Sistema Musculoesquelético PDF

Sistema Musculoesquelético: Composição: músculos, ossos e articulações. Funções do esqueleto: ▪ Locomoção ▪ Suporte ▪ Proteção de órgãos ▪ Armazenamento de minerais ▪ Alojamento do tecido hematopoiético. As articulações- é o local de junção ou união de dois ou mais ossos, a su...

Sistema Musculoesquelético: Composição: músculos, ossos e articulações. Funções do esqueleto: ▪ Locomoção ▪ Suporte ▪ Proteção de órgãos ▪ Armazenamento de minerais ▪ Alojamento do tecido hematopoiético. As articulações- é o local de junção ou união de dois ou mais ossos, a sua função primária é promover o movimento e flexibilidade no corpo -As mais comuns são as sinoviais -Estrutura complexa, composta não só pelas extremidades dos ossos, como também ligamentos, cartilagem, capsula articular e membrana sinovial Cartilagem articular- é um tecido altamente especializado, avascular e com uma concentração celular reduzida, composto por água e produtos extracelulares produzidos pelos condrócitos. Função e composição da matriz extracelular: -Água (65-80%): Resistência friccional e pressurização -Proteoglicanos: atraem as moléculas de água para exercer pressão Colagénios: A pressão é contrabalançada pela rede de fibras de colagénio que rodeia os proteoglicanos. Patologias que afetam as articulações: Artrite Reumatóide, a Condrocalcinose e Osteoartrose Todas são a destruição progressiva da cartilagem como consequência dos desiquilíbrios entre o anabolismo e catabolismo Osteoartrose em PT- maior % no joelho, depois mão e so dps na anca. Mulheres mais que homens Espondilose anquilosante> que artrite reumatoide em PT Osteoartrose é o tipo de artrite mais comum e tem um grande impacto na qualidade de vida das pessoas. Estima-se que cerca de 35% da população mundial possa desenvolver osteoartrose sintomática até 2030 e que este seja o principal motivo de incapacidade. Fatores que contribuem para o estabelecimento da osteoartrose: Carga mecânica Envelhecimento Hereditariedade Obesidade Síndromes metabolicos Acumulação de microcristais de fosfato de cálcio Forma do osso/articulação Lesão Massa muscular Ocupação e atividade física Osteoartrose-Causas Lesão articular Excesso de carga mecânica e obesidade Trabalho físico Fatores genéticos (hereditariedade) Fatores ambientais Avaliação da Osteoartrose: TP1 Microscopia: Microscopia de campo claro Mais utilizado em histologia. Ampliação até ~1000x; adequado para visualização de amostras fixas e vivos. Baixa resolução limitada por comprimento de onda da luz. Microscopia de fluorescência Utiliza corantes fluorescentes ou anticorpos para identificar componentes celulares específicos (por exemplo, proteínas, DNA, RNA). Muito sensível em imunofluorescência e na identificação de marcadores celulares. Algumas limitações de autofluorescência, photobleaching, danos derivados a fluorescência, aparecimento de moléculas fora de foco. Microscopia de fluorescência (confocal) Pode fornecer imagens 3D de alta resolução de tecidos. Utiliza lasers para focar planos específicos dentro da amostra, eliminando a luz fora de foco.  Ideal para estudar amostras e tecidos espessos com maior pormenor. Microscopia Eletrónica ME de transmissão (TEM): Fornece imagens pormenorizadas da estrutura interna das células (organelos, membranas) com grande ampliação. ME de varrimento (SEM): Oferece uma topografia de superfície pormenorizada de amostras de tecidos, proporcionando uma visão semelhante a 3D. Vantagens Resolução 1000x superior a microscopia visível. Altamente detalhado. Desvantagens Amostras não podem estar vivas. Imagens a preto e branco Custo 1º caso clínico-Diagnosticar uma condição misteriosa do fígado Qual a informação relevante? Sexo masculino, 45 anos; Fadiga persistente (problemas hepáticos); Icterícia (indicando que a bilirrubina, um produto da degradação da hemoglobina, está se acumulando no sangue; Dor abdominal leve (sinal de inflamação ou inchaço no fígado). Níveis elevados de enzimas hepáticas (AST e ALT)(Indicam danos às células hepáticas); Níveis elevados de bilirrubina (Confirmam a presença de icterícia e sugerem problemas com a capacidade do fígado de processar a bilirrubina); Ecografia revela um fígado aumentado, sem sinais claros de lesões focais ( Sugere que o fígado está aumentado de tamanho, mas não há sinais de tumores ou cistos) Que tipo de amostras seriam úteis? Biópsia do fígado: A biópsia é o padrão-ouro para o diagnóstico de doenças hepáticas. Permite a análise microscópica do tecido hepático, revelando a causa da inflamação, fibrose ou outras alterações. Análise de sangue: Exames adicionais de sangue podem ser úteis para investigar a função hepática mais detalhadamente, incluindo: Proteínas séricas: Avaliar a capacidade do fígado de sintetizar proteínas. Tempo de protrombina (TP): Avaliar a capacidade do fígado de produzir fatores de coagulação. Marcadores virais: Investigar a presença de hepatite viral (A, B, C). Autoanticorpos: Investigar doenças autoimunes que afetam o fígado. Qual uma boa abordagem inicial em microscopia ? Coloração de hematoxilina e eosina (H&E): Uma coloração padrão para análise de tecidos, que permite visualizar a estrutura geral do fígado, identificar inflamação, fibrose e alterações celulares. Coloração de imunofluorescência: Pode ser útil para identificar depósitos de imunoglobulinas e outros componentes do sistema imune, sugerindo doenças autoimunes. Microscopia eletrônica: Pode fornecer informações mais detalhadas sobre a estrutura das células hepáticas, incluindo a presença de vírus ou outras partículas. O que se observou: Microscopio ótico Observou se sinais de inflamação e infiltração celular, mas a causa exata não é clara. Tentar outra microscopia Os resultados da microscopia de fluorescência são inconclusivos, não revelando a presença de antigénios virais. No entanto, suspeita-se de sinais de fibrose com base nos achados da microscopia ótica. Tentar ainda outra Microscopia confocal de fluorescência de modo a aprofundar a analise molecular e os seguintes achados foram obtidos: Discussão final: Qual o possível diagnostico? Fibrose hepática com possível doença metabólica-Acumulação excessiva de matriz extracelular (ativação das células estreladas hepáticas) e outras células inflamatórias, levando à cicatrização do tecido hepático Utilidade e limitações de cada tipo de microscopia para o diagnostico? Tipo de Microscopia Utilidade Limitações Microscópio Óptico Acessibilidade, visualização não Resolução limitada, menos detalhes em marcada, exame de rotina amostras espessas, dependência de contraste Microscopia de Visualização de estruturas Fluorescência de fundo, limitação de Fluorescência específicas, versatilidade, rápida profundidade, necessidade de marcadores Microscopia Confocal de Imagens 3D, alta resolução, Custo elevado, tempo de aquisição, Fluorescência seleção de camadas preparação complexa Corante fluorescente- marcar células mortas em estudos de viabilidade celular. Ele se liga ao DNA, permitindo a visualização de células que não estão viáveis. RSK (p90 ribosomal S6 kinase- Quinase que faz sinalização celular, especialmente em resposta a fatores de crescimento e estresse Glial Fibrillary Acidic Protein)-uma proteína que é um marcador específico de células gliais, especialmente astrócitos no sistema nervoso central TP2 Anatomia do olho Técnicas de coloração permitem identificar populações celulares distintas nas camadas da retina e identificar patologias. Hematoxilina-eosina (núcleos e componentes celulares). Coloração de Golgi-Cox (fotorreceptores)  Córtex visual é uma estrutura estratificada com diferentes populações celulares. Doenças Comuns Detetáveis por Histologia Degeneração Macular Relacionada à Idade (DMRI): Dano à macula e/ou degeneração da retina (aparecimento de vasos sanguíneos). Glaucoma: Perda de células ganglionares e degeneração do nervo ótico.  Atrofia do Córtex Visual: Trauma, hipóxia ou outras condições que causam a morte neuronal. 2º Caso Clínico- Morte Suspeita com Lesão Ocular Qual a informação relevante? Idade da Vítima: Mulher de 45 anos. Condição do Corpo: Encontrada morta no chão da sua casa, sem sinais de violência explícita. Alteração de Coloração: Relato de coloração vermelha em um dos olhos, o que pode indicar várias condições, como hemorragia subconjuntival ou outras anomalias. Objetivo da Investigação: Determinar se a morte foi natural, acidental ou homicídio. Solicitação de Exame Histológico: Para esclarecer a causa da morte. Hipoteses possíveis? Morte Natural: Pode incluir condições médicas subjacentes, como doenças cardíacas, AVC, ou outras patologias que não apresentem sinais externos de violência. Morte Acidental: Poderia ser resultado de uma queda, intoxicação ou overdose, que não deixaram marcas visíveis no corpo. Homicídio: Embora não haja sinais de violência explícita, a alteração na coloração do olho pode sugerir uma possível agressão ou envenenamento, que requer investigação mais aprofundada. 1ª evidência a analisar antes de testes histologicos? História Clínica e Circunstâncias da Morte: Entender o contexto em que a mulher foi encontrada, incluindo qualquer histórico médico relevante, uso de medicamentos, ou comportamentos que possam ter contribuído para a morte. Exame Externo do Corpo: Avaliar cuidadosamente o corpo para qualquer sinal de trauma, marcas de estrangulamento, ou outras evidências que possam não ser imediatamente visíveis. Análise do Olho: A alteração de coloração do olho deve ser examinada mais de perto, pois pode fornecer pistas sobre a causa da morte, como hemorragias ou condições oculares que podem estar relacionadas a causas naturais ou traumáticas. O que se fez: Relatório macroscópico: Observa-se: Olho com lesão hemorrágica na região do globo ocular direito. A retina aparenta danificada e o nervo ótico apresenta sinais de tensão. O resto do corpo não apresenta sinais evidentes de trauma externo. Pode ter ocorrido: Trauma Ocular Interno: Impacto interno sem marcas visíveis. Descolamento de Retina: Descolamento da retina, causando hemorragia. Para obter mais info realiza-se relatorio macroscopio ao cerebro: Revela uma possível hemorragia subdural no lobo occipital, sem fraturas no crânio visíveis. Quais testes histológicos podem ser realizados para investigar se a lesão ocular e a hemorragia subdural estão associadas a um trauma violento? Exames histológicos como a coloração H&E, imunohistoquímica, análise de sangue e fluído cerebral, além de estudos de microscopia eletrônica, podem revelar a presença de hemorragias, inflamação, danos celulares e marcadores específicos de trauma. Exame histológicos aos olhos : A coloração de Hematoxilina e Eosina (H&E) revela: Exame histológicos ao córtex visual: Conclusão: A vítima sofreu uma lesão traumática grave no olho, que se estendeu ao córtex visual e causou danos cerebrais adicionais. A combinação de hemorragia retiniana, descolamento da retina e lesão axonal no nervo ótico é altamente indicativa de trauma por agressão. As lesões cerebrais confirmam que a morte foi provavelmente causada por trauma não acidental, implicando violência externa, possivelmente homicídio Coloração Utilidade Limitações H&E Coloração geral, avaliação de Menos específica, necessidade de colorações adicionais para (Hematoxilina e lesões informações detalhadas Eosina) Nissl Identificação de neurônios, estudo Não diferencia tipos celulares além dos neurônios, não de doenças neurológicas fornece informações sobre axônios ou dendritos Azul da Prússia Detecção de ferro, diagnóstico de Pode não detectar ferro em sua forma não bivalente (Fe³⁺), de Perls hemocromatose interpretação pode ser difícil sem contexto clínico Coloração de Nissl (marcação neuronal).  Hemorragia intensa (seta). Descolamento da retina (R), com rotura das camadas de células ganglionares e dos fotorrecetores, sugerindo um trauma por impacto direto. Outras analises mostram que o nervo óptico mostra degeneração axonal e edema perineural, característicos de lesão por tração súbita, sugerindo um movimento brusco da cabeça ou um golpe. Quais são as possíveis causas dessa lesão ocular? Como diferenciar se foi causada por um acidente ou por violência intencional? 1. Acidentes Domésticos: Quedas ou batidas em móveis. 2. Acidentes de Trabalho: Exposição a produtos químicos ou uso inadequado de ferramentas. 3. Acidentes de Trânsito: Impactos diretos nos olhos durante colisões. 4. Violência Intencional: Agressões físicas que resultam em hematomas ou lacerações. 5. Exposições Químicas: Contato com substâncias irritantes que causam queimaduras. Coloração de Nissl no córtex revela Necrose neuronal nas camadas mais profundas, sugerindo trauma severo e perda neuronal. A coloração azul da Prússia de Perls para o ferro mostra que a hemorragia no córtex visual é possivelmente recente. TP3 Anatomia do hipocampo  Responsável por formação e consolidação de memórias de longo prazo. Essencial para navegação espacial. Circuito unidirecional: córtex entorrinal → giro denteado → CA3→CA2 → CA1. Processos de degeneração do hipocampo perda de memória 1. Declínio cognitivo associado ao envelhecimento Diminuição da Densidade Sináptica: As conexões entre neurónios tornam-se menos densas. Redução na Mielinização: As fibras nervosas perdem mielina, comprometendo a eficiência e velocidade de condução dos sinais neuronais. Doenças relacionadas ao hipocampo: 2. Doença de Alzheimer Presença de placas de β-amiloide e emaranhados neurofibrilares de proteína tau hiperfosforilada nas regiões CA1 e giro denteado do hipocampo. Perda sináptica, atrofia hipocampal. 3. Demência vascular Lesões isquémicas e micro-hemorragias no cérebro devido a doenças dos vasos sanguíneos. 4. Demência Mista Combina os efeitos degenerativos de Alzheimer com as lesões vasculares da demência vascular. Marcações histológicas para o hipocampo Colorações permitem identificar estruturalmente hipocampo e identificar possíveis patologias. Cresil Violeta: Visualiza corpos celulares e camadas neuronais. Bielschowsky: Destaca emaranhados neurofibrilares e placas amiloides. Luxol Fast Blue (LFB): Avalia a integridade da mielina nos axónios. Imuno-histoquímica para Tau e β-amiloide: Marca proteínas relacionadas com a doença de Alzheimer e demência. Vermelho do Congo: Marca especificamente a proteínas organizadas em estruturas amiloides, como as fibras de β-amiloide. 3º Caso Clínico- Declínio Cognitivo Progressivo com Alterações Hipocampais Informações Relevantes Mulher de 78 anos Histórico de Sintomas: Perda de memória: Esquecer compromissos e repetir histórias. Desorientação: Não reconhecer lugares familiares. Exame Histológico do Hipocampo: O hipocampo é uma área crucial para a formação de memórias. O exame pode revelar alterações que ajudam a diagnosticar a causa do declínio cognitivo. Hipoteses possíveis: Doença de Alzheimer: É a forma mais comum de demência, caracterizada pela perda progressiva de neurônios no hipocampo, uma área crucial para a memória. O exame histológico do hipocampo pode revelar placas amiloides e emaranhados neurofibrilares, características da doença. Doença de Parkinson: Embora a perda de memória não seja um sintoma inicial, a doença de Parkinson pode causar demência em estágios avançados. O exame histológico do hipocampo pode revelar a presença de corpos de Lewy, que são características da doença de Parkinson. Demência Vascular: Causada por danos nos vasos sanguíneos do cérebro, pode levar a perda de memória e desorientação. O exame histológico pode revelar sinais de danos vasculares no hipocampo. Relatório macroscópico: O hipocampo apresenta atrofia visível, especialmente na região CA1, sugerindo perda de volume típico de algumas formas de demência. Observa-se descoloração em algumas áreas, levantando suspeitas de alterações mielínicas Normal Paciente Hipoteses: Doença de Alzheimer ou doença vascular para identificar placas de amiloide, lesões vasculares ou sinais de neurodegeneração: Exames Histológicos com Cresil Violeta e Bielschowsky: A coloração Cresil Violeta revela: Redução da densidade de neurónios nas camadas CA1 e CA3, consistente com perda neuronal. A coloração Bielschowsky permite observar: Placas amiloides e emaranhados neurofibrilares na região CA1, sugestivos da doença de Alzheimer. Estes achados não são suficientes para confirmar Alzheimer Imuno-histoquímica para Tau e β-amiloide: A imuno-histoquímica para β-amiloide e Tau hiperfosforilada confirma: Placas amiloides extensivas nas regiões CA1 e CA3, reforçando o diagnóstico de Alzheimer. Emaranhados neurofibrilares nas camadas do giro denteado e CA1, típicos da progressão de Alzheimer. Coloração Luxol Fast Blue (LFB): A coloração LFB revela: Perda de mielina em regiões específicas do hipocampo, indicando um possível componente vascular associado ao envelhecimento. Como afeta o diagnóstico? A desmielinização, juntamente com a perda neuronal, sugere demência mista, com possível componente vascular. Vermelho do Congo em vasos: Depósitos amiloides em vasos sanguíneos, sugerindo angiopatia amiloide cerebral, comum em demência vascular.  Nome específico da doença: Angiopatia Amiloide Cerebral (AAC) Declínio Cognitivo Progressivo com Alterações Hipocampais Discussão final: Qual a vossa conclusão? Que doença apresenta componente vascular (internet)? A combinação de Alzheimer e alterações vasculares sugere uma demência mista em particular angiopatia amiloide cerebral. Utilidade e limitações de cada tipo de coloração para o diagnostico? A análise com diversas técnicas histológicas demonstram como é possível diferenciar Alzheimer de outras patologias cognitivas, sublinhando a importância de técnicas complementares para diagnóstico diferencial. O diagnóstico final aponta para demência mista em particular angiopatia amiloide cerebral, dada a coexistência de emaranhados neurofibrilares, placas amiloides e alterações vasculares. TP4-Retinopatia Diabética Proliferativa Sintomas: Manchas na visão Visão embaciada Perda da visão súbita Distorção na visão Glaucoma neovascular Edema macular diabético Quais são as alterações histológicas típicas da retinopatia diabética proliferativa (RDP)? Alterações histológicas: Neovascularização Microaneurismas Hemorragias intrarretinianas e preretinianas Exsudatos duros Edema macular Tecido fibroso e formação de membranas epirretinianas  Perda de pericitos Biomarcadores: Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas (PDGF) Proteínas de Adesão Celular Citocinas e Marcadores Inflamatórios: IL-6, IL-1β e TNF-α Marcadores de Stresse Oxidativo Fibrina e Fibronectina Ácido Hialurónico e Colagenio Células Gliais Reativas (GFAP) Apoptose de Células Retinianas (ex.: expressão de caspases e TUNEL) Neovascularização: Novos vasos sanguíneos anormais, frágeis e propensos a ruturas e hemorragias na retina Microaneurismas: Dilatações nos capilares retinianos Hemorragias intrarretinianas e preretinianas: Frágeis e frequentemente rompem-hemorragias dentro da retina (intrarretinianas) e na camada entre a retina e o vítreo (preretinianas). Exsudatos duros: São depósitos de lipídios e proteínas que se acumulam devido ao vazamento dos capilares comprometidos. Podem aparecer na forma de pequenas manchas amareladas na retina. Edema macular: O acúmulo de fluido na região macular devido ao vazamento dos vasos sanguíneos danificados pode levar ao espessamento da retina e à formação de edema, afetando a visão central. Tecido fibroso e formação de membranas epirretinianas: A neovascularização frequentemente leva à formação de tecido cicatricial, que pode contrair e causar tração na retina. Isso pode resultar na formação de membranas epirretinianas e, em casos graves, causar o descolamento da retina. Perda de pericitos: Os pericitos, que são células de suporte ao redor dos capilares, são gradualmente perdidos na RDP devido ao stress metabólico da hiperglicemia. A perda dos pericitos contribui para a fragilidade dos vasos e para a formação de microaneurismas. Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF): O aumento do VEGF é um dos principais marcadores na RDP, pois promove a neovascularização e o vazamento dos vasos sanguíneos, sendo crucial na formação de vasos anormais. Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas (PDGF): O PDGF contribui para a proliferação de células nos vasos sanguíneos e a formação de tecido fibroso, que está associado com a tração e descolamento da retina. Proteínas de Adesão Celular (ex.: ICAM-1 e VCAM-1): A expressão elevada dessas proteínas reflete inflamação vascular e promove o recrutamento de células inflamatórias, exacerbando a lesão nos vasos sanguíneos. Perda de Pericitos: A ausência de pericitos, que sustentam e estabilizam os capilares retinianos, é um marcador inicial de dano vascular na retinopatia diabética e leva ao desenvolvimento de microaneurismas. Citocinas e Marcadores Inflamatórios: Altos níveis de citocinas como IL-6, IL-1β e TNF-α são encontrados em tecidos afetados, refletindo uma resposta inflamatória crónica que contribui para o agravamento da lesão retiniana. Marcadores de Stress Oxidativo (ex.: produtos avançados de glicação – AGEs e espécies reativas de oxigénio): O acúmulo de AGEs e outros marcadores de stress oxidativo contribui para a degeneração dos vasos sanguíneos e para a apoptose celular. Fibrina e Fibronectina: A deposição dessas proteínas na matriz extracelular está associada ao espessamento dos vasos e ao aumento da permeabilidade, um processo que promove edema e acúmulo de fluido. Ácido Hialurónico e Colagenio: Níveis elevados de ácido hialurónico e colagenio indicam o desenvolvimento de tecido cicatricial e fibrose, associando-se a tração e descolamento da retina. Células Gliais Reativas (ex.: GFAP): O aumento da expressão de GFAP indica ativação glial, um sinal de resposta inflamatória e de remodelação tecidual na retina. Apoptose de Células Retinianas (ex.: expressão de caspases e TUNEL): Marcadores de apoptose são comumente observados em células dos fotorreceptores e células ganglionares, indicando dano celular irreversível em estágios avançados da RDP. Retinopatia Diabética Proliferativa Vasos normais bloqueados e danificados-corpo liberta o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) (proteína) que levará à criação de novos vasos (mas anormais)- Esse processo é chamado de neovascularização e indica o quarto estágio da doença. O desenvolvimento de vasos anormais pode provocar a formação de tecido cicatricial. Esse tecido cicatricial pode puxar ou tracionar a retina, levando a uma condição chamada descolamento de retina. Os vasos também podem apresentar vazamento, permitindo que o sangue entre no humor vítreo (o fluido em forma de gel localizado na parte posterior do olho). Esse processo, conhecido como hemorragia vítrea, pode impedir que a luz alcance determinados pontos na retina. A hemorragia vítrea pode afetar a visão ou até bloquear completamente a visão. Embora possa se resolver sozinha com o tempo, a causa da hemorragia sempre exigirá algum tipo de tratamento. Avaliação pré-clínica do novo alvo terapêutico: Retinogen-PRO. Retinogen-PRO é uma combinação terapêutica de ação prolongada que une inibidores de VEGF de nova geração, com agentes anti-inflamatórios moduladores de IL-6 e TNF-α e uma nova molécula antioxidante que preserva a integridade celular da retina. A fórmula é projetada para bloquear a angiogénese patológica, reduzir a inflamação e proteger contra o dano oxidativo que contribui para a progressão da retinopatia. Avaliação pré-clínica do novo alvo terapêutico: Retinogen-PRO Avaliação pré-clínica do novo alvo terapêutico: Retinogen-PRO. Que modelo podíamos utilizar? Um modelo com diabetes induzida farmacologicamente Um modelo transgénico com sobre-expressão de VEGF Que colorações ou técnicas histológicas podemos utilizar?  Hematoxilina e Eosina (H&E) Imunohistoquímica (IHC) VEGF, IL-6, TNF-α, ICAM-1 e caspase-3. Coloração de PAS (Periodic Acid-Schiff) Coloração com Tricrómio de Masson Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) Hematoxilina e Eosina (H&E) Finalidade: H&E é uma coloração de rotina que ajuda a visualizar a arquitetura geral da retina e identificar alterações estruturais, como edema, presença de células inflamatórias e formação de tecido cicatricial. Aplicação no Retinogen-PRO: Avaliação geral da estrutura retiniana e observação de possíveis reduções em anormalidades estruturais, indicando preservação dos tecidos. 2. Imuno-histoquímica (IHC) Finalidade: A IHC utiliza anticorpos específicos para detectar proteínas associadas a processos relevantes na RDP, como VEGF, marcadores inflamatórios (IL-6, TNF-α), proteínas de adesão (ICAM-1) e marcadores de apoptose (caspase-3). Aplicação no Retinogen-PRO: VEGF: Avaliar se o Retinogen-PRO reduz os níveis de VEGF, indicando efeito antiangiogénico. IL-6 e TNF-α: Observar se há redução na expressão de citocinas inflamatórias. ICAM-1: Analisar a adesão e recrutamento de células inflamatórias, que podem diminuir com a terapia. 3. TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) Finalidade: Detecta fragmentação de DNA, um indicador de apoptose celular, especialmente útil para avaliar a morte de células ganglionares e fotorreceptores. Aplicação no Retinogen-PRO: Determinar se a terapia reduz a apoptose nas células da retina, mostrando efeito neuroprotetor. 4. Coloração de PAS (Periodic Acid-Schiff) Finalidade: Evidencia a membrana basal dos vasos sanguíneos, útil para identificar o espessamento da parede dos capilares, uma alteração comum na retinopatia diabética. Aplicação no Retinogen-PRO: Avaliar o efeito do medicamento na redução do espessamento capilar e na prevenção da formação de microaneurismas. 5. Imunofluorescência (IF)  Finalidade: Método para detectar múltiplos marcadores ao mesmo tempo, permitindo a visualização de proteínas como VEGF, PDGF e fatores de stress oxidativo (como os AGEs). Aplicação no Retinogen-PRO: VEGF e PDGF: Visualizar simultaneamente a expressão de VEGF e PDGF para avaliar o impacto antiangiogénico e antifibrótico do Retinogen-PRO. AGEs: Observar se o antioxidante no Retinogen-PRO reduz o stress oxidativo. 6. Coloração com Tricrómio de Masson Finalidade: Destaca fibras de colágeno, facilitando a identificação de tecido fibroso e cicatricial. Aplicação no Retinogen-PRO: Verificar se há redução na formação de tecido cicatricial e fibrose, um objetivo importante na prevenção de descolamento de retina. 7. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) Finalidade: Permite a análise ultraestrutural detalhada dos capilares retinianos e células neuronais. Aplicação no Retinogen-PRO: Observar diretamente as alterações nos pericitos, membranas basais e mitocôndrias, fornecendo uma visão detalhada do efeito protetor do medicamento nas células retinianas. Análise comparativa com os tratamentos atuais. Como poderíamos comparar histologicamente o novo tratamento com os existentes? Vantagens e desvantagens dos atuais? As injeções de anti-VEGF são eficazes para controlar a neovascularização, mas exigem aplicações repetidas e podem ter efeitos adversos a longo prazo. A fotocoagulação a laser reduz a neovascularização, mas destrói áreas da retina, o que pode levar a perda de visão periférica e noturna. Ambos os tratamentos focam em controlar a doença, mas não oferecem uma cura definitiva e podem ser limitados em casos avançados. A análise histológica permite identificar se a terapia preserva a estrutura retiniana, sem causar necrose ou inflamação adicional. Observações de uma redução da neovascularização e uma diminuição da inflamação são indicadores de uma resposta positiva. Adicionalmente, a ausência de danos não intencionais no tecido sugere que a terapia é segura. 4. Discussão e análise crítica Qual seria a estratégia ideal para o acompanhamento de pacientes tratados com a nova terapia?  O acompanhamento deve incluir exames de imagem (como OCT e angiografia) para monitorar a retina, medições de biomarcadores vítreos para avaliar a resposta inflamatória e angiogénica, além de controle regular da glicemia e pressão. Qual a importância do controle glicémico e da pressão arterial em conjunto com os tratamentos para a RDP? O controle glicémico e da pressão arterial é essencial para reduzir a progressão da retinopatia diabética. Altos níveis de glicose e pressão aumentam o risco de dano vascular na retina, promovendo a angiogénese e a inflamação. Quais são os possíveis desafios e limitações da nova terapia proposta? A terapia pode enfrentar desafios, como reações adversas à combinação de fármacos ou uma resposta limitada em doentes com RDP avançada. Além disso, o desenvolvimento de resistência ou adaptação ao tratamento é um risco, exigindo a monitorização contínua e possivelmente ajustes na formulação. Qual é o impacto esperado da nova terapia na qualidade de vida dos pacientes com retinopatia diabética proliferativa? Espera-se que a nova terapia reduza a frequência de injeções e procedimentos a laser, preservando a visão com menos efeitos adversos e melhorando a qualidade de vida dos doentes. Isso é especialmente significativo em doentes com RDP avançada, onde a preservação da visão é crucial. TP5 Alterações neuropatológicas em SCA2 O Cérebro e a região do cerebelo A estrutura do cortex cerebeloso Coloração com violeta de cresilo Utilizado na chamada “coloração de Nissl” Corante básico (“acidófilo) Cora ácidos nucleicos de roxo/azul - RNA no retículo endoplasmático e nos ribossomas (substância/grânulos/corpos de Nissl) - DNA no núcleo Método de Golgi Permite visualizar neurónios individuais e observar as suas projeções Cora alguns neurónios mas não outros, aleatoriamente Sais de prata precipitados coram as células de castanho/preto Método: 1. Incubação com dicromato de potássio 2. Secagem 3. Incubação com nitrato de prata 4. Formação de complexos de cromato de prata 5. Desidratação com álcool 6. Montagem das preparações com lâminas e lamelas Imunocitoquímica e imunohistoquímica Imunodeteção Imunocitoquímica e imunohistoquímica Quem é quem ? mouse anti -Calbindin (PCs) IHC vísivel DAB + ABC Coloração com Método de Golgi rabbit anti-ATXN2 IHC vísivel DAB + ABC mouse anti-Calbindin (PCs) IHC Fluorescência Alexa 488 Coloração violeta de cresilo Procurar um artigo científico na internet que tenha resultados de histologia do cerebelo. Identificar o contexto da investigação e com que objetivo se utilizou técnicas histológicas. Identificar que métodos quatitativos foram utilizados no contexto da investigação. TP6-Alterações neuropatológicas em SCA2 As camadas do cerebelo e o seu conteúdo celular Que dados podemos obter da análise histológica do cerebelo? - Diferentes técnicas histológicas produzem diferentes dados Que dados podemos obter da análise histológica do cerebelo? - Diferentes técnicas histológicas produzem diferentes dados Que dados podemos obter da análise histológica do cerebelo? - Diferentes técnicas histológicas produzem diferentes dados Quantificação automática pelo software Fiji/ImageJ - Adjust Threshold - O ajuste do threshold transforma uma imagem em binária balizando os que é considerada expressão verdadeira para uma proteína específica (ex. calbindina). - Esse ajuste tem de ser o mais ajustado à realidade possível para não dar “falsos positivos” ou “falsos negativos”. Quantificação automática pelo software Fiji/ImageJ - Analyse particles - O ajuste da quantificação do tamanho dos pixéis permite definir o que é uma partícula que é efetivamente uma célula e partículas que não representam uma célula Análise de dados - Que informações Podemos retirar de um gráfico com os dados obtidos? - Comparação de 2 grupos (WT vs TG) - Comparação dos grupos em diferentes timepoints. - Realizar estatística para verificar se as diferenças observadas são estatisticamente significativas. Nota: Só Podemos afirmar que existem diferenças quando p < 0,05 (*). COISAS IMPORTANTES - É essencial que todas as técnicas realizadas desde o desenho da experiencia, obtenção dos tecidos, realização das colorações/marcações histológicas, à análise de dados seja feita de forma meticulosa para que os resultados sejam o mais fiéis possível à realidade. - A coloração/marcação depende do que se está à procura analisar naquele tecido e experiência em específico. - Dependendo de cada coloração/marcação que se que fazer, diferentes preparações são necessárias ter em conta? Ex. Fixações de tecidos diferentes, protocolos diferentes, planos de corte diferentes, etc... PL1- Caracterização histopatológica da cartilagem articular do joelho Até 2030, a OA será a principal causa de incapacidade, afetando 35% da população, com 130 milhões de pessoas apresentando sintomas até 2050. A OA é multifatorial, resultando de um desequilíbrio entre estresse mecânico, predisposição genética e resposta imune nas articulações. Embora a maioria dos estudos se concentre na degeneração da cartilagem articular, o osso subcondral e a membrana sinovial também desempenham papéis importantes. Alterações na Cartilagem Articular: Aumento na percentagem de água na matriz extracelular (MEC) da cartilagem, devido à perda de glicosaminoglicanos, levando a inchaço e alterações nas propriedades mecânicas. A degradação da cartilagem inicia-se na zona superficial e pode progredir para camadas mais profundas, resultando em danos irreversíveis. Os condrócitos, ao responderem ao estresse mecânico, podem induzir processos catabólicos que afetam a MEC, contribuindo para a degeneração da cartilagem e esclerose do osso subcondral. Protocolo Experimental: O objetivo- analisar a cartilagem articular de dois grupos de ratinhos: um grupo controle (wild type) e um grupo mutante knockout para um gene relevante. Cada grupo é composto por 6 animais, com 3 seções de cartilagem em diferentes profundidades. A avaliação será feita de forma cega, utilizando uma tabela de classificação baseada no método de Glasson. Os resultados serão analisados estatisticamente para comparar a degradação da cartilagem entre os grupos. As classificações obtidas para as 3 profundidades em cada animal devem ser somadas, isto é, se um animal tiver 0,5; 1, 0,5 para o fémur e 1, 2, 2 para a tíbia, a classificação final deste animal será de 7, sendo que o Fémur=2 e Tíbia=5 Os alunos devem construir um gráfico de barras que expresse a média dos 4 valores para o grupo A e 4 valores para o grupo B. PL2-Coloração com Von Kossa Introdução Esta coloração é recorrentemente usada em processos histológicos pois permite detetar a presença de quantidades anormais de cálcio nos tecidos, evidenciado estruturas mineralizadas como os ossos e calcificações ectópicas nos tecidos. A técnica de Von Kossa é uma reação de dois passos, primeiro os catiões de prata reagem com componentes dos depósitos de cálcio, o que resulta numa coloração amarela transiente, enquanto o segundo passo, o material orgânico reduz os complexos de prata e cálcio, promovendo a deposição de um sal de cor preto metálico com a ajuda da exposição à luz. Procedimento: 1- Colocar as lâminas na hotte 2- Com a uma pipeta de Pasteur de plástico colocamos solução de nitrato de prata a 1%, na secção até preencher completamente o corte e aguardamos 30 min sob luz forte. 3- Lavar as amostras com água destilada. 4- Aplicar a solução de tiossulfato de sódio 2,5% por 5min. 5- Lavar as amostras com água destilada. 6- Coloração de contraste com azul de toluidina (1% em 0.1% Borax) por 1min. 7- Lavar as amostras com água destilada. 8- Etanol 96% 1min; 9- Etanol 100% 1min; 10- Xilol 100% 5min; 11- Montar preparação definitiva com meio de montagem DPX. Notas a ter em conta: Sendo a azul toluidina um corante histológico metacromático, significa que as cores obtidas vão variar segundo as ligações estabelecidas entre a solução e os elementos do tecido (por exemplo: ácidos nucleicos, proteínas e glicosaminoglicanos da ECM). As secções podem ser analisadas e diferenciadas segundo as seguintes cores: ▪ Sais de cálcio: preto ▪ Estrutura normal do tecido: azul ▪ Proteoglicanos e glicosaminoglicanos: rosado PL3- Coloração com Hematoxilina & Eosina Notas iniciais: Este procedimento deve ser realizado na Hotte! A Hematoxilina cora os ácidos nucleicos negativamente carregados (núcleos e ribossomas) de cor azul. A Eosina cora as proteínas de cor rosa. Materiais Conjunto de caixas (as caixas são identiLcadas individualmente com os nomes das soluções e colocadas na caixa de histologia média): Suporte para lâminas Solução de Hematoxilina modiLcada de acordo com Gill III Solução aquosa de Eosina Y 0,5% Meio de montagem (Eukitt Mounting Medium) Lâminas de vidro 50mm*15mm Pinças Xileno Água destilada Etanol 100% Etanol 95% Pipetas de Pasteur descartáveis  Procedimento 1. Coloque as lâminas com cortes em paraLna no suporte para lâminas. 2. Desparafine e reidrate as lâminas: Xileno (Hidratação) por 3 minutos Xileno (Hidratação) por 2 minutos Etanol 100% (Hidratação) por 4 minutos Etanol 95% (Hidratação) por 2 minutos Água destilada por 30 segundos Água destilada por 30 segundos 3. Coloque a lâmina na Hematoxilina por 30 segundos. 4. Lave com água destilada por 2 minutos. 5. Lave com água destilada por 1 minuto. 6. Realize a coloração com Eosina por 1 minuto 7. Lave com água destilada por 1 minuto. 8. Lave com água destilada por 1 minuto. 9. Desidrate e clariLque as lâminas passando o suporte pelas soluções de desidratação: Etanol 95% (Desidratação) por 1 minuto Etanol 100% (Desidratação) por 1 minuto Etanol 100% (Desidratação) por 1 minuto o d. Xileno (Desidratação) por 2 minutos Xileno (Desidratação) por 2 minutos Após secar, adicione o meio de montagem (3 gotas com a pipeta) e coloque a lamela a cobrir com a ajuda de pinças. PL4- Cérebro Histologia Retina delimita a porção posterior do olho e converte luz em estímulos neuroquímicos; é a porção do SNC visível do exterior Técnicas de coloração permitem identificar populações celulares distintas nas camadas da retina e identificar patologias. - Hematoxilina-eosina (núcleos e componentes celulares) - Coloração de Golgi-Cox (fotorreceptores) Marcações histológicas para olho e córtex visual Técnicas de coloração diferentes permitem identificar populações celulares distintas nas camadas do córtex visual e identificar patologias - Coloração de Nissl (marcação neuronal). Retinopatia Diabética Proliferativa (RDP) Sintomas:  Manchas na visão Visão embaciada Perda súbita da visão Distorção na visão pGlaucoma neovascular Edema macular diabético Alterações Histológicas Típicas: 1. Neovascularização: Formação de novos vasos sanguíneos anormais na retina, que são frágeis e propensos a rupturas. 2. Microaneurismas: Dilatações nos capilares retinianos, sinal inicial da retinopatia, que podem causar vazamentos. 3. Hemorragias intrarretinianas e preretinianas: Resultantes da ruptura de vasos frágeis. 4. Exsudatos duros: Depósitos de lipídios e proteínas devido ao vazamento dos capilares. 5. Edema macular: Acúmulo de fluido na região macular, afetando a visão central. 6. Tecido fibroso e membranas epirretinianas: Formação de tecido cicatricial que pode causar tração na retina. 7. Perda de pericitos: Células de suporte ao redor dos capilares, cuja perda contribui para a fragilidade vascular. Biomarcadores: VEGF: Promove neovascularização e vazamento vascular. PDGF: Contribui para a proliferação celular e formação de tecido fibroso. Proteínas de adesão celular: Indicadores de inflamação vascular. Citocinas inflamatórias (IL-6, IL-1β, TNF-α): Refletem resposta inflamatória crónica. Marcadores de stress oxidativo: Contribuem para a degeneração vascular. Fibrina e Fibronectina: Associadas ao espessamento e aumento da permeabilidade vascular. Ácido Hialurónico e Colágeno: Indicadores de fibrose e cicatrização. Células gliais reativas (GFAP): Sinalizam resposta inflamatória na retina. Apoptose de células retinianas: Indicadores de dano celular irreversível. A RDP é caracterizada por alterações significativas na retina, levando a complicações visuais graves, e é crucial monitorar os biomarcadores para entender a progressão da doença.