anillo.  En las membranas existen una gran variedad de dominios en los que las proteínas unen específicamente lípidos Caveolas particulares. Se conocen tres clases de interacciones lípido-proteína:  Rafs o balsas lipídicas  Caveolas (estiramiento/relajación celular)  Vesículas recubiertas (colesterol/transferrina/virus)  Hay un gran número de enfermedades humanas relacionadas con mutaciones en los dominios de unión de lípidos de las proteínas. Vesículas recubierta de clatrina Tema 1. Biomembranas y transporte 15 Permeabilidad de las membranas Difusión simple Difusión simple y transporte mediado  La permeabilidad selectiva es una propiedad de la membrana plasmática y de otras membranas semipermeables que permiten el paso (flujo) de sólo ciertas moléculas a través de ellas en un tiempo dado.  La permeabilidad disminuye con el aumento del tamaño de la molécula y con el aumento de la polaridad (apolar > polar > con carga).  Una molécula polar o cargada tiene que perder su capa de solvatación para introducirse en la membrana (G>0) y la vuelve a recuperar al salir (G