T.8 Requerimiento y Crecimiento Bacteriano PDF

T.8 REQUERIMIENTO Y CRECIMIENTO BACTERIANO ​ REQUERIMIENTO BACTERIANO: ​ Para el cultivo y el estudio de las bacterias es necesario: -​ Un sustrato o nutriente presente en un medio de cultivo. -​ Unas condiciones físico-químicas. -​ Evitar las interferencias de ot...

T.8 REQUERIMIENTO Y CRECIMIENTO BACTERIANO ​ REQUERIMIENTO BACTERIANO: ​ Para el cultivo y el estudio de las bacterias es necesario: -​ Un sustrato o nutriente presente en un medio de cultivo. -​ Unas condiciones físico-químicas. -​ Evitar las interferencias de otros m.o. (medio estéril y que no se contamine durante su tratamiento). ​ Las condiciones físico-químicas y los requerimientos nutritivos bacterianos son: ○​ Temperatura: Cada bacteria tiene una Tª óptima de crecimiento, por encima o por debajo no hay crecimiento. Existen bacterias, según la Tª a la que se desarrollen, se dividen en tres grupos: -​ Psicrófilas: Amantes del frío y las bajas Tª. -​ Mesófilas: Crecen bien a las Tª corporales de los mamíferos (37º C) -​ Termófilas: Amantes del calor y las altas Tª. ○​ Humedad: El agua es imprescindible para la vida de todo ser vivo. Al ser la bacteria un ser unicelular, la toma directamente del medio donde vive. ○​ Ph: Cada bacteria posee un intervalo de pH óptimo de crecimiento. Hay que adecuar el pH de los medios de cultivo para conseguir los resultados deseados. ○​ Energía: Las bacterias obtienen directamente energía de la luz (fotótrofas) o degradando sust. químicas orgánicas o inorgánicas (quimiótrofas). ○​ Oxígeno: Existen 3 tipos: -​ Bacterias aerobias: Aquellas que necesitan el oxígeno para producir energía mediante la oxidación de los compuestos orgánicos. -​ Bacterias anaerobias estrictas: Son las que producen fermentaciones. Mueren en presencia de oxígeno. -​ Bacterias anaerobias facultativas: Crecen tanto en presencia como en ausencia de oxígeno. El oxígeno difunde poco a través del medio de cultivo, las bacterias aerobias crecerán en la superficie y las anaerobias facultativas lo harán en la totalidad del tubo. ○​ Anhídrido carbónico: Algunos m.o. (cocos Gram (-) crecen en ambientes ricos en CO2. ○​ Principios inmediatos: Los m.o. necesitan nutrientes para su desarrollo como HC, proteínas, lípidos, sales minerales y vit. ​ CRECIMIENTO BACTERIANO: ○​ Tipo de reproducción: División binaria es una célula que se divide, produce dos. ○​ Tiempo de generación: Plazo necesario para que una célula se convierta en dos. Variable para cada especie. Depende de las condiciones ambientales (temperatura, nutrientes,...) ○​ Fases crecimiento bacteriano (número de individuos/unidad de tiempo): 1)​ Fase de latencia o de adaptación: Apenas hay incremento en el nº de individuos. Los organismos están en actividad metabólica, aumentan de tamaño, fisiológicamente muy activas, sintetizando protoplasma nuevo y enzimas. 2)​ Fase exponencial: Se produce un número muy rápido de individuos. Las células se multiplican regularmente a ritmo constante. 3)​ Fase estacionaria: El nº de individuos se mantiene constante, no aumenta. Existe un equilibrio entre el índice de reproducción y el de declive o muerte. 4)​ Fase de declinación o muerte: Disminuye el nº de individuos debido a la acumulación de productos tóxicos resultantes del metabolismo y a la escasez de nutrientes.  MEDIOS DE CULTIVO ​ INTRODUCCIÓN: ​ Medios de cultivo: Son soluciones con sust. imprescindibles (nutrientes) para las bacterias ya que permiten su crecimiento. -​ Son sólidos, además de ser fuente de nutrientes, sirven como soporte físico para las bacterias, de tal forma que crezcan formando colonias. ​ Colonia: es un grupo de individuos idénticos entre sí, porque son el resultado de la multiplicación asexual de uno sólo. ​ Cultivos mixtos: Las bacterias u otros m.o. que se desarrollan en medios de laboratorio, se llaman cultivos. -​ Los cultivos, en el laboratorio, se obtienen realizando siembras de los m.o. a identificar. ​ Cultivo puro: Es el que incluye a un solo tipo de m.o. ​ A partir de un cultivo puro, se determinan: -​ Características del cultivo: Examen macroscópico (características organolépticas, examen morfológico). -​ Pruebas bioquímicas de identificación bacterianas. ​ COMPONENTES: a)​ Componentes básicos: Forman parte de la mayoría de los medios de cultivo. ○​ Proteínas: -​ Son fuente de nitrógeno. -​ Se emplea extracto de carne, gelatina, caseína, soja, peptonas,... -​ Los aa aislados no se emplean como nutrientes, sino como prueba de identificación bacteriana. ○​ HC: -​ Son fuente de carbono. -​ Se emplea almidón, lactosa, sacarosa, maltosa, glucosa,... -​ También se emplean como sustrato en pruebas de identificación bacteriana. -​ El agar es un polisacárido mixto. -​ No es un nutriente para las bacterias. -​ Se emplea como espesante en mayor o menor proporción. ○​ Iones metálicos y no metálicos: -​ Facilitan o inhiben el crecimiento bacteriano. -​ Dependiendo de la cantidad son macro o micronutrientes. -​ El cloruro sódico inhibe el crecimiento de bacterias ambientales. b)​ Componentes facilitadores: ○​ Buffer o tampones: -​ Estabilizan el pH del medio, absorbiendo las pequeñas variaciones del mismo. Haciéndolo óptimo para el tipo de bacterias que nos interese, facilitando su crecimiento e inhibiendo el de otros m.o. ○​ Vitaminas: -​ Se emplean sobre todo las vitaminas del grupo B. -​ Soportan mal las Tª del autoclave. c)​ Componentes inhibidores: ○​ Indicadores y colorantes: -​ Los indicadores son sust. químicas cuya forma molecular ionizada tiene distinto color a la forma molecular no ionizada, por lo que detectan el cambio de pH. -​ Se emplean en las pruebas de identificación bacteriana. -​ Los colorantes inhiben el crecimiento bacteriano por lo que se emplean para seleccionar. ○​ Antibióticos: -​ Sust. químicas bactericidas o bacteriostáticas. -​ Inhiben el crecimiento de algunas bacterias, creciendo únicamente las que nos interesan. -​ Se emplean en las pruebas bioquímicas de identificación bacteriana y para hacer antibiogramas. d)​ Componentes excepcionales: Se añaden muy pocas veces, generalmente en pruebas muy concretas. ○​ Ácidos nucleicos. ○​ Esteroles. ​ CLASIFICACIÓN: a)​ Según la naturaleza de los componentes: ○​ Naturales: Llevan compuestos orgánicos tal y como están en la naturaleza; por ejemplo: leche, medios de patata, zumo de tomate, etc. ○​ Sintéticos: De composición química conocida. Por ejemplo: medios con aminoácidos. ○​ Semi-sintéticos: Contienen moléculas naturales parcialmente hidrolizadas; por ejemplo, los que llevan peptonas. b)​ Según es estado físico: ○​ Líquidos: Los m.o. crecen en todas las direcciones, enturbiando el medio. ○​ Sólidos: Resultan de añadir a los líquidos sust. solidificantes como el agar o la gelatina. Los m.o. crecen en colonias. ○​ Semisólidos: Contienen 0,1% de agar. Son sólidos pero muy blandos. Se suelen utilizar para ver la movilidad de los gérmenes. c)​ Según la preparación: ○​ Preparados a partir de los componentes de las fórmulas: Resulta más didáctico, pues se ven todos los pasos de la técnica de fabricación de los medios de cultivo. ○​ Hidratando los medios comerciales liofilizados: Son los medios más adecuados en la docencia por su relación coste-tiempo. ○​ Adquiriendo los medios preparados y esterilizados: La utilización debe ser inmediata ya que la caducidad es a muy corto plazo. Resultan muy caros. d)​ Según su utilización: ○​ Generales o comunes: Son medios de tipo general. Crece la gran mayoría de los m.o. Ejemplo: agar común, caldo nutritivo... ○​ Enriquecidos: Son medios a los que se les añade una serie de sust. que m.o. necesitan para su desarrollo, especialmente los gérmenes patógenos. Se suele añadir: sangre, suero, vit.... Ejemplo: agar sangre, agar chocolate... ○​ Enriquecimiento o electivos: Medios con sust. que favorecen el desarrollo de un germen e inhiben el de otros. Ejemplo: caldo selenito, caldo verde brillante... ○​ Diferenciales: Permiten el crecimiento de un grupo de bacterias solamente. Ejemplo: medio McConkey por su contenido en sales biliares sólo crecen enterobacterias. ○​ Selectivos: Permiten el crecimiento de un tipo (género) de bacterias. Ejemplo: medio SS (Salmonella-Shigella), medio Chapman... ○​ Identificación: Contienen alguna o algunas sust. que empleamos en pruebas bioquímicas (agar Kliguer) ○​ Especiales: Medios empleados con fines específicos, utilizado en la realización de antibiogramas (medio Mueller-Hinton). e)​ Según la presentación: ○​ Líquidos: Se emplean normalmente para enriquecimiento o identificación. El recipiente que los contenga puede ser: -​ Frasco o botella: Empleado cuando se desean condiciones especiales de incubación. Se siembra con pipeta Pasteur o jeringa. -​ Tubo: Todo el medio es aeróbico debido a las corrientes de convección. Se pueden sembrar distintos volúmenes de muestras. ○​ Semisólidos: Se presentan en tubo y se emplean para observar la motilidad del m.o. tras la siembra en picadura. ○​ Sólidos: Pueden estar contenidos en: -​ Frasco o botella: Muy poco utilizados. -​ Tubo recto: Utilizado para siembras en picaduras o para fundir. -​ Tubo inclinado: Se emplea, sobre todo, para la identificación, obtención de masa de m.o. y almacenamiento. Se contamina y deseca menos que la placa de Petri. El fondo es anaeróbico y la superficie inclinada aeróbica. -​ Placa de Petri: Se ven perfectamente las colonias y se puede realizar mejor que en tubo la toma de una sola colonia. Sufre más desecación. Todo el medio es aeróbico. ​ PREPARACIÓN: Procedimiento general en la preparación de los medios de cultivo. ○​ Elegir los ingredientes: Únicamente cuando se elabora un medio de cultivo a partir de los elementos que lo componen. ○​ Pesada: Debe realizarse cuidadosamente, ingredientes o medio deshidratado comercial. ○​ Hidratación: El agua en la reconstitución debe ser destilada y calentada previamente a 50-60º C. -​ Vaso de precipitados poner agua, se añaden los ingredientes o medio, homogeneizando con varilla agitadora y manteniendo el calor. -​ Medios líquidos, no necesitan llegar a la ebullición en su preparación, los medios con agar deben llevarse a ebullición, precisan Tª de 98-100º C para disolverse. -​ Preparación de medios sólidos, antes de iniciar el calentamiento se dejen reposar durante 5-10 min. ○​ Ajuste del Ph: Imprescindible cuando se parte de los ingredientes por separado. -​ Preparados comerciales deshidratados no suelen necesitar este ajuste. -​ Se mide el pH con papel indicador o pHmetro. ○​ Distribución: Se distribuirá en recipientes que permitan una buena esterilización y, que sean los definitivos para llevar a cabo el cultivo. Se emplean 2 posibilidades: -​ Medios en tubo. -​ Medios en placa. ○​ Esterilización: Excepto para medios de gran termolabilidad, se lleva a cabo en la autoclave. ○​ Vertido en placas: Se extrae del autoclave, el volumen del medio de cultivo se vierte en una placa petri. ○​ Enfriamiento: Se dejará enfriar a temperatura ambiente antes de introducir en el frigorífico. ​ TÉCNICAS DE SIEMBRA Y OBJETOS: ○​ Siembra en caldo: (observar crecimiento y obtener respuestas bioquímicas). ○​ Siembra en agar semisólido: (con hilo de platino) (observar movilidad). ○​ Siembra en agar inclinado: -​ En superficie (con asa de platino) (obtener masa de crecimiento y obtener respuestas bioquímicas). -​ En picadura y superficie (con hilo de platino) (observar crecimiento en condiciones de anaerobiosis y aerobiosis). ○​ Siembra en placa por estría (aislar colonias). ○​ Siembra en placa por dilución (hacer recuentos).