Vanjski i unutrašnji simptomi infekcija biljnim virusima - Skripta - Teorijski deo

– teorijski dio : - - ( P : N Arthropoda – Aphididae Nematoda - 1 g Olpidium brass...

– teorijski dio : - - ( P : N Arthropoda – Aphididae Nematoda - 1 g Olpidium brassicae b N (Cuscuta 2  i - - ( - , – – Nicotiana spp., Chenopodium spp. Phaseolus spp. - T 4  – C C A B A B 5  A A B C (  Vanjski i unutrašnji simptomi infekcija biljnim virusima – teorijski dio Vanjski simptomi (promjene na biljci vidljive golim okom) Tipovi infekcija (zaraza) biljnim virusima: lokalne (vanjski simptomi vidljivi su samo s e ili sustavne ( transpor elementima) latentne ili pritajene ( simptom dokazati povratnom inokulacijom na ) povratna inokulacija koja pokazuje latentno koja pokazuje vanjske simptome biljka vanjske simptome klorot kloroze ( je posljedica razgradnje ) nekroze (karakterizira ih odumiranje tkiva rnu boju) ostali simptomi. se promjene javljaju u obliku mrlja ih listova te ili prosvjetljenje 1  promjene Pod ostale sim abnormalnim mjestima) oblik simptoma ovisan je. Unutrašnji simptomi ( svjetlosnim i elektronskim mikroskopom) Kao posljedica virusne replikacije unutar d stanica dolazi do nakupljanja virusnih se m. se oblik i sastav razlikuju kod pojedinih virusnih vrsta. „biljeg“ pri dijagnosticiranju virusne bole stvaraju inkluzije. Tipovi virusnih inkluzija: amorfne inkluzije (tzv. X-tijela) kristal inkluzije o parakristali o pravi kristali Am a karakterizira ih nepravilan oblik koji je samu jezgru. kristal virus mozaika samo biljni unutar inkluzije mogu pravilno slagati u dvije (parakristali) ili nastaju u citoplazmi. X virus kakteja (tvori virus mozaika duhana (tvori prave kristale). 2  Vanjski i unutrašnji simptomi infekcija biljnim virusima – Vanjski simptomi na biljkama u koje je virus ulacij pripravcim koji se javljaju uslijed Unutrašnji simptomi (Schlumbergera bridgesii) - virusom kakteja aste parakristale (tzv. proteinska vretena). aste parakristale. skicirati ultrastrukturu jednog parakristala X-virusa kakteja - Skica ultrastrukture parakristala X virusa kakteja mikroskopom pogledati pra prizmi). Rubni prerez plojke treba prave kristale. Pravi kristali u stanicama dlaka duhana skicirati ultrastrukturu jednog pravog kristala virusa mozaika duhana zaika duhana Pod svjetlosnim mikroskopom pogledati poliedarske okluzije virusa citoplazmatske poliedroze kukaca. Okluzije ovog virusa su poseban su tip tvorbi pravilno strukturiranog proteinskog matriksa. Protein polihedrin je kodiran virusnim genomom Poliedri iz kukaca 4 Skica ultrastrukture okluzije virusa citoplazmatske poliedroze kukaca 5  Serološka (imunokemijska) reakcija – teorijski dio Serološka reakcija je reakcija antigena i protutijela na inertnoj podlozi u uvjetima in vitro. Ime je dobila prema krvnom serumu koji se u reakciji koristi kao izvor protutijela, a valja je razlikovati od imunološke reakcije, koja se odvija u organizmu. Do danas je poznato više seroloških tehnika, a primarni im je cilj identifikacija antigena ili protutijela, mada se neke izvedbe mogu koristiti i za njihovu kvantifikaciju te karakterizaciju. Antigeni su uglavnom molekule proteina ili poli koje nakon unosa u organizam u limfocitima B (tzv. humoralna imunost). Kod antigen predstavlja Protutijela (antitijela) su proteini iz skupine gama-globulina (imunoglobulini, Ig), koji se sastoje od dva teška i dva laka lanca. „V“- ine dva fragmenta, tzv. Fab- Jedna molekula protutijela istovremeno ati do dva antigena, svakim Fab-fragmentom po jedan. Vezivanje antigena i protutijela: Na krajevima Fab-fragmenata nalaze se paratopi prepoznaju epitope (antigenske determinante) na molekulama antigena. Jedan antigen jednu vrstu epitopa. 1 Priprava protutijela: Protutijela se pripravljaju jednokratnim ili višekratnim unošenjem vrlo , štakor, koza, injektiranja, kada je proizvodnja serum naziva se antiserum. Prema potrebi, još jednu dozu antigena (booster me se dodatno stimulira stvaranje protutijela. Prilikom proizvodnje monoklonskih antiseruma, potrebno je izdvojiti te in vitro-fuzionirati je hibridomska stanica stvarati protutijela. Poliklonski antiserumi – epitopa nekog antigena. Monoklonski antiserumi – amo jedan tip epitopa nekog antigena te su npr. pogodna za razlikovanje virusnih sojeva. Dvostruka radijalna imunodifuzija (DRID – double radial immunodiffusion) DRID je izvedba serološke u inertnoj podlozi. taje reakcija koja je vidljiva imunoprecipitat. im Fab fragmentima istovremeno mogu vezati i na molekule antigena te stvarati agregate kako je prikazano na skici. DRID- (serološki titar). Serološki titar predstavlja (najmanju koncentraciju) antigena ili protutijela koje još uzrokuje vidljivu serološku reakciju. 2  Jednostruka radijalna imunodifuzija (SRID – single radial immunodiffusion) SRID je izvedba serološke reakcije kod koje se samo jedan reaktant unosi u inertnoj podlozi, - reakcija -reakcija pogodna je za analizu a ali je u podlogu dodati i protutijela. Kao i DRID, ova je izvedba pogodna ne samo za identifikaciju, relativnu kvantifikaciju antigena ili protutijela (promjer nastalog prstena direktno je ovisan o koncentraciji reaktanta). AgY IMUNOPRECIPITACIJSKI PRSTEN SRODNI ANTIGENI ANTIGENI ANTIGENI ANTIGENI (DVA ANTISERUMA) DRID SRID 3 ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) ELISA-tehnika k uzoraka. Osim antigena i protutijela, u reakciju se do je znak pozitivne serološke reakcije. ELISA se provodi sa i antigene ili protutijela primjenjivan oblik ELISA-reakcije je tzv. DAS-ELISA (double antibody sandwich). Na shemi je prikazan direktni oblik tehnike DAS-ELISA. vezanje protutijela (Ab) u bazen i e mikrotitarske plo ice vezanje dodanih antigena (Ag) na adsorbirana protutijela dodavanje konjugata protutijelo-enzin (Ab-E) i njegovo vezanje na antigen dodatak enzimskog supstrata uz promjenu obojenja Imunoelektroforeza Imunoelektroforeza je tehnika koja kombinira elektroforezu i serološku identifikaciju antigena metodom DRID. Nakon razdvajanja ciljnog antigena od ostali i na nekoj vrsti polisaharidnog gela (agar, agaroza) nakon elektroforeze dodaje antiserum (prikazano na slici). kao imunop tzv. imunoelektroforetska pokretljivost, neki antigen te je koris prilikom njegove karakterizacije. ANTIGEN ANTIGEN 4 Posebna izvedba imunoelektroforeze je tzv. raketna elektroforeza, koja je dobila ime po talogu koji antigena metodom SRID pa se kod nje jedan reaktant , dok se drugi fiksira u podlogu. Kod ove izvedbe, elektroforeza i serološka reakcija se simultano. Osim za identifikaciju, raketna je elektroforeza pogodna i za relativnu kvantifikaciju antigena ili protutijela jer je nastale „rakete“ direktno ovisna o koncentraciji reaktanta kako je prikazano na slici. As-u podlozi oblici taloga nastali pri raketnoj elektroforezi virusnih pripravaka 5  Serološka (imunokemijska) reakcija – Priprema podloge i reaktanata za DRID-reakciju: Podloga - u Sörensenovom puferu (pH 7) prirediti 1%-tni gel agara (u agar se kao konzervans dodaje NaN 3 ) - na predmetno stakalce pipetom izliti 3 ml otopljenog agara te ga se jednoliko razliti po površini stakalca - ostaviti stajati 10-ak minuta dok gel polimerizira - prema šabloni na milimetarskom papiru, metalnim smještene u vrhove agar Antigen - pripremiti infektivni sok virusa (TYMV) sojeva Y i N homogeniranjem u tarioniku uz dodatak Sörensenovog pufera (kao - iz dobivenog infektivnog soka (soj Y) u Sörensenovom puferu prirediti binarna razr (1/2-1/32) prema navedenoj skici 6  Prvo u sve epruvete treba dodati po 5 jednakih kapi pufera, a zatim u svaku epruvetu dodati po 5 je promiješati! Razrje api/ukupan broj kapi u epruveti. Protutijela - soj Y virusa Postavljanje reakcije DRID Prema shemi Y- virus TYMV soja Y N- virus TYMV soja N AsY- TYMV S jkom! R tom kapalicom od najve ! U svak jednak v vrha)! Reakcija postaje vidljiva nakon 24-48 sati, a odvija se pri sobnoj temperaturi (ili u hladnjaku kod manje stabilnih virusa). Kako se gel ne bi osušio i popucao atmosferi (. Nakon pojave reakcije, gel se tretira octenom kiselinom (fiksiranje reakcije) te 7 Rezultati reakcije Kod spomenute izvedbe DRID- tativni. reakcijom DRID Skica dobivenih rezultata DRID-reakcije: 8  Kultiviranje animalnih virusa u – in vitro in vitro P - 37-39 °C V : 1  – – – – – - – - P e p I 2 3 Kultiviranje animalnih virusa u – : - - - - – - - - - - - - - - - - - - - - p - 4  LIJEVO: pileći embrij zaražen DESNO: normalno razvijeni pileći virusom bronhitisa peradi – prestao s embrij star 19 razvojem 19. dana embrionalnog razvoja Lezije na korio-alantoisnoj membrani nastale uslijed zaraze virusom boginja peradi. Pro – - - - H- - - -  - - - – - – – – – –  - - SI - - - - - - -  – – - - - - - - - - - - - - - – -  Određivanje titra bakteriofaga T4 tehnikom čistina –teorijski dio Bakteriofagi (skraćeno fagi) su virusi koji inficiraju bakterije. Otkrili su ih neovisno jedan o drugome Frederick Twort (1915) i Felix d'Herelle (1917). Kao i njihovi domaćini, bakteriofagi su također sveprisutni i mogu se izolirati iz svakog mjesta gdje se nalaze i bakterije: zemlje, vode, biljaka, životinja, ljudi… Dosada je otkriveno i proučeno više vrsta bakteriofaga koji se međusobno razlikuju po veličini, morfologiji i tipu nukleinske kiseline (najčešće DNA). Po obliku se mogu svrstati u izometrične, filamentozne te repate fage. Izometrični bakteriofagi Filamentozni bakteriofagi Repati bakteriofagi Svi repati fagi imaju glavu (anizometričnu ili izometričnu) i rep s repnim nitima koji može biti kratak i rigidan (Podoviridae, npr. bakteriofag T7), dugačak i kontraktilan (Myoviridae, npr. bakteriofag T4), ili dugačak i rigidan (Siphoviridae, npr. bakteriofag λ). T4, T7 i λ su samo neki od faga koji inficiraju bakterijsku vrstu Escherichia coli (kolifagi). Životni ciklus bakteriofaga može biti lizogeni ili litički. Ciklus bakteriofaga T4 je litički. Fag se nitima prihvaća na receptore na površini bakterije, otpušta enzime koji razgrađuju stijenku bakterije, ali i kontrahira rep i tako unosi svoju nukleinsku kiselinu u stanicu, dok prazna kapsida ostaje izvana. Unutar stanice preuzima staničnu mašineriju za proizvodnju virusnih nukleinskih kiselina i proteina, a istovremeno dolazi do razgradnje bakterijske nukleinske kiseline (nukleazama kodiranima u genomu faga). Nakon sinteze novih dijelova faga i sklapanja virusnih čestica dolazi do raspada bakterijske stanice što se naziva liza, a zreli virioni se otpuštaju i mogu inficirati nove stanice ako ih ima u blizini. Bakteriofag λ pak pripada umjerenim (engl. temperate) fagima, što znači da može ući u lizogeni, ali i u litički životni ciklus. U lizogenom ciklusu bakteriofag nakon ulaska u bakterijsku stanicu integrira svoj genom u bakterijski kromosom. Integrirani bakteriofag (profag) replicira se pasivno, zajedno s bakterijskim genomom. Bakterije koje sadrže profag nazivaju se lizogene bakterije i imune su na infekciju drugim fagima. U stresnim uvjetima profag se oslobađa i aktivira litički ciklus. Određivanje titra faga T4 tehnikom čistina (plakova) Virusni titar je kvantitativna mjera biološke aktivnosti virusa i izražava se kao broj infektivnih faga, tj. jedinica koje stvaraju čistine/plakove (PFU, od „plaque forming units“) u mililitru suspenzije. Broj infektivnih (LITIČKIH) faga može se odrediti tehnikom čistina (plakova). Test se temelji na sposobnosti faga da stvori plak na tzv. bakterijskoj livadi, tj. sloju osjetljivih bakterija izraslih na krutoj hranjivoj podlozi. podl Bakterijska livada nastaje spajanjem malih bakterijskih kolonija uslijed velike koncentracije bakterija na podlozi. Nastanak plaka ili čistine, svjetlije zone kružnog oblika u kojoj nema bakterija (slika desno), započinje tako da bakteriofag inficira jednu bakterijsku stanicu. Nakon umnažanja faga i lize stanice, u okolinu se otpuštaju nove virusne čestice koje inficiraju okolne bakterijske stanice te se ciklus ponavlja sve dok se ne unište veliki brojevi bakterija. Uništene stanice nakon 6-24h24h vidljive vidljiv su kao čistine na inače mutnoj bakterijskoj bakterijsko livadi na ploči. Svaka čistina sadrži potomstvo jedne virusne čestice. Zato broj plakova akova na bakterijskoj livadi odgovara govara broju infektivnih čestica u suspenziji te se može koristiti za procjenu broja infektivnih faga. Morfologija plaka ovisi o vrsti faga, vrsti domaćina i uvjetima rasta. Određivanje titra faga T4 tehnikom čistina – protokol vježbe Za tehniku čistina potrebni su nam: Suspenzija litičkog faga (T4) Budući da suspenzije mogu sadržavati veliki broj virusnih čestica, suspenzija se mora razrijediti kako bi se na Petrijevoj zdjelici nakon inkubacije jasno vidjeli odvojene čistine. Pripremaju se decimalna razrjeđenja početne suspenzije Pufer „lambda“ (0.1M Tris, 0.01M MgSO4, pH 7.2) za pripremu razrjeđenja Osjetljiva bakterija: kultura soja E.coli 633. Najbolje je koristiti kulturu u eksponencijalnoj fazi rasta jer su tada bakterijske stanice metabolički najaktivnije, što pogoduje brzom razmnožavanju faga. Može se koristiti i stacionarna kultura. Spektrofotmetrijskim mjerenjem turbiditeta (optičke gustoće) bakterijske suspenzije pri valnoj duljini od 600nm (OD600) može se približno odrediti broj stanica. Optička gustoća je mjera raspršenja svjetla: veći broj stanica jače raspršuje svjetlo, no proporcionalnost između OD i gustoće stanica vrijedi samo kad je optička gustoća OD600 ≤ 0.4. Petrijeva zdjelica s čvrstom hranjivom podlogom LB koja služi kao gel-podloga Polučvrsta hranjiva podloga LB (sa upola manje agara nego čvrsta) u koji se dodaju osjetljive bakterije Polučvrsta hranjiva podloga LB brzo polimerizira i na taj način su na podlozi imobilizirane bakterijske stanice koje će stvoriti homogenu bakterijsku livadu. Ako bi uzgajali bakterije i fage u tekućoj suspenziji, virusi bi se mogli neometano kretati, nasumično lizirati bakterije te ne bi došlo do nastanka čistine. Polučvrsta hranjiva podloga LB je dovoljno čvrsta da ograniči i širenje novonastalih virusa samo na susjedne stanice i time omogućuje nastanak plaka, ali je istodobno dovoljno mekan da fagi mogu lako difundirati kroz medij što dovodi do formiranja pravilnog plaka (u čvrstoj podlozi može doći do nejednake apsorbcije faga i nastajanja nepravilnih plakova na ploči). Priprema bakterija : Pet mililitara tekućeg Luria – Bertani (LB) medija inokulira se jednom kolonijom bakterije E.coli i uzgaja preko noći uz jaku trešnju pri 37°C. Ujutro se prekonoćna kultura razrijedi u tekućem LB mediju (1:10) te se inkubira pri 37°C sve dok OD600 ne dosegne vrijednost ~ 0.1 (2- 4sata). Bakterije su već pripremljene. Priprema ploča sa polučvrstom LB hranjivom podlogom: 1. Staviti prethodno pripremljene ploče s čvrstom LB hranjivom podlogom1 sobne temperature u inkubator (37°C) da se zagriju. 2. Polučvrstu LB hranjivu podlogu (LB tekući medij s dodatkom agara u finalnoj koncentraciji 0.8%) otopiti u mikrovalnoj pećnici. 3. Prenijeti 5mL polučvrste LB hranjive podloge sterilnom pipetom u sterilnu epruvetu s poklopcem (12mm) i inkubirati u vodenoj kupelji sve dok se temperatura agara ne spusti na 45°C (nekoliko minuta). Ta je temperatura dovoljno visoka da agar ostane u tekućem stanju, no dovoljno niska da bakterije mogu preživjeti. Epruvete držati u vodenoj kupelji do ponovne upotrebe. 4. Za vrijeme dok se polučvrsta LB hranjiva podloga hladi u vodenoj kupelji, donijeti ploče sa čvrstom LB hranjivom podlogom označiti ih s donje strane kao na slici. 1 LB tekući medij s dodatkom agara u finalnoj koncentraciji 1.6%) 3. Dodati odati 100µL bakterijske kulture u epruvetu s polučvrstom hranjivom podlogom LB i pažljivo promiješati sadržaj laganim tresenjem epruvete. 5. Cijelii sadržaj izliti na krutu hranjivu podlogu LB i lagano kružiti Petrijevom zdjelicom tako da se smjesa ravnomjerno rasporedi. 6. Ostaviti iti poklopljenu Petrijevu zdjelicu 5 minuta dok se polučvrsti agar ne stvrdne. Paziti da se ne pomakne (pomicanje nakon što počne polimerizacija po čini sloj agara zrnatim). zrnatim) Priprema razrjeđenja: 1. Označiti sterilne epruvete u u kojima će se pripremati decimalna razrjeđenja: 10-1 – 107 (vidi sliku). 2. Upaliti plamenik 3. U svaku epruvetu otpipetirati 0,9mL pufera „lambda“. Pipetu prije upotrebe sterilizirati (70%EtOH)), a pufer zatvarati nakon svakog pipetiranja. 4. Iz suspenzije faga otpipetirati 100µL virusnog pripravka u epruvetu s oznakom 10-1. Vorteksirati ili promiješati pipetiranjem. Tako smo priredili navedeno razrjeđenje 5. Novim plastičnim nastavkom pipete prenijeti 100µL u epruvetu s oznakom 10-2 i vorteksirati. 6. Ponoviti postupakpak za sva razrjeđenja i paziti paziti da svaki put uzmemo novi plastični nastavak za pipetu. Nanošenje razrjeđenja bakteriofaga: Različita razrjeđenja faga nanose se na za to predviđena mjesta na ploči. Volumen razrjeđenja koje se nanosi iznosi 10 µL. Početi s nanošenjem najvećeg razrjeđenja (10-7). Kapljicu pažljivo ispustimo (nastavkom se ne smije ogrebati agar). Ploče se inkubiraju na sobnoj temperaturi sve dok se kapljice ne upiju, a na mjestu upijanja nastane neravnina na agaru (1h). Tada se ploče prenesu u inkubator gdje inkubiraju preko noći pri 37°C. Brojanje plakova i računanje titra faga: 1. Promotrite i nacrtajte plakove koji su nastali 2. Izbrojite plakove u pojedinom kvadrantu. Ako plakovi nisu jasno razdvojeni u tablicu u stupac sa brojem plakova upisati „previše za izbrojati“, a u stupac s titrom „nije određeno“. Razrjeđenje Broj plakova Titar (PFU/mL) 0 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 Srednja vrijednost titra 3. Izračunati titar faga tako da se broj izbrojenih plakova pomnoži sa faktorom razrjeđenja za svako pojedino razrjeđenje. Primjerice, za razrjeđenje 10-4, faktor razrjeđenja iznosi 104! Broj plakova x faktor razrjeđenja = PFU/mL U obzir se mora uzeti da kod nanošenja faga na ploče nismo koristili cijelo pripremljeno razrjeđenje, nego samo 10µL (1/100) od ukupnog volumena (1mL) što je ekvivalentno tome da smo otopinu razrjedili još 100 puta (faktor razrjeđenja 102), pa formula finalno izgleda: Broj plakova x faktor razrjeđenja x 102 = PFU/mL 4. Titar faga u originalnoj suspenziji dobiva se tako da izračunamo srednju vrijednost titra (PFU/mL) svih razrjeđenja.