Sbobine Micro.pdf - Le Cellule Procariote

2. STRUTTURE E FUNZIONI DELLE CELLULE PROCARIOTE LA CELLULA Tu# gli organismi viven0 sono cos0tui0 da cellule, ne riconosciamo due 0pi: Cellule eucariote Cellula procariote LA CELLULA PROCARIOTA Diﬀerenze e similitudini tra cellula procariota e cellula eucariota Diﬀerenze La cara9eris0ca primaria che dis0ngue le cellule eucariote da quella procariote è il nucleo; mentre nella cellula eucariote i cromosomi sono contenu0 in un nucleo delimitato da una membrana nucleare, nella cellula procariota la membrana nucleare è assente e il materiale gene0co, cos0tuito generalmente sono da un cromosoma, è a dire9o conta9o con il citoplasma e forma una stru9ura chiamata nucleoide. Le cellule eucariote presentano organelli cellulari delimita0 da membrane, assen0 nelle cellule procariote. Le cellule eucariote hanno anche dimensioni maggiori rispe9o a quelle procariote. La divisione cellulare nei procario0 avviene in genere per scissione binaria, mentre negli eucario0 per mitosi. Similitudini Tu9e le cellule sono dotate di una membrana plasma@ca che separa il contenuto citoplasma0co dall’esterno e regola il trasporto di nutrien0 e sostanze di riﬁuto. La composizione del citoplasma è simile, entrambi contengono ribosomi, diversi per dimensione e composizione, necessari per svolgere la sintesi proteica. Diﬀerenze e similitudine tra baAeri e archei I procario0 non cos0tuiscono un gruppo ﬁlogene0camente omogeneo, infa# si iden0ﬁcano due dis0n0 domini: Ba9eri Archaea Ques0 due domini sono dota0 di importan0 diﬀerenze gene0che, funzioni e stru9urali, che li dis0nguono profondamente; queste diﬀerenze riguardano gli stra0 superﬁciali e le appendici esterne (membrana plasma0ca, parete cellulare e ﬂagelli). Morfologia, dimensioni e organizzazione delle cellule procariote I ba9eri sono invisibili a occhio nudo e hanno dimensioni che vanno da 0,2 a 2 μm; questo fa si che il rapporto superﬁcie/volume delle cellule procariote sia molto più elevato di quello delle cellule eucariote, con ovvie conseguenze sulla velocità con cui avvengono gli scambi molecolari tra cellula e ambiente, il trasporto di nutrien0, la crescita, la divisione cellulare e l’evoluzione. Essendo per lo più unicellulari, i ba9eri presentano una limitata varietà di forme, le più comuni sono: Forma sferica (cocco) - Possono essere più o meno ovali e allunga0 ﬁno a diventare coccobacilli Quando si dividono possono rimane a9acca0 in vario modo uno all’altro - Diplococchi: restano appaia0 dopo la divisione 1 - Streptococchi: formano delle catenelle - Tetradi: i cocchi si dividono su due piano e restano uni0 in gruppi di qua9ro - Sarcine: si dividono su tre piani, sono cos0tute da gruppi di o9o cellule - Staﬁlococchi: formano grappoli irregolari Forma bastoncellare (bacillo) - Diplobacilli: i bacilli rimangono appaia0 - Streptobacilli: catene Forma di virgola (vibrioni) Forma di spirale (spirilli o spirochete): cellule più so#li e ﬂessibili degli spirilli Altri ba9eri hanno forme molto più complesse, i ba9eri ﬁlamentosi come gli streptomice0 formano ife cos0tuite da lunghe catene di cellule, che danno origine ad un micelio, simile a quello dei funghi; i baAeri peduncola@ o prosteca@ presentano un peduncolo o prosteca che consente loro di aderire al substrato o aumentare la superﬁcie di scambio con l’ambiente. 2 Morfogenesi delle cellule baAeriche Forma e dimensione sono importan0 per le funzioni cellulare specialmente la diﬀusione e l’assorbimento di nutrien0, per questo non sono casuali. La morfologia ba9erica è determinata dalla parete mureinica o sacculo, cos0tuto da un’unica macromolecola gigante di un polisaccaride complesso, il pep@doglicano, che avvolge la cellula. Sono state iden0ﬁcate proteine che presentano similarità con proteine del citoscheletro delle cellule eucariote e che controllano la forma e le dimensioni delle cellule ba9eriche durante l’accrescimento: FtsZ: proteina simile alla tubulina che durante il processo di divisione cellulare coordina la sintetasi della nuova parete cellulare che separerà le due nuove cellule (seAo); MreB: proteina simile all’ac0na, questa nella maggior parte dei ba9eri a forma di bastoncello forma una stru9ura elicoidale a livello della membrana plasma0ca; CreS: 0pica di un ba9erio a forma di vibrione, il Caulobacter crescentus, è simile ai ﬁlamen0 intermedi degli eucario0, infa# è responsabile della curvatura della cellula. 3 MEMBRANE E PARETI RIVESTIMENTO DELLE CELLULE PROCARIOTE Le cellule procariote sono dotate di complesse stru9ure di rives0mento che consentono loro di ada9arsi a speciﬁci habitat; la cellula procariota è delimitata da una membrana plasma@ca, questa a sua volta è prote9a da una parete, che assume stru9ure diverse in Archea, ba9eri Gram posi0vi e ba9eri Gram nega0vi. Mol0 procario0 in aggiunta alla parete possiedono ulteriori stra0 di rives0mento, come strato S, capsula o glicocalice) e appendici superﬁciali (pili, ﬂagelli); queste stru9ure conferiscono loro ulteriori proprietà per interagire con ambien0 complessi. Le diverse cara9eris0che della parete perme9ono di dis0ngue i ba9eri i due gruppi fondamentali: Gram nega@vi: sono cos0tui0 da una membrana esterna, formata da un doppio foglie9o di lipidi e glicolipidi e proteine associate, mentre la membrana plasma0ca viene deﬁnita membrana interna; nello spazio delimitato dalle due membrane, de9o periplasma, si trova un so#le strato di pep@doglicano o mureina, un polimero complesso formato da aminozuccheri e aminoacidi che avvolge interamente il ba9erio. Per la sua composizione chimica la membrana esterna rappresenta una barriera contro il passaggio per diﬀusione di mol0 compos0, conferendo così alla cellula par0colare resistenza a sostanze tossiche e la capacità di colonizzare svaria0 ambien0 os0li; Gram posi@vi: privi di membrana esterna e la loro parete è composta da uno spesso strato di pep0doglicano, altri polimeri e proteine di superﬁcie. Non posseggono un vero e proprio spazio periplasma0co. Le due diverse archite9ure della parete ba9erica stanno alla base della risposta, posi0va o nega0va, a una speciﬁca colorazione ideata dal microbiologia danese Hans Chris7an Gram. Oggi si preferisce indicare i ba9eri Gram nega0vi e Gram posi0vi rispe#vamente con didermi, poiché dota0 di due membrane, e monodermi, dota0 di una sola membrana. COLORAZIONE DI GRAM La colorazione di Gram è il più comune metodo di colorazione usato in microbiologia per l’osservazione di microrganismi in microscopio o#co. Essa perme9e di dis0nguere i ba9eri in due gruppi, Gram posi0vi e Gram nega0vi, in base alla diversa risposta al procedimento che consiste in una colorazione con il cristalviole9o. I ba9eri che dopo il lavaggio con alcol tra9engono il complesso cristalviole9o-ioduro appaiono blu-viola al microscopio e vengono de# Gram posi@vi. In altri ba9eri de# Gram nega@vi i ripetu0 lavaggi con etanolo rimuovono il precipitato dalle cellule che così si decolorano. Membrana plasma@ca La membrana plasma0ca svolge varie funzioni: Delimita il contenuto cellulare, quindi è fondamentale per conferire alla cellula la sua individualità e per regolamentare gli scambi tra cellula e ambiente esterno; Perme9e alle cellule di acquisire nutrien0, eliminare sostanze di riﬁuto e secernere molecole speciﬁche; Man0ene costante il contenuto cellulare indipendentemente dai cambiamen0 delle condizioni esterne, omeostasi; Nei procario0 è la sede di importan0 processi metabolici (respirazione, fotosintesi, biosintesi di lipidi), che nelle cellule eucariote sono delega0 a organelli speciﬁci; È dotata di receAori speciﬁci, per questo è una stru9ura fondamentale per la trasduzione di segnali. 4 Composizione e stru:ura della membrana plasma7ca nei ba:eri Sia nei procario0 che negli eucario0 la membrana è cos0tuita da un doppio foglieAo fosfolipidico a cui sono associate in vari modi diversi 0pi di proteine. Tu9avia le membrane procariote diﬀeriscono da quelle eucariote sia per la composizione lipidica sia per la 0pologia di molte proteine presen0. La membrana presenta varie modiﬁcazioni morfologiche nelle varie classi che sono correlate alla par0colare a#vità metabolica di tali ba9eri. La maggior parte dei lipidi che compongono le membrane biologiche sono molecole an@pa@che cos0tuite da una testa polare e una coda fortemente idrofoba. La membrana plasma0ca di Bacteria e Eukarya è cos0tuita 0picamente da fosfolipidi in cui: Testa polare: molecole di D-glicerolo 3-fosfato Coda idrofobica: due molecole di acidi grassi non ramiﬁca0 esteriﬁca0 al C1 e C2 dello scheletro del D-glicerolo; al fosfato esteriﬁcato in C3 possono essere lega0 gruppi funzionali, come etanolamina e serina. In ambiente acquoso i fosfolipidi tendono a formare un doppio strato con le catene laterali degli acidi grassi che si associano tramite legami idrofobi, mentre le porzioni polari, capaci di interagire con l’ambiente acquoso, sono rivolte all’esterno. La stru9ura generale della membrana plasma0ca è stabilizzata da interazioni idrofobe e da ca@oni bivalen@, quali Mg2+ e Ca2+, che stabiliscono interazioni ioniche con le cariche nega0ve dei fosfolipidi. 5 Le membrane ba9eriche sono simili a quelle eucariote per quanto riguarda la composizione dei fosfolipidi, tu9avia nelle membrane cito plasma0che eucariote si ritrovano anche steroli, lipidi cara9erizza0 da un nucleo a qua9ro anelli aroma0ci, come il colesterolo, generalmente assen0 nei ba9eri. Fanno eccezione i ba9eri me7lotroﬁ che sono in grado di sinte0zzarli e inserirli nelle proprie membrane. Gli steroli si trovano anche nelle membrane dei micoplasmi, tu9avia ques0 non sono sono in grado di sinte0zzarli e u0lizzano quelli prodo# dalla cellula ospite. Nella maggior parte dei ba9eri sono presen0 opanoidi, simili agli steroli e che svolgono una funzione analoga. Le membrane plasma0che dei ba9eri contengono vari 0pi di proteine, che conferiscono alla membrana numerose proprietà funzionali, tra queste ricordiamo: Proteine integrali di membrana: non sono facilmente estraibili dalla membrana e risultano insolubili in soluzioni acquose; sono anﬁpa0che, e le loro regioni idrofobe sono incluse nella matrice lipidica mentre quelle idroﬁle sporgono sia verso il citoplasma sia verso l’esterno della cellula; Proteine periferiche: più facilmente rimovibili e possono essere associate alla membrana tramite interazioni non covalen0 con proteine integrali oppure ancorate dire9amente al foglie9o lipidico grazie a un corso segmento di aminoacidi idrofobici (dominio transmembrana) situato generalmente nella regione N-terminale; Lipoproteine: classe di proteine ancorate alla membrana plasma0ca da dove si estendono vero l’esterno; l’ancoraggio alla membrana avviene grazie a una modiﬁcazione post-tradizionale che introduce una coda lipidica all’estremità N-terminale. Membrana plasma7ca negli Archaea I lipidi delle membrane degli Archea hanno cara9eris0che uniche che li dis0nguono ne9amente da ba9eri e eucario0. Le diﬀerenze riguardano: Chiralità del glicerolo: L-glicerolo anziché D-glicerolo; Tipo di legame: tra glicerolo e catena alifa0ca, etere anziché estere; Tipo di catena alifa@ca: satura ramiﬁcata anziché lineare insatura. Negli Archea il fosfato è esteriﬁcato con il glicerolo in C1, producendo così la forma enan0omerica L- glicerolo; le catene laterali alifa0che non sono cos0tuite da acidi grassi lineari insaturi esteriﬁca0 al glicerolo bensì da catene isoprenoidi il cui gruppo OH terminale è condensato all’L-glicerolo in C2 e C3 tramite legame etere. Le catene alifa0che sono cos0tuite da unità isoprenoidi ripetute che formano lunghe catene sature ramiﬁcate. I lipidi degli Archea possono essere: Dieteri di glicerolo: cos0tui0 da due catene alifa0che (ﬁtanili) a 20 atomi di C legate a un’estremità a una molecole di glicerolo; Tetraeteri di glicerolo: due lunghe catene alifa0che (biﬁtanili) a 40 atomi di C sono legate, a ciascuna delle due estremità, a due molecole di glicerolo; i tetraeteri di glicerolo formano le membrane monostrato, che oﬀrono maggiore resistenza alla separazione rispe9o a un doppio foglie9o lipidico, questo 0po di membrana è frequente negli Archea ipertermoﬁli, che crescono a temperature estremamente elevate, nei quali una o più subunità isoprenoidi dei tetraeteri possono formare stru9ure cicliche a cinque atomi di C; la presenza di ques0 anelli contribuisce a ridurre la mobilità delle catene isoprenoidi. Nonostante tu9e queste par0colarità le membrane degli Archea mantengono la stru9ura generale 0pica delle membrane biologiche: mosaico ﬂuido di lipidi e proteine in cui lo stra9o lipidico è cos0tuito da due superﬁci idroﬁle che delimitano una parte interna idrofoba. Funzioni della membrana plasma@ca 6 Barriera seleTva: il doppio strato fosfolipidico perme9e la diﬀusione dell’acqua, di gas (O2, CO2) e di piccole molecole liposolubili (prive di carica o scarsamente polari) come ammoniaca, urea, etanolo e glicerolo, mentre risulta impermeabile a ioni, compos0 polari e grosse molecole anche non polari. I traspor0 a9raverso membrana avvengono sia a#vamente, contro gradiente di concentrazione, che passivamente, secondo gradiente di concentrazione; Produzione di energia: nei procario0 al livello della membrana avvengono respirazione e fotosintesi, che generano un gradiente ionico transmembrana (forza proton-motrice), u0lizzato dalla cellule per sinte0zzare ATP, che alimenta altri processi che richiedono energia (es: trasporto di solu0, movimento dei ﬂagelli, ecc..); Trasduzione del segnale: le cellule sono in grado di rispondere rapidamente a cambiamen0 delle condizioni ambien0 grazie a sistemi di trasduzione del segnale, che sono capaci di percepire gli s0moli esterni, trasme9ere il segnale all’interno della cellula, modiﬁcare il proﬁlo dell’espressione genica e conseguentemente di una o più cara9eris0che geno0piche cellulari. I segnali percepi0 dai microrganismi possono essere: - Fisici: luce e temperatura - Fisico-chimico: osmolarità, disponibilità di acqua, pressione di ossigeno, concentrazione di metaboli0, nutrien0, molecole tossiche o sgradevoli Le proteine responsabili della traduzione sono associate alla membrana e possiedono domini espos0 nell’ambiente extracellulare e domini citoplasma0ca; Biosintesi di componen@ cellulari: la membrana è anche sede di importan0 processi biosinte0ci, quali sintesi di fosfolipidi e alcuni passaggi della sintesi del lipopolisaccaride e del pep0doglicano avvengono in questo comparto cellulare. Nel caso della biosintesi della membrana, la sintesi in situ dei lipidi garan0sce l’accrescimento della membrana durante la crescita cellulare. ANTIBIOTICI CHE AGISCONO SULLE MEMBRANE La membrana plasma0ca cos0tuisce un potenziale bersaglio su cui possono agire molecole che la danneggino o ne inibiscano le funzioni, sono note alcune classi di compos0 an0microbici, 0picamente molecole anﬁpa0che di natura pep0dica, lipopep0dica o polienica, che agiscono con una certa sele#vità sulle membrane dei ba9eri o anche dei funghi. PEPTIDI ANTIMICROBICI La produzione di pep0di an0microbici rappresenta un meccanismo di difesa diﬀuso in tu# gli organismi viven0 con esempi riscontrabili nei ba9eri ma anche nelle piante e negli animali. Tu# gli organismi viven0 possono produrre pep0di an0microbici mediante sintesi proteica ribosomiale seguita da maturazione e modiﬁcazioni post-traduzionali; nei ba9eri e nei funghi pep0di complessi possono essere sinte0zza0 anche per via non ribosomale, mediante pep@de sintetasi specializzate. I pep0di microbici possono uccidere dire9amente cellule ba9eriche disgregando l’integrità delle membrane oppure penetrando nelle cellule inibendone le funzioni essenziali. L’azione an0microbica di ques0 pep0di può anche esplicarsi indire9amente modulando la risposta immunitaria innata. In alcuni pep0di sono state riscontrate anche proprietà di immunomodulatori: interagendo dire9amente con le cellule dell’ospite possono alterare o s0molare l’espressione di geni speciﬁci, agendo per tanto come eﬀe9ori nell’immunità innata verso i microrganismi. Mol0 di ques0 pep0di esplicano la loro azione ba9ericida interagendo con componen0 della membrana plasma0ca. Le loro cara9eris0che, quali la composizione aminoacidica, l’anﬁpa0cità e le dimensioni, consentono il legame e l’inserimento nel doppio foglie9o delle membrane con formazione di pori che le destabilizzano. Tu9avia, spesso il meccanismo ba9ericida è più raﬃnato poiché il pep0de è capace di 7 interagire anche con bersagli intracellulari e inibire la sintesi proteica, la replicazione o la trascrizione del DNA e l’interazione con la membrana è funzionale all’ingresso del pep0de stesso all’interno della cellula. BATTERIOCINE Le ba9eriocine sono prodo# da ba9eri Gram posi0vi e Gram nega0vi mediante sintesi ribosomale, spesso seguita da modiﬁcazioni post-tradizionali. Le ba9eriocine si legano a rece9ori localizza0 sulla membrana delle cellule bersaglio, dove possono formare dei pori che danneggiano la membrana, oppure essere traslocate nel citoplasma, dove interferiscono in vari modi con le funzioni essenziali della cellula. POLIMIXINE Le polimixine cos0tuiscono una famiglia di an0bio0ci a sintesi non ribosomale, prodo# da vari ceppi del ba9erio Gram posi0vo Paenibacillus polymyxa. Queste molecole sono formate da un decapep0de ca0onico e da una coda lipoﬁla; per questa loro stru9ura le polimixine agiscono come detergen0 ca0onici, interagendo con i fosfolipidi della membrana plasma0ca e, nei ba9eri Gram nega0vi, con il lipopolisaccaride della membrana esterna. In tal modo distruggono l’integrità e la permeabilità sele#va delle membrane alternando l’equilibrio ele9ro-osmo0co della cellula a causando il blocco delle sue funzioni ﬁno alla lisi cellulare. La polimixina B e la polimixina E sono due an0bio0ci impiega0 nella pra0ca clinica. Meccanismi di resistenza: in genere la resistenza a una polimixina è crociata verso tu9e le altre molecole della classe e anche verso altri pep0di ca0onici. Mol0 meccanismi no0 sono riconducibili all’alterazione della membrana esterna nei ba9eri Gram nega0vi. Un meccanismo molto frequente consiste nel ridurre la carica nega0va del lipopolisaccaride, riducendo l’aﬃnità per questo an0bio0co; questo avviene grazie a mutazioni di geni. DAPTOMICINA La daptomicina appar0ene alla classe dei lipope0di ciclici, a sintesi non ribosomale, a#vi nei confron0 dei ba9eri Gram posi0vi. È prodo9a da Streptomyces roseosprus e agisce sulla membrana plasma0ca ba9erica. La daptomicina, in presenza di ioni Ca2+, si lega alla membrana plasma0ca ove inserisce la sua coda lipoﬁla, alterando la conformazione della membrana, creando dei pori e causando una rapida depolarizzazione con perdita di ioni K+. Meccanismi di resistenza: la resistenza allo daptomicina è dovuta ad un’alterazione che porta ad un cambiamento delle cariche ele9riche in superﬁcie, da nega0ve a posi0ve, impedendo per repulsione ele9rosta0ca il legame tra l’an0bio0co e il bersaglio. POLIENI I polieni, una classe di macrolidi, sono cos0tui0 da una lunga catena carboniosa ciclizzata tramite legame estere contenente da una parte una serie di doppi legami coniuga0 (polieni) e dall’altra numerosi gruppi ossidrilici. Alcuni di quesi polieni furono isola0 in Candida-non-albicans. I polieni formano complessi con gli steroli di membrana, principalmente con l’ergosterolo, e sono pertanto a#ve sono nei confron0 delle cellule eucariote. Vengono usa0 per il tra9amento di infezioni fungine ed esprimono: 8 Azione fungista@ca: alla base della quale vi è l’interazione con gli steroli, che causa un aumento della permeabilità della membrana stessa, questo porta all’alterazione del gradiente protonico con fuori uscita di ioni K+; Azione fungicida: imputabile ad un’inibizione irreversibile dell’ATPasi di membrana. PARETE BATTERICA La maggior parte dei ba9eri, esternamente alla membrana plasma0ca, possiede una parete; sia la parete di 0po Gram posi0vo sia quella di 0po Gram nega0vo posseggono un’unica enorme molecole polimerica de9a sacculo di mureina. Sacculo di mureina Il sacculo conferisce alla cellula rigidità e forma, ne protegge l’integrità contrastando la pressione osmo0ca interna ed è capace di restringere ed espandere il suo volume ﬁno a 3 volte senza rompersi so9o una pressione osmo0ca che può raggiungere le 20 atmosfere. Questa stru9ura cellula è essenzialmente cos0tuita da pep@doglicano, de9o anche mureina. Nella parete dei Gram posi0vi è presente un unico spesso strato di pep0doglicano, mentre in quella dei Gram nega0vi è presente una stru9ura pluristra0ﬁcata e più complessa che comprende solo un so#le stra9o di pep0doglicano. La parete mureinica può essere indebolita o rimossa mediante tra9amento con an0bio0ci che inibiscono la sintesi del pep0doglicano o con enzimi speciﬁci che lo degradano, come il lisozima, che catalizza l’idrolisi del legame β-1,4 glicosidico tra gli aminozuccheri del pep0doglicano. Ques0 tra9amen0 possono portare alla lisi osmo0ca delle cellule se si trovano in un ambiente ipotonico. Pep@doglicano L’unità monomerica del pep0doglicano è cos0tuita dal glicano tetrapep0de, un disaccaride cui è legato un tetrapep0de formato da aminoacidi D ed L alterna0. Il disaccaride è cos0tuito da due amino-deriva0 del glucosio, lega0 da legami β-1,4 glicosidici: Acido N-aceNl-muramico (NAM): si diﬀerenzia dal NAG per la presenza di un residuo di acido D- la#co unito con legame etere al C3 del glicerolo, cui è legato il tetrapep0de; N-aceNl-glucosamina (NAG) La composizione del tetrapep0de è variabile, quella più frequentemente riscontrata presenta la seguente sequenza: L-alanina, acido D-glutamico, acido meso-diaminopimelico (DAP), D-alanina. Nei ba9eri Gram posi0vi, l’acido meso-diaminopimelico è sos0tuito dalla L-lisina. I ﬁlamen0 di glicano adiacen0 sono connessi da legami transpep@dici, che si formano tra il gruppo carbossilico della D-alanina in posizione 4 di un tetrapep0de e il gruppo amminico del diaminoacido in posizione 3 di un tetrapep0de di un ﬁlamento glicanico adiacente. Tale legame deﬁnito legame crociato 3-4 9 direAo si trova principalmente nei Gram nega0vi; nei Gram posi0vi in genere il legame è mediato da un ponte interpep@dico: in S. Aureus il ponte è cos0tuito da 5 molecole di glicina. L’archite9ura della parete di mureina non è stata ancora cara9erizzata con sicurezza, un recente modello (foto) sos0ene che i ﬁlamento di glicano sono associa0 in ﬁbre che, avvolgendosi a elica, formano dei cavi di pep0doglicano che a loro volta avvolgono la cellula. Biosintesi del pep@doglicano e accrescimento della parete mureinica La biosintesi del pep0doglicano si può suddividere in tre stadi, ciascuno dei quali si svolge in un diverso comparto cellulare: 1. Sintesi dei precursori: avviene nel citoplasma; 2. Sintesi dell’unità monomerica: avviene al livello della membrana plasma0ca, con la sintesi del ﬁlamento pep0doglicanico (il glicano pentapep@de); 3. Reazioni di polimerizzazione e transpep@dazione con formazione di legami crocia@: avvengono nel periplasma. 1° stadio: SINTESI DEI PRECURSORI Nel citoplasma si svolgono le qua9ro tappe che portano alla formazione dei precursori dell’unità glicanpep0dica della mureina. I precursori sinte0zza0 nel citoplasma sono i due aminozuccheri NAM e NAG lega0 all’UDP a formare UDP-NAG e UDP-NAM, sul cui residuo la#co sarà polimerizzato il pentapep0de. Gli aminoacidi l del pentapep0de derivano dalle normali vie metaboliche cellulari, compreso l’acido meso- diaminopimelico, che è l’ul0mo intermedio della via biosinte0ca della l-lisina. Gli ul0mi due aminoacidi del pentapep0de, invece, solitamente due D-alanine, sono aggiun0 come dimero. La sintesi del dimero D-Ala-D-Ala e dell’acido d-glutamico richiede enzimi biosinte0ci speciﬁci per la loro forma D. La tappa ﬁnale consiste nell’assemblaggio del pentapep0de con la formazione dell’UDP-NAM-pentapep0de. Nel citoplasma la sintesi dell’UDP-NAG avviene a par0re dal fruQosio-6-P e UTP. La sintesi dell’UDP-NAM è catalizzata dagli enzimi MurA e MurB, a par0re da UDP-NAG con trasferimento, catalizzato da MurA, di 10 fosfoenolpiruvato (PEP) al gruppo OH dell’UDP-NAG in posizione 3’; questo intermedio viene poi trasformato da MurA in UDP-NAM. Gli enzimi responsabili della sintesi del pentapep0de legato al NAD sono no0 come ligasi Mur: catalizzano il legame dell’alanina al residuo carbossilico dell’UDP-NAM, e l’aggiunta dell’acido D-glutammico e dell’acido meso-diaminopimelico (o della lisina); gli ul0mi due aminoacidi vengono aggiun0 come dipep0de, generalmente cos0tuito da dimero D-Ala-D-Ala. Il monomero precursore del pep0doglicano è quindi sinte0zzato come glicano pentapep@de, la D-alanina in posizione 5 sarà successivamente rilasciata durante la formazione del legame transpep0dico. 2° stadio: SINTESI DELL’UNITÀ MONOMERICA Dopo essere sta0 sinte0zza0 i precursori del pep0doglicano devono essere trasporta0 all’esterno della membrana plasma0ca, nello spazio periplasma0co, per essere inseri0 nella parete; questo avviene grazie una trasportatore lipidico, il bactoprenolo (decaprenil- fosfato): alcol a 55 atomi di C fortemente idrofobo. NAM-pentapep0de si lega al bactoprenolo formando il lipide I, il quale viene legato a una molecola di NAG formando il lipide II (undecaprenil-difosfo-NAG-NAM- pentapep7de). Il monomero di glicano viene poi trasportato sulla faccia esterna dove avverrà la polimerizzazione del monomeri (3° stadio); il bactoprenolo dopo aver donato il monomero di glicano pentapep0de sarà defosforilato e ribaltato sulla faccia interna della membrana, pronto per un nuovo ciclo di sintesi e trasporto del glicano pentapep0de. 3° stadio: REAZIONI DI POLIMERIZZAZIONE E TRANSPEPTIDAZIONE Si ha prima di tu9o la polimerizzazione dei monomeri di glicano pentapep0de per opera delle transglicosilasi: catalizzano la formazione di legami glicosidici tra il nuovo monomero e il ﬁlamento di glicano nascente. Quindi si forma il legame pep0dico tra la catena pentapep0dica del nuovo monomero e il tetrapep0de di una catena di glicano adiacente; in questa reazione, catalizzata da enzimi de# transpep@dasi, il legame pep0dico tra le due D-alanine terminali del pentapep0de viene trasferito al gruppo amminico libero della lisina di un pep0de adiacente. Le transpep0dasi hanno una forte aﬃnità per gli an0bio0ci β-la9amici (di cui la penicillina è il proto0po) e vengono per questo chiamate proteine che legano la penicillina (PBP – penicillin-binding proteins). Questo legame stabile avviene a causa della somiglianza stru9urale degli an0bio0ci β-la9amici con il dipep0de D-Ala-D-Ala, substrato naturale delle PBP. Durante l’accrescimento della cellula anche la parete deve aumentare la propria esternazione e ciò avviene rompendo alcuni dei legami della rete e inserendo nuovi ﬁlamen0 di glicano, questo avviene grazie ad un elemento numero di enzimi idroli0ci, deﬁni0 autolisine, che tagliano il pep0doglicano in diversi punto; se ne riconoscono diverse classi sulla base del legame che idrolizzano: Muramidasi e transglicosilasi li@che: tagliamo il legame β-1,4 glicosidico tra NAM e NAG; Amidasi: idrolizzano il legame amidico tra NAM e L-alanina; Endopep@dasi: tagliano i legami pep0dici tra due aminoacidi all’interno del pep0de; Carbossipep@dasi: rimuovono l’ul0mo aminoacido D-alanina. Ques0 enzimi intervengono anche nella separazione delle cellule ﬁglie dopo la divisione cellulare. Foto: fasi di biosintesi del pep7doglicano al livello della membrana plasma7ca. 11 Biogenesi della parete mureinica Nella foto in basso sono presen0 tre schemi di come ba9eri diversi coordinano la sintesi della parete mureinica con accrescimento e divisione cellulare. I ba9eri con forma sferica (coccoide), come S. Aureus, sinte0zzano la nuova parete solo al momento della divisione cellulare; la maggior parte dei ba9eri con forma bastoncellare, come E. Coli, possiede almeno un omologo di MreB, proteina citoplasma0ca simile all’ac0na che controlla la sintesi del pep0doglicano insieme a MreC e MreD. Alcuni ba9eri a forma di bastoncello, che non possiedono MreB, si accrescono allungandosi ai poli tra un ciclo di divisione e l’altro. MODELLI DI SINTESI DELLA PARETE. In giallo è indicata la nuova parete in fase di sintesi, in rosso il pep0doglicano inserito in una speciﬁca fase. (a) I ba9eri con forma sferica (coccoide) sinte0zzano la nuova parete solo al momento della divisione, 12 quando il se9o divide la cellula (a sinistra) e si rimodella per formare un nuovo emisfero (al centro). Ogni cellula ﬁglia possiede quindi un nuovo emisfero prodo9o durante la divisione (a destra). (b) La maggior parte dei ba9eri con forma bastoncellare può avere due fasi di allungamento. La prima fase è cara9erizzata da inserimento di nuova parete in modo sparso lungo il cilindro cellulare, tra i due poli che rimangono iner0. Successivamente, prima della formazione del se9o, nel processo di divisione avviene un allungamento FtsZ-dipendente, durante il quale la sintesi della parete si localizza vicino all’anello FtsZ. Inﬁne avviene la divisione delle due cellule. (c) Pochi ba9eri a forma di bastoncello (come ad esempio Corynebacterium) non possiedono MreB e si accrescono allungandosi ai poli tra un ciclo di divisione e l’altro. Hanno due fasi di accrescimento, l’allungamento e la divisione. Durante l’allungamento la sintesi di nuova parete ai poli consente l’allungamento del cilindro cellulare. Durante la divisione, il se9o si divide formando due poli di nuova sintesi. Parete dei baAeri Gram posi@vi (monodermi) È cos0tuita essenzialmente da uno spesso strato di mureina, in cui sono inserite altre molecole polimeriche: Acidi teicoici: cos0tuiscono dal 30 al 60% della parete cellulare - Acidi teicoici di parete: polimeri anionici cos0tui0 da unità ripetute di 1,3-glicerol- fosfato o 1,5 D-ribitol-fosfato unite da legami fosfodiesterici; sono responsabili della carica nega0va della superﬁcie cellulare. Sono ancora0 all’involucro mureinico tramite legami covalen0 con residui NAM del pep0doglicano; - Acidi lipoteicoici: cos0tui0 da catene di poli-glicerol-fosfato legate a un residuo glicolipidico tramite il quale sono ancora0 alla membrana plasma0ca. Acidi teicuronici: polimeri privi di fosforo contenen0 N-ace0l-gala9osamina e acido D-glucoronico; Proteine di superﬁcie ANTIBIOTICI INIBITORI DELLA SINTESI DEL PEPTIDOGLICANO L’apparato biosinte0co della mureina è un bersaglio ideale per molecole an0ba9eriche altamente speciﬁche, infa# una gran parte di an0bio0ci diﬀusi nella pra0ca clinica interferisce con questo sistema. Gli an0bio0ci che inibiscono la sintesi del pep0doglicano agiscono al livello dei diversi stadi del complesso processo di biogenesi della parete cellulare stessa. 13 Inibitori di reazioni del 1° stadio: FOSFOMICINA E CICLOSERINA La fosfomicina è un analogo stru9urale del fosfoenolpiruvato e si lega covalentemente all’enzima piruviltransferasi; è un an0bio0co ad ampio spe9ro u0lizzato sopra9u9o nelle infezioni delle vie urinarie. La cicloserina, analogo stru9urale della D-alanina, inibisce l’a#vità di due enzimi: Alanil racemasi: converte l’L-alanina in D-alanina; D-alanil-D-alanina sintetasi: catalizza la formazione del legame pep0dico tra due molecole di D- alanina. La cicloserina è un an0bio0co ad ampio spe9ro, u0lizzato anche nel tra9amento della tubercolosi. La mureidomicina, un polinucleoside che esercita una potente a#vità an0ba9erica contro Pseudomonas aeruginosa, inibisce in modo compe00vo la traslocasi MraY, che trasferisce l’UDP-NAM-pentapep0de fosfato all’undecaprenil fosfato. Inibitori di reazioni del 2° stadio: BACITRICINA Tra gli inibitori del secondo stadio ricordiamo la bacitricina, un pep0de ciclico isola0 da alcuni ceppi di Bacillus licheniformis; questo an0bio0co si lega all’undecaprenil pirofosfato e ne inibisce la defosforilazione a undecaprenil fosfato e di conseguenza la formazione del lipide I e la biosintesi del glicano pentapep0de. Un meccanismo di resistenza della bacitricina è rappresentano da un sistema di secrezione dell’an0bio0co mediato dal trasportatore ABC BcrABC; un altro meccanismo è fornito da quei plasmidi che codiﬁcano per una undecaprenol chinasi (BacA) che genera de novo l’undecaprenolo monofosfato. Inibitori di reazioni del 3° stadio: ANTIBIOTICI β-LATTAMICI Gli an0bio0ci β-la9amici sono cara9erizza0 dalla presenza di un β-la9ame (amide ciclica con anello a qua9ro atomi). Gli an0bio0ci β-la9amici agiscono come inibitori compe00vi delle proteine che legano la penicillina (PBP), che catalizzano alcune reazioni chiave nella biosintesi del pep0doglicano, in par0colare: Transglicosilasi Transpep0dasi D-alanina carbossipep0dasi Pep0doglicano-endopep0dasi Il legame dell’an0bio0co agli enzimi comporta l’inibizione della funzione di ques0 ul0mi. Penicilline e cefalosporine Le penicilline sono un ampio gruppo di an0bio0ci cos0tui0 da un nucleo (acido 6-aminopenicillanico) legato a diﬀeren0 catene laterali. La penicillina G è prodo9a per via fermenta0va da Penicillium chrysogenum e il suo spe9ro d’azione è cos0tuito quasi esclusivamente dai ba9eri Gram posi0vi. Sos0tuzioni successive in posizione 6 dell’acido 6-aminopenicillanico hanno dato origine ad una vasta gamma di compos0 ad ampio spe9ro, suddivisi in aminopenicilline (ampicillina), ureidopenicilline, penicilline an0staﬁlococciche semisinte0che (me@cillina) e isossiazolipenicilline; tu9e queste molecole legano con maggiore o minore aﬃnità le principali PBP. Le cefalosporine rappresentano la classe di molecole an0bio0che più sviluppata e ar0colata, grazie alle numerose modiﬁcazioni chimiche apportate nel tempo, che hanno ampliato lo spe9ro d’azione. Contengono il nucleo dell’acido 7-aminocefalosporanico, formato da un anello β-la9amico e da un anello diidro0azinico. Dalla cefalosporina C, prodo9a dal fungo Cephalosporium acremonium, derivano tu9e le cefalosporine suddivise in generazioni da I a V. 14 Questa classiﬁcazione si basa sulla valutazione dello spe9ro di a#vità: così le cefalosporine di prima generazione sono cara9erizzate da uno spe9ro an0ba9erico ristre9o verso un numero limitato di patogeni, mentre le generazioni successive hanno modiﬁcato il loro spe9ro ampliandolo sempre di più ﬁno a includere microrganismi mul0resisten0, tra cui Pseudomonas aeruginosa. recentemente è stata introdo9a in clinica una nuova cefalosporina di v generazione, con spe9ro rivolto ai Gram posi0vi, sopra9u9o Staphylococcus aureus resistente a meNcillina (MRSA). MonobaQami e carbapenemi L’unico an0bio0co della classe dei monobaAami che ha avuto uno sviluppo clinico è l’aztreonam, un β- la9amico monociclico; originariamente o9enuto dai brodi colturali di Chromobacterium violaceum. Il suo meccanismo d’azione, simile agli altri an0bio0ci della classe, si esplica preferenzialmente inibendola PBP3; è un an0bio0co ba9ericida a#vo verso i ba9eri Gram nega0vi. I carbapenemi stru9uralmente diﬀeriscono dagli altri β-la9amici poiché possiedono una catena idrossie0lica in trans in posizione 6, questo conferisce cara9eris0che uniche a questo gruppo di an0bio0ci, che sono notevolmente stabili all’idrolisi enzima0ca da parte di numerose famiglie di β-la9amasi. L’imipenem è il primo derivato semisinte0co della 0enamicina, prodo9a da Streptomyces ca:leya. I carbapenemi legano preferenzialmente la PBP1 e PBP2 dei ba9eri Gram posi0vi e Gram nega0vi, causando allungamento della cellula e successiva lisi. Meccanismi di resistenza agli an7bio7ci β-la:amici La resistenza a ques0 an0bio0ci può essere ricondo9a a tre meccanismi principali: 1. Impermeabilità dell’an@bio@co: i ba9eri Gram nega0vi sono intrinsecamente insensibili a molte molecole β-la9amiche grazie alla membrana esterna scarsamente permeabile al farmaco, che pertanto non può raggiungere le PBP bersaglio localizzate nel periplasma. Molte modiﬁcazioni chimiche apportate ai β-la9amici naturali mirano appunto a rendere tali molecole capaci di penetrare la barriera cos0tuita dalla membrana esterna e ampliarne così lo spe9ro d’ospite; 2. Modiﬁcazione del bersaglio: sono presen0 delle PBP con bassa o nulla aﬃnità per gli an0bio0ci β- la9amici, tale condizioni può veriﬁcarsi innanzitu9o a causa di mutazioni in più geni codiﬁcan0 per le PBP che riducono l’aﬃnità per l’an0bio0co della proteine bersaglio senza comprome9erne l’a#vità enzima0ca. L’accumulo di mutazioni in più geni codiﬁcan0 per PBP diverse porta a un incremento graduale della resistenza del microrganismo dell’an0bio0co; 3. InaTvazione enzima@ca: la resistenza ai β-la9amici può esplicarsi inﬁne per ina#vazione del farmaco, a seguito della produzione di enzimi come le β-la9amasi, che idrolizzano il legame amidico dell’anello β-la9amico. Le β-la9amasi sono prodo9e da ba9eri sia Gram posi0vi sia Gram nega0vi; nei ba9eri Gram nega0vi le β-la9amasi, cos0tu0ve o inducibili, sono localizzate nello spazio periplasma0co e agiscono sia sulle penicilline sia sulle cefalosporine. Nei ba9eri Gram posi0vi le β- la9amasi sono a#ve solo verso le penicilline. I geni che codiﬁcano tali enzimi possono essere localizza0 sul cromosoma o su plasmidi, trasposoni e integroni. Quelle plasmidi che solitamente sono cos0tu0ve e hanno maggiore importanza clinica. Inibitori delle β-laQamasi Tra i compos0 β-la9amici si ritrovano molecole capaci di legarsi alle β-la9amasi e di ina#varle, contrastando così un importante meccanismo di resistenza agli an0bio0ci β-la9amici. L’acido clavulanico, il sulbactam e il tazobactam sono i rappresentan0 principali di ques0 inibitori delle β- la9amasi u0lizza0 in associazione con alcuni an0bio0ci β-la9amici per impedirne l’idrolisi da parte delle β- la9amasi prodo9e da ba9eri resisten0. 15 Meccanismo d’azione e uso clinico: l’acido clavulanico, prodo9o da Streptomyces clavuligerus, inibisce la penicillasi staﬁlococcica e molte delle β-la9amasi prodo9e dai ba9eri Gram nega0vi. Il sulbactam ha una bassa a#vità an0ba9erica, mentre il tazobactam è un derivato dell’acido penicillanico, stru9uralmente correlato al sulbactam, pur avendo scarsissima a#vità an0ba9erica, è un potente inibitore delle β-la9amasi. GlicopepNdi I glicopep0di sono pep0di ciclici il cui capos0pite è la vancomicina, isolata da una coltura di Amycolatopsis orientalis, tra i glicopep0di si ricordano anche la teicoplanina, prodo9a da Ac7noplanes teichomyce7cus, più eﬃcace della vancomicina verso diversi patogeni. Gli an0bio0ci glicopep0dici trovano un eﬃcace impiego contro le infezioni gravi da ba9eri Gram posi0vi, in par0colare staﬁlococchi, inclusi ceppi me0cillino-resisten0. Vancomicina e teicoplanina sono eﬃcaci anche verso enterococchi. Meccanismo d’azione: non agiscono dire9amente un enzima implicato nella sintesi della parete mureinica, ma si legano con alta aﬃnità al gruppo terminale D-alanil-D-alanina (D-Ala-D-Ala) del glicano pentapep0de, ovvero l’unità monomerica del ﬁlamento glicanico. I glicopep0di impediscono la polimerizzazione delle nuove unità monomeriche nel ﬁlamento di glicano nascente bloccando così l’allungamento della catena del pep0doglicano. Meccanismi di resistenza: gli an0bio0ci glicopep0dici hanno uno spe9ro d’azione ristre9o, non solo i ba9eri Gram nega0vi ma anche mol0 gruppi di Gram posi0vi sono intrinsecamente tolleran0. L’uso clinico di vancomicina e teicoplanina specialmente per il tra9amento di infezioni da enterococchi, staﬁlococchi e clostridi, ha portato alla comparsa di ceppi resisten0. Una forma importante di resistenza acquisita è dovuta a modiﬁcazione del bersaglio speciﬁco di quella classe di an0bio0ci; nei ceppi resisten0 il glicano pentapep0de non termina con il dipep0de D-Ala-D-Ala bensì con un depsipep7de D-alanil-D-la9ato (D-Ala-D-Lac), questa sos0tuzione elimina uno dei cinque legami idrogeno che si formano tra il glicano pentapep0de e l’an0bio0co, con successiva diminuzione dell’aﬃnità tra glicopep0de e gli amo pentadepsipep0de. La sos0tuzione del pentapep0de con il pentadepsipep0de è mediata da una re-direzione della via biosinte0ca del glicano pentapep0de; il processo richiede almeno cinque geni, generalmente residen0 su un trasposone Tn1546. VanS e VanR cos0tuiscono un sistema a due componen7 per la trasduzione del segnale, che in presenza dell’an0bio0co a#va l’espressione dell’operone vanHAX, ques0 geni codiﬁcano per gli enzimi necessari alla sintesi del depsipep0de D-Ala-D-Lac e alla rimozione del dipep0de D-Ala-D-Ala. Negli staﬁlococchi sono più comuni altre forme di tolleranza ai glicopep0de meno ben cara9erizzate, mol0 ceppi resisten0 ai glicopep0di presentano un ispessimento della parete cellulare che impedisce all’an0bio0co di raggiungere il suo bersaglio. Lan@bio@ci i lan0bio0ci sono pep0di sinte0zza0 per via ribosomale e modiﬁca0 a livello post-traduzionale con la formazione di legami 0oetere che cara9erizzano gli aminoacidi non proteinogenici lan0onina e 3-me0l lan0onina. Sono prodo# da ba9eri Gram posi0vi quali la9ococchi, bacilli e a#nomice0 e presentano a#vità an0microbica verso ba9eri patogeni Gram posi0vi, inclusi Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus e Clostridium. Il rappresentante più noto di queste molecole è la nisina. Una delle modiﬁcazioni più importan0 cui è so9oposto il pep0de core è la deidratazione enzima0ca delle serine e treonine, con formazione rispe#vamente di deidroalanina (Dha) e deidrobu0rrina (Dhb); 16 successivamente alcune di esse vengono a9accate sul loro doppio legame dal gruppo 0olico (–SH) di una cisteina, formando un legame 0oetere. Il bersaglio molecolare di ques0 an0bio0ci è cos0tuito dal lipide ii: legandosi al gruppo pirofosfato, essi inibiscono la polimerizzazione del glicano pentapep0de. I lan0bio0ci hanno un secondo meccanismo d’azione, sono in grado di formare pori transien0 nella membrana cellula danneggiandone l’integrità. PARETE DEI BATTERI GRAM NEGATIVI I ba9eri Gram nega0vi sono circonda0 da una peculiare membrana esterna, una vera e propria membrana a doppio strato lipidico; lo spazio compreso tra membrana interna ed esterna prende il nome di periplasma. Nel periplasma si trova anche una parete mureinica che, a diﬀerenza di quella dei Gram posi0vi, è cos0tuita solo da un so#le strato di pep0doglicano. Periplasma Lo spazio periplasma0co è un compar0mento acquoso che cos0tuisce dal 20 al 40% del volume totale della cellula. Se la membrana esterna viene danneggiata in condizioni ipotoniche che però non danneggino il pep0doglicano e la membrana plasma0ca (shock periplasma0co), le proteine periplasma@che vengono prontamente rilasciate nel mezzo di sospensione e possono essere facilmente studiate. Queste proteine periplasma0che sono coinvolte in numerose funzioni: Acquisizione di nutrien@: proteine periplasma0che legan0 il substrato dei sistemi di trasporto ABC; Generazione di energia: proteine periplasma0che delle catene di trasporto degli ele9roni; Sintesi del pep@doglicano: transglicosilasitranspep0dasi; Biogenesi della membrana esterna e degli altri rives@men@ cellulari: proteine coinvolte nel trasporto del LPS, delle proteine della membrana esterna, dei cos0tuen0 di pili, ﬁmbrie e ﬂagelli; Catabolismo iniziale di nutrien@ complessi: per consen0rne il trasporto a9raverso la membrana plasma0ca; Degradazione o inaTvazione di an@bio@ci e altre sostanze tossiche: ad esempio β-la9amasi e altri enzimi idroli0ci o con svariate altre funzioni. Il corre9o ripiegamento delle proteine periplasma0che viene garan0to dalla presenza di proteine chaperon periplasma@che, che aiutano il ripiegamento delle proteine senza la necessità di ATP per la loro a#vità. Membrana esterna: struAura, composizione e funzioni La cellula dei ba9eri didermi è circondata dalla membrana esterna, questa è una membrana asimmetrica cos0tuita da fosfolipidi nel foglie9o interno e lipopolisaccaride (LPS) nel foglie9o esterno, in cui sono immerse proteine transmembrana. Il LPS è una grande e complessa molecola anﬁpa0ca contenente sia lipidi che residui saccaridici. Nel LPS si possono dis0nguere tre diverse porzioni: 1. Uno speciale saccarolipide de9o lipide A; 2. Una regione polisaccaridica de9a nocciolo o core; 3. Una lunga catena polisaccaridica de9a an@gene O. 17 SCHEMA GENERALE DELLA PARETE DEI BATTERI GRAM NEGATIVI. La stru9ura dell’involucro cellulare del ba9erio Gram nega0vo Escherichia coli. I diversi monosaccaridi sono rappresenta0 da piccoli re9angoli e ovali di colori diﬀeren0. L’an0gene O è cos0tuito da un lungo polimero di una subunità tetra- o pentasaccaridica di cui è rappresentato un esempio. MI: membrana interna; Kdo: 2-cheto-3-deossio9onato. [LIPOPOLISACCARIDE. La stru9ura del lipide A-Kdo di Escherichia coli. In blu è indicato il dimero bis-fosforilato di N- ace0l-glucosamina legato a sei residui estere di acidi grassi (in verde); in nero i due residui di 2-cheto-3-deossio9onato (Kdo).] Il lipide A, cos0tuito da un dimero di N- ace0l-glucosamina esteriﬁcato con due residui fosfato e un numero variabile di molecole di acidi grassi (da 4 a 7) nei diversi ba9eri Gram nega0vi, è la parte lipidica che àncora il LPS alla membrana esterna. Al lipide A è legato il core polisaccaridico, che può essere suddiviso ulteriormente in core interno ed esterno: la composizione 18 del core interno è abbastanza conservata nei diversi 0pi di LPS e con0ene da una a tre molecole di 2- cheto-3-deossio9onato (Kdo) e uno zucchero a 7 atomi di C (eptosio); il core esterno è più variabile e con0ene zuccheri a 6 o 7 atomi di C. Al core saccaridico è legata la catena polisaccaridica O (an0gene O), cos0tuita da lunghe catene di unità tetra- o pentasaccaridiche ripetute che si estendono verso l’esterno della cellula. Molte cara9eris0che e funzioni della membrana esterna dipendono dalla presenza del LPS nel suo strato esterno. Poiché, oltre al lipide A, anche il core saccaridico può contenere gruppi fosfato e residui di zuccheri carichi, la superﬁcie della cellula risulta carica nega0vamente; ca0oni bivalen0 (Ca2+, Mg2+) sono generalmente associa0 al LPS, generando così una stru9ura estremamente stabile. Nei ba9eri patogeni il LPS rappresenta un importante fa9ore di virulenza in grado di evadere le difese aspeciﬁche dell’ospite come la fagocitosi e l’a#vazione del complemento. Il LPS rappresenta anche, per gli organismi ospi0, un importante “segnale” della presenza ba9erica. Infa# la catena polisaccaridica O è in grado di indurre la produzione di an0corpi speciﬁci nell’ospite, mentre il lipide A è in grado di a#vare l’immunità innata, vengono indo# una serie di even0 a cascata che culmina con la produzione di citochinine pro-inﬁammatorie. La diﬀusione nel periplasma di ioni e piccole molecole è possibile grazie alla presenza di proteine canale denominate porine. Le porine sono una classe di proteine omotrimeriche in cui ogni monomero è rappresentato da una proteina transmembrana con una stru9ura a bo9e (β-barrel) la cui cavità centrale cos0tuisce il canale, la dimensione del canale può variare a seconda della porina considerata. Oltre a canali “non speciﬁci”, nella membrana esterna sono presen0 anche porine che consentono la diﬀusione di speciﬁci nutrien0. Il proto0po di questa seconda classe di porine è rappresentato da LamB, che perme9e l’ingresso di maltosio e maltodestrine in E. coli. Dal momento che la membrana esterna è priva di fon0 energe0che, il passaggio di nutrien0 a9raverso le porine avviene secondo il gradiente di concentrazione (diﬀusione facilitata). Un’altra classe di proteine associate alla membrana esterna è rappresentata dalle lipoproteine, che partecipano a numerose funzioni cellulari quali: Stabilizzazione delle stru9ure di superﬁcie della cellula Trasporto Resistenza ad an0bio0ci Trasduzione del segnale Biogenesi della membrana esterna I componen0 della membrana esterna (lipopolisaccaride, fosfolipidi, proteine e lipoproteine) sono sinte0zza0 nel citoplasma o sul lato citoplasma0co della membrana interna e devono quindi a9raversare due diversi compar0 cellulari, la membrana plasma0ca e il periplasma, prima di raggiungere la des0nazione ﬁnale. Inoltre sia il periplasma sia la membrana esterna sono privi di fon0 energe0che quali gradiente protonico (forza proton-motrice) e ATP. Trasporto delle proteine integrali della membrana esterna Le proteine della membrana esterna sinte0zzate nel citoplasma possiedono una sequenza segnale all’N- terminale che le indirizza alla traslocazione a9raverso la membrana interna. I sistemi responsabili della traslocazione delle proteine a9raverso la membrana plasma0ca sono due: il cosidde9o traslocone Sec, che provvede al trasporto di proteine non ancora ripiegate nella stru9ura terziaria deﬁni0va (proteine 19 unfolded), e il sistema Tat, che invece trasloca proteine che sono già state corre9amente ripiegate nel citoplasma. Tu9e le proteine della membrana esterna (denominate OMP) studiate ﬁno ad oggi sono trasportate dal sistema Sec, il che suggerisce che queste raggiungano il periplasma in uno stato non ripiegato (unfolded). Dopo essere state traslocate a9raverso la membrana interna le proteine dire9e alla membrana esterna devono a9raversare lo spazio periplasma0co e speciﬁche proteine chaperon le assistono durante il passaggio in questo comparto. In E. coli sono state studiate in de9aglio due di queste proteine chaperon, Skp e SurA. Skp interagisce con le proteine dire9e alla membrana esterna non appena queste escono dal canale del traslocone Sec e il legame con Skp ne previene l’aggregazione durante il trasporto. Si pensa invece che la proteina chaperon SurA sia richiesta per il corre9o ripiegamento delle OMP prima della loro inserzione nella membrana esterna. Alcune OMP possiedono legami disolfuro la cui formazione è catalizzata da speciﬁci enzimi periplasma0ci che formano e isomerizzano legami disolfuro durante il passaggio delle OMP a9raverso il periplasma. MODELLO DI TRASPORTO DELLE PROTEINE ALLA MEMBRANA ESTERNA OPERATO DAL MACCHINARIO Bam. La proteina della membrana esterna, OMP (in giallo), sinte0zzata nel citoplasma e rilasciata dal traslocone Sec, è immediatamente legata dalla proteina chaperon Skp, che ne previene l’aggregazione nel periplasma. La sequenza segnale localizzata al C-terminale della OMP e riconosciuta da BamA è indicata in rosso. Prima di essere inserita nella membrana esterna, la OMP deve essere corre9amente ripiegata: questo processo sembra essere catalizzato dalla proteina chaperon SurA. L’oligomerizzazione delle porine avviene probabilmente dopo l’inserzione nella membrana esterna. Trasporto delle lipoproteine 20 Le lipoproteine sono sinte0zzate nel citoplasma come prolipoproteine e possiedono una sequenza segnale all’N-terminale che le indirizza al traslocone Sec, il quale provvede al loro trasporto a9raverso la membrana plasma0ca. È stato studiato in E. coli e comprende almeno cinque proteine denominate Lol (Lipoproteins outer membrane Localiza7on. Il complesso formato dalle proteine LolCDE, un trasportatore ABC, localizzato nella membrana interna, prende in carico le lipoproteine che hanno a9raversato la membrana interna e, grazie all’energia derivata dall’idrolisi di ATP, le indirizza allo chaperon periplasma0co LolA. La proteina LolA possiede una cavità idrofoba che lega la porzione lipidica della lipoproteina formando così un complesso solubile che può a9raversare il periplasma. Il complesso LolA-lipoproteina interagisce quindi con LolB, un rece9ore localizzato nella membrana esterna responsabile dell’inserzione della lipoproteina nella membrana esterna. Il sistema di trasporto Lol discrimina tra le lipoproteine e trasporta alla membrana esterna solo quelle che non possiedono un residuo Asp in posizione +2 nella proteina matura. Quindi questo residuo aminoacidico funge da segnale di ritenzione nella membrana interna e impedisce il riconoscimento e il trasporto da parte del sistema Lol. TRASPORTO DELLE LIPOPROTEINE ATTRAVERSO L’INVOLUCRO DEI BATTERI GRAM NEGATIVI. (a) Le lipoproteine neosinte0zzate a9raversano la membrana plasma0ca grazie al traslocone Sec e subiscono la modiﬁcazione lipidica a livello di un residuo di cisteina (C) all’N-terminale nel periplasma. Le lipoproteine che possiedono un residuo di aspartato (D) in posizione +2 restano nella membrana interna, mentre quelle che possiedono un altro residuo aminoacidico (X) nella stessa posizione vengono indirizzate alla membrana esterna. Il complesso LolCDE trasferisce la lipoproteina a LolA u0lizzando l’energia derivata dall’idrolisi 21 dell’ATP. Quando il complesso LolA-lipoproteina interagisce con il rece9ore LolB, la lipoproteina viene trasferita a LolB e inserita sul lato periplasma0co della membrana esterna. Alcuni ba9eri Gram nega0vi possiedono lipoproteine anche nello strato esterno della membrana esterna, ma il trasportatore responsabile non è ancora stato iden0ﬁcato. Trasporto del lipopolisaccaride La via di biosintesi del LPS è ben conosciuta e avviene in parte nel citoplasma e in parte nel foglie9o interno della membrana plasma0ca. La porzione lipide A-core è sinte0zzata separatamente dalle unità polisaccaridiche che cos0tuiscono l’an0gene O; gli zuccheri che le compongono sono infa# assembla0 sul trasportatore lipidico undecaprenolo-P (che come si ricorderà è anche implicato nel trasporto del glicano pentapep0de, il monomero precursore del pep0doglicano), ancorato alla membrana interna. Ne consegue che la porzione lipide A-core è trasportata a9raverso la membrana plasma0ca separatamente dalle unità ripetute dell’an0gene O. Il trasporto della porzione lipide A-core è mediato da una proteina (MsbA) che appar0ene alla famiglia dei trasportatori ABC. BIOSINTESI E TRASPORTO DEL LIPOPOLISACCARIDE (LPS) ALLA MEMBRANA ESTERNA. Le unità polisaccaridiche precursori dell’an0gene O sono trasportate a9raverso la membrana interna da un trasportatore ABC (qui evidenziato in arancione). Una volta nel periplasma, le unità polisaccaridiche 22 vengono polimerizzate (polimerasi Wzy) e legate alla porzione lipide A-core (ligasi WaaL). La porzione lipide A-core sinte0zzata nel citoplasma viene trasportata a9raverso la membrana interna dal trasportatore ABC MsbA. Il trasporto del lipopolisaccaride a9raverso il periplasma dipende dal complesso mul0proteico LptBCFG localizzato nella membrana interna. LptA è lo chaperon responsabile del trasporto del LPS a9raverso il periplasma. Inﬁne, il complesso cos0tuito dalle proteine LptD e LptE inserisce il LPS nella membrana esterna. Nel periplasma le subunità dell’an0gene O sono legate alla porzione lipide A-core ancorata sul lato periplasma0ca della membrana interna per formare il LPS maturo. La maggior parte delle nostre conoscenze su questa parte del processo di trasporto derivano da studi su E. coli. In questo ba9erio sono state iden0ﬁcate se9e proteine che partecipano al processo di trasporto e che cos0tuiscono un complesso mul0proteico che conne9e la membrana interna a quella esterna. I MICOPLASMI: BATTERI GRAM+ SENZA PARETE I micoplasmi sono ba9eri appartenen0 alla classe Mollicutes, phylum Tenericutes, e sono divisi in tre ordini: Anaeroplasmatales Acholeplasmatales Mycoplasmatales Questo par0colare gruppo di ba9eri è incapace di sinte0zzare il pep0doglicano ed è pertanto privo di parete. Le cellule dei micoplasmi, quindi, sono racchiuse esclusivamente dalla membrana plasma0ca e ricordano molto da vicino i protoplas0. La loro membrana è peculiare: è lipoproteica e ricca di steroli, caso unico fra le cellule ba9eriche. Queste cara9eris0che della membrana rendono i micoplasmi resisten0 alla lisi osmo0ca. il maggior responsabile di patologie respiratorie è Mycoplasma pneumoniae, una delle principali cause della polmonite a0pica primaria. Sono commensali M. salivarium, M. orale, M. buccale. LE CLAMIDIE: BATTERI GRAM- SENZA PARETE MUREINICA Anche i ba9eri appartenen0 al phylum delle Chlamydiae sono privi di parete mureinica. Tu# i ba9eri del phylum sono patogeni per l’uomo e sono parassi0 intracellulari obbliga0. Fra le Chlamydiae più conosciute vi sono l’agente eziologico della psiAacosi (C. psi:aci), l’agente del tracoma, mala#a dell’occhio (C. trachoma7s). Altri @pi di parete nei Bacteria La maggior parte dei ba9eri risponde in modo univoco alla colorazione di Gram, ma alcuni gruppi di ba9eri ﬁlogene0camente appartenen0 ai Gram posi0vi si colorano in modo diverso a seconda della fase di crescita; ques0 ba9eri vengono deﬁni0 Gram variabili. I ba9eri appartenen0 al genere Mycobacterium sono cara9erizza0 dalla presenza di una parete cellulare assolutamente peculiare, insolitamente spessa, ricca di componen0 cerose che formano uno spesso strato impermeabile; la colorazione di Ziehl-Neelsen perme9e di colorare in modo diﬀerenziale questo importante gruppo di ba9eri. La parete dei micoba9eri ha una stru9ura abbastanza complessa che può essere divisa in due stra0: Strato basale (core): cos0tuito da pep7doglicano e arabinogala:ano; Stru9ura più esterna bistra0ﬁcata cos0tuita da uno strato di acidi micolici e uno di cere (glicolipidi fenolici), la disposizione di acidi micolici e cere è tale da formare una vera e propria membrana esterna; 23 Lo strato basale è cos0tuito da un copolimero di pep0doglicano e arabinogala9ano. L’arabinogala9ano, che rappresenta il maggior polisaccaride di parete, è un polisaccaride ramiﬁcato complesso, dove i residui di zuccheri (arabinosio e gala9osio) che lo compongono sono presen0 in forma furanosica. Gli acidi micolici, che fanno parte del foglie9o interno della membrana esterna micoba9erica, sono acidi grassi complessi a catena lunga (C60-C90), alchila0 e idrossila0. Gli acidi micolici sono ancora0 covalentemente alla parete dei ba9eri, contribuendo alla scarsa ﬂuidità della membrana esterna micoba9erica. Nel foglie9o esterno troviamo le cere, glicolipidi complessi cara9erizza0 da catene carboniose molto lunghe e ramiﬁcate che interagiscono con gli acidi micolici legandosi ad essi in modo non covalente a9raverso le porzioni lipidiche. I MICOBATTERI I ba9eri del genere Mycobacterium appartengono al subphylum dei ba9eri Gram posi0vi ad alto G+c, gli Ac7nobacteria, ordine Ac7nomycetales. Tra i micoba9eri patogeni, quelli che causano mala#e polmonari vengono comunemente dis0n0 in due gruppi: 1. MicobaQeri tubercolari: fanno parte del cosidde9o complesso MTB (Mycobacterium tuberculosis complex), possono causare forme di tubercolosi (tB). tra ques0 troviamo M. tuberculosis, patogeno per l’uomo, M. bovis, patogeno per gli animali, M. micro7, M. caneXi e M. africanum. 2. MicobaQeri non tubercolari: (o MOTT, Mycobacterium other than tuberculosis) provocano mala#e polmonari simili alla tubercolosi. M. leprae, inﬁne, è l’agente eziologico della lebbra. LA COLORAZIONE DI ZIEHL – NEELSEN (ACIDO RESISTENZA) La par0colare stru9ura della parete cellulare conferisce ai ba9eri del genere Mycobacterium una cara9eris0ca importante per la loro iden0ﬁcazione in microscopia o#ca, de9a acido resistenza. I micoba9eri infa# sono estremamente diﬃcili da colorare con le consuete tecniche, poiché i coloran0 tradizionali, come quelli u0lizza0 per la colorazione di Gram, non riescono a oltrepassare la barriera impermeabile della loro parete cellulare. 24 Verso la ﬁne del secolo XIX Franz Ziehl e Friedrich Neelsen misero a punto un procedimento (noto come colorazione di Ziehl-neelsen o acido resistente) con cui colorare in modo irreversibile i micoba9eri. Questa colorazione diﬀerenziale prevede, in primo luogo, dopo la ﬁssazione al calore del campione su un vetrino da microscopio, un tra9amento a caldo dei ba9eri con una soluzione di fucsina e fenolo in etanolo (de9a anche carbolfucsina): a temperatura elevata questo colorante è solubile nei lipidi di parete dei micoba9eri e può così penetrare nel citoplasma. si procede poi con una decolorazione con alcol acido (al 3%) a temperatura ambiente. Questo tra9amento non ha eﬀe9o sui micoba9eri, ma decolora tu# gli altri ba9eri presen0 sul vetrino. inﬁne si eﬀe9ua una colorazione di contrasto con blu di me@lene, che non viene assorbito dai micoba9eri ma colora gli altri ba9eri presen0 nel preparato. sul vetrino così colorato i micoba9eri appaiono come bastoncini rossi (perché non hanno perso la colorazione iniziale della fucsina), mentre altri ba9eri eventualmente presen0 sono colora0 in blu. PARETE CELLULARE NEGLI ARCHAEA 25 L’archite9ura e la composizione della parete degli Archaea è molto diversiﬁcata. Nei microrganismi studia0 più approfonditamente (gli Archaea metanogeni e aloﬁli estremi) sono sta0 descri# vari 0pi di pare0 cellulari. La stru9ura di ques0 involucri, qualunque sia la loro natura chimica, è par0colarmente ada9a agli ambien0 estremi in cui ques0 procario0 possono vivere. Gli Archaea metanogeni presentano pare0 diverse nei diversi gruppi: i microrganismi appartenen0 agli ordini Methanobacteriales e Methanopyrales contengono una sostanza simile al pep0doglicano, de9a pseudopep0doglicano o pseudomureina. Lo pseudopep@doglicano è un polisaccaride composto dalla ripe0zione di subunità cos0tuite da due aminozuccheri, l’N-ace@l- glucosamina (NAG) e l’acido N- ace@l-talosaminuronico (NAT). Nell’acido ace0l-talosaminuronico tu# gli aminoacidi che cos0tuiscono le catene pep0diche laterali sono in forma L. Gli aminozuccheri dello pseudopep0doglicano sono uni0 da un legame glicosidico (1,3). Le diﬀerenze chimiche tra pseudopep0doglicano e pep0doglicano rendono i metanogeni resisten0 al lisozima. Fa eccezione Thermoplasma, che manca di una vera parete cellulare; la cellula è avvolta da una singola membrana a triplo strato, 5-10 nm di spessore, molto peculiare perché con0ene lipoglicani tetraetere con catene isoprenoidi C40 legate a oligosaccaridi contenen0 glucosio e mannosio. MONODERMI E DIDERMI Tu9avia studi più approfondi0 sulle stru9ure di rives0mento svol0 su un maggior numero di organismi, uni0 ai recen0 progressi nel campo della genomici, hanno evidenziato una più ampia varietà dell’involucro ba9erico non riconducibile alla suddivisione sopra menzionata. Infa#, ad esempio, microrganismi (Thermotogae) classiﬁca0 come Gram nega0vi, pur essendo dota0 di membrana esterna, non possiedono lipopolisaccaride associato ad essa. D’altro canto alcuni microrganismi classiﬁca0 come Gram posi0vi (Corynebacterineae) appaiono dota0 di una membrana esterna basata sostanzialmente su acidi micolici. Appare quindi che la classiﬁcazione dei Bacteria in Gram nega0vi e Gram posi0vi non sia soddisfacente per raggruppare in modo coerente le diverse archite9ure e composizioni del rives0mento ba9erico. Viene u0lizzata la suddivisione in monodermi e didermi. Il gruppo dei monodermi quindi comprende Bacteria circonda0 da un’unica membrana (la membrana plasma0ca), mentre il gruppo dei didermi comprende Bacteria che possiedono un doppio sistema di membrane (membrana interna e membrana esterna) indipendentemente dalla composizione lipidica della membrana esterna. 26 CAPSULA E ALTRI RIVESTIMENTI ESTERNI Strato S Mol0 procario0 sono provvis0 di uno strato proteico paracristallino a stru9ura regolare, chiamato strato S; questo è stato osservato in poche specie ba9eriche, sia Gram + sia Gram -, e in quasi tu# gli Archaea no0. Lo strato S si forma per autoassemblaggio di subunità proteiche sulla superﬁcie cellulare e cos0tuisce un re0colo cristallino spesso 5-25 nm con simmetria esagonale, quadrata od obliqua a seconda del numero e della stru9ura delle subunità proteiche che lo compongono. L’assemblaggio di subunità uguali forma pori di iden0che dimensioni (2-8 nm) e morfologia. In mol0 stra0 S sono state iden0ﬁcate due o più classi dis0nte di pori che occupano ﬁno al 70% della superﬁcie cellulare. Questo rives0mento esterno è ancorato, mediante legami non covalen0, alle diﬀeren0 stru9ure della parete cellulare dei diversi gruppi microbici. Nei ba9eri Gram posi0vi e negli archei dota0 di parete pseudomureinica le subunità dello strato S sono associate rispe#vamente al pep0doglicano e alla pseudomureina, mentre nei ba9eri Gram nega0vi si ancorano al lipopolisaccaride della membrana esterna. Negli Archaea privi di una parete pseudomureinica, lo strato S può cos0tuire l’unico componente del rives0mento cellulare all’esterno della membrana plasma0ca ed è stre9amente associato ad essa. Lo strato S è composto da proteine insolubili in acqua, debolmente acide, con un alto contenuto di acido glutamico, acido aspar0co, lisina e aminoacidi idrofobi. Esse vengono secrete a9raverso la via di secrezione generale dipendente da Sec, ma in alcuni casi, come in Caulobacter crescentus, è u0lizzato il sistema di trasporto ABC. Inﬁne, una cara9eris0ca peculiare di queste proteine è quella di essere frequentemente legate in modo covalente a catene di glicani cos0tui0 da sequenze ripetute di una grande varietà di zuccheri che sporgono nell’ambiente extracellulare. La biosintesi di una glicoproteina dello strato S è un processo complesso in cui la glicosilazione deve essere coordinata con la quan0tà di proteina sinte0zzata, la sua traslocazione a9raverso la parete cellulare e l’incorporazione nello strato S esistente. La funzione dello strato S non è del tu9o chiara. Esso potrebbe fungere da barriera prote#va e setaccio molecolare escludendo il passaggio di macromolecole, promuovere l’adesione cellulare e il riconoscimento di superﬁci, mantenere la rigidità della parete cellulare e, nei ba9eri patogeni, conferire protezione nei confron0 dei meccanismi di difesa dell’ospite. Capsule e polisaccaridi extracellulari In aggiunta alle stru9ure di rives0mento ﬁnora descri9e, mol0 ba9eri secernono polimeri, in genere polisaccaridi, che aderiscono alla superﬁcie cellulare formando uno strato mucoso, il glicocalice. Quando il glicocalice è ben stru9urato e adeso alla parete cellulare viene denominato capsula o CPS (capsular polysaccharide). Quando invece non è organizzato, o forma un’area di materiale diﬀuso ed è lassamente adeso alla parete cellulare, viene chiamato strato mucoso o “slime layer” o EPS. La presenza della capsula conferisce alle colonie ba9eriche una morfologia liscia (S = smooth) e un aspe9o lucido. Mutan0 ba9erici privi di capsula formano colonie rugose (R = rough). Le capsule polisaccaridiche sono fortemente idratate ﬁno a contenere il 90% di acqua; esse sono cos0tuite da singole unità ripetute di monosaccaridi, uni0 da legami glicosidici. I polisaccaridi capsulari danno origine a un ampio gruppo di molecole che possono variare non solo per i monosaccaridi che li cos0tuiscono ma anche per il 0po di legame che li unisce. CPS ed EPS svolgono molte 27 funzioni nella biologia dei procario0 e frequentemente rappresentano “determinanN di virulenza” essenziali nei patogeni di piante, animali e uomo. È stato ampiamente dimostrato che le capsule proteggono le cellule ba9eriche dalla fagocitosi di protozoi predatori e di cellule del sistema immunitario e dall’a9acco di agen0 an0microbici di origine vegetale e animale. Inﬁne, CPS ed EPS promuovono l’aderenza di ba9eri sia ad altri ba9eri sia a superﬁci di varia natura e perme9ono la colonizzazione di diﬀeren0 nicchie ecologiche e la formazione di bioﬁlm. BIOGENESI DEI RIVESTIMENTI BATTERICI E SECREZIONE DI MACROMOLECOLE Le membrane che cos0tuiscono l’involucro delle cellule procariote (la membrana plasma0ca dei ba9eri monodermi e degli Archaea e le membrane plasma0ca ed esterna dei ba9eri didermi) rappresentano un’importante barriera al ﬂusso di macromolecole dall’interno all’esterno della cellula e viceversa. L’ampia varietà di funzioni metaboliche svolte dalle membrane delle cellule procariote dipende dalle numerose e svariate proteine in esse contenute: queste sono sinte0zzate nel citoplasma e devono quindi essere trasportate e inserite nel doppio strato lipidico della membrana plasma0ca o, nel caso dei ba9eri Gram nega0vi, nel periplasma e nella membrana esterna. Inoltre, molte importan0 stru9ure (capsule, pili, ﬁmbrie e ﬂagelli) sono situate esternamente alla parete cellulare; le cellule devono quindi possedere sistemi per il trasporto dei singoli componen0, proteici e non, e per il loro assemblaggio sulla superﬁcie della cellula. Per rispondere a tu9e queste esigenze, i ba9eri hanno evoluto svaria0 sistemi per trasferire proteine dal loro sito di sintesi, il citoplasma, all’interno e a9raverso la membrana. Sistema di secrezione Sec e sue diramazioni Sec – dipenden@ La principale via di secrezione delle proteine è de9a sistema di secrezione Sec, ed è stata riscontrata in tu# e tre i domini del mondo vivente. È preposta sia al trasporto di proteine a9raverso la membrana plasma0ca sia all’inserimento di proteine nella membrana plasma0ca stessa. L’apparato di secrezione Sec è cos0tuito da una “macchina proteica” in cui possiamo dis0nguere tre par0: Complesso transmembrana, de9o anche “traslocone Sec”, che media il trasporto delle proteine; A questo è associato, sul versante citoplasma0co, il “motore” che fornisce l’energia necessaria per il trasporto; Sistema citoplasma@co che riconosce le proteine da trasportare. Tu9e le proteine indirizzate al sistema Sec sono infa# sinte0zzate come precursori (pre-proteine) dota0, all’estremità N-terminale, di una sequenza segnale di circa 24 aminoacidi, cara9erizzata da una stru9ura riconducibile a tre domini: Regione centrale idrofoba (6-15 aminoacidi) ﬁancheggiata all’N-terminale da una Porzione idroﬁla basica: localizzata nella regione centrale idrofoba, localizzata nell’N-terminale Porzione leggermente polare al C-terminale. La proteina SecB, una speciale proteina chaperon citoplasma7ca, lega la proteina nascente e ne rallenta il ripiegamento aiutandola a raggiungere il complesso di membrana nella conformazione richiesta per il trasporto. Infa# il sistema di secrezione Sec trasporta a9raverso la membrana proteine che non sono ancora state ripiegate in una stru9ura terziaria. Il complesso transmembrana è un eterotrimero cos0tuito dalle proteine integrali di membrana SecYEG in cui SecY forma un canale. L’energia per il lavoro di trasporto fornita dall’idrolisi di ATP viene trasferita al complesso SecYEG da SecA, una ATPasi associata alla membrana. 28 Durante l’a9raversamento del canale formato dal complesso SecYEG la proteina è mantenuta in una forma competente per il trasporto dalla proteina chaperon SecB. Quando la preproteina fuoriesce dal canale Sec la sequenza segnale all’N-terminale viene rimossa da una speciﬁca pep0dasi associata alla membrana. Se la proteina matura è des0nata al periplasma può ora cominciare il processo di ripiegamento (folding); se invece è des0nata alla membrana esterna o all’ambiente extracellulare è presa in consegna da successivi sistemi di trasporto. Nei ba9eri Gram posi0vi sono a9accate covalentemente al pep0doglicano da speciﬁci enzimi associa0 alla membrana, a cos0tuire le proteine di superﬁcie. Indirizzamento delle proteine alla membrana interna Il sistema che controlla il riconoscimento delle proteine des0nate alla membrana e che le indirizza al complesso che ne media l’inserzione prende il nome di sistema SRP (signal recogni7on par7cle) ed è conservato in procario0 ed eucario0. In E. coli il sistema SRP è cos0tuito da un complesso ribonucleoproteico, formato dalla proteina F~ e dall’RNA 4.5S, e dal rece9ore del complesso SRP (proteina FtsY). Le proteine indirizzate alla membrana plasma0ca possiedono una sequenza di natura idrofobica all’N-terminale che generalmente è il primo segmento transmembrana della proteina (anche chiamata sequenza segnale transmembrana àncora). 29 Questa sequenza viene riconosciuta dal complesso SRP non appena sinte0zzata ed esposta all’esterno dal ribosoma. Il legame SRP- sequenza segnale è cruciale per indirizzare la proteina nascente alla membrana dove è presente la proteina FtsY, il rece9ore del complesso SRP-sequenza segnale-ribosoma. Data l’aﬃnità del rece9ore FtsY per SecY, il ribosoma e la proteina nascente sono indirizzate al traslocone Sec. L’inserzione delle proteine nella membrana mediata dallo stesso apparato inizia prima che la traduzione sia stata terminata ed è quindi un processo co-traduzionale. In E. coli l’inserzione della maggior parte delle proteine della membrana interna richiede l’intervento di una proteina essenziale (YidC), presente anche nei ba9eri Gram nega0vi, Gram posi0vi, nei mitocondri e nei cloroplas0. Questa proteina è associata al traslocone Sec ed è implicata sia nel corre9o ripiegamento delle proteine non appena inserite nella membrana sia nell’assemblaggio di complessi mul0merici. Indirizzamento delle proteine all’ambiente extracellulare Nei ba9eri didermi le proteine secrete a9raverso la membrana interna devono a9raversare la membrana esterna per raggiungere l’ambiente extracellulare. Sono no0 almeno qua9ro diversi 0pi di sistemi di trasporto che operano a valle del sistema Sec e trasportano proteine speciﬁche a9raverso la membrana esterna: Sistema di secrezione di @po II Sistema di secrezione a due partner Sistema dell’autotrasporto e la via “chaperon/usciere SISTEMA DI SECREZIONE DI TIPO II Il numero di proteine indispensabili per cos0tuire un sistema di secrezione di 0po II funzionale varia a seconda delle specie ed è compreso tra 12 e 15 componen0. Queste proteine sono assemblate in un complesso mul0proteico che abbraccia l’intero rives0mento del ba9erio Gram nega0vo (membrana interna, periplasma e membrana esterna) e che presenta un poro di secrezione nella membrana esterna e una componente citoplasma0ca associata alla membrana che fornisce l’energia al sistema grazie all’idrolisi di nucleosidi trifosfa0 (ATP o GTP). I sistemi di secrezione di 0po II sono molto speciﬁci e dedica0 al trasporto di un singolo substrato, come ad esempio la tossina colerica in Vibrio cholerae, oppure le proteine che formano pili speciﬁci di Neisseria gonorrhoeae. La speciﬁcità dell’apparato di secrezione di 0po II è evidente dal fa9o che sistemi correla0 sono in grado di discriminare il proprio substrato da proteine molto simili. 30 È presumibile quindi che l’apparato di secrezione sia in grado di discriminare il proprio substrato tra le varie proteine periplasma0che grazie al riconoscimento di elemen0 stru9urali che emergono solo in seguito al loro corre9o ripiegamento. SISTEMA DI SECREZIONE A DUE PARTNER (two partner secreNon, TPS) Il sistema di secrezione a due partner è cos0tuito da una sola proteina di trasporto che funge da canale nella membrana esterna e da uno speciﬁco elemento nella proteina trasportata. Le proteine di trasporto hanno una 0pica stru9ura “a bo9e” (β-barrel) che forma il canale nella membrana esterna a9raverso il quale il substrato è secreto all’esterno della cellula. Le proteine trasportate possono essere di natura diversa e comprendono proteasi, tossine, adesine e invasine. Le proteine substrato dei sistemi TPS, solitamente di grandi dimensioni, sono cara9erizzate dalla presenza di un dominio all’N- terminale della proteina matura di circa 300 aminoacidi (dominio TPS, che cara9erizza la superfamiglia di proteine TpsA). Le proteine canale a bo9e (β-barrel) appartengono alla superfamiglia TpsB, diﬀusi tra i ba9eri Gram nega0vi; sono presen0 anche nei cloroplas0 e nei mitocondri, dove mediano l’inserimento diproteine nelle rispe#ve membrane. I geni che codiﬁcano per TpsA e TpsB sono generalmente organizza0 in un operone. 31 SISTEMA DELL’AUTOTRASPORTO (SISTEMA DI SECREZIONE DI TIPO V) Alcune proteine, giunte nel periplasma grazie al sistema Sec, possono essere secrete a9raverso la membrana esterna senza l’ausilio di altri fa9ori poiché possiedono un dominio C-terminale che ne media la secrezione. Queste proteine, che cos0tuiscono la famiglia degli autotrasportatori perché sono capaci di secrezione autonoma a9raverso la membrana esterna, sono sinte0zzate 0picamente come precursori dota0 di tre dis0n0 domini: la sequenza segnale all’N-terminale per la secrezione a9raverso la membrana plasma0ca mediata da Sec e che viene rimossa dopo il trasporto nel periplasma; il dominio interno che cos0tuisce il “passeggero” (passenger domain), ossia il dominio funzionale speciﬁco della proteina; il dominio C-terminale che forma il canale di trasporto. Il sistema dell’autotrasporto non sembra richiedere una fonte di energia esterna. Una volta raggiunta la superﬁcie della cellula la proteina può essere rilasciata nell’ambiente extracellulare grazie a un evento di proteolisi (o autolisi) oppure può rimanere ancorata alla membrana esterna. SECREZIONE ATTRAVERSO LA VIA CHAPERON/USCIERE La via denominata chaperon/usciere (chaperon/usher) è generalmente dedicata alla secrezione e all’assemblaggio di stru9ure localizzate sulla superﬁcie della cellula, come alcuni 0pi di pili e stru9ure di adesione, che spesso sono fa9ori di virulenza di ba9eri patogeni. Il passaggio a9raverso la membrana esterna delle componen0 da assemblare sulla superﬁcie della cellula richiede due proteine, una proteina chaperon periplasma0ca (chaperon) e una proteina di membrana esterna (“usciere”). Le varie subunità del pilus, trasportate a9raverso la membrana interna dal sistema generale di secrezione Sec e maturate nel periplasma, interagiscono con la proteina chaperon periplasma0ca PapD che ne guida il corre9o ripiegamento. Il legame PapD-pilina assolve diversi altri compi0: Previene un’interazione prematura delle subunità del pilus nel periplasma; Stabilizza la subunità del pilus mascherandone le porzioni idrofobiche; Indirizza il complesso PapDpilina alla proteina usciere PapC situata nella membrana esterna. L’interazione del complesso PapD-pilina con PapC induce la dissociazione della proteina chaperon dalla subunità del pilus lasciando esposte le regioni idrofobe che ne consentono l’incorporazione nella stru9ura nascente. Questo sistema non sembra richiedere una fonte di energia esterna per la secrezione della pilina 32 a9raverso la membrana esterna e il suo assemblaggio nei pili. È probabile che l’energia derivi unicamente dalle interazioni proteina-proteina che guidano ques0 processi. SISTEMI DI SECREZIONE INDIPENDENTI DA SEC Nei ba9eri esistono numerosi altri sistemi di trasporto che operano in modo indipendente da Sec. Trasporto aAraverso la membrana plasma@ca di proteine ripiegate: IL SISTEMA TAT Il sistema Tat (twin-arginine transloca7on system) ha come peculiarità la capacità di trasportare proteine corre9amente ripiegate a9raverso la membrana plasma0ca. Questo sistema è conservato in Bacteria, Archaea e negli organelli (mitocondri e cloroplas0) delle piante. I substra0 secre0 dal sistema Tat possiedono una sequenza segnale all’N- terminale cara9erizzata da tre domini: Dominio all’N-terminale cara9erizzato da aminoacidi carichi posi0vamente; Dominio centrale idrofobico Dominio al C-terminale Il pep0de segnale dei substra0 di Tat è generalmente più lungo (circa 38 residui aminoacidici) di quello dei substra0 Sec (circa 24 residui). Il macchinario di trasporto Tat viene u0lizzato dai procario0 in modo molto diverso: in E. coli solo il 6% delle proteine secrete u0lizza Tat per l’a9raversamento della membrana interna; al contrario, più del 90% delle proteine secrete dall’archaea aloﬁlo estremo Halobacterium viene trasportato grazie a questa via. Anche la natura dei substra0 trasporta0 dal sistema Tat è molto diversa: in E. coli molte proteine secrete dal macchinario Tat sono implicate in reazioni di ossidoriduzione nel processo di respirazione anaerobia e contengono cofa9ori. 33 In generale il sistema Tat è in grado sia di inserire nella membrana plasma0ca proteine integrali di membrana, sia di trasportare a9raverso la membrana plasma0ca proteine ripiegate. In E. coli il macchinario Tat è composto da tre proteine: TatA TatB TatC L’intero processo di trasporto mediato dal sistema Tat è schema0zzato nella ﬁgura. La pre-proteina che viene sinte0zzata e rilasciata dal ribosoma non viene riconosciuta dal sistema Sec e, con l’intervento di speciﬁche proteine chaperon, assume la corre9a conﬁgurazione terziaria e quaternaria associandosi anche a eventuali cofa9ori. La proteina ripiegata si associa al complesso TatBC e viene secreta a9raverso il canale formato da TatA. L’energia necessaria per il trasporto è fornita dalla forza proton-motrice. Figura: Modello di trasporto del sistema Tat: 1. La pre-proteina nascente evita l’indirizzamento ad altre vie di secrezione (es. traslocone Sec) grazie alla presenza della sequenza segnale Tat-dipendente; 2. La proteina è ripiegata nel citoplasma grazie all’intervento di proteine chaperon Tat-speciﬁche (cerchi rossi) e, se richies0, vengono addiziona0 cofa9ori (cerchie9o verde); 3. La proteina ripiegata è indirizzata al complesso TatBC; 4. Il canale di trasporto formato da TatA si associa al complesso TatBC e consente il passaggio della proteina a9raverso la membrana plasma0ca. L’energia per il trasporto proviene dalla forza proton- motrice. 34 Trasportatori ABC Una classe importante di trasportatori è rappresentata dai cosidde# sistemi di trasporto ABC, così chiama0 in quanto presentano, nella loro stru9ura, una proteina della famiglia ABC (dove ABC sta per ATP-binding casse:e). Le proteine di questa famiglia sono cara9erizzate dalla presenza di un dominio ATPasico (dominio ABC) che, come dimostrato in diversi casi, lega e idrolizza l’ATP, fornendo quindi energia a svaria0 processi biologici. Il sistema cos0tuito dai trasportatori ABC è estremamente diﬀuso e presente in tu# e tre i domini del mondo vivente. Si tra9a di un sistema molto versa0le in grado di importare nella cellula o esportare dal citoplasma o dal periplasma un’ampia varietà di substra0 (nutrien0, proteine, lipidi, an0bio0ci e compos0 tossici di varia natura). Il sistema di trasporto ABC è composto, 0picamente, da tre proteine: Una proteina associata alla membrana interna che lega e idrolizza ATP (ABC) Una proteina associata alla membrana interna che si estende nel periplasma denominata anche proteina di fusione di membrana (MFP) Una proteina associata alla membrana esterna (OMP). Questo complesso proteico forma un canale di secrezione che abbraccia membrana interna ed esterna. Cara9eris0ca delle proteine secrete dal sistema ABC è quella di non possedere una sequenza segnale al l’N-terminale ma una sequenza di riconoscimento nella porzione C-terminale che non viene rimossa dopo la secrezione. 35 Tra i sistemi di trasporto ABC uno dei più studia0 è quello che consente la secrezione dell’emolisina α, una tossina di E. coli. In questo trasportatore il dominio ABC non si trova su una proteina associata alla membrana ma cos0tuisce il dominio citoplasma0co della proteina integrale di membrana (HlyB). Questa proteina è un dimero e forma il canale che consente all’α-emolisina di a9raversare la membrana interna. La seconda componente è HlyD che, in forma trimerica, cos0tuisce la MFP del sistema. HlyD possiede una porzione N-terminale che ne consente l’ancoraggio alla membrana interna mentre il dominio C- terminale è esposto nel periplasma e prende conta9o con la porzione periplasma0ca del terzo componente del sistema di trasporto, TolC; questo è una proteina a bo9e (β-barrel). TolC si assembla in una stru9ura trimerica che forma il canale di secrezione a9raverso la membrana esterna. Il complesso TolC-HlyD forma un canale che consente il trasporto dell’α-emolisina dire9amente all’esterno della cellula. Un altro esempio di sistema di trasporto ABC è quello che consente il processo di biosintesi e secrezione di polisaccaridi capsulari (CPS) ed extracellulari (EPS). Nei ba9eri Gram nega0vi, nonostante la grande diversità di stru9ure, i processi di biosintesi e secrezione di CPS ed EPS sono indis0nguibili. A9ualmente, sono no0 in E. coli due meccanismi di biosintesi: uno dipendente dalla proteina integrale di membrana Wzy, l’altro dipendente da un trasportatore ABC. 36 BIOSINTESI DEI POLISACCARIDI CAPSULARI ED EXTRACELLULARI. Biosintesi Wzy-dipendente. I polimeri di questa classe sono costrui0 sull’acce9ore bactoprenolo da una glicosiltransferasi localizzata nello strato interno della membrana plasma0ca. Gli intermedi sono poi trasporta0 a9raverso la membrana dalla proteina integrale Wzx (in giallo), polimerizza0 nel versante periplasmico da Wzy e trasloca0 a9raverso la membrana esterna da proteine di un sistema di polimerizzazione e traslocazione. Biosintesi Wzyindipendente. L’assemblaggio dei polimeri di questa classe avviene in maniera diversa e alcuni componen0 e tappe sono ancora poco chiari. Il polisaccaride è polimerizzato nella faccia citoplasma0ca della membrana interna per aggiunta di residui saccaridici alla catena nascente. Il polimero è successivamente trasportato a9raverso la membrana cellulare mediante un trasportatore ABC (in verde). Sistema di secrezione di @po III Il sistema di secrezione di 0po III è ampiamente diﬀuso tra ba9eri Gram nega0vi patogeni di animali o di piante. È stato inizialmente iden0ﬁcato in Yersinia e in seguito in mol0 altri ba9eri patogeni nei generi Salmonella, Shigella, Pseudomonas e in alcuni ceppi di E. coli. Le proteine secrete dal sistema di 0po III sono trasportate dire9amente dal citoplasma ba9erico nel citoplasma delle cellule eucariote bersaglio senza passare a9raverso intermedi periplasma0ci o extracellulari. 37 L’apparato è cos0tuito da circa ven0 proteine che si assemblano in una complessa stru9ura che abbraccia l’intero rives0mento dei ba9eri Gram nega0vi: membrana interna, periplasma e membrana esterna. Di queste ven0 proteine, nove sono molto conservate, presen0 in tu# i sistemi di secrezione di 0po III; le altre proteine sono speciﬁche per ogni sistema e comprendono proteine che cos0tuiscono la stru9ura ad “ago” che si estende dalla membrana esterna ed entra in conta9o con la membrana della cellula eucariota. L’analisi della sequenza e della stru9ura delle proteine che cos0tuiscono l’apparato di secrezione ha messo in evidenza una sorprendente omologia con le proteine che cos@tuiscono il corpo basale del ﬂagello. MODELLO DEL SISTEMA DI SECREZIONE DI TIPO III E CONFRONTO CON LA STRUTTURA DEL FLAGELLO. Il sistema di secrezione di 0po III è mostrato sul lato destro della ﬁgura, mentre la stru9ura di un ﬂagello è indicata sul lato sinistro. Le componen0 omologhe tra ﬂagello e sistema di secrezione di 0po III sono indicate in base allo stesso “codice colore” e localizzazione cellulare. I componen0 dell’apparato di secrezione di 0po III sono indica0 in base alla nomenclatura di Yersinia (le proteine Ysc cos0tuiscono l’apparato di secrezione mentre le Yop rappresentano proteine secrete). Le proteine Yop secrete possiedono una sequenza di riconoscimento nella regione N-terminale che le indirizza all’apparato di secrezione. La secrezione per ciascuna Yop è anche assis0ta da speciﬁche proteine chaperon (Syc). Le proteine Yop passano a9raverso il canale cos0tuito dalle proteine Ysc. A canale aperto le proteine Yop a9raversano la stru9ura ad “ago” e vengono dire9e alla cellula eucariota, dove le proteine YopB e YopD formano un canale nella membrana plasma0ca. Un’altra peculiarità dell’apparato di secrezione di 0po III è la presenza di speciﬁche proteine chaperon che assistono la secrezione delle proteine eﬀe9rici. Solo il conta9o del ba9erio con la cellula eucariota rappresenta il segnale ﬁsiologico che a#va il processo di secrezione delle proteine eﬀe9rici e ne s0mola la sintesi. Infa#, in seguito al c

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