Oxidaciones Biológicas PDF | Apuntes de Clase

OXIDACIONES BIOLÓGICAS GENERALIDADES Hay 4 formas de transferir electrones y energía entre moléculas: 1) Como electrón directamente (ej. oxidación de Fe+2 por Cu+2) 2) Como átomos de H (FADH2) 3) Como ión hidruro (ej. en las deshidrogenasas NAD+ dependientes) 4) En una rea...

OXIDACIONES BIOLÓGICAS GENERALIDADES Hay 4 formas de transferir electrones y energía entre moléculas: 1) Como electrón directamente (ej. oxidación de Fe+2 por Cu+2) 2) Como átomos de H (FADH2) 3) Como ión hidruro (ej. en las deshidrogenasas NAD+ dependientes) 4) En una reacción con el O2. *Cuanto más reducida es una molécula, mayor es la energía que tiene acumulada en sus enlaces covalentes. TIPOS DE PROCESOS OXIDATIVOS 1) CADENA RESPIRATORIA Se descompone en la mitocondria el combustible que llega a la célula, empleando O2 y generando ATP. Los residuos de este tipo de respiración son el CO2 y el H2O. Los procesos oxidativos tanto de glúcidos, lípidos o proteínas, convergen en esta etapa final del catabolismo, donde se transfieren los electrones en equivalentes de reducción como el NADH + H+ y el FADH2 (reducidos), que son entregados a una serie de transportadores electrónicos que es un complejo multienzimático que va transfiriendo estos electrones en reacciones redox acopladas, de tal manera que accionan bombas de protones que generan un gradiente de protones. El aceptor final que se reduce es el Oxígeno, que se reduce a H2O. Esta energía libre se emplea para unir el ADP con el Pi en el proceso de la fosforilación oxidativa en la síntesis de ATP. Se acopla la cadena respiratoria con la fosforilación oxidativa. Estos procesos de la cadena respiratoria ocurren en los eucariotas en la membrana mitocondrial interna, o en bacterias en la membrana plasmática.  2) CADENA DE TRANSPORTE MICROSOMAL Microsomal: cuando se aísla por centrifugación a las membranas del retículo endoplásmico. El transporte de electrones se usa para oxidar moléculas por inserción de Oxígeno. En este caso el sustrato queda oxidado. Se emplea para la detoxificación de contaminantes y la desaturación de ácidos grasos 3) BIOLUMINISCENCIA Hay un gran cambio en la energía libre de una molécula que se excita a un estado activado, y este cambio de energía tiene que ser suficientemente grande (40-60 kcal) como para que cuando la molécula vuelva al estado normal, emita luz visible. En bacterias, insectos, hongos, etc. 4) FASE LUMÍNICA DE LA FOTOSÍNTESIS Se oxida el agua a oxígeno con NADP+ como aceptor electrónico. Este proceso depende de la luz. Con la energía que se toma de la luz hay un transporte electrónico que activa bombas de protones que genera un gradiente de protones, que finalmente estos electrones terminan siendo aceptados por el NADP+ que se reduce a NADPH. Estos electrones que se sacaron del agua terminan oxidando a oxígeno, y finalmente el poder reductor, junto con el ATP, se utilizan en el ciclo de fijación del carbono para generar metabolitos, entre ellos, azúcares. Tanto la fosforilación oxidativa mitocondrial, como la fotofosforilación en la fotosíntesis, ocurren por mecanismos similares que se basan en la Teoría Quimiosmótica, que postula que las diferencias transmembrana de concentraciones de protones (el gradiente de H+) es una forma de acumular energía libre en que va a ser el impulsor de la síntesis de ATP. RESPIRACIÓN CELULAR En la respiración, la oxidación es más completa con oxígeno, por lo que libera mucha más energía libre de la glucosa en comparación con su fermentación. Consecuencias: Un organismo que no usa oxígeno no podrá tener un tamaño grande. El Oxígeno es “nuevo” en nuestro planeta, impulsó la evolución de la multicelularidad. ¿Por qué no entregar directamente los electrones al oxígeno? Esto ocurre en la combustión y la liberación de energía es enorme, pero es una reacción explosiva. Esta reacción no tiene control. En cambio,en una célula, mediante la respiración celular, la energía libre se va liberando en etapas y de forma controlada. RESUMEN RESPIRACIÓN CELULAR TRANSPORTE DE ELECTRONES EN LA MITOCONDRIA La mitocondria tiene una doble membrana, entre ambas un espacio intermembrana, y en el interior la matriz mitocondrial. Están en número variable, 1 en espermatozoide y de cientos a miles en ovocito. La membrana interna está compuesta por más del 70% de proteínas (todos los complejos para transformar energía) + transportadores de moléculas hacia/desde la matriz. Para generar ATP en la mitocondria se produce un gradiente de protones por acción de bombas de protones, y estos gradientes impulsan la síntesis de ATP cuando los protones fluyen a través de la ATP sintasa, a favor del gradiente. El bombeo de protones hace que haya un medio más ácido del lado exterior. Oxidación de compuestos de 1C en organismos aeróbicos *Cuanto más reducido esté el carbono, más energía libre se libera por su oxidación. La cadena de transporte mitocondrial tiene 5 tipos de transportadores electrónicos Cada una de las reacciones redox que ocurren en el transporte de electrones se dan espontáneamente, es decir que los transportadores se ordenan en la membrana de acuerdo a los valores de sus potenciales de óxido-reducción. 5 tipos: 1) Nucleótidos de nicotinamida (NAD y NADP) que son coenzimas de deshidrogenasas. Transporta hidruros. Tienen nicotinamida en su estructura. Son transportadores de electrones solubles en medio acuoso. Se ubican en la mitocondria y en el citoplasma. En la mitocondria predomina el NAD y en el citoplasma el NADP. Son coenzimas porque se unen reversiblemente a las enzimas. El NAD mitocondrial está separado del NADP citosólico porque la membrana mitocondrial es impermeable (por esto se necesita el sistema de lanzadera). 2) Flavinas (FAD y FMN - flavín mononucleótido) que son grupos prostéticos de deshidrogenasas, de las flavoproteínas. Transportan átomos de H, que a diferencia de las deshidrogenasas ligadas al NAD, en este caso pueden aceptar 1 sólo hidrógeno, teniendo una forma de semiquinona, y el segundo hidrógeno quedando totalmente reducido (En NAD los 2 hidrógenos ingresan juntos). Existen muchas DH que emplean las flavinas. En la mitocondria hay 3 grupos: NADH-DH que forman complejos con flavin mononucleótidos y ferrosulfoproteínas. Estos complejos son transmembrana. Succinato DH que se encarga de oxidar el succinato en fumarato generando FAD reducido. También se encuentra en la membrana mitocondrial interna, y es un complejo transmembrana. Glicerol 3-P DH se oxida a dihidroxiacetona fosfato. Se encuentran en la membrana mitocondrial interna pero de la cara externa de la membrana. Utilizan FAD como grupo prostético. Este complejo enzimático contiene en su interior ferrosulfoproteínas. 3) Moléculas liposolubles simples: Coenzima Q = Ubiquinona. Transporta hidrógenos. Es una molécula lipofílica ubicada en la membrana mitocondrial interna, pero en el interior de la membrana, en la región hidrofóbica porque es soluble en lípidos por su baja polaridad. Es una parabenzoquinona que tiene una cadena de isopreno lateral de un largo variable (6 en bacterias y hasta 10 en mamíferos). Puede aceptar 1 H pasando a una semiquinona (parcialmente reducida) o completamente reducida como ubiquinona (con los 2 H).  4) Centros hierro-azufre formando parte de proteínas ferrosulfuradas. Son proteínas que intervienen en reacciones redox y tienen hierro férrico/ferroso que está formando un complejo en el núcleo con azufre. Tienen de 2 a 8 átomos de Fe siempre asociados al azufre, que forma parte del aminoácido cisteína. Están asociados a flavoproteínas o independientes. Transportan electrones. 5) Citocromos (proteínas con grupo prostético hemo). En la mitocondria hay 3 tipos de estas hemoproteínas que contienen citocromos b, C y A. Se clasifican según sus máximos de absorción espectral, y tienen subclases de acuerdo a diferencias en los espectros y diferencias de potencial redox. Los citocromos que tienen el hemo A son parte del “complejo 4”, y es la oxidasa terminal que es la que finalmente va a terminar entregando los electrones al oxígeno. Hay 2 subtipos: A y A3 (que son grupos prostéticos de esta oxidasa). Cerca del grupo un hemo, se ubica un ion cobre que participa activamente en el transporte de electrones hacia el oxígeno. En esta oxidasa terminal es donde se consume el cerca del 95% del O2 de los eucariotas. El citocromo C es soluble en los fosfolípidos y se mueve en la membrana mitocondrial interna. La subunidad 1 de la Citocromo C oxidasa (COI) se emplea para analizar la biodiversidad (código de barras del ADN mitocondrial para diferenciar especies). RESUMEN CADENA DE TRANSPORTADORES DE ELECTRONES Durante la respiración celular de la glucosa, la célula oxida generando un total de 32 ATP. La mayoría se genera en la mitocondria, durante la última fase de la respiración en la cual hay un transporte de electrones y ocurre la síntesis de ATP. En la membrana interna de la mitocondria, se ubican la cadena de transporte electrónica y un complejo de síntesis de ATP. En el espacio intermembrana hay protones que se bombean desde la matriz mitocondrial. El NAD y FAD reducido son los que alimentan la cadena. Los componentes de la cadena se ordenan según su potencial redox. Cuando el NAD entrega sus hidruros, estos quedan en el complejo, y el NAD queda oxidado para ser reutilizado como coenzima en el citoplasma. El aceptor es la NADH-Q reductasa, que emplea parte de los electrones para bombear protones al espacio intermembrana. Pasan luego los electrones a la Ubiquinona y esta a su vez se lo entrega al complejo citocromo C reductasa, que emplea la energía de los electrones para bombear protones al espacio intermembrana (reacción redox). Los electrones son utilizados para reducir al citocromo C quien luego es oxidado por la enzima citocromo C oxidasa que emplea estos electrones para nuevamente bombear protones al espacio intermembrana. Esta citocromo C oxidasa, con estos electrones que tienen baja energía, son aceptados por el oxígeno que junto con protones, se reduce a agua. Esto hace que se genere un gradiente de protones acumulados en el espacio intermembrana como un gradiente electroquímico (energía potencial). Esta energía libre que se liberó luego se emplea para la síntesis de ATP. Los protones pueden pasar a través de la membrana interna sólo a través de canales. Uno de ellos es la ATP sintasa que se utiliza para la síntesis de ATP. OXIDACIONES BIOLÓGICAS TRANSPORTE DE ELECTRONES MITOCONDRIAL Al fluir, los electrones van liberando su energía.Los electrones se transfieren desde el NAD hasta el O2 a través de 3 grandes complejos proteicos. La energía libre que se libera se emplea para generar un gradiente de protones. Energética de la energía liberada en el transporte y conservada en ATP Esquema del transporte ubicándolos de acuerdo a sus potenciales de reducción estándar, desde el par más electronegativo NADH al par más electropositivo que es el del O2 al agua. El potencial electroquímico se puede convertir en valores de energía libre de Gibbs. Esta diferencia en la energía electroquímica entre los pares de electrones se traduce en un delta G de -52,7 Kcal. Hay 3 saltos energéticos importantes en la cadena de transporte. En estos 3 sitios, la energía libre generada es suficiente para la síntesis de 3 ATP. Para determinar la secuencia en la cual estaban ubicados los transportadores de electrones, se emplearon inhibidores enzimáticos. Uno de ellos es la rotenona que inhibe el complejo I. Es una sustancia ictiotóxica en muchas poblaciones del Amazonas, la extraen de las raíces de una planta que se utiliza para matar a los peces. Al bloquear este primer paso, evita que el NADH entregue sus electrones al complejo, por lo que todos los componentes luego de la rotenona van a estar oxidados (rosa), y el NADH va a quedar reducido (celeste). Otro inhibidor es la antimicina A que bloquea el complejo III, y de esa manera los componentes de la cadena: NADH, coenzima Q y citocromo b, van a quedar reducidos. Lo que hace es impedir que los electrones lleguen al O2 y reducir mucho el bombeo de protones en la cadena transportadora, por lo que disminuye mucho la cantidad de ATP que se produce en la mitocondria. El tercer grupo de inhibidores son el CN o CO, son los que inhiben el complejo de la Citocromo oxidasa. Bloquean la cadena transportadora al final, impiden el pasaje de electrones al O2, por lo cual todos los componentes anteriores están todos reducidos. El CN se presenta naturalmente en muchas plantas y es utilizado por muchos animales que se adaptaron a consumir el cianuro en una forma precursora llamada glicósidos cianogénicos que es un azúcar unido al precursor del cianuro, de tal manera que cuando la planta es lastimada, estos glicósidos se descomponen y liberan el cianuro, afectando la cadena respiratoria y la liberación de energía, siendo muy tóxico para los herbívoros. Sin embargo, algunos insectos se han especializado, encontrando un mecanismo de defensa frente a este tóxico, o lo reutilizan para su propio beneficio secuestrando el glicósido ( Cianogénesis en mariposas del género Heliconius - mariposa almendra - color de advertencia). Coevolución defensas artrópodo - planta: bloquear con cianuro la citocromo C oxidasa “CICLO Q” de transferencia de electrones y protones Tiene lugar en el complejo III de la cadena y está mediado por la coenzima Q que está como ubiquinol reducida y entrega un par de electrones y protones al complejo. El problema es que el citocromo C que es el aceptor, solo acepta de a 1 electrón y el ubiquinol cede 2 electrones. Entonces ocurre un ciclo de 2 etapas: en la primera, 1 electrón va a parar al citocromo C a través de un complejo ferrosulfurado (complejo de risque) y el otro electrón se entrega a los citocromos B y finalmente se emplea para reducir parcialmente a una ubiquinona que se reduce a semiquinona. En la segunda etapa, una ubiquinona como ubiquinol (completamente reducida) se une al complejo III y nuevamente cede un par de electrones, de los cuales uno va al citocromo C y el otro hace el mismo ciclo, va al citocromo b y se entrega a la semiquinona que estaba reducida y se reduce completamente a ubiquinol. Entonces en el ciclo se bombean 2 protones por vez, 4 en total; 2 electrones siguen su camino al citocromo C y los otros dos se utilizaron para reducir la ubiquinona en ubiquinol. NETO: 4 protones y 2 electrones. CADENA RESPIRATORIA Transporte de protones al exterior: - Complejo I: no se sabe bien cómo: 4H+ - Complejo III: canal de H+: 4H+ - Complejo IV:protonación / desprotonación: 2H+ En la mitocondria se da el bombeo de protones hacia el espacio intermembrana, que generan una fuerza protón-motriz que está dada por 2 componentes: el gradiente electroquímico (gradiente de cargas) y por otra parte un gradiente químico de concentración de protones de un lado y del otro. Este gradiente se disipa a través de un canal protónico que forma parte de la ATP - sintasa para formar ATP. ANIMACIÓN COMPLEJOS Los complejos I, III y IV bombean protones directamente desde la matriz al espacio intermembrana. El II no lo hace directamente, pero sí promueve el bombeo de protones en los otros complejos. El bombeo de protones requiere energía y los complejos la obtienen al transferir electrones a través de una serie de reacciones acopladas. Por esto se conoce como “cadena transportadora de electrones”. En el complejo I, un producto derivado del metabolismo de los glúcidos (NADH) deposita 2 electrones de alta energía en el complejo I donde pasan a través de una cadena de centros redox. Estos son un grupo de átomos que tienen diferente afinidad por los electrones, basados en su configuración atómica. Las razones por las que un electrón se mueve desde un centro redox superior a uno inferior son: en primer lugar, el último centro redox tiene una afinidad electrónica que el primero, y el segundo lugar, la distancia entre 2 centros redox adyacentes es la ideal para que ocurra un salto de electrones (por eso no saltean centros redox). Una pequeña cantidad de energía se libera cada vez que un electrón pasa entre 2 centros redox. El complejo I explota esta energía a lo largo de todos los centros redox y la utiliza para bombear protones. El último centro redox dona 2 electrones a una molécula de coenzima Q. El complejo II es similar al I en 2 aspectos: primero, electrones de alta energía también entran al complejo por un producto derivado del metabolismo de glúcidos (FADH2); en segundo lugar, el CII también transporta electrones a través de numerosos centros redox antes de donarlos a la coenzima Q. Sin embargo, una diferencia es que el CII no usa la energía liberada para bombear protones. Las moléculas de coenzima Q provenientes del complejo I y II donan sus electrones al C III. Uno de los electrones es reciclable y puede reingresar al complejo III más adelante. El otro pasa a través de 2 centros redox antes de llegar al citocromo C, el cual transporta el electrón al complejo IV. La cadena de transporte de electrones termina en el Complejo IV donde una serie de reacciones que involucran 4 electrones, convierte 1 molécula de O2 en 2 moléculas de H2O. El gradiente de protones se intensifica porque 4 protones de la matriz son incorporados en moléculas de agua, y otros 4 son bombeados al espacio intermembrana. En ausencia de O2, la transferencia de electrones llega a detenerse, lo que implica que la síntesis de ATP también se detenga. Todos los complejos están densamente empaquetados y juntos logran eficientemente que la totalidad de la superficie de la membrana mitocondrial interna se convierta en una planta de energía celular gigante. TOXICIDAD DEL OXÍGENO REDUCIDO PARCIALMENTE Reducción completa del O2 (4e-) 2H2O Reducción parcial: genera especies reactivas del O2 (ROS). El O2, cuando recibe el primer electrón pasa a un radical superóxido; con un segundo electrón a un peróxido; cuando recibe un tercer electrón se convierte en un radical hidroxilo; y finalmente con el cuarto electrón y con su correspondiente protón, genera la molécula de H2O. Estos 3 radicales son altamente oxidantes y tienen efectos perjudiciales, tanto sobre ácidos nucleicos, proteínas y lípidos. En algunos casos tiene un efecto beneficioso que se utiliza por ejemplo, en la defensa contra el ataque bacteriano ya que hay reacciones que liberan estos radicales libres en grandes cantidades, lo que se llama “explosión respiratoria”, donde hacen funcionar a la cadena muy rápidamente, generando muchos radicales libres que se liberan al ambiente para combatir a las bacterias que estén rodeando estas células. Los radicales libres del O2 (ROS) provocan daño celular - atacar membranas en el retículo endoplásmico, y golgi - daño a proteínas  - daño en el núcleo al ADN - en lípidos provocan la peroxidación lipídica que destruye las membranas y la inestabilización de las membranas pueden provocar un flujo masivo de calcio, que provoca una permeabilidad aumentada, por lo que entra agua y la célula se hincha y muere - daño mitocondrial Hay una teoría que asocia esta presencia aumentada de radicales libres con el envejecimiento de la célula y el organismo en general. *Opuesto a esto: hay unas almejas bentónicas cerca de Islandia (Arctica islandica que vive 220 años), lo que hace es enterrarse en barros anóxicos, disminuye su metabolismo casi al 10% y en ese estado logra que la producción de radicales libres se disminuya muchísimo, y esto se asocia con la enorme longevidad que tiene. MECANISMOS DE ELIMINACIÓN NATURAL DE LOS RADICALES LIBRES Algunos son mediados por enzimas y otros por sustancias antioxidantes: ❖ ENZIMÁTICOS a) Superóxido dismutasa: toma 2 radicales superóxidos y los convierte a 1 peróxido y 1 molécula de O2 b) Catalasa: el peróxido puede ser posteriormente degradado por una peroxidasa, como la catalasa que a 2 moléculas de peróxido de hidrógeno las cataliza en 2 H2O + 1O2. c) Peroxidasas: tienen porfirinas en su estructura y son capaces de provocar la peroxidación de estas moléculas, a agua y la sustancia oxidada. El glutatión peroxidasa es una peroxidasa muy común en la células, que toma 2 moléculas de glutatión que tienen las sulfidrilos de la cisteína expuestos, y en presencia del peróxido, lo convierten en su forma oxidada formando un puente cistina, y esos electrones se utilizan para terminar de reducir el peróxido a 2 moléculas de agua. d) Peroxidación lipídica: detiene la reacción en cadena de la peroxidación lipídica, generando un alcohol graso, agua y el glutatión oxidado. ❖ NO ENZIMÁTICOS: ANTIOXIDANTES  Eliminan radicales libres Reducen compuestos oxidados a) Glutatión b) Ácido ascórbico (Vitamina C), antioxidante soluble en agua c) Ácido úrico d) alfa-Tocoferol (Vitamina E), antioxidante de fase lipídica e) Astaxantina, carotenoide que funciona como antioxidante (500 veces más potente que la vitamina E como antioxidante). SISTEMAS DE LANZADERA (INGRESO DE ELECTRONES) Ingreso del NADH citosólico para su oxidación: LANZADERAS En la glucólisis se generan cantidades de NADH en el citoplasma que, como la membrana es impermeable a este NADH, necesita transferir los equivalentes de reducción a la cadena transportadora, y para eso existen 2 sistemas de lanzaderas: 1) Lanzadera del Glicerol-3P (el más primitivo) La dihidroxiacetona fosfato acepta un equivalente de reducción del NADH, entonces la glicerol 3 fosfato DH citoplasmática (isoenzima) se reduce a glicerol 3-P, y este interactúa en el espacio intermembrana con otra isoenzima que en este caso está unida a la cara externa de la membrana mitocondrial interna, y lo que hace es catalizar la reoxidación del glicerol 3-P a dihidroxiacetona fosfato, y los electrones se transfieren al FAD que se reduce, y finalmente el FADH2 los entrega a la ubiquinona generando ubiquinol que ingresa al complejo III. En este caso, el NADH estaría entregando los electrones indirectamente a través de este sistema de lanzadera, al complejo III a través de la ubiquinona. En este caso, como en el complejo III hay menos protones que se bombean, esto da como resultado una cantidad de ATP de alrededor de 1,5 moléculas de ATP por cada par de electrones que ingresan por esta lanzadera.  2) Lanzadera del Malato-aspartato Es la más activa en riñón, hígado y corazón. Los equivalentes de reducción del NAD se transfieren en primer lugar a un oxalacetato del lado citoplásmico, que se reduce a malato por una deshidrogenasa del citoplasma, y este malato ingresa por un transportador al interior de la mitocondria, por un sistema de transporte (malato alfacetoglutarato). Y dentro de la matriz, estos equivalentes de reducción pasan por otra isoenzima de la malato DH pero del lado mitocondrial, que lo reoxidan a oxalacetato, y de esta manera, el NAD es el aceptor de este par de electrones que se reduce a NADH y de esta manera puede ingresar directamente a la cadena respiratoria por el complejo I. Por lo cual, cuando este par de electrones llega hasta el O2, se bombea una cantidad de protones que generan una energía libre suficiente para sintetizar aproximadamente 2,5 moléculas de ATP. OXIDACIONES BIOLÓGICAS FOSFORILACIÓN OXIDATIVA El origen evolutivo común de la maquinaria de conversión de energía en mitocondrias, cloroplastos, Archaea y Bacteria se refleja en el mecanismo que comparten para aprovechar la energía. Esto se conoce como Acoplamiento Quimiosmótico. Ocurre en 2 etapas: La primera etapa vincula las reacciones químicas que generan ATP (“quimio”) y los procesos de transporte de membrana y bombeo de protones (“aspecto osmótico”). En esta etapa, la energía de la luz del sol o la capturada en la oxidación de los compuestos de alimentos, genera un gradiente de protones (gradiente electroquímico). En una segunda etapa, complejo llamado ATP sintasa (proteína transmembrana), que se ubica en la bicapa lipídica, aprovecha este gradiente electroquímico de los protones como un depósito de energía libre en la mitocondria para la síntesis. TEORÍA DEL ACOPLAMIENTO QUIMIOSMÓTICO de Mitchel - ¿Cómo se sintetiza? La síntesis no favorable de ATP se acopla al transporte favorable de H+ desde el espacio intermembrana hasta la matriz. La respiración controla indirectamente la síntesis de ATP. Es decir, el transporte espontáneo de electrones a través de los complejos se acopla al pasaje no favorable de H+ hacia afuera formando un gradiente electroquímico. FOSFORILACIÓN OXIDATIVA: SÍNTESIS DE ATP Se puede medir, midiendo la eficiencia de la fosforilación: relación entre el P incorporado en ATP y el O consumido en la cadena (P/O). Aproximadamente se considera que: se requiere bombear 4 H+ para sintetizar 1 ATP si asumimos un bombeo total de 6-10 H+ protones por par de electrones:  ○ se forman 2,5 ATP por cada par de e- del NADH ○ se forman 1,5 ATP por cada par de e- del FADH (succinato) Conclusión: los complejos I, III y IV impulsan la síntesis de ATP. El complejo II (Succinato DH) no lo hace. Complejo V = ATP sintasa = Fo-F1 = ATPasa Los protones que pasan por el canal Fo (canal transmembrana) provocan la síntesis de ATP. Este complejo se ubica en las crestas de la membrana mitocondrial interna. Está formada por 2 subcomplejos: 1) F1: proteínas periféricas: subunidad catalítica 2) Fo: proteínas integrales de membrana: realizan el transporte de H+ (“o” porque es sensible a la oligomicina) Complejo V = ATP sintasa: enzima para la síntesis de ATP Experimentos de confirmación del papel del complejo: 1) Reconstitución mitocondrial 2) Racker fabrica partículas que sintetizan ATP y respiran 3) La eliminación de F1 (con urea): PSM NO sintetizan ATP pero respiran 4) Liposomas de fosfolípidos combinando complejos y Fo-F1 sintetizan ATP 5) Se purifica el complejo enzimático Se toma una mitocondria, se aísla por centrifugación. Si a una mitocondria le agregamos energía en forma de ultrasonido, se rompen las membranas y espontáneamente se forman partículas “submitocondriales” que espontáneamente se resellan pero dadas vuelta, con la cara interna hacia afuera, por lo que estas proyecciones F1 quedan hacia afuera. Lo que se vio fue que si eliminaban este complejo F1 con urea que rompe las uniones no covalentes, y se separaba, las partículas que quedaban no eran capaces de sintetizar ATP pero si eran capaces de respirar, es decir que la cadena transportadora de electrones quedó intacta. Además, el F1 aislado hidrolizaba ATP, por lo cual la función ATPasa del sitio confirmaba que era el sitio catalítico. Otra cosa que se pudo ver es que si se eliminaba la fracción Fo, la membrana cambiaba su permeabilidad a los protones, por lo cual se infería que Fo era un canal de protones. Por otra parte, se fabricaron membranas artificiales liposomas de fosfolípidos combinando complejos y Fo-F1, y se generó una membrana capaz de sintetizar ATP en condiciones de laboratorio. Todo esto sugería que la ATP sintasa era el complejo donde se sintetizaba el ATP en la mitocondria. Evidencia experimental del acoplamiento quimiosmótico: 1) Las membranas pueden establecer un gradiente de H+. Se pudo medir la diferencia de un lado y del otro de la membrana interna, que llegó a ser de 1 unidad de pH (10 veces más de un lado que del otro), demostrando la existencia de un gradiente electroquímico, y en teoría, cada 2 electrones se bombearían 2 H+. Pero no es así. 2) Se necesita la membrana intacta. Si la membrana por algún motivo se alteraba, se disipaba el gradiente (queda impermeable a los protones). 3) Las proteínas de las bombas de protones deben ser proteínas integrales (transmembrana) de la membrana mitocondrial interna. 4) Desacoplantes. Se vió que si uno aumentaba la permeabilidad de la membrana con compuestos llamados desacoplantes, se impedía la síntesis del ATP. 1, 2 y 3) Cualquier gradiente de H + genera ATP aún sin transporte de electrones. Para hacer esto, aprovecharon el conocimiento de una bacteria que tenía una proteína llamada bacteriorrodopsina, que permite en presencia de luz, bombear protones de un lado al otro de la membrana de la bacteria. Lo que se hizo fue agregar detergente, fosfolípidos, la bacteriorodopsina y la ATP sintasa purificada. Se mezcló todo y se generó un liposoma donde quedaba incorporada en la membrana la ATP sintasa y la bacteriorodopsina. Entonces se veía que, cuando se agregaba luz al sistema, la luz funcionaba como una energía que permitía el bombeo de la bacteriorodopsina, aumentaba la concentración de protones en el interior y esto hacía que la ATPasa sintetizara ATP si se agregaba ADP y P. 4) Desacoplamiento de la fosforilación oxidativa. Dentro de los compuestos desacoplantes sintéticos tenemos: Ácidos débiles liposolubles (a pH alcalino el H+ se disocia del grupo OH) disipan el gradiente.A pH ácido están protonados y al ser liposolubles atraviesan la membrana, y a pH alcalino, liberan el protón. Ej: 2,4- DiNitroFenol, transporta protones de un lado al otro de la membrana y de esa manera disipa el gradiente. Posteriormente se pudo analizar la estructura de la ATP sintasa: Está formada por las 2 subunidades Fo y F1, la F1 está formada por varias subunidades que son un hexámero de 3 subunidades alfa y 3 beta, que están unidos a la Fo por una varilla con una subunidad gamma, y sostenido por subunidades delta a la Fo. La unidad Fo tiene muchas proteínas integrales de membrana. Entre ellas forman un cilindro. Las subunidades C varían dependiendo la especie de 9 a 12 y según el organoide. Fuerza protón-motriz: energía libre del gradiente de H+ La energía libre o potencial almacenada en el gradiente de protones. Tiene 2 componentes: por un lado una variación de carga eléctrica; y por otra parte, un gradiente químico debido al gradiente de pH del lado intermembrana al lado interno. Esta fuerza protón-motriz, es la combinación de la diferencia del potencial y la diferencia de concentración de protones. La estructura de las ATP sintasas está muy conservada evolutivamente La ATP sintasa tendría el motor Fo: el motor más pequeño que existe. Evolucionó hace unos 2.500 Ma. Los motores eléctricos son dispositivos que transforman la energía eléctrica en energía mecánica por medio de la acción de los campos magnéticos generados en sus bobinas. Son máquinas eléctricas rotatorias compuestas por un estator y un rotor. En el caso del motor protónico de la mitocondria, es la única enzima conocida capaz de transformar energía electroquímica en energía química (ATP), a través del siguiente mecanismo: Los protones circulan por el canal y el campo electromagnético hace rotar al rotor, que mueve el eje *La ATP sintasa, como cualquier enzima, puede trabajar en ambos sentidos, si la concentración de ATP es elevada y el gradiente de protones es bajo, la ATP sintasa funcionará en sentido contrario al habitual, de manera que hidrolizará ATP mientras bombea protones a través de la membrana. Otra evidencia experimental: Por medio de técnicas de ingeniería genética, por un lado, unieron con unas colas de histidina a una placa que tenía níquel (que se une a la histidina fuertemente), fijando las subunidades que catalizaban la síntesis de ATP. En este caso, lo que hicieron es dejar estas subunidades y al filamento gamma lo unieron a filamentos de actina, y a la actina le unieron proteína GFP fluorescente, de tal manera que invirtieron el funcionamiento de la enzima, haciéndola funcionar como una ATPasa. El ATP era catalizado en las subunidades beta, y al catalizar cambiaba la conformación y hacía rotar la varilla gamma, y al rotar esta varilla, rotaba el filamento de actina, y se veía que la rotación era por pasos (cada vez rotaba 120°, es decir que daba una vuelta completa en 3 pasos). Top-down view of F1 - cambios conformacionales durante la síntesis de ATP La subunidad beta 1 está en una conformación abierta que recibe al ADP + Pi y hace rotar al eje gamma 120° (gracias al flujo de protones), cambiando la conformación y pasa a un estadío low L de baja afinidad por el ADP y Pi, y cuando vuelve a girar, pasa a un estado tenso T donde fuerza al ADP y al P para que se sintetice el ATP. Luego vuelve a la posición abierta que se abre permitiendo al ATP liberarse. Este último paso no requiere energía, permitiendo que vuelva a ingresar ADP + P. Esto se repite para cada una de las 3 subunidades. El ATP se sintetiza por catálisis rotacional Este proceso de síntesis de ATP en 3 cambios conformacionales del complejo Fo-F1 permite que vaya cambiando la estructura de los 3 sitios catalíticos. TRANSPORTADORES DEL ATP FUERA DE LA MITOCONDRIA Hay transportadores de membran que llevan el ADP + Pi a la matriz, y el ATP recién sintetizado al citosol. La translocasa de los nucleótidos de alanina es un antiporter ya que la misma proteína mueve el ADP hacia la matriz, al mismo tiempo que el ATP hacia afuera. El efecto de reemplazar el ATP con 4 cargas negativas por ADP con 3 cargas en la matriz, provoca un flujo neto de carga negativa, que se ve favorecido por la diferencia de carga a través de la membrana ya que es positiva en el exterior. Por otro lado, el otro symporter es la fosfato translocasa que es específica para el fosfato diácido. La concentración de protones baja en la matriz, en este caso, favorece el movimiento hacia adentro de los protones. Entonces, la fuerza protón-motriz es la responsable tanto de proporcionar la energía para la síntesis del ATP como para el transporte de los grupos fosfatos hacia el interior de la matriz, y la salida del ATP hacia el citoplasma. Estos 2 tipos de transportadores se ubican cerca del complejo F0-F1 de la ATP sintasa. CONSERVACIÓN DE LA ENERGÍA EN ATP La estequiometría no es fácil de calcular ni exacta en cuanto a la cantidad de protones que se necesita para generar moléculas de ATP. Más o menos se bombean 10 protones hacia el exterior en el complejo I, III y IV. Los protones que se necesitan para sintetizar el ATP son 4. Entonces, depende del potencial redox que tenga el par electrónico que se transporta (si viene del NAD alcanza como para bombear 10 protones y conservar esa energía en más o menos 2,5 ATP; y si viene del FADH2 más o menos se generan 1,5 ATP de 6 protones). Además, hay que sumar la cantidad de protones que se gastan para sacar el ATP, para ingresar el fosfato y otros usos del gradiente electroquímico. RESUMEN METABOLISMO ENERGÉTICO DE LA MITOCONDRIA REGULACIÓN DE LA RESPIRACIÓN Y FOSFORILACIÓN OXIDATIVA 1) Control del estado de respiración por ADP. La fosforilación solo ocurre si hay suficiente cantidad de sustrato (ADP). No existe ningún tipo de control alostérico. Si bien el ADP es el más limitante, según la situación metabólica, los otros compuestos también pueden ser importantes (fosfato, oxígeno, NADH o FADH2). Existe una interdependencia, no solo el ATP se forma si existe un flujo electrónico hacia el O2 en la mitocondria, sino también el flujo normal sólo ocurre cuando la mitocondria está sintetizando ATP. A esto se lo denomina control respiratorio.  2) Control por carga energética (CE). Según las necesidades energéticas de la célula, la célula va a aumentar o detener la respiración (oxidación de compuestos) y la fosforilación acoplada. En este caso, existe una relación de las concentraciones celulares de los siguientes compuestos: Entonces, si la carga energética es baja, quiere decir que hay mucho AMP y poco ATP. Esto estimula la producción de energía. Y una carga energética alta, es decir mucho ATP y poco AMP, estimula la disminución de energía. La carga energética tiene un gran efecto sobre la estructura de la mitocondria, de tal manera que la matriz queda grande o relajada o condensada dependiendo de la carga energética de la célula. *Ejemplo: La respiración aeróbica no es obligatoria en todos los eucariotas Se encontró en 2020 un cnidario parásito del salmón (Myxozoa) que carece de genoma mitocondrial y por lo tanto tiene un montón de los componentes clave de la respiración aeróbica que están ausentes. Tienen un ciclo de vida complejo que requiere 2 hospedadores: un pez y un anélido. OXIDACIONES BIOLÓGICAS OTROS USOS DE LA ENERGÍA LIBRE DEL GRADIENTE DE H+ 1) Transporte activo de iones ATP, ADP, P, piruvato, Ca++  2) Producir calor: termogenina (proteína desacoplante del gradiente electroquímico) Ej: pez espada (Xiphias) tiene una adaptación bioquímica llamada “endotermia parcial”, es decir que son capaces de generar calor metabólico pero en unos pocos órganos. En particular, rodeando el cerebro y los ojos tienen un órgano llamado “órgano calentador” que puede aumentar unos 13° por encima de la temperatura con respecto a la del agua que lo circunda. Esto lo logran gracias a una porción del tejido muscular que se modifica en este órgano (miocitos modificados). Son una masa de tejido rojo intenso y estas células musculares no tienen miofibrillas y este color está dado por la gran cantidad de mioglobina que tienen como depósito de O2 y también de mitocondrias (recordar: cuanto menor es la eficiencia en la conversión de energía, mayor calor se genera). Entonces, como no hay fibras, lo que hace este órgano es tomar sustratos (O2 de la mioglobina) y por todos los procesos de acoplamiento quimiosmótico entre la cadena transportadora y la fosforilación oxidativa, genera grandes cantidades de ATP. Entonces, cuando llega el impulso nervioso a estas células musculares modificadas, la placa motora induce la salida de Ca++ del retículo sarcoplásmico y este Ca++ es reingresado por una bomba de Ca+ + (Calcio ATPasa) con consumo de ATP. Esta bomba es mucho menos eficiente que la bomba de los miocitos normales, de tal forma que existe un ingreso y egreso continuo de calcio y este ciclado de calcio entre el retículo y el citoplasma con esta bomba ineficiente, genera cantidades de calor importantes. Además, evitan la pérdida de todo este calor en el agua fría que circunda, rodeando el cerebro y los ojos con gran cantidad de tejido adiposo.  Acción desacoplante de termogenina: otra forma, en mamíferos, de generar calor es emplear una proteína desacoplante (termogenina) en las mitocondrias, de esa manera, generan calor para proteger órganos vitales de la baja temperatura ambiente. Ej: tejido adiposo marrón (grasa parda en mamíferos hibernantes), el color es debido a la gran cantidad de mitocondrias que tienen mucha cantidad de citocromo que absorben fuertemente la luz en el rango visible. Estas mitocondrias tienen todos los componentes habituales, por lo que pueden bombear los protones al espacio intermembrana, y también tienen ATPasa, pero además tienen la termogenina que brinda un paso al gradiente de protones para que estos vuelvan a ingresar al interior de la matriz, entonces la energía se disipa en forma de calor, y esto hace que este cortocircuito de protones impide que funcione eficientemente la ATPasa. Otro tipo de acción desacoplante en la mitocondria es el que ocurre en plantas de la familia Araceae que les permite generar calor y derretir nieve, atrayendo a polinizadores. Para esto utilizan unas enzimas alternativas que directamente entregan los electrones del NADH pero sin utilizar la NAD DH común, sino otra que es insensible a la rotenona, y que entrega directamente los electrones a la coenzima  Q. También hay una DH que está del lado externo de la membrana mitocondrial interna, que toma electrones del NADH o NADPH y también los entrega a la coenzima Q. Y la Coenzima Q, en vez de entregarlo al complejo III, directamente los entrega a una coenzima Q oxidasa que es resistente al cianuro y que transfiere los electrones directamente al O2. De esta manera se evitan los complejos I, III, y IV, y los electrones van a parar directamente al O2, de tal manera que generan mucho calor que puede llegar a ser entre 20 y 40 más alto que la temperatura ambiente. TRANSPORTE DE ELECTRONES MICROSOMAL Cadena microsomal (retículo endoplasmático liso). Estos microsomas tienen transportadores de electrones, no sintetizan ATP pero si utilizan O2 en reacciones redox, tanto de desaturación de los ácidos grasos para obtener ácidos grasos insaturados y también reacciones de hidroxilación que se utilizan en la síntesis de esteroides, eicosanoides, detoxificación de contaminantes de tipo xenobióticos. Todos tienen en común que la cadena tiene una nicotinamida que cede los electrones (de a pares) a una flavoproteína, y luego 2 citocromos hemoproteína que transportan los electrones de a 1 hasta el aceptor final de electrones. De acuerdo a cómo participa el O2, se agrupan en 3 tipos: a) Oxigenasas, cuando los 2 átomos de O se insertan en el sustrato. b) Hidroxilasas = Oxidasas de función mixta, cuando solamente 1 de los O va a parar al sustrato y el otro se reduce a agua. c) Desaturasas (oxidasa), los 2 O se reducen a 2 agua, no aparecen en el producto. Los electrones se eliminan del sustrato que se oxida. ❖ OXIGENASAS Involucradas en la síntesis del triptófano ❖ HIDROXILASAS el más importante en el microsoma es el que se asocia a una familia de Citocromos, C. P450. La flavoproteína NADPH Cit P450 reductasa acepta  electrones del NADPH y este par de equivalentes de reducción son cedidos de a 1 al Citocromo P450 que los entregan al sustrato y al oxígeno. El sustrato se oxida con el O2 y queda hidroxilado, mientras que otro par de electrones se utiliza para reducir el O2 a H2O. ❖ DESATURASAS de ácidos grasos la cadena transportadora utiliza otro tipo de citocromos, Cit B5 que cede los electrones a la desaturasa que tienen Fe en su estructura. Oxida el sustrato y los 4 electrones van a parar a la reducción de una molécula de O2 a 2 H2O. BIOLUMINISCENCIA en Bacteria, Animalia y Fungi Conversión de energía química en energía luminosa La luz bioluminiscente se produce como resultado de la oxidación de un compuesto emisor de fotones conocido como Luciferina. Esta oxidación está controlada por una enzima llamada Luciferasa (o fotoproteína). Y para controlar la emisión de luz, los organismos tienden a almacenar luciferina y luciferasa por separado o bien mantener la luciferina secuestrada dentro de una proteína hasta que se necesite. Las fotoproteínas permiten el control de la reacción uniendo la luciferina y el O2 por separado, hasta que un cofactor fnal como iones Ca++ o Mg desencadenan la reacción de oxidación. Las moléculas de luciferina están muy conservadas en la naturaleza. Aparecen en taxones no relacionados. Aunque las estructuras de las luciferinas más conocidas son muy diferentes entre sí, lo que proporciona un fenómeno especial de convergencia evolutiva. Las especies que emiten más de un color, como algunos escarabajos o el pez dragón, lo hacen utilizando múltiples luciferasas. En general hay 4 luciferinas que parecen impulsar la mayoría de la bioluminiscencia en el medio marino. Funciones de la bioluminiscencia Ahuyenta depredadores Alarma Advertencia (se lo llama aposematismo en el medio terrestre) Seduce presas Atrae parejas Ataque ❖ Función en el medio marino Contrailuminación sirve de camuflaje ya que los órganos luminiscentes o los fotóforos se ubican del lado ventral (Calamar luciérnaga) Calamar castiga a la bacteria si apaga la luz. El calamar nocturno Euprymna scolopes usa bacterias bioluminiscentes para el camuflaje. Es tan vital que tiene un órgano especial donde aloja al Vibrio fischeri. Tiene un ciclo diario de expresión de genes. Si el operón Lux de la bacteria se elimina, y el simbionte se oscurece, el calamar altera el órgano de la luz y no le envía nutrientes castigando al simbionte. Es un ejemplo de la influencia recíproca entre la microbiota y el huésped. Calamares se saludan y se comunican con luz. El calamar de profundidad Dosidicus gigas tiene numerosos pequeños fotóforos subcutáneos (órganos bioluminiscentes) en todo el tejido muscular hacen que todo el cuerpo brille, retroiluminado patrones de pigmentación. ❖ Funciones en el medio terrestre Función aposemática. Milliedo Motyxia sequoiae. Luminiscencia verdosa advierte a depredadores roedores que tienen toxinas, en este caso el inhibidor de la cadena respiratoria Cianuro. Reproducción en hongos. Atrae insectos para propagar las esporas. EJEMPLOS DE ESTRUCTURAS DE LUCIFERINAS MARINAS 1) Celenterazina (la más común). Tripéptido que se sintetiza a partir de fenilalanina y 2 tirosinas (Phe-Tyr-Tyr). Se encuentra en protistas radiolarios, cnidarios, crustáceos, equinodermos, chaetognatha, cefalópodos, tunicados y algunos peces.  Luciferina de la enzima Aequorina. 2) Cypridina, es de la familia de la Celenterazina, también se sintetiza a partir de un tripéptido, Trp-Ile-Arg. Está presente sobre todo en Ostrácodos (Vargula hilgendorfii y Cypridina noctiluca), y en algunos peces que se alimentan de estos ostrácodos. También algunos peces lo incorporan en los fotóforos de la cabeza, y otros incorporan al ostrácodo pero lo dejan en el intestino, de tal manera que utilizan el tracto digestivo como un órgano de luz. 3) Dinoluciferina (Dinoflagelados del fitoplancton). Se sintetiza a partir de la clorofila (tetrapirrol). Hay 18 géneros de dinoflagelados bioluminiscentes (ej, Pyrocystis, Protoperidnium, Gonyaulax, Noctiluca). Aparece en Krill (Euphasidos) que la adquieren de la dieta. 4) Bacterioluciferina (fosfato de riboflavina reducido). Se codifica la síntesis por enzimas que codifican en un “operón lux” que está muy conservado evolutivamente. En el Océano Índico hay grandes densidades de bacterias luminiscentes, y un tipo de detección de quórum sincroniza su acción a gran escala, generando “mares brillantes” visibles desde el espacio. Algunos calamares y peces han adquirido independientemente bacterias simbióticas, localizadas en órganos productores de luz. MECANISMO BIOLUMINISCENCIA EN BACTERIAS GRAM- Como enzima tienen una Luciferasa (oxidasa de función mixta). Utiliza una pequeña cadena de transporte electrónico. La flavoproteína entrega los electrones al O2 catalizado por la luciferasa, y como sustrato toma un aldehído como el palmitaldehido y lo oxida a ácido palmítico con generación de luz y la reducción del O2 a H2O. La luz es de color azul. Sólo está presente en 3 géneros: Vibrio, Photobacterium y Xenorhabdus. La mayoría son marinas. BIOLUMINISCENCIA EN INSECTOS (cortejo, apareamiento, predación) En el medio terrestre, algunas luciferinas son exclusivas como la de las luciérnagas. El color que emiten las luciferinas, va a depender del tipo de luciferasa. Cuando se excita y desexita esta molécula, en la oxidación con la luciferasa, tiene un delta G de 57 Kcal/mol en una sola etapa (mucha energía liberada). El pH también modifica a la luciferasa y la longitud de onda que emite. En la reacción se forma un intermediario con el ATP, formando luciferil-AMP y en presencia de O2 y catalizado por la luciferasa, produce una excitación, llevando los electrones a un estado excitado, que cuando vuelven a su estado basal emiten luz en forma de fotones de diferente longitud de onda. Se pudo descubrir cómo es que puede controlarse la emisión y oscuridad de luz ya que la frecuencia de los destellos es característica de cada especie. El mecanismo es el siguiente: En primer lugar, se bloquea la llegada de O2 a la luciferasa mediante mitocondrias que tienen alta capacidad de absorber O2 y generar ATP. En ese momento la célula está oscura y cuando entre en estado de flash donde emite los destellos de luz y lo que hace la célula bajo control del SN es estimular la síntesis del gas óxido nítrico que rodea a la mitocondria e impide que esta intercepte el O2, permitiendo que este O2 sea finalmente utilizado por el complejo Luciferina-Luciferasa. Como este gas difunde muy rápido, se puede sintetizar y difundir rápido, permitiendo los pulsos de luz en la luciérnaga. *Mimetismo para predar - Photuris versicolor. Imita el color y frecuencia de la presa para atraerla. Evidencia experimental de la síntesis de ATP Aplicación práctica: cuantificar ATP sintetizado empleando luciferina-luciferasa. Se dio vuelta el complejo F1 y la varilla gamma, fijaron la subunidad catalítica por unas colas de histidina y una placa de níquel, y unieron un cabezal magnético a la varilla. Se aplicaba un campo electromagnético y se forzaba la rotación de la varilla. Al rotarlo, agregaron los sustratos adecuados y se iba sintetizando ATP, y si se hacía rotar para el otro lado, funcionaba como ATPasa. Evolución dirigida de una Luciferasa Aumentaron el brillo de un par L-L 1400 veces. Emite en infrarrojo. Esta potencia y brillo permite que: - La luz sea capaz de atravesar la piel - El sustrato atraviesa la barrera hematoencefálica - Se emplea en organismos vivos. Es no invasivo - Permite ver células individuales del cerebro / tumores.