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Questions and Answers
¿Qué se visualiza como resultado de incorporar desoxinucleótidos marcados radiactivamente en la síntesis de DNA?
¿Cuál es el efecto de la electroforesis en gel sobre los fragmentos de DNA?
¿Qué tipo de nucleótidos se utilizan en la secuenciación de Sanger?
¿Cómo se organizan las muestras en la electroforesis?
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¿Qué se utiliza para visualizar los nucleótidos después de la electroforesis?
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¿Cuál fue una mejora notable en la secuenciación de Sanger en los años 90?
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¿Cuál es el orden de movimiento de los fragmentos de DNA durante la electroforesis?
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¿Qué se diferencia en el producto de DNA durante el proceso de electroforesis?
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¿Cuál es la principal diferencia entre la secuenciación de primera generación y la de segunda generación?
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¿Qué hace que los didesoxinucleótidos (ddNTPs) sean diferentes de los desoxinucleótidos (dNTPs)?
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¿Cuál es una de las características de la secuenciación de tercera generación?
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¿Qué aspecto caracteriza a las plataformas de secuenciación de segunda generación?
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En el método de Sanger, ¿qué efecto tienen los ddNTPs en la elongación de la cadena de DNA?
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¿Qué método de secuenciación se desarrolló primero y ganó el Premio Nobel en 1977?
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¿Qué ventaja representa la cuarta generación de secuenciación?
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¿Cuál es una desventaja del método químico de secuenciación desarrollado por Maxam y Gilbert?
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¿Cuál es el objetivo principal de la secuenciación de fragmentos de DNA en proyectos de secuenciación?
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¿Qué método utilizó el Proyecto Genoma Humano para secuenciar el genoma?
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¿Cuál fue un hito importante en la secuenciación del genoma humano?
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¿Cuál de las siguientes afirmaciones refleja correctamente un aspecto de la secuenciación del genoma?
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¿Cuál fue la principal ventaja del método utilizado por Celera en comparación con el Proyecto Genoma Humano?
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¿Cuál es uno de los pasos en el proceso de secuenciación de genomas completos?
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¿Qué significa tener una fiabilidad del 99% en la secuenciación del genoma humano?
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¿Qué problemas enfrenta la secuenciación de genes compuestos por 1000 bases?
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¿Cuál es una ventaja principal del método de secuenciación Next Generation Sequencing (NGS) en comparación con el método Sanger?
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¿Qué permiten las ligaduras de adaptadores en NGS?
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¿Cuál es la longitud de lectura aproximada de la plataforma Illumina/Solexa?
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¿Cuál es la función de la amplificación clonal en las plataformas de NGS?
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¿Qué característica tiene la plataforma 454 en comparación con otras plataformas?
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¿Qué representa el costo actual de la secuenciación de un genoma humano a nivel comercial?
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¿Cuál es un método utilizado por Ion Torrent para monitorear la secuenciación?
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¿Qué se logra con la miniaturización en los procesos de secuenciación?
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¿Cuál es el primer paso en el proceso de pirosecuenciación del DNA?
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¿Cuál es el rol de la sulfurilasa en la pirosecuenciación?
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En el método de la secuenciación Illumina, ¿qué se utiliza para marcar los diferentes nucleótidos?
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¿Qué ocurre en el ciclo de la pirosecuenciación cuando se añade un nucleótido a la cadena de DNA en crecimiento?
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¿Cuál es la función de la luciferasa en el proceso de pirosecuenciación?
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¿Qué tipo de nucleótidos se utilizan en la secuenciación Illumina?
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En el proceso de pirosecuenciación, ¿qué se forma cada vez que se incorpora un nucleótido a la cadena de DNA?
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¿Qué tipo de reacción se realiza en la emulsión oleosa durante la pirosecuenciación?
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Study Notes
Secuenciación del DNA
- Permite determinar la estructura primaria de la cadena de DNA y el orden de los nucleótidos.
Métodos de Secuenciación
-
Métodos clásicos de secuenciación:
-
1ra generación (1977, Premio Nobel):
- Método químico (Maxam y Gilbert) + método enzimático (Sanger).
- Secuencia un único fragmento de DNA previamente amplificado.
-
Next-Generation Sequencing (NGS):
-
2da generación (Comercializado 2005):
- Secuencia múltiples amplicones en paralelo, amplificados de manera clonal.
- Secuenciación del genoma humano.
- Plataformas para la secuenciación masiva de DNA.
-
3ra generación (En desarrollo desde 2012):
- Secuenciación a partir de una única molécula de DNA.
- No requiere amplificación clonal.
-
4ta generación (En desarrollo):
- Secuenciación directa desde las células o los tejidos fijos.
-
2da generación (Comercializado 2005):
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1ra generación (1977, Premio Nobel):
Métodos Clásicos de Secuenciación del DNA: 1ra Generación, Método de Sanger o Didesoxi (ddNTPs)
-
Didesoxinucleótidos (ddNTPs):
- Son análogos a los desoxinucleótidos (dNTPs).
- No presentan un grupo hidroxilo en el C2 o C3 de la molécula de azúcar.
- Son reconocidos como nucleótidos por la DNA Polimerasa, estableciendo un enlace fosfodiéster con un extremo 3' libre en una cadena de crecimiento.
- No pueden formar el enlace fosfodiéster si no hay un hidroxilo libre en el extremo 3'.
- Finalizan la cadena, por lo que se les conoce como nucleótidos terminales.
Cómo Funciona el Método de Sanger
-
Electroforesis y Autorradiografía de un Gel de Secuencia:
- Se utiliza una colección de productos de DNA de diferente tamaño según la localización del nucleótido terminal.
- Se diferencian el DNA de nueva síntesis del DNA molde y del DNA correspondiente a los “primer”.
- Se utiliza un desoxinucleótido marcado radioactivamente.
- Cada vez que se incorpora un dNTPs, también se incorpora un ddNTPs radiactivo, el cual se visualiza.
- Se realiza una separación de fragmentos según su tamaño por electroforesis en geles de poliacrilamida.
- Los fragmentos se diferencian en un solo nucleótido.
- Se utiliza una película autorradiográfica para visualizar los isótopos radiactivos.
-
Secuenciación Automática con Terminadores Fluorescentes:
- Mejorado en los años 90 del s.XX.
- Se utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
- Se divide el DNA en fragmentos solapados que se acoplan para obtener las secuencia completas (contigs).
- El acoplamiento de fragmentos se realiza computacionalmente (bioinformática).
- La cobertura de la secuencia 10x garantiza la fiabilidad de la secuenciación.
Secuenciación de Genomas Completos
-
A finales del siglo XX:
- Se presentó el proceso de secuenciación de genomas completos basado en tecnología automatizada.
-
Proyecto Genoma Humano (HGP)
- Iniciación en 1990.
- Secuenciación completa del genoma humano en 2003.
-
Celera vs. HGP:
- Celera (WGP) utilizó un método más rápido y preciso, la fragmentación al azar llamada Whole genome shotgun sequencing.
- Ambos proyectos publicaron el 15 de febrero de 2001 el primer borrador del genoma humano, en las revistas Nature (HGP) y Science (Celera, WGP).
-
Proceso de Secuenciación del Genoma Humano:
- Fragmentación del genoma por métodos mecánicos.
- Separación de los fragmentos por electroforesis.
- Purificación de los fragmentos.
- Ligación con vectores de clonación para crear una biblioteca genómica.
- Secuenciación inicial de los vectores de clonación.
- Selección de contigs de las agrupaciones solapadas.
Ventajas del Next Generation Sequencing (NGS)
-
Procesos más rápidos y sencillos:
- Se elimina la necesidad de clonar en vectores de clonación y separar los fragmentos de DNA en geles de acrilamida.
- Se utilizan adaptadores con secuencias universales para generar bibliotecas fáciles de amplificar y secuenciar.
-
Miniaturización y aumento del volumen de trabajo:
- La amplificación de los fragmentos se realiza in situ o sobre superficies sólidas.
- Se incrementa el volumen de trabajo y se disminuye el coste.
Plataformas de la 2da Generación más Usadas para la Secuenciación Masiva de DNA
-
Plataforma 454 (Life Science /Roche):
- Amplificación clonal de los fragmentos de DNA por PCR de emulsión.
- Centenares de miles a millones de lecturas.
- Longitud de lectura: 400-500 nucleótidos.
-
Illumina/ Solexa:
- Amplificación clonal de los fragmentos de DNA por PCR puente.
- Decenas de millones de lecturas.
- Longitud de lectura: 100-200 nucleótidos.
-
SOLID ™ (Sequencing by Oligo Ligation and Detection, Applied Biosystems):
- Secuenciación por ligación.
- Monitorización por cambios de pH.
- Decenas de millones de lecturas.
-
Ion Torrent (Life Technologies):
- Monitorización por cambios de pH (generación de hidrogeniones durante la formación de los enlaces 3'-5' fosfodiester).
- Decenas de millones de lecturas.
Secuenciador 454: Pirosecuenciación
-
Principio:
- Se sintetiza DNA y se genera una molécula de pirofosfato inorgánico (cada vez que se incorpora un nucleótido en la cadena de DNA en crecimiento).
- Se utiliza una sulfurilasa para transformar el pirofosfato inorgánico a ATP.
- La luciferasa, activa por el ATP, genera luz detectable con una intensidad proporcional al número de nucleótidos añadidos.
- Se utilizan nucleótidos no modificados, añadidos en ciclos de uno en uno.
Secuenciador Illumina: Secuenciación con Terminadores Reversibles
-
Principio:
- Se utiliza PCR puente para amplificar el DNA.
- Se usan dNTPs modificados: fluorescentes y terminadores.
- Se bloquea de forma reversible el extremo 3' -OH para evitar la incorporación de más nucleótidos.
- Se usa una polimerasa DNA.
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Description
Este cuestionario explora las diferentes técnicas de secuenciación del DNA, desde los métodos clásicos hasta las últimas innovaciones en secuenciación de nueva generación. Aprenderás sobre los hitos alcanzados en la determinación de la estructura del DNA, así como las aplicaciones y plataformas utilizadas en estos procesos. ¡Pon a prueba tus conocimientos sobre este fascinante tema de biología molecular!
