Komplexe Peptid Massenspektren PDF

Komplexe Peptid Massenspektren Isotopie: Atome mit gleicher Anzahl von Protonen und unterschiedlicher Anzahl von Neutronen 12C 13C Komplexe Peptid Massenspektren Isotopie Monoisotopische Masse: Atommassen der am häufigst vorkommenden Isotope...

Komplexe Peptid Massenspektren Isotopie: Atome mit gleicher Anzahl von Protonen und unterschiedlicher Anzahl von Neutronen 12C 13C Komplexe Peptid Massenspektren Isotopie Monoisotopische Masse: Atommassen der am häufigst vorkommenden Isotope (=> leichteste Isotope) Durchschnitts Masse: Atommassen aller Isotope in ihrer natürlichen Häufigkeit (nicht überall identisch)  Aminosäure Massen Monoisotopische Masse 1H, 12C, 14N, 16O, 32S Durchschnitts Masse 1H/2H, 12C/13C, 14N/15N, 16O/17O/18O, 32S/33S/34S/35S/36S Glycine 57.02147 57.0520 Aspartic acid 115.02695 115.0886 Alanine 71.03712 71.0788 Glutamine 128.05858 128.1308 Serine 87.03203 87.0782 Lysine 128.09497 128.1742 Proline 97.05277 97.1167 Glutamic acid 129.04264 129.1155 Valine 99.06842 99.1326 Methionine 131.04049 131.1986 Threonine 101.04768 101.1051 Histidine 137.05891 137.1412 Cysteine 103.00919 103.1448 Phenylalanine 147.06842 147.1766 Isoleucine 113.08407 113.1595 Arginine 156.10112 156.1876 Leucine 113.08407 113.1595 Tyrosine 163.06333 163.1760 Asparagine 114.04293 114.1039 Tryptophan 186.07932 186.2133 Monoisotopische und Durchschnitts Masse Isotopie 12C 13C 1H 14N 16O 64 2 95 19 26 Bestimmung der Peptid Ladung Basierend auf Isotopologen Muster [MH]+ [MH2]2+  Protein Identifizierung mit Hilfe der Massenspektrometrie Mittels Analyse intakter Proteine ist schwierig!!! Spaltung in Peptide mittels enzymatischem Verdau Bottom-Up vs. Top-Down Massenspektrometrie Messung “Surrogater Peptide” Messung “Intakter Proteine”  Bottom-Up vs. Top-Down Messung “Surrogater Peptide” vs. “Intakter Proteine”  Vorteile  Gute chromatographische Trennung  Einfache Daten Akquisition  Fragmentierungs Mechanismus bekannt  Gute Software  Nachteile  Protein-Peptid Verhältnis Information geht verloren  Hohe Proben Komplexität  Nachteile  Löslichkeit  Multiple Ladungszustände  Komplexe Fragmentierung  Massenheterogenität wegen PTM  Geringe Empfindlichkeit  Schwierige chromatographische Trennung  Protein Identification Bottom-Up Approach  Peptide Mass Fingerprinting  Tandem Mass Spectrometry  Peptide Mass Fingerprinting Massen der Peptide aus Protein Verdau sind ausreichend um Protein zu identifizieren  Peptide Mass Fingerprinting Peptidmassen des Proteins nach Verdau sind ausreichend unique um Protein zu identifizieren MKAVVLTLAV LFLTGSQARH FWQQDDPQSS WDRVKDFATV YVEAIKDSGR DYVAQFEASA LGKQLNLKLL DNWDTLASTL SKVREQLGPV TQEFWDNLEK ETASLRQEMH KDLEEVKQKV QPYLDEFQKK WHEEVEIYRQ KVAPLGEEFR EGARQKVQEL QDKLSPLAQE LRDRARAHVE TLRQQLAPYS DDLRQRLTAR LEALKEGGGS LAEYHAKASE QLKALGEKAK PVLEDLRQGL LPVLESLKVS ILAAIDEASK KLNAQ  Massenspektrum eines Protein Verdaus  Vergleich gemessener Massen mit Datenbank Massen  Anzahl der Matches  Peptide Mass Fingerprint Datenbank  Protein Sequenz Datenbank  Enzymatische Spaltungsstellen (K,R)  Alle möglichen Peptidsequenzen aller Proteine  Masse (M+H) aller Peptide bestimmen  Verbindung Peptidmassen mit Protein  Notwendige Information Peptide Mass Fingerprinting Liste der gemessenen Massen Protease Datenbank Organismus (optional) Geschätzte Masse und pI des Proteins (optional) Cystein Modifikation (alkyliert) Massen Toleranz (100 ppm = 1000.0 ± 0.1 Da) PMF search engine Peptide Mass Fingerprinting  PMF Datenbank Suche Protein Prospector Mascot Massenspektrometrie Peptide Mass Fingerprinting.  Protein Prospector Peptide Mass Fingerprint Datenbanksuche http://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msfitstandard Tandem Massenspektrometrie zur Proteinsequenzierung  Tandem Massenspektrometrie Peptidionen Einzelenes Peptid Tochter Mischung Peptidion Ionen Ion MS1 MS2 source  Fragment Ionen liefern Struktur Information  Zwei Massenanalysatoren getrennt durch mit Gas gefüllter Kollisionszelle (N2, Ar, Xe)  Ausgewählte Ionen werden in Kollisionszelle fragmentiert Tandem Massenspektrometrie zur Proteinsequenzierung y-Ionen b-Ionen http://www.bio.davidson.edu/genomics/method/ms.html  Tandem Massenspektrometrie zur Proteinsequenzierung Glycin: H2N-CH2-COOH 75 Da Glycin in Protein: -HN-CH2-CO- 75-18 Da = 57 Da Aminosäure Massen minus 18 (H2O) Tandem Massenspektrometrie zur Proteinsequenzierung  Tandem Massenspektrometrie Fragmentionen Serie ist nicht immer vollständig YADSGEGDFLAEGGGVR fehlende Fragmentionen 100 80 L A Relative Abundance F D G 60 E A E G 40 S D 20 0 400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z Tandem MS Massenspektrometrie Tandem MS Data.  Massenspektrometrie Tandem MS Data. Peptid Masse Fragment Massen  Tandem Massenspektrometrie Sequenzierung  tryptische Peptide:  kleinste Fragmentmasse im Spektrum ist Lys oder Arg  y1 Masse R  147.113 Lys + |  175.119 Arg H3N ˗ CH ˗ COOH  y1 Ion wird berechnet mittels Addition von 19.018 Da (Aminosäure + H2O + H+)  Suche nach prominentem Peak rechts von y1 Ion, der y1 + einer Aminosäure Masse entspricht => y2 Ion  Schritte nach rechts wiederholen, …  yn Serie ergibt “reverse” Sequenz (von C-Terminus nach N-Terminus) R  Tandem Massenspektrometrie  Spezifischer als Peptide Mass Fingerprinting  intakte Peptid Masse + Fragment Massen Information  alle Fragment Massen stammen von Precursor Peptid  Informativer als Peptide Mass Fingerprinting  de novo Sequenz Analyse möglich  Identifizierung von Proteinen in komplexen Mischungen  Charakterisierung von post-translationalen Modifikationen  Massenspektrometrie Zur Bestimmung von Post-Translationalen Modifikationen.  Phosphorylierung +80  Acetylierung +42  Methylierung +14  Disulfidbrücke - 2  Deamidierung + 1  Protein Identifikation  Edman Abbau  Massenspektrometrie  Immunochemie Immunochemische Methoden Antikörper – Antigen Interaktionen Einsatz von Antikörpern als analytische Reagenzien  Antikörper Antigen Bindung  Glycoproteine  Abwehr von Mikroorganismen und Viren  Unterscheidung von körpereigenen/nicht-eigenen Substanzen  Binden mit hoher Affinität und Spezifität  Grosse Vielfalt durch Variation der Bindungsstelle Paratop Epitop Immunoglobulin Struktur  Antikörper Epitop = antigene Determinante: Molekülabschnitt eines Antigens, gegen den das Immunsystem Antikörper bildet Diskontinuierliches Epitop: aus verschiedenen im Raum nah bei einander liegenden Aminosäureresten bestehend, die im Protein voneinander entfernt sind => nur im nativen Zustand des Proteins vorhanden Kontinuierliches Epitop: aus Aminosäueresten bestehend, die in der Sequenz aufeinander folgen => auch nach Protein Denaturierung vorhanden  Antikörper  Antiserum: Immunisierung von Labortieren (meist Kaninchen) mit Antigen führt zu der Generierung von „polyclonalen Antikörpern“, die gegen mehrere Epitope des Antigens gerichtet sind.  Monoklonaler Antikörper: Immunisierung von Labortieren (Mäusen) mit Antigen führt zu der Generierung von „polyclonalen Antikörpern“; „monoclonaler Antikörper“ entsteht durch somatische Hybridisierung von einer B Zelle mit Tumorzelle; Selektion und Propagation in Zellkultur; gegen monospezifisches Epitop gerichtet.  Antikörper Polyklonal Monoklonal  Monoklonale Antikörper  Von einer B Zelle stammend  Hybridisierung B Zelle mit Tumor Zelle  Selektion und Propagation in Zellkultur  Monospezifisches Epitop  Unbegrenzte Menge  Antikörper  Peptid-Antikörper: Immunisierung von Labortieren mit synthetischem Peptid, das auf Proteinsequenz basiert  => limitierte Anzahl von Epitopen. MKAVVLTLAV LFLTGSQARH FWQQDDPQSS DRVKDFATV YVEAIKDSGR DYVAQFEASA LGKQLNLKLL DNWDTLASTL SKVREQLGPV TQEFWDNLEK ETASLRQEMH KDLEEVKQKV QPYLDEFQKK WHEEVEIYRQ KVAPLGEEFR EGARQKVQEL QDKLSPLAQE LRDRARAHVE TLRQQLAPYS DDLRQRLTAR LEALKEGGGS LAEYHAKASE QLKALGEKAK PVLEDLRQGL LPVLESLKVS ILAAIDEASK KLNAQ  Western Blot Gelelektrophorese mit anschliessendem Proteinblotting und Immundetektion Western Blot  Immunfluoreszenz Protein Detektion auf Zell- oder Gewebeoberflächen Direkt Indirekt Immun-histochemie, -cytochemie Protein Detektion in Geweben oder Zellen  Quantitative Protein Bestimmungen Qualitative Identifizierung von Proteinen reicht nicht aus um biologisches System zu beschreiben. Analyse von Protein Veränderungen notwendig  räumlich  zeitlich  krank - gesund  nach Behandlung mit Medikament Protein Quantifizierung Plasma Proteine  Quantitative Protein Bestimmungen  Immunochemie  Gelelektrophorese/Western Blot  Massenspektrometrie RadioImmuno Assay (RIA) Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Enzyme Enzyme  Quantitative Protein Bestimmungen  Immunochemie  Western Blot/Gelelektrophorese  Massenspektrometrie Western Blot Quantifizierung Banden Färbeintensität  Quantitative Protein Bestimmungen  Immunochemie  Gelelektrophorese/Western Blot  Massenspektrometrie  Quantifizierung mittels Massen Spektrometrie  Absolute Quantifizierung  Tatsächliche Menge  Relative Quantifizierung  Mengen Unterschied zwischen Proben  Quantifizierung mittels Massenspektrometrie Signal Intensität eines Peptidions ist abhängig von  Konzentration  Effizienz des Enzymatischen Verdaus in Peptide  Ausbeute Probenvorbereitung  Ionisierung  Matrix Effekte Unter der Annahme von komplettem enzymatischem Verdau in Peptide Differenzielle Peptid Ionisierung Signal Intensität eines Peptidions korreliert nicht direkt mit Proteinmenge Präzise Quantifizierung nicht möglich  Massen Spektrometrie Ionisierungseffizienz der Peptidionen ist abhängig von Matrix I1 + I1 < I2 I2 +  Quantifizierung mittels Massen Spektrometrie =15N  Quantifizierung mit Hilfe von mit stabilen Isotopen markierten Peptiden als Referenz.  Unmarkiertes und markiertes Referenz Peptid mit identischer Sequenz haben dieselbe Ionisierungseffizienz.  Markiertes Referenz Peptid und unmarkiertes Peptid haben verschiedene Masse und können im Massenspektrometer getrennt werden.  Verhältnis der Signale von unmarkiertem und markiertem Referenz Peptid erlaubt relative Quantifizierung.  Massen Spektrometrie Unterschiedliche Ionisierungseffizienz R 1 = I1 / I1 I1 + Markiertes Referenzpeptid I1 + R1 = R 2 I2 + Markiertes Referenzpeptid I2 + R 2 = I2 / I2 Absolute Quantifizierung mit Stabilen Isotopen markiertes Peptid als interne Referenz Zell/Gewebe Extrakt Proteine Peptide Markiertes Referenzpeptid mit bekannter Menge Massen spectrometrie Absolute Quantifizierung mit Stabilen Isotopen markiertes Peptid als interne Referenz 4 x 15N 3 x 13C Absolute Quantifizierung mit Stabilen Isotopen markiertes Peptid als interne Referenz zu quantifizierendes Peptid + Markiertes Peptid mit identischer Sequenz und bekannter Menge I m/z Quantifizierung mit Hilfe von Stabilen Isotopen In Vivo Metabolische Markierung Ziel: relative Quantifizierung zweier Zustände Zell-/Gewebe-Extrakt Reinigung Proteine Verdau Peptide Massen Spektrometrie Quantifizierung mit Hilfe von Stabilen Isotopen In Vivo Metabolische Markierung mit Aminosäuren 12C -Lys: 12C H N O 6 6 12 2 Δm = 6 Da 13C -Lys: 13C H N O 6 6 12 2 12C -Lysine 13C -Lysine 6 6 Quantifizierung mit Hilfe von Stabilen Isotopen In Vivo Metabolische Markierung mit Aminosäuren 12C 13C Quantifizierung mit Hilfe von Stabilen Isotopen In Vivo Metabolische Markierung mit Aminosäuren Ziel: relative Quantifizierung zweier Zustände 12C -Lys 13C -Lys 6 6 1:1 Mischung Protein Extrakt Trypsin Verdau Peptide  Quantifizierung mit Hilfe von Stabilen Isotopen In Vivo Metabolische Markierung mit Aminosäuren Ziel: relative Quantifizierung zweier Zustände -HN-CH-COOH Δm = 6 Da NH2- I -HN-CH-COOH CH2 I NH2- I CH2 CH2 I I CH2 MS CH2 I I CH2 CH2 I I CH2 NH2 I NH2 Kommentare, Kritik, Vorschläge [email protected]