Análisis de Laboratorio PDF

TEMA 12: ANÁLISIS DE LABORATORIO: OBSERVACIÓN, MEDIDAS Y ENSAYOS ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 2. UNIDADES DE MEDIDA 3. PROCEDIMIENTOS DE MEDIDA 4. INSTRUMENTOS Y SISTEMAS DE MEDIDA 5. FASES DE UN PROCEDIMIENTO DE MEDIDA 6. CALIBRACIÓN 1. INTRODUCCIÓN En el laboratorio hay que trabajar de manera ordenada...

TEMA 12: ANÁLISIS DE LABORATORIO: OBSERVACIÓN, MEDIDAS Y ENSAYOS ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN 2. UNIDADES DE MEDIDA 3. PROCEDIMIENTOS DE MEDIDA 4. INSTRUMENTOS Y SISTEMAS DE MEDIDA 5. FASES DE UN PROCEDIMIENTO DE MEDIDA 6. CALIBRACIÓN 1. INTRODUCCIÓN En el laboratorio hay que trabajar de manera ordenada y eficaz. Para ello, es importante que la muestra sea obtenida de forma correcta, procesarla adecuadamente, medirla y analizarla. Para conseguir todo esto es necesario aplicar una serie de pruebas, procedimientos y ensayos para obtener medidas precisas y exactas de los instrumentos del laboratorio, así como realizar el mantenimiento y calibrado de los mismos. En los laboratorios sanitarios se estudian las propiedades de las sustancias biológicas extraídas de los pacientes (muestras biológicas). Estos estudios, análisis o exámenes consisten en obtener un valor para una propiedad o cualidad particular. La materia se organiza en los seres vivos en distintos niveles, que de más pequeño a más grande serían: Átomo: un protón con electrones. Molécula: conjunto de átomos Célula: conjunto de moléculas Tejido: conjunto de céliulas Órgano: conjunto de tejidos Sistema: conjunto de órganos Organismo: conjunto de sistemas Cuando analizamos material biológico, éste procede de un espécimen o individuo al que estamos sometiendo a análisis. La porción de material biológico se denomina muestra. Esta muestra puede abarcar cualquiera de los niveles de organización de los seres vivos, es decir, la muestra pueden ser átomos o moléculas extraídas de un individuo (glucosa, urea, magnesio, calcio, etc.), o unas cuantas células (células sanguíneas, células de mucosa oral, etc.), una porción de tejido (muy empleado en las biopsias), o el análisis de un órgano completo o de un cuerpo completo (en biopsias y necropsias). Los organismos son estructuras químicas complejas, compuestos por numerosas moléculas diferentes que se asocian y combinan para formar las células, los tejidos y los órganos. Cuando uno de los componentes químicos de un organismo está siendo analizado, se denomina analito. Por ejemplo, la concentración de calcio en sangre o la concentración de amilasa en la saliva. En el primer caso, el analito es el calcio y en el segundo la amilasa (enzima que facilita la hidrolisis del almidón). Las propiedades biológicas a analizar de un individuo o muestra también se llaman variables. Por ejemplo, si queremos saber la cantidad de azúcar en sangre de un individuo, tomaremos una muestra de su sangre y analizaremos la presencia de azúcar en sangre y su cantidad. La variable estudiada “índice glucémico” es una variable cuantitativa, ya que determina la cantidad de azúcar en sangre por mL. Si lo que quiero analizar en un individuo es su color de pelo, la variable analizada es cualitativa, ya que no se puede cuantificar el valor observado, si no que se le atribuye una cualidad, como rubio, moreno, castaño, pelirrojo, etc. Las variables cuantitativas son aquellas que se expresan numéricamente, mientras que las cualitativas se expresan como una cualidad o atributo no numérico. EJEMPLOS: HAMBRE BELLEZA ALTURA PESO COLOR PELO IGNORANCIA TEMPERATURA NOTA MEDIA El proceso de seleccionar la información que se quiere analizar se denomina observación. Esta observación, como se ha comentado antes, se puede realizar sobre variables cuantitativas (p.e., el número de microorganismos de una muestra) o sobre variables cualitativas (p.e., el color de un lunar en la piel). Las variables cuantitativas se pueden dividir en: Discretas: expresadas en números enteros. No aceptan fracciones o decimales. Por ejemplo, n.º de hijos, n.º de habitaciones de un hotel, etc. Contínuas: aceptan valores comprendidos entre dos números enteros (decimales), por ejemplo la altura, peso, edad, etc. Las variables cualitativas se pueden dividir en: Ordinales: se pueden ordenar en función de un gradiente, como la gravedad, el dolor, el tamaño, etc. Por ejemplo, al observar el estado de salud bucodental de una persona, podemos determinar tras su análisis que su estado puede ser: ◦ Muy malo ◦ Malo ◦ Regular ◦ Bueno ◦ Muy bueno Nominales: no se pueden ordenar las observaciones en función de un gradiente. Un ejemplo de variable cualitativa nominal es la comida preferida de una persona. Tras preguntar a una población por su comida preferida, cada individuo podrá contestar: ◦ Pasta ◦ Arroz ◦ Hamburguesas ◦ Berenjenas ◦ Lentejas Los análisis cualitativos se utilizan en el laboratorio, principalmente, como métodos de respuesta rápida con varias finalidades clínicas: cribado, diagnóstico, confirmación o monitorización de una enfermedad. El cribado es la diferenciación clínica entre una persona sana y otra enferma. Estas pruebas cualitativas suelen ser de tipo binario, es decir, solo tienen dos posibilidades: positivo / negativo, presencia / no presencia, sí / no... Por ejemplo: ¿Presenta el paciente sangre en orina? Tras el análisis de la orina del paciente, la respuesta a este análisis solo puede ser sí o no. Una tercera opción sería “inválido” o “defectuoso”. Esta sería una prueba cualitativa de tipo binario y serviría para el cribado clínico. Analizar la PRESENCIA / AUSENCIA de azúcar en sangre Analizar la CANTIDAD de azúcar en sangre 2. UNIDADES DE MEDIDA El proceso de asignar un valor a una variable analizada se denomina medición. Medir es registrar un valor. Tras la observación, viene la medición. El valor de la medición puede ser cuantitativo o cualitativo, en función del tipo de variable observada. Para una variable cuantitativa, el valor se denomina magnitud y viene expresado numéricamente y acompañado de una unidad de medida. Podemos decir que magnitud es sinónimo de valor numérico. En las variables cualitativas el valor es un atributo no numérico (alto, bajo, fino, grueso, etc.) y no viene acompañado de unidades de medida. ENSAYO: es cualquier examen o prueba realizada en el laboratorio, bajo unas condiciones controladas y reproducibles, con la finalidad de conocer alguna característica o propiedad del objeto de estudio (generalmente la muestra). Es el conjunto de observaciones y mediciones que se realizan para obtener la información necesaria para su posterior análisis. Un ensayo también se podría considerar equivalente a experimento. Las primeras unidades de medida tomaron como referencia diversas partes del cuerpo humano: pulgada, pie, codo, mano o palmo, etc. Era frecuente que sus dimensiones variaran de una ciudad a otra o de una cultura a otra. La ausencia de un sistema normalizado generaba todo tipo de problemas de interpretación en el comercio, la industria y la ciencia o la tecnología, por lo que comerciantes, gobernantes y científicos decidieron normalizar las medidas mediante la adopción de patrones basados en constantes naturales que sirvieran como referencias universales. El Sistema Internacional de Unidades (SI) o sistema métrico decimal fue creado en Francia a finales del S. XVIII y posteriormente fue adoptado por el resto de naciones. El SI ha definido 7 unidades básicas, aunque admite otras unidades de uso generalizado como el litro (L) en lugar del metro cúbico (m 3). A partir de las unidades básicas se pueden formar unidades derivadas, como el metro cuadrado (m 2) para el área, los moles por litro (mol/L) para la concentración de sustancias o el katal (mol/s) para la actividad catalítica. Cada unidad tiene múltiplos y submúltiplos que están definidos por prefijos especificados. En los laboratorios de Anatomía Patológica y Análisis Clínicos se recomienda la utilización exclusiva de las unidades del SI, con sus múltiplos y submúltiplos. MAGNITUD UNIDAD SI SÍMBOLO Cantidad de sustancia Mol mol Longitud Metro m Masa Kilogramo kg Volumen Metro cúbico o Litro m³ o L Tiempo Segundo s Intensidad eléctrica Amperio A Intensidad luminosa Candela cd Temperatura Kelvin K MÚLTIPLOS SUBMÚLTIPLOS Prefijo Equivalencia Prefijo Equivalencia Deca 101 Deci 10-1 Hecto 102 Centi 10-2 Kilo 103 Mili 10-3 Mega 106 Micro 10-6 Giga 109 Nano 10-9 Tera 1012 Pico 10-12 Peta 1015 Femto 10-15 3. PROCEDIMIENTOS DE MEDIDA El PRINCIPIO DE MEDIDA es el fenómeno físico, químico o biológico en el que se fundamenta la medición, es decir, qué leyes, de las que gobiernan el comportamiento de la naturaleza, son las que se van a poner a prueba en la medición y nos van a permitir observar variaciones en los valores obtenidos: espectrofotometría, cromatografía, conductimetría, gravimetría, volumetría, etc. Por ejemplo, la centrifugación de un tubo de ensayo con orina produce la precipitación de material pesado al fondo del tubo, acumulándose de esa forma el sedimento y las células presentes en la orina en el fondo. Al observar el fondo del tubo, podemos observar si hay mucho material o poco material acumulado (valoración cualitativa). Se ha usado el principio de gravedad (gravimetría) para realizar esta medida. Un MÉTODO DE MEDIDA es la forma en que el investigador consigue los valores de las medidas. Los métodos de medida se pueden clasificar en dos grandes grupos: Métodos directos: el investigador observa directamente lo que se está analizando o estudiando. Por ejemplo, para saber la presión arterial de un paciente, un método directo es colocar un esfingomanómetro al paciente y medirle la presión arterial. Métodos indirectos: el investigador no observa directamente lo que se está analizando o estudiando. Por ejemplo, para saber la presión arterial de un paciente, en lugar de ponerle un esfingomanómetro y medirle la presión arterial, le pregunto al paciente cuál es su presión arterial. Los métodos directos son mucho más fiables, rigurosos y aceptables que los indirectos. Un PROCEDIMIENTO DE MEDIDA es el conjunto de operaciones que se describen de forma suficientemente detallada y se utilizan para la ejecución de mediciones particulares según un método concreto. El procedimiento de medida se incluye dentro del PNT que contiene la información necesaria para que el técnico pueda efectuar una medición sin necesidad de otras informaciones. Incluye fases, pasos, volúmenes, reactivos, tiempos de incubación, formas de calibración, instrumentos, cálculos matemáticos, etc. 4. INSTRUMENTOS Y SISTEMAS DE MEDIDA Para hacer una medición es necesario disponer de un instrumento de medida y, en muchas ocasiones, de unos reactivos. Un instrumento, aparato o equipo de medida es cualquier dispositivo útil para hacer mediciones. Por ejemplo: pH-metro, espectrofotómetro, pipeta, balanza, matraz aforado, etc. El término reactivo incluye, en su sentido amplio, a cualquier tipo de sustancia química implicada en una reacción química. Los reactivos pueden utilizarse en estado líquido (disoluciones, suspensiones) o sólido (tiras reactivas, anticuerpos, etc.). 5. FASES DE UN PROCEDIMIENTO DE MEDIDA Recordemos que la fase preanalítica de un ensayo o experimento incluye la recogida, procesamiento y conservación de la muestra, la fase analítica las observaciones y mediciones y la postanalítica las conclusiones, decisiones, publicaciones, etc. Hay que tener en cuenta que muchos errores en el resultado de la medición pueden tener su origen en la fase preanalítica. Los procedimientos de medida de analitos que se utilizan en los laboratorios de AP y análisis clínicos pueden incluir alguno o todos de los siguientes procesos: Separación: Proceso mediante el cual se separa, total o parcialmente, el componente de interés (analito) de otras sustancias presentes en la muestra. El objetivo es evitar efectos indeseables de los demás componentes sobre el procedimiento de medida. Los procesos de separación actuales se basan principalmente en la centrifugación, la cromatografía o la electroforesis. Otros como la filtración y la inmunoseparación se utilizan en casos concretos. Obtención de la señal mensurable: En ocasiones, lo que se analiza tiene alguna propiedad física que puede ser medida directamente: la masa de un cálculo urinario (balanza), el volumen de una muestra de orina (probeta) o el pH de la muestra (pH-metro). Sin embargo, cuando queremos medir un analito que no se manifiesta directamente, es necesario transformarlo mediante el empleo de reactivos o instrumentos para obtener una señal que se pueda medir. La transformación se consigue mediante reacciones químicas, excitación por radiación o electrotérmica, etc. Por ejemplo, para detectar la cantidad de proteínas que hay  en la orina de un paciente sería muy útil utilizar algún reactivo que, al reaccionar con las proteínas de la orina, cambie de color y se manifieste un cambio de tonalidad en la orina al hacer el ensayo. El reactivo de Benedict es un reactivo empleado para la detección de proteínas en distintas muestras (orina, alimentos, secreciones, etc.) Medición de la señal: Proceso mediante el cual se obtiene un valor para una característica física medible (señal) utilizando un instrumento de medida. Por ejemplo, mido el pH de una muestra de orina con unas tiras de pH reactivas, que cambian de color en función del pH de la sustancia con la que entran en contacto. Calibración: La calibración es la comparación de un valor medido con el valor correcto en condiciones especificas, documentando la desviación, calculando la incertidumbre de la medición y emitiendo el certificado. Por ejemplo, para calibrar una balanza de precisión debemos tener siempre a nuestra disposición una masa de referencia que no varíe, como una moneda de 1 euro, que pesa exactamente 7,5 g. Nuestro instrumento de medida estará bien calibrado cuando al pesar la moneda aparezca en la pantalla el valor de 7,5 g. En caso de dar otro valor, tendremos que anotar de qué forma varían los valores para posteriormente realizar un cálculo que nos arroje el valor real de la medida. 6. CALIBRACIÓN Calibrar consiste en establecer la relación entre los valores que proporciona un instrumento y los valores reales. Es un proceso que certifica si la medida obtenida por un instrumento es compatible con lo esperado y si es apto para su uso, con el fin de evitar desviaciones o errores en las medidas durante un análisis. Determinados instrumentos, como las balanzas o el material volumétrico de vidrio, se adquieren ya calibrados porque son bastante estables a largo plazo. La calibración de algunos analizadores automáticos empleados en el laboratorio es estable solo durante varios días. Otros, en cambio, hay que calibrarlos cada vez que se utilizan (pH-metro, espectrofotómetro, etc.) En cualquier proceso de calibración es necesario disponer de los patrones de medida con valores conocidos. Puede ser una medida material (una masa patrón de 7,5 g), un instrumento de medida (termómetro de vidrio certificado) o un material de referencia (suero calibrador de pH neutro). En el contexto de la calibración se usan como sinónimos las palabras “patrón”, “material de referencia” y “calibrador”. La relación que existe entre los valores que se observan en un instrumento o sistema de medida y los valores de los calibradores se expresa mediante una función de calibración. La representación gráfica de la función es una recta patrón o curva patrón (también llamadas recta de calibración o curva de calibración). X: Peso obtenido (g) Y: Peso real (g) 7,00 7,50 14,00 15,00 21,00 22,50 28,00 30,00 Por ejemplo, estamos calibrando nuestra balanza del laboratorio usando como medida de referencia (calibrador) la masa conocida de una moneda de 1 euro. El valor obtenido en la balanza es muy cercano al real, pero no es exacto.  Haremos una representación gráfica de una recta con los valores de X e Y de la tabla anterior. En el eje de ordenadas colocaremos los valores de Y, y en el eje de abscisas los valores de X. 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Lo primero que haremos será obtener nuestra ecuación de la recta a partir de la tabla: Y = aX + b La columna de la izquierda será la variable independiente X, y la columna de la derecha la variable dependiente Y, así que cada par de valores representan coordenadas x,y: Coordenadas Valores (X1,Y1) (7,00; 7,50) (X2,Y2) (14,00; 15,00) (X3,Y3) (21,00; 22,50) (X4,Y4) (28,00; 30,00) Calculamos el valor a de la ecuación de la recta, que corresponde con la pendiente: a = (Y2 - Y1) / (X2 - X1) = (15,00 - 7,50) / (14,00 - 7,00) = 7,50 / 7,00 = 1,07 a = 1,07 Una vez obtenida a, tomo cualquier par de valores de X e Y y los sustituyo en la ecuación de la recta, donde también incorporaré el valor de a. De esta ecuación despejo el valor de b, conocido como “término independiente”: Y = aX + b; 15,00 = 1,07.14,00 + b; b=0 Finalmente, sustituyo los valores de a y b en la ecuación de la recta: Y = 1,07.X + 0 Esta es nuestra recta de calibración, y con ella podemos saber cuál es el valor real de mi medida, ya que lo único que tengo que hacer es colocar en la fórmula el valor obtenido en la pesada (X) y calcular el valor real (Y). Si en una pesada obtengo 17,35 g, el valor real de la pesada será (recordemos que a = 1,07 y b = 0): Y = 1,07.17,35 + 0 = 18,59 g EJERCICIO: A partir de los siguientes datos, obtenidos durante la calibración de una balanza, realiza una recta de calibración y obtén la ecuación de calibración. X: peso obtenido (g) Y: peso real (g) 11,88 1,15 24,00 2,12 26,77 2,34 47,26 3,98 Una vez realizada la recta y la ecuación, contesta: ¿Cuál será el peso real de un objeto que marca 396,41 g en nuestra balanza?