SEMINARIO 2_ AULA INVERSA PDF

SECUENCIACIÓN DEL DNA Permite conocer la estructura 1ria de la cadena de DNA y el orden de los nucleótidos. Métodos clásicos de secuenciación Next- Generation sequencing (NGS) 1ra generación (1977, Premio Nobel) 2da generación (Comercializado 2005) Metódod químico...

SECUENCIACIÓN DEL DNA Permite conocer la estructura 1ria de la cadena de DNA y el orden de los nucleótidos. Métodos clásicos de secuenciación Next- Generation sequencing (NGS) 1ra generación (1977, Premio Nobel) 2da generación (Comercializado 2005) Metódod químico (Maxam y Gilbert) + Se pueden secuenciar múltiples método enzimático ( Sanger) amplicones en paralelo, amplificados de manera clonal Se basa en secuencia un único Secuenciación del genoma humano fragmento de DNA, previamente Plataformas para la secuenciación amplificado (mediante un amplicón), masiva de DNA para obtener una única secuencia. 3ra generación (En desarrollo desde 2012) A partir de una única molécula de DNA No requiere amplificación clonal 4ta generación (En desarrollo) Secuenciación directa desde las células o los tejidos fijos MÉTODOS CLÁSICOS DE SECUENCIACIÓN DEL DNA : 1RA GENERACIÓN, MÉTODO DE SANGER O DIDESOXI (ddNTPs) Los didesoxinucleótidos (ddNTPs) son análogos a los desoxinucleótidos (dNTPs) → Estructura: No presenta un grupo hidroxilo en el C2 o C3 de la molécula de azúcar. Cuando hay ddNTPs en el medio, la DNA Polimerasa, los reconoce como nucleótidos, estableciendo un enlace fosfodiéster con un extremo 3’ que presente un hidroxilo libre en una cadena de crecimiento. En el caso contrario, las ddNTPs no podrán formar el enlace fosfodiéster También se las conoce como nucleótidos terminales porque finalizan la cadena. → ¿Cómo funciona? ○ LA INCORPORACIÓN DE UN ddNTP DETIENE LA DNA POLIMERASA Inicialmente se preparan 4 tubos separados con 4 reacciones paralelas en cada uno, que tendrán los siguientes elementos comunes: 1) DNA a secuenciar (molde) 2) Primer o cebador (monocatenaria, normalmente in vitro de DNA que hibridará en una zona de la cadena) 3) DNA Polimerasa 4) 4 dNTPs mezcla equimolar En los 4 tubos de reacción se podrá sintetizar DNA a partir del primer y los componentes necesarios. Además en cada uno de ellos se añadirá un ddNTPs diferente (ej.: ddATP, ddCTP, ddGTP o ddTTP). En el ejemplo de la imagen: Pondremos ddATP (didesoxinucleótido de Adenina) dentro del tubo , en el recuadro se nos representa la proporción que hay entre ddATP y dATP, equivalente a 1ddATP/ 100dATP. Cuando hayamos deshibridado la cadena de DNA molde a una temperatura alta de fusió, para después bajar la temperatura y conseguir la temperatura óptima dentro del tubo para conseguir la hibridación de los “primer”. Los “primer” hibridarán en las zonas homólogas y la DNA polimerasa en presencia de los nucleótidos comenzará a sintetizar DNA. Los dNTPs que se van sintetizando son los de color azul (los que habrá en mayor proporción) y a medida que se van añadiendo, de vez en cuando, la polimerasa añade un ddNTP, en este caso de adenina. Esto sucederá de forma independiente en cada una de las cadenas que se van sintetizando. Además que la concentración de moléculas de DNA molde es tan elevada que en el tubo encontraremos finalmente todas las posibilidades de cadena representadas que se pueden sintetizar con un ddNTP al final.  ○ ELECTROFORESI Y AUTORRADIOGRAFÍA DE UN GEL DE SECUENCIA En la imagen podemos observar lo que sucede en los 4 tubos de reacción (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), en los cuales tenemos una colección de productos de DNA de diferente tamaño según la localización del nucleótido terminal. Además se puede diferenciar el DNA de nueva síntesis del DNA molde y del DNA correspondiente a los “primer”. Esto es posibles gracias a que la síntesis del DNA se realiza en presencia de un desoxinucleótido marcado radioactivamente, lo que significa que cada vez que se incorpore un dNTPs, también se incorporará un ddNTPs radiactivo que podrá ser visualizado. Por tanto, tendremos una colección de 4 muestras de DNA radiactivas de diferente tamaño. El siguiente paso es una separación de fragmentos según su tamaño por electroforesis en geles de poliacrilamida (los fragmentos se diferencian en un solo nucleótido).Los contenidos de los 4 tubos se han de sembrar separadamente en cada una de las columnas de la electroforesis y el DNA comenzará a correr desde la parte superior (polo negativo, fragmentos más grandes) a la parte inferior (polo positivo, fragmentos más pequeños). Una vez ya tenemos el gel de la electroforesis, está se pone en contacto con una película autorradiográfica y los isótopos radiactivos utilizados para marcar estos nucleótidos permite la visualización de los nucleótidos ○ SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA CON TERMINADORES FLUORESCENTES El modelo de secuenciación de Sanger fue notablemente mejorado en los años 90 del s.XX. Para mejorar este modelo se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa, que también utiliza polimerasas del DNA. Este hecho dio paso al uso de marcadores fluorescentes en vez de radiactivos En este modelo no tendremos 4 tubos distintos, haremos todo el proceso en un solo tubo que tendrá: el DNA molde, los “primer”, polimerasa del DNA, mezcla equimolar de los 4 dNTPs y los 4 ddNTPs conjugados (modificados químicamente conjugados  cada uno a un fluorocromo diferente, es decir, emitirá una longitud de onda diferente cada uno para poder diferenciar por color el nucleótido terminal) El proceso comienza en el tubo con la deshibridación del DNA molde incrementando la temperatura y después dejamos hibridar los “primers” con los DNA. A partir de aquí, la polimerasa de DNA irá añadiendo los dNTPs y de vez en cuando, un ddNTPs. Como la cantidad del DNA molde y los “primers” será muy elevada ,tendremos una colección que presentará todas las posibilidades de un nucleótido a partir de la síntesis de un “primer” con diferentes ddNTPs en cadenas distintas de tamaño y de color de DNA. En esta mezclas de secuencias obtenidas de diferente tamaño y con un nucleótido terminal fluorescente distinto,se llevan a una electroforesis de DNA de grandes capilares que permiten diferenciar las cadenas según su tamaño en un sistema láser, de los fragmentos más pequeños a los más grandes. Finalmente, se obtiene un electroferograma que representa el orden de los nucleótidos según el pico de fluorescencia detectada. ○ LIMITACIONES DE LA METODOLOGÍA SANGER Solo se pueden determinar secuencias de hasta aprox. 800-900 parejas de bases. Esto se debe tanto a las características de la DNA polimerasa como a la resolución de la electroforesis capilar. Muchos genes contienen miles de parejas de bases. Los proyectos actuales de secuenciación pretenden obtener secuencias completas de grandes regiones genómicas (millones de bp). Como resultado, los proyectos de secuenciación implican la división del DNA en una colección de fragmentos solapados que requieren el posterior acoplamiento de estos fragmentos para obtener las secuencias completas (contigs = contiguous sequenced region) El acoplamiento de fragmentos solapados se hace computacionalmente (bioinformática). Es un proceso laborioso y caro; el Proyecto Genoma Humano costó aprox. 300 millones $. Cobertura de la secuencia 10x (todos los nucleótidos del genoma se secuencian al menos 10 veces, para asegurar la fiabilidad de secuenciación) Problemas: muchos genes están compuestos por 1000 de bases, para poder secuenciar mediante esta metodología, se ha de fragmentar el DNA, secuenciarse individualmente y conseguir solaparse entre ellos para poder conseguir el resultado final. SECUENCIACIÓN DE GENOMAS COMPLETOS A finales del siglo XX, se presentó el proceso de secuenciación de genomas completos basados en tecnología automatizada. 1990→ inicio del proyecto genoma humano 1995 →secuenciación de una bacteria 2001→ 1r borrador del genoma humano 2003→ genoma humano completado (más o menos) Tardaron 13 años aprox. en descubrir casi todo el genoma humano, con una fiabilidad del 99%, es decir de cada 1/10⁴ nucleótidos, hay uno erróneo. Aún así quedan pequeñas regiones de DNA repetitivo de heterocromatina sin saber. SECUENCIACIÓN DEL GENOMA HUMANO : HUMAN GENOME PROJECT VS. CELERA El Human Genome Project (HGP) fue realizado por un consorcio público internacional que utilizó una estrategia laboriosa (secuenciación jerárquica), donde inicialmente se hizo un mapa físico del genoma y se procedió a ir secuenciando fragmentos posicionados. Celera (WGP), una empresa privada, utilizó un método distinto, aplicó la fragmentación al azar Whole genome shotgun sequencing, que fue más rápido y preciso, además de menos laborioso, pero tuvo un mayor esfuerzo computacional. Después de años de competencia, se llegó a un acuerdo final. Ambos proyectos publicaron el 15 de febrero de 2001, el primer borrador del genoma humano a las revistas Nature (HGP) y Science (Celera, WGP). → PROCESO: 1) Fragmentación el genoma de DNA por métodos mecánicos (ultrasonidos) 2) Separación de los fragmentos por electroforesis de DNA (por tamaño) 3) Purificación de los fragmentos (aprox. 3000 pb) 4) Ligación con vectores de clonación para crear una biblioteca genómica. 5) Secuenciación inicial de los vectores de clonación (plásmidos) con los fragmentos de DNA, para observar la solapación de una secuencia y hacer un primer mapa del genoma 6) Selección de los contigs de las agrupaciones solapadas. VENTAJAS DEL NGS Las limitaciones del método Sanger han llevado a desarrollar plataformas que facilitan la secuenciación masiva de DNA: Next Generation Sequencing (NGS). → Procesos más rápidos y sencillos: no hace falta clonar en vectores de clonación, ni separar fragmentos de DNA en geles de acrilamida. La ligación de adaptadores (pequeño trozo de DNA bicatenario en ambos extremos) con secuencias universales genera bibliotecas fáciles de amplificar y secuenciar. El genoma de un individuo humano se puede secuenciar en 1-2 días y el bacteriano en pocas horas. → En lugar de trabajar en tubos o placas de micropozos, los fragmentos de las bibliotecas a secuenciar se amplifican, in situ, o sobre superficies sólidas, permitiendo miniaturizar el procedimiento. La miniaturización ha permitido incrementar masivamente el volumen de trabajo y disminuir enormemente el coste (el costo actual comerciar para particulares ronda en unos 800€ el genoma. ) PLATAFORMAS DE LA 2DA GENERACIÓN MÁS USADAS ACTUALMENTE POR LA SECUENCIACIÓN MASIVA DE DNA Se basan en secuenciar múltiples secuencias en paralelo del DNA Plataforma 454 (Life Science /Roche) Illumina/ Solexa 2005 2007 Amplificación clonal de los fragmentos Amplificación clonal de los fragmentos de DNA a secuenciar mediante PCR de DNA a secuenciar mediante PCR de emulsión. puente (con “primers” ligados a una Centenares de miles a millones de superficie sólida). lectura. Decenas de millones de lecturas. Longitud de lectura: 400-500 nucleótidos Longitud de lectura: 100-200 nucleótidos. SOLID ™ (Sequencing by Oligo Ligation Ion Torrent (Life Technologies) and Detection, Applied Biosystems) 2007 2010 Secuenciación por ligación. Monitorización por cambios de pH Decenas de millones de lecturas (generación de hidrogeniones durante la formación de los enlaces 3’-5’ fosfodiester). Decenas de millones de lecturas ○ SECUENCIADOR 454: PIROSECUENCIACIÓN Tenemos un DNA grande que queremos secuenciar: 1) Fragmentación DNA 2) Ligación en los extremos de adaptadores (pequeños fragmentos de DNA y de secuencia conocida), representados con las letras A y B 3) El adaptador B permite la hibridación con oligonucleótidos covalentemente unidos a microesferas de agarosa en una solución especial ( emulsión oleosa) 4) En la emulsión oleosa se llevará a cabo la amplificación clonal mediante el proceso de PCR de emulsión.En una de las esferas se ligará con un solo fragmento del DNA del genoma, cada una de estas microesferas estará dentro de una gota. Contiene por tanto los elementos para realizar una PCR. 5) Las microesferas se comportará como un microreactor que se depositará en una micropozos de una microplaca para proceder la secuenciación de los fragmentos amplificados Cada microplaca contiene centenares de miles de micropozos.Se basa en sintetizar DNA y la formación de una molécula de pirofosfato inorgánico (cada vez que incorporamos un nucleótido en la cadena de DNA en crecimiento) que permitirá la síntesis de ATP. Finalmente, para emitir luz y definir la secuenciación. Se utilizan dNTPs no modificados (normales), pero añadidos en ciclos de uno en uno (no los 4 simultáneamente). Cuando la polimerasa de DNA adiciona un nucleótido se libera una molécula de pirofosfato inorgánico, el cúal será transformado por una sulfurilasa a ATP. La molécula de ATP activa la reacción catalizada por la luciferasa, la cúal en presencia del sustrato luciferina emite luz detectable con una intensidad proporcional al nº de nucleótidos añadidos. Finalmente, una apirasa, elimina los nucleótidos no incorporados y se puede pasar al ciclo siguiente. La adición de nucleótidos se detecta por quimioluminiscencia.  ○ SECUENCIADOR ILLUMINA: SECUENCIACIÓN CON TERMINADORES REVERSIBLES Se amplifica el DNA a secuenciar para crear una biblioteca de fragmentos pequeños de DNA con unos adaptadores que se utilizarán para hibridar con “primers” a partir de los cuales tendrá lugar la secuenciación por el método de PCR puente. Se realiza la secuenciación en presencia de la polimerasa DNA y una mezcla de dNTPs modificados: fluorescentes (con fluorocromos, uno por cada tipo de nucleótido) y terminadores (con extremos 3’ -OH bloqueado de manera reversible). Después del ciclo se eliminan químicamente o por pirólisis el fluorocromo y el bloqueo en 3’-OH. Finalmente se limpia y se inicia un nuevo ciclo de secuenciación. Ej. de la imagen: incorporación de una TIMINA con fluorocromo y un extremo 3’ -OH bloqueado, se emite la fluorescencia, se detecta y el sistema elimina el fluorocromo.Este deja de ser fluorescente y se desbloquea el 3’-OH dejando que el siguiente nucleótido actúe, de forma sucesiva se detectan e incorporan los nucleótidos fluorescentes.