Secuenciación del DNA y Métodos Clásicos
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Questions and Answers

¿Qué se visualiza como resultado de incorporar desoxinucleótidos marcados radiactivamente en la síntesis de DNA?

  • Un gel de poliacrilamida
  • El DNA molde y los primers (correct)
  • Muestras de proteínas
  • Fragmentos de RNA

    • ¿Cuál es el efecto de la electroforesis en gel sobre los fragmentos de DNA?

  • Se separan según su tamaño (correct)
  • Se transforman en RNA
  • Se aumentan de tamaño
  • Se separan según su carga

    • ¿Qué tipo de nucleótidos se utilizan en la secuenciación de Sanger?

  • Desoxinucleótidos y didesoxinucleótidos (correct)
  • Nucleótidos sintetizados químicamente
  • Desoxinucleótidos marcados con fluorescencia
  • Nucleótidos de RNA

    • ¿Cómo se organizan las muestras en la electroforesis?

    <p>Se siembran en columnas separadas</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué se utiliza para visualizar los nucleótidos después de la electroforesis?

    <p>Una película autorradiográfica</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál fue una mejora notable en la secuenciación de Sanger en los años 90?

    <p>La implementación de la reacción en cadena de la polimerasa</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el orden de movimiento de los fragmentos de DNA durante la electroforesis?

    <p>De polo negativo a polo positivo</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué se diferencia en el producto de DNA durante el proceso de electroforesis?

    <p>El tamaño de los fragmentos</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es la principal diferencia entre la secuenciación de primera generación y la de segunda generación?

    <p>La primera generación solo analiza un fragmento de DNA, mientras que la segunda puede secuenciar múltiples amplicones en paralelo.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué hace que los didesoxinucleótidos (ddNTPs) sean diferentes de los desoxinucleótidos (dNTPs)?

    <p>Los ddNTPs finalizan la cadena, impidiendo la elongación del DNA.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es una de las características de la secuenciación de tercera generación?

    <p>Puede realizarse a partir de una única molécula de DNA.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué aspecto caracteriza a las plataformas de secuenciación de segunda generación?

    <p>Permiten secuenciar el genoma humano de manera masiva.</p> Signup and view all the answers

    En el método de Sanger, ¿qué efecto tienen los ddNTPs en la elongación de la cadena de DNA?

    <p>Los ddNTPs causan la finalización de la cadena de DNA.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué método de secuenciación se desarrolló primero y ganó el Premio Nobel en 1977?

    <p>Primera generación mediante el método de Sanger.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué ventaja representa la cuarta generación de secuenciación?

    <p>Permite la secuenciación directa desde células o tejidos fijos.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es una desventaja del método químico de secuenciación desarrollado por Maxam y Gilbert?

    <p>Se basa en propiedades químicas que pueden ser peligrosas.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el objetivo principal de la secuenciación de fragmentos de DNA en proyectos de secuenciación?

    <p>Obtener secuencias completas mediante el acoplamiento de fragmentos solapados.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué método utilizó el Proyecto Genoma Humano para secuenciar el genoma?

    <p>Secuenciación jerárquica.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál fue un hito importante en la secuenciación del genoma humano?

    <p>La finalización del genoma humano en 2003.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál de las siguientes afirmaciones refleja correctamente un aspecto de la secuenciación del genoma?

    <p>La cobertura de secuencias de 10x asegura la fiabilidad de la secuenciación.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál fue la principal ventaja del método utilizado por Celera en comparación con el Proyecto Genoma Humano?

    <p>Mayor esfuerzo computacional y mayor precisión.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es uno de los pasos en el proceso de secuenciación de genomas completos?

    <p>Fragmentación del genoma de DNA por métodos mecánicos.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué significa tener una fiabilidad del 99% en la secuenciación del genoma humano?

    <p>De cada 1 de cada 10^4 nucleótidos, hay uno erróneo.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué problemas enfrenta la secuenciación de genes compuestos por 1000 bases?

    <p>Requiere que se solapen entre ellos para obtener resultados.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es una ventaja principal del método de secuenciación Next Generation Sequencing (NGS) en comparación con el método Sanger?

    <p>No es necesario clonar en vectores de clonación.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué permiten las ligaduras de adaptadores en NGS?

    <p>Crear bibliotecas fáciles de amplificar y secuenciar.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es la longitud de lectura aproximada de la plataforma Illumina/Solexa?

    <p>100-200 nucleótidos.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es la función de la amplificación clonal en las plataformas de NGS?

    <p>Generar suficientes copias de fragmentos de ADN para la secuenciación.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué característica tiene la plataforma 454 en comparación con otras plataformas?

    <p>Utiliza amplificación de emulsión.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué representa el costo actual de la secuenciación de un genoma humano a nivel comercial?

    <p>Alrededor de 800€.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es un método utilizado por Ion Torrent para monitorear la secuenciación?

    <p>Cambios de pH durante los enlaces 3'-5'.</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué se logra con la miniaturización en los procesos de secuenciación?

    <p>Aumentar el volumen de trabajo y reducir costos.</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el primer paso en el proceso de pirosecuenciación del DNA?

    <p>Fragmentación del DNA</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es el rol de la sulfurilasa en la pirosecuenciación?

    <p>Transformar pirofosfato inorgánico en ATP</p> Signup and view all the answers

    En el método de la secuenciación Illumina, ¿qué se utiliza para marcar los diferentes nucleótidos?

    <p>Adaptadores con fluorocromos</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué ocurre en el ciclo de la pirosecuenciación cuando se añade un nucleótido a la cadena de DNA en crecimiento?

    <p>Se produce pirofosfato inorgánico</p> Signup and view all the answers

    ¿Cuál es la función de la luciferasa en el proceso de pirosecuenciación?

    <p>Emitir luz en presencia de ATP</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué tipo de nucleótidos se utilizan en la secuenciación Illumina?

    <p>Nucleótidos modificados y no modificados</p> Signup and view all the answers

    En el proceso de pirosecuenciación, ¿qué se forma cada vez que se incorpora un nucleótido a la cadena de DNA?

    <p>Pirofosfato inorgánico</p> Signup and view all the answers

    ¿Qué tipo de reacción se realiza en la emulsión oleosa durante la pirosecuenciación?

    <p>Reacción de amplificación clonal</p> Signup and view all the answers

    Study Notes

    Secuenciación del DNA

    • Permite determinar la estructura primaria de la cadena de DNA y el orden de los nucleótidos.

    Métodos de Secuenciación

    • Métodos clásicos de secuenciación:
      • 1ra generación (1977, Premio Nobel):
        • Método químico (Maxam y Gilbert) + método enzimático (Sanger).
        • Secuencia un único fragmento de DNA previamente amplificado.
      • Next-Generation Sequencing (NGS):
        • 2da generación (Comercializado 2005):
          • Secuencia múltiples amplicones en paralelo, amplificados de manera clonal.
          • Secuenciación del genoma humano.
          • Plataformas para la secuenciación masiva de DNA.
        • 3ra generación (En desarrollo desde 2012):
          • Secuenciación a partir de una única molécula de DNA.
          • No requiere amplificación clonal.
        • 4ta generación (En desarrollo):
          • Secuenciación directa desde las células o los tejidos fijos.

    Métodos Clásicos de Secuenciación del DNA: 1ra Generación, Método de Sanger o Didesoxi (ddNTPs)

    • Didesoxinucleótidos (ddNTPs):
      • Son análogos a los desoxinucleótidos (dNTPs).
      • No presentan un grupo hidroxilo en el C2 o C3 de la molécula de azúcar.
      • Son reconocidos como nucleótidos por la DNA Polimerasa, estableciendo un enlace fosfodiéster con un extremo 3' libre en una cadena de crecimiento.
      • No pueden formar el enlace fosfodiéster si no hay un hidroxilo libre en el extremo 3'.
      • Finalizan la cadena, por lo que se les conoce como nucleótidos terminales.

    Cómo Funciona el Método de Sanger

    • Electroforesis y Autorradiografía de un Gel de Secuencia:
      • Se utiliza una colección de productos de DNA de diferente tamaño según la localización del nucleótido terminal.
      • Se diferencian el DNA de nueva síntesis del DNA molde y del DNA correspondiente a los “primer”.
      • Se utiliza un desoxinucleótido marcado radioactivamente.
      • Cada vez que se incorpora un dNTPs, también se incorpora un ddNTPs radiactivo, el cual se visualiza.
      • Se realiza una separación de fragmentos según su tamaño por electroforesis en geles de poliacrilamida.
      • Los fragmentos se diferencian en un solo nucleótido.
      • Se utiliza una película autorradiográfica para visualizar los isótopos radiactivos.
    • Secuenciación Automática con Terminadores Fluorescentes:
      • Mejorado en los años 90 del s.XX.
      • Se utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
      • Se divide el DNA en fragmentos solapados que se acoplan para obtener las secuencia completas (contigs).
      • El acoplamiento de fragmentos se realiza computacionalmente (bioinformática).
      • La cobertura de la secuencia 10x garantiza la fiabilidad de la secuenciación.

    Secuenciación de Genomas Completos

    • A finales del siglo XX:
      • Se presentó el proceso de secuenciación de genomas completos basado en tecnología automatizada.
    • Proyecto Genoma Humano (HGP)
      • Iniciación en 1990.
      • Secuenciación completa del genoma humano en 2003.
    • Celera vs. HGP:
      • Celera (WGP) utilizó un método más rápido y preciso, la fragmentación al azar llamada Whole genome shotgun sequencing.
      • Ambos proyectos publicaron el 15 de febrero de 2001 el primer borrador del genoma humano, en las revistas Nature (HGP) y Science (Celera, WGP).
    • Proceso de Secuenciación del Genoma Humano:
      • Fragmentación del genoma por métodos mecánicos.
      • Separación de los fragmentos por electroforesis.
      • Purificación de los fragmentos.
      • Ligación con vectores de clonación para crear una biblioteca genómica.
      • Secuenciación inicial de los vectores de clonación.
      • Selección de contigs de las agrupaciones solapadas.

    Ventajas del Next Generation Sequencing (NGS)

    • Procesos más rápidos y sencillos:
      • Se elimina la necesidad de clonar en vectores de clonación y separar los fragmentos de DNA en geles de acrilamida.
      • Se utilizan adaptadores con secuencias universales para generar bibliotecas fáciles de amplificar y secuenciar.
    • Miniaturización y aumento del volumen de trabajo:
      • La amplificación de los fragmentos se realiza in situ o sobre superficies sólidas.
      • Se incrementa el volumen de trabajo y se disminuye el coste.

    Plataformas de la 2da Generación más Usadas para la Secuenciación Masiva de DNA

    • Plataforma 454 (Life Science /Roche):
      • Amplificación clonal de los fragmentos de DNA por PCR de emulsión.
      • Centenares de miles a millones de lecturas.
      • Longitud de lectura: 400-500 nucleótidos.
    • Illumina/ Solexa:
      • Amplificación clonal de los fragmentos de DNA por PCR puente.
      • Decenas de millones de lecturas.
      • Longitud de lectura: 100-200 nucleótidos.
    • SOLID ™ (Sequencing by Oligo Ligation and Detection, Applied Biosystems):
      • Secuenciación por ligación.
      • Monitorización por cambios de pH.
      • Decenas de millones de lecturas.
    • Ion Torrent (Life Technologies):
      • Monitorización por cambios de pH (generación de hidrogeniones durante la formación de los enlaces 3'-5' fosfodiester).
      • Decenas de millones de lecturas.

    Secuenciador 454: Pirosecuenciación

    • Principio:
      • Se sintetiza DNA y se genera una molécula de pirofosfato inorgánico (cada vez que se incorpora un nucleótido en la cadena de DNA en crecimiento).
      • Se utiliza una sulfurilasa para transformar el pirofosfato inorgánico a ATP.
      • La luciferasa, activa por el ATP, genera luz detectable con una intensidad proporcional al número de nucleótidos añadidos.
      • Se utilizan nucleótidos no modificados, añadidos en ciclos de uno en uno.

    Secuenciador Illumina: Secuenciación con Terminadores Reversibles

    • Principio:
      • Se utiliza PCR puente para amplificar el DNA.
      • Se usan dNTPs modificados: fluorescentes y terminadores.
      • Se bloquea de forma reversible el extremo 3' -OH para evitar la incorporación de más nucleótidos.
      • Se usa una polimerasa DNA.

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