Secuenciación del DNA y Métodos Clásicos

Secuenciación del DNA

• Permite determinar la estructura primaria de la cadena de DNA y el orden de los nucleótidos.

Métodos de Secuenciación

• Métodos clásicos de secuenciación:
  • 1ra generación (1977, Premio Nobel):
    • Método químico (Maxam y Gilbert) + método enzimático (Sanger).
    • Secuencia un único fragmento de DNA previamente amplificado.
  • Next-Generation Sequencing (NGS):
    • 2da generación (Comercializado 2005):
      • Secuencia múltiples amplicones en paralelo, amplificados de manera clonal.
      • Secuenciación del genoma humano.
      • Plataformas para la secuenciación masiva de DNA.
    • 3ra generación (En desarrollo desde 2012):
      • Secuenciación a partir de una única molécula de DNA.
      • No requiere amplificación clonal.
    • 4ta generación (En desarrollo):
      • Secuenciación directa desde las células o los tejidos fijos.

Métodos Clásicos de Secuenciación del DNA: 1ra Generación, Método de Sanger o Didesoxi (ddNTPs)

• Didesoxinucleótidos (ddNTPs):
  • Son análogos a los desoxinucleótidos (dNTPs).
  • No presentan un grupo hidroxilo en el C2 o C3 de la molécula de azúcar.
  • Son reconocidos como nucleótidos por la DNA Polimerasa, estableciendo un enlace fosfodiéster con un extremo 3' libre en una cadena de crecimiento.
  • No pueden formar el enlace fosfodiéster si no hay un hidroxilo libre en el extremo 3'.
  • Finalizan la cadena, por lo que se les conoce como nucleótidos terminales.

Cómo Funciona el Método de Sanger

• Electroforesis y Autorradiografía de un Gel de Secuencia:
  • Se utiliza una colección de productos de DNA de diferente tamaño según la localización del nucleótido terminal.
  • Se diferencian el DNA de nueva síntesis del DNA molde y del DNA correspondiente a los “primer”.
  • Se utiliza un desoxinucleótido marcado radioactivamente.
  • Cada vez que se incorpora un dNTPs, también se incorpora un ddNTPs radiactivo, el cual se visualiza.
  • Se realiza una separación de fragmentos según su tamaño por electroforesis en geles de poliacrilamida.
  • Los fragmentos se diferencian en un solo nucleótido.
  • Se utiliza una película autorradiográfica para visualizar los isótopos radiactivos.
• Secuenciación Automática con Terminadores Fluorescentes:
  • Mejorado en los años 90 del s.XX.
  • Se utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
  • Se divide el DNA en fragmentos solapados que se acoplan para obtener las secuencia completas (contigs).
  • El acoplamiento de fragmentos se realiza computacionalmente (bioinformática).
  • La cobertura de la secuencia 10x garantiza la fiabilidad de la secuenciación.

Secuenciación de Genomas Completos

• A finales del siglo XX:
  • Se presentó el proceso de secuenciación de genomas completos basado en tecnología automatizada.
• Proyecto Genoma Humano (HGP)
  • Iniciación en 1990.
  • Secuenciación completa del genoma humano en 2003.
• Celera vs. HGP:
  • Celera (WGP) utilizó un método más rápido y preciso, la fragmentación al azar llamada Whole genome shotgun sequencing.
  • Ambos proyectos publicaron el 15 de febrero de 2001 el primer borrador del genoma humano, en las revistas Nature (HGP) y Science (Celera, WGP).
• Proceso de Secuenciación del Genoma Humano:
  • Fragmentación del genoma por métodos mecánicos.
  • Separación de los fragmentos por electroforesis.
  • Purificación de los fragmentos.
  • Ligación con vectores de clonación para crear una biblioteca genómica.
  • Secuenciación inicial de los vectores de clonación.
  • Selección de contigs de las agrupaciones solapadas.

Ventajas del Next Generation Sequencing (NGS)

• Procesos más rápidos y sencillos:
  • Se elimina la necesidad de clonar en vectores de clonación y separar los fragmentos de DNA en geles de acrilamida.
  • Se utilizan adaptadores con secuencias universales para generar bibliotecas fáciles de amplificar y secuenciar.
• Miniaturización y aumento del volumen de trabajo:
  • La amplificación de los fragmentos se realiza in situ o sobre superficies sólidas.
  • Se incrementa el volumen de trabajo y se disminuye el coste.

Plataformas de la 2da Generación más Usadas para la Secuenciación Masiva de DNA

• Plataforma 454 (Life Science /Roche):
  • Amplificación clonal de los fragmentos de DNA por PCR de emulsión.
  • Centenares de miles a millones de lecturas.
  • Longitud de lectura: 400-500 nucleótidos.
• Illumina/ Solexa:
  • Amplificación clonal de los fragmentos de DNA por PCR puente.
  • Decenas de millones de lecturas.
  • Longitud de lectura: 100-200 nucleótidos.
• SOLID ™ (Sequencing by Oligo Ligation and Detection, Applied Biosystems):
  • Secuenciación por ligación.
  • Monitorización por cambios de pH.
  • Decenas de millones de lecturas.
• Ion Torrent (Life Technologies):
  • Monitorización por cambios de pH (generación de hidrogeniones durante la formación de los enlaces 3'-5' fosfodiester).
  • Decenas de millones de lecturas.

Secuenciador 454: Pirosecuenciación

• Principio:
  • Se sintetiza DNA y se genera una molécula de pirofosfato inorgánico (cada vez que se incorpora un nucleótido en la cadena de DNA en crecimiento).
  • Se utiliza una sulfurilasa para transformar el pirofosfato inorgánico a ATP.
  • La luciferasa, activa por el ATP, genera luz detectable con una intensidad proporcional al número de nucleótidos añadidos.
  • Se utilizan nucleótidos no modificados, añadidos en ciclos de uno en uno.

Secuenciador Illumina: Secuenciación con Terminadores Reversibles

• Principio:
  • Se utiliza PCR puente para amplificar el DNA.
  • Se usan dNTPs modificados: fluorescentes y terminadores.
  • Se bloquea de forma reversible el extremo 3' -OH para evitar la incorporación de más nucleótidos.
  • Se usa una polimerasa DNA.