Samenvatting Gentechnologie (2024-2025) PDF

SAMENVATTING Gentechnologie 2024 - 2025 Abstract Dit is een samenvatting gemaakt van de ppt slides en notities gemaakt in de les....

SAMENVATTING Gentechnologie 2024 - 2025 Abstract Dit is een samenvatting gemaakt van de ppt slides en notities gemaakt in de les. Ook worden er examenvragen in weergegeven. Lauren Donche Hoofdstuk 1: Enzymen uit de recombinante DNA technologie HERHALING ENZYMEN: - Endonucleasen - Exonucleasen - Ligasen - Fosfatasen en kinasen - DNA polymerasen - Reverse transcriptase - Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) - Topoisomerasen - Recombinasen Endonucleasen = enzymen die DNA en RNA cellen bewerkt door fosfodiësterbindingen te breken tussen nucleotiden gelegen binnenin de keten. Voorbeeld: restrictie-endonucleasen Deze enzymen zijn bijzonder omdat ze specifieke, korte DNA-sequenties (meestal palindromen) herkennen en precies op die locaties het DNA knippen. Het zijn dus een soort restrictie-enzymen. Restrictie-enzymen worden door bacteriën gebruikt om vreemd DNA, zoals dat van bacteriofagen (virussen), in stukken te knippen en zo te vernietigen. Omdat DNA universeel is en zowel bacteriën als andere organismen, zoals mensen, dezelfde basen gebruiken, zouden deze enzymen theoretisch ook het bacteriële eigen DNA kunnen knippen. Om dit te voorkomen, markeren bacteriën hun eigen DNA door specifieke plaatsen te methyleren, wat betekent dat er methylgroepen aan het DNA worden toegevoegd. Deze methylering zorgt ervoor dat het eigen DNA onherkenbaar wordt voor de restrictie-enzymen, waardoor het beschermd blijft tegen afbraak. Hierdoor kunnen bacteriën onderscheid maken tussen eigen en vreemd DNA en hun afweermechanisme effectief gebruiken zonder zichzelf te beschadigen. Pagina 1 van 55 Een schoolvoorbeeld van een soort restrictie-enzym of anders gezegd restrictie- endonuclease is EcoRI, deze is afkomstig van E.coli. Dit enzym herkent de sequentie GAATTC (in beide strengen van dsDNA), en knipt ter hoogte van deze sequentie. Beide strengen worden gekliefd. Omdat de knip asymmetrisch gepositioneerd is in de herkenningssequentie, ontstaan twee fragmenten met een 5’ overhang. Naamgeving restrictie-endonucleasen: EcoRI BamHI E = genus Escherichia B = genus Bacillus co = soort coli am = soort amylolique faciens R = stam RY13 H = stam H I = 1ste geïsoleerde endonuclease I = 1ste geïsoleerde endonuclease Verschillende klassen: Klasse 1 Klasse 2 Klasse 3 - Herkennen specifieke - Herkennen specifieke - Kenmerken van beide sequenties sequenties types (I en II) - Knippen ~ 1000-5000 - Knippen beide strengen - Knippen beide strengen basen verder van het DNA, dicht bij op een zekere afstand - Knippen stuk (~75) eruit herkenningssite van de herkenningssite - Tweede molecule van - Co-factor: Mg2+ - Co-factoren: Mg2+ en het RE nodig om 2de ATP streng te knippen - Co-factoren: Mg2+, ATP en SAM (S-adenosyl methionine) Weet dat er in de gentechnologie vooral wordt gewerkt met klasse II restrictie-enzymen: - De nuclease en methylase zijn hierbij apart - Ze herkennen de sequentie en knippen erin dit kan twee verschillende uitkomsten geven: o Sticky ends (overhangende eindes) o Blunt ends (rechte eindes) - Ze knippen minimum 4bp Pagina 2 van 55 De knipplaatsen worden weergegeven tot op de nt volgens de IUPAC code. De te kennen codes zijn aangeduid met een rood kader op de afbeelding hiernaast. Verschil sticky-ends en blunt-ends: Sticky ends zijn de uiteinden van een DNA-streng die een overhang (of "sticky" gedeelte) hebben, oftewel een ongebonden enkele streng van nucleotiden. Deze worden nog verder onderverdeeld in: - 5’ overhang: overhang aan 5’ - 3’ overhang: overhang aan 3’ Blunt ends zijn de uiteinden van een DNA-streng waar de knip recht door de dubbele helix is gegaan, zonder enige overhang van enkele basenparen. Chimere constructies: Door gebruik te maken van restrictie-enzymen kan DNA van verschillende oorsprongen met elkaar gecombineerd worden. Hierbij hebben ze eenzelfde uiteinde waardoor de compatibele eindes met elkaar kunnen binden (fosfodiësterbinding) met behulp van ligatie. Door een stuk DNA te knippen met combinaties van verschillende restrictie-enzymen kan men een restrictiemap opstellen. Dit is een schematische voorstelling die de knipplaatsen van de verschillende enzymen weergeeft en de afstanden tussen deze knipplaatsen. Een Pagina 3 van 55 restrictiemap is een hulp bij het opstellen van een kloneringsstrategie of bij de identificatie van een onbekend DNA. Opgelet, een restrictiemap kan ook circulair zijn (plasmiden, bacterieel chromosomaal DNA)! Voorbeeld: Crispr/Cas9 = Cluster regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISP associated protein(s) CRISPR is een natuurlijk voorkomend verdedigingsmechanisme die bacteriën (Archaea) gebruiken om zich te beschermen tegen virussen. CRISPR ziet er als het volgende uit: Spacersequentie – repeat – spacersequentie – repeat – spacersequentie – repeat - … Cas9 is een enzym, namelijk een endonuclease die het DNA op een specifieke plaats gaat knippen met behulp van een gids-RNA (RGEN - RNA-guided endonucleases). Gids-RNA is een korte, synthetische sequentie die ervoor zorgt dat het Cas9 precies op de juiste plek knipt door te binden aan een complementaire DNA-sequentie in het genoom. Deze techniek wordt gebruikt om defecte genen te vervangen of actieve genen uit te schakelen en wordt in vivo als in vitro gebruikt. De precieze werking: Een stuk target DNA wordt herkend door complementair RNA, waarna het Cas-enzym het dubbelstrengig DNA in beide strengen zal doorknippen. Dit RNA bestaat enerzijds uit crRNA en tracrRNA die samen een duplex vormen. Deze duplex kan ook vervangen worden door één sgRNA (single guided RNA) - bij streptococcus pyogenes. - crRNA (CRISPR RNA) herkend een stuk van het target DNA dat spacer wordt genoemd en 20nt lang is – op de target DNA krijgt dat complementaire stuk de naam protospacer. - Ook heeft crRNA een complementair gedeelte met het tracrRNA (trans-activating RNA). De protospacer van 20nt + de PAM-sequentie (protospacer adjacent motif) NGG vormen samen de targetsite voor RNA-guided endonucleases (RGEN) Mechanisme in bacteriën: 1. Faag DNA komt binnen in een bacteriële cel Pagina 4 van 55  2. CAS endonuclease klieft het faag-DNA in stukken 3. De kleine stukken DNA-fragment worden nieuwe spacers die in de CRISPR-locus worden ingebouwd 4. DNA van de CRISPR-locus wordt afgeschreven in pre-CRISPR RNA 5. Pre-CRISPR RNA wordt geprocessed tot crRNA en vormt een hybirde met tracrRNA 6. TracrRNA trekt het CAS endonuclease aan 7. CrRNA herkent het binnenkomende faag DNA 8. Samen inactiveren ze het faag DNA Geel = spacer - Roze = repeat Dit mechanisme hebben wetenschappers wat omgevormd zodanig dit ook toegepast kan worden op mensen als genoommodificatie! PAM Fluo groen: Fluo blauw: ‘design’ spacer protospacer Groen: spacer Pagina 5 van 55  a) CRISPR-Cas systeem zoals het voorkomt in bacteriën. Na hybridisatie van het CRISPR RNA (crRNA) aan het transactivating CRISPR RNA (tracrRNA) wordt het CRISPR associated 9 (Cas9) eiwit aangetrokken, waarna het complex door de protospacer naar het lichaamsvreemde DNA wordt geleid, dat zal geknipt worden door het Cas9 eiwit. b) CRISPR/Cas als sequentie specifieke DSB inducerend systeem voor gerichte genoom modificatie. Het crRNA en tracrRNA werd gefusioneerd tot het synthetic guide RNA (sgRNA) dat het Cas9 eiwit aantrekt en het complex naar het target DNA doet migreren, waar Cas9 een dubbelstrengige breuk aanbrengt. Hoe afleveren in een eukaryote cel? Afbeelding op volgende pg Links op de afbeelding (a) wordt het systeem weergegeven in bacteriën. Rechts op de afbeelding (b) wordt het CRISP/CAS systeem weergegeven als genoommodificatie voor mensen. Maar hoe krijgen we dat systeem in een eukaryote cel? Er zijn drie vormen om het systeem in een eukaryote cel te krijgen, namelijk: - Plasmide - RNA - Proteïne/ eiwit Deze drie vormen kunnen m.b.v. 3 mechanismen in een eukaryote cel worden gebracht: Plasmide RNA Proteïne/ eiwit Lipofectie X X X Elektroporatie X X AAV mediated X Lipofectie maakt gebruik van lipiden (vetmoleculen) die zich verbinden tot liposomen, kleine vetbolletjes die genetisch materiaal omhullen. Door de gelijkenis met de celmembraan kunnen deze liposomen de cel binnendringen. Elektroporatie is een methode waarbij elektrische impulsen tijdelijke poriën in de celmembraan creëren, waardoor componenten de cel kunnen binnendringen. AAV mediated verwijst naar het gebruik van adeno-geassocieerde virussen (AAV) als vectoren, waardoor componenten de cel kunnen binnendringen. Pagina 6 van 55 Gebruik van genmodificatie: Wij, mensen hebben een automatisch systeem dat kapot DNA terug gaat herstellen. Doordat we met genoommodicatie met CRISPR/CAS het DNA kapot knippen gaat ons lichaam dit automatisch gaan willen herstellen. Deze herstelling kan op twee manieren: - LINKS Non-homologous end joining (NHEJ): er wordt geen template meegegeven hoe ons lichaam het kapot DNA moet herstellen. - RECHTS Homology-directed repair (HDR): er wordt wel een donor template meegegeven Waar kan deze techniek toegepast worden? – OVERZICHT: De techniek kan toegepast worden op: - Menselijke cellen - Zebravissen - Bacteriële cellen NHEJ veroorzaakt inserties en deleties wat inactivering van het gen geeft of anders gezegd knock-out. HDR veroorzaakt puntmutaties of insertie van een template wat herstel van genen geeft of anders gezegd knock-in. Zie een voorbeeld in de ppt (6-enzymen in de re…) op dia 21 Waarom is CRISPR de ideale genome editing technologie? Pagina 7 van 55 - Heeft een hoge efficiëntie want klieft exact - Het is een eenvoudige tool met brede toepasbaarheid (in vivo en in vitro ) - Éénmalige behandeling want eenmaal het DNA aangepast is zou deze in de volgende generaties ook juist moeten zijn! - Er kunnen meerder plaatsen tegelijk veranderd worden - Mogelijkheid om eender welke site in het genoom en vreemde genomen te editeren Toepassingen: 1) Gentherapie ALGEMEEN Het inbrengen van het Cas eiwit en het sgRNA kan op verschillende manieren, met behulp van: - Plasmiden met de code voor Cas9 en het sgRNA (DNA) of als RNA dat met behulp van lipofectie of electroporatie wordt ingebracht. - Een virus Als je alle cellen wilt gaan aanpassen dan moet dit vroeg in de embryogenese = MAG NIET In vivo wordt niet gedaan Wel ex vivo gentherapie: voorbeeld: humane T-cellen die werden veranderd zodanig de eigen immuuncellen van de patiënt de kanker kan gaan aanvallen. Moet in heel propere omstandigheden gedaan worden omdat die uit de patiënt worden gehaald, aangepast en terug geplaatst in de patiënt. Voorbeeld 1 – gentherapie: Bestrijden van HIV-infecties Het CCR5-gen wordt uitgeschakeld in eigen CD4-cellen ex vivo (knock-out) met HDEJ zodanig het gen wordt uitgeschakeld en de patiënt geen HIV meer heeft Voorbeeld 2 – gentherapie: DMD herstel van het ontbrekende exon 44 Pagina 8 van 55 DMD = Duchene Muscular Dystrophy, ernstige spierziekte vnl. bij jongens, te wijten aan fouten in het DMD-gen. Gaan bloedcellen kweken tot pluripotente stamcellen en wordt een spiercel en die kunnen vervolgens gebruikt worden om de mensen met DMD te gaan helpen. Deze patiënten kunnen nog niet herstelt worden!! 2) Longkanker – chinese klinische studie 2016-2020 Men gaat ex vivo T-cellen drie keer gaan aanpassen met CRISPR/CAS: - 1x knock-in: nieuwe T-celreceptor toevoegen (GROEN) - 2x knock-out: eigen T-celreceptor uitschakelen (bevat een alpha keten en een beta keten dus daarom 2x knock out) (PAARS) Pagina 9 van 55 3) Dead Cas9 (dCas9) Is een gemodificeerde versie van het Cas9-eiwit waarbij een mutatie aanwezig is. Hierdoor gaat het Cas9-eiwit geen DNA knippen waardoor het gebruikt kan worden voor andere doeleinden zoals vb; genregulatie, beeldvorming van DNA, etc. 1. Als gen activator 2. Als gen repressor 3. Als visualisatie – voorbeeld met een reportereiwit Risico’s van het CRISPR/CAS-systeem: OFF TARGET EFFECTEN - De PAM-sequentie komt om de 12nt voor in het genoom dit zorgt ervoor dat CAS op alle plaatsen kan gaan klieven - De spacer moet zo gedesigned worden dat die exact op de gewenste plaats gaat binden en dus ook gaat klieven – kans op fouten is mogelijk. o Als er één mismatch plaatsvindt kan het zijn dat Cas nog altijd iets verder weg gaat klieven = off target effect dat vermeden moet worden!! Als de miss match dicht gelokaliseerd is bij de PAM kan het zijn dat CAS toch niet werkt, maar is deze ver gelokaliseerd van de PAM dan kan die wel zijn functie gaan uitvoeren ookal is er 1 nt niet overeenkomstig. o Pas vanaf twee mismatches krijg je GEEN off target effect GENE DRIVES Eén chromosoom bevat een CRISPR edit die gaat gekopieerd worden op het andere homologe chromosoom waardoor een exponentiële stijging plaatsvindt binnenin de populatie waarin je die code hebt ingebracht. Vb. muggen. Exonucleasen Pagina 10 van 55 = zijn enzymen die 1 nt per keer klieven aan het einde van een DNA-sequentie door de fosfodiësterbinding te hydrolyseren. Er bestaan 5’-3’ exonucleasen alsook 3’-5’ exonucelasen. Bepaalde DNA-polymerasen beschikken ook deze activiteit om verkeerd ingebouwde nucleotiden terug te verwijderen = proofreading Ligasen = zijn enzymen die worden gebruikt om DNA-moleculen met elkaar te ‘verbinden’ Bij chimere constructie is er overlap van sticky-ends en gaan aan elkaar plakken door basenparing. Hierbij zijn ze nog niet covalent verbonden want er is nog een opening in de fosfodiësterbinding, die kan gesloten worden door ligase (mits er energie wordt geleverd door ATP om deze chemische verbinding mogelijk te maken). Enkel het ligase afkomstig van E.coli kan sticky ends met elkaar verbinden. Het T4 DNA ligase wordt het meest gebruikt in kloneringen en kan ook blunt end fragmenten aan elkaar zetten hetzij minder efficiënt. Voor deze functie is er ATP nodig als co-substraat en aan de 5’ kant moet een fosfaatgroep aanwezig zijn. Pagina 11 van 55 DNA ligase is niet het enige enzym dat 2 DNA moleculen kan verbinden, ook DNA top- isomerase I doet dit. Dit enzym controleert de graad van supercoiling in DNA door hoofdzakelijk één streng te knippen waardoor vrije rotatie plaatsvindt van de DNA streng en dus minder supercoiling plaatsvindt. Het enzym blijft covalent verbonden aan de fosfaatgroep na knippen. De bindingsenergie die vrijkomt wordt gebruikt om opnieuw de kapot geknipte streng met elkaar te verbinden. Dit enzym wordt voornamelijk gebruikt bij het kloneren van PCR- producten. Fosfaten en kinasen Kinasen zijn enzymen die fosfaatgroepen toevoegen aan een DNA-molecule aan de 5’ einde. Dit proces wordt fosforylering genoemd. Fosfaten of fosforylasen zijn enzymen die fosfaatgroepen afsplitsten van een DNA- molecule aan de 5’ einde. Dit proces wordt de-fosforylering genoemd DNA-polymerasen Pagina 12 van 55 = zijn enzymen die zorgen een sleutelrol spelen in de DNA-replicatie, het proces waarbij DNA wordt gekopieerd. Het is verantwoordelijk voor het synthetiseren van nieuwe DNA- strengen door nucleotiden (de bouwstenen van DNA) toe te voegen aan een bestaande streng (template). Ze worden opgesplitst in twee groepen - Voor prokaryoten o DNA polymerase I: gaps tussen primers invullen bij de lagging streng  5’-3’ polymerase activiteit  5’-3’ exonuclease activiteit: verwijderen RNA primers  3’-5’ exonuclease activiteit: proofreading o DNA polymerase II: DNA herstel  3’-5’ exonuclease activiteit  Geen 5’-3’ exonuclease activiteit o DNA polymerase III: belangrijkste polymerase bij de DNA replicatie (polymerisatie in de leading strand)  Replicatie leading streng  3’-5’ exonuclease proofreading - Voor eukaryoten o  = RNA primase, synthetiseert de primer, na 20 nt wordt de synthese van de lagging streng overgenomen door  en door  voor de leading streng, heeft geen proofreading activiteit o : DNA herstel (via recombinatie tussen homologe chromosomen) o : synthese van de leading streng, heeft proofreading activiteit o : DNA herstel en lagging streng synthese, heeft ook proofreading activiteit o : replicatie van mitochondriaal DNA Reverse transcriptase = zijn enzymen die doen aan ‘omgekeerde transcriptie’. Het zet mRNA opnieuw om in DNA. Dit DNA wordt copy-DNA of complementair DNA genoemd (cDNA). Het enzym heeft een primer nodig om te kunnen starten, dikwijls wordt gebruik gemaakt van een oligo-d(T)-primer, die complementair is aan de poly(A)staart. Vertrekkend van deze primer loopt het enzym verder over de template en bouwt achtereenvolgens nucleotiden in naar het voorbeeld van de mRNA- template. Aan het eind van de template ‘valt’ het enzym eraf en stopt de synthese. Polymerisatie-richting: 5’3’. Pagina 13 van 55 Het revers transcriptase wordt gebruikt bij de klonering van mRNA. Het mRNA wordt eerst omgezet in cDNA door het RT, met behulp van een oligo-d(T)-primer. Wanneer de synthese van de cDNA-streng volledig is, wordt het RNA gehydrolyseerd (alkalische degradatie). Het cDNA zal door interne basenparing een lus vormen, indien dit zich voordoet aan het 3’-eind van de molecule, kan het dubbelstrengig gedeelte dienen als aanzetstuk/primer voor de synthese van de tweede streng door een DNA polymerase. Het enkelstrengig gedeelte van de lus wordt verwijderd door S1 nuclease een enzym dat alleen enkelstrengige moleculen knipt. Terminaal deoxynucelotidyl transferase (TdT) = is een template-onafhankelijke DNA-polymerase dat deoxynucleotiden aanhecht aan het 3’ OH einde van DNA, met vrijstelling van anorganisch fosfaat. Recombinasen Recombinatie is een proces waarbij DNA moleculen met elkaar interageren en waarbij er een uitwisseling van genetische informatie plaatsvindt. Dit proces wordt uitgevoerd door het enzym recombinase en is afkomstig van de bacteriofaag lambda. Er zijn drie soorten recombinatie: - Homologe recombinatie: uitwisseling van genetische materiaal tussen twee moleculen die sterk op elkaar gelijken - Plaatsspecifieke recombinatie: uitwisseling van genetisch materiaal op zeer specifieke plaatsen vb. integratie van de bacteriofaag in het genoom van de gastheer (profagen) - DNA transpositie De plaatsspecifieke recombinasen zijn handige tools in de gentechnologie om genen en chromosomen te manipuleren. Het recombinase van bacteriofaag lambda werkt in op de attB en attP sites van respectievelijk de faag (P= phage) en de bacterie (B). Faag lambda recombinatie in E.coli: Pagina 14 van 55  Faag lambda recombinase maakt gebruik gemaakt van de att recombinatie site in bacteriën (attB, met B van bacteriën) en de attP van de faag (P van ‘Phage’). Faag lambda integreert in het bacterieel DNA met recombinatiespecifieke enzymen. De resulterende hybride recombinatiesites zijn attL en attR (van Left en Right). Wanneer de faag de lytische fase ingaat, snijdt het zichzelf uit het bacterieel DNA. In de aanwezigheid van een andere set recombinatie en excisie-enzymen, recombineert attL met attR, zodat de faag vrijkomt uit het bacterieel genoom. Cre recombinase en Lox P : Cre recombinase van bacteriofaag P1 werkt in op de loxP site. De LoxP herkenningssequentie is 34 bp lang en bestaat uit twee geïnverteerde herhalingssequenties (‘inverted repeats’) en een spacer van 8bp die de oriëntatie van de LoxP site bepaalt (A). Het recombinatieproduct hangt af van de locatie en de relatieve oriëntatie van de LoxP-sites. Twee DNA moleculen met één enkele loxP site zullen gefuseerd worden. DNA tussen twee loxP-sites in dezelfde oriëntatie wordt uitgeknipt in circulaire vorm (B), DNA tussen twee LoxP sites in omgekeerde oriëntatie zal geïnverteerd worden t.o.v. de sequenties aan de buitenzijde van de LoxP-sites Deletie of inversie Deletie en inversie zijn beide soorten genetische mutaties die een verandering in het DNA van een organisme veroorzaken. Deletie is een mutatie waarbij een of meerdere nucleotiden (DNA-bouwstenen) worden verwijderd uit het DNA. Inversie is een mutatie waarbij een segment van het DNA omgekeerd wordt. Het segment wordt afgesneden, 180 graden gedraaid, en opnieuw in het DNA ingevoegd. Hoofdstuk 2: Vectoren in kloneringen Pagina 15 van 55 Plasmiden Plasmiden zijn circulair, dubbelstrengig en supercoiled DNA. Ze repliceren zich in bacteriën en worden gebruikt in kloneringen tussen een lengte van 2 – 5 kb. Ze repliceren zich los van het chromosoom, dus volgen het ritme van de celcyclus niet. Bepaalde plasmiden kunnen niet gecombineerd worden met elkaar in éénzelfde bacterie. Dit wordt incompatibiliteit genoemd. Plasmiden kunnen van de ene bacterie naar de andere overgedragen worden met behulp van conjugatie of transformatie/transfectie. Plasmiden bevatten genen met interessante eigenschappen: - Vermogen tot conjugatie - Resistentie tegen AB, zware metalen, faaginfectie - Productie exotoxinen - Vermogen tot afbraak bizarre producten - Vermogen tot inductie van planttumoren De naam van een plasmide die wordt gebruikt als vector begint met de p… Voorbeeld: pT181 Gemanipuleerde plasmiden = plasmiden waaraan is geprutst voor bijvoorbeeld de farmaceutische sector. Voorbeelden van selectiemerkers zijn: Amp R (“bla”) (“Ap”) of TetAR of LacZ ORI = origin of replication (startplaats voor replicatie): geeft aan dat het voor bacteriën is MCS = multiple cloning site of polykloneringsplaats Promotor is vaak T7 of SP6 (faagpromotoren): indien niet aanwezig géén expressie De restrictie-enzymen mogen niet op meerdere plaatsen knippen!! Karakteristieken plasmide voor kloneringen: - Selecteerbare merkers: AB resistentie-gen o AmpR gen: codeert voor beta-lactamase enzym dat het AB ampicilline afbreekt o TetAR gen: codeert voor de aanmaak van actief TetA eiwit dat instaat voor tetracylcine resistentie Pagina 16 van 55 - Informatie voor hun eigen replicatie: ‘ori’ of ‘origin of replication’ (startplaats voor replicatie) - Elementen voor kloneringsdoeleinden: polykloneringsplaats (MCS) - Promotor die instaat voor de transcriptie en daaropvolgende expressie van het heterologe eiwit. - Aanhechtingsplaatsen voor primers (priming sites T7 of SP6) rond polykloneringssites - Karakterisering door hun restrictiemap Origin of replication: ORI is de startplaats voor replicatie en enkele honderden nucleotiden lang. - Plasmiden met de Ori van het E.coli plasmide ColE1 zijn multi-copy plasmiden. - In het geval van expressieplasmiden is het genproduct soms schadelijk voor de bacterie en kan het gewenst zijn om met een low-copy plasmide te werken. - Als je E. coli wil gebruiken voor initiële replicatie en een andere gastheer voor bv. studie van gedrag van het gekloneerde gen, kan je een shuttle plasmide gebruiken met 2 verschillende ori’s, deze shuttle vector kan uitgewisseld worden tussen 2 species. Polykloneringsplaats Dit gebied bevat een hele reeks herkenningsplaatsen voor restrictie-enzymen, nodig voor de insertie van het nieuwe DNA fragment. Ook is het belangrijk dat elk restrictie-enzym slechts 1x knipt, zodat het plasmide gelineariseerd wordt, maar niet in verschillende stukken wordt geknipt. Selectiemerkers Selectiemerkers zijn nodig om te kunnen controleren of het insert effectief aanwezig is in de plasmide: controle op transformanten Selectiemerkers zijn ook nodig om te kunnen controleren of het insert in de juiste richting aanwezig is in het plasmide en dus zinnig is: controle op insert-transformanten = insertionele activering (is de techniek om te controleren of een plasmide een vreemd stuk DNA heeft opgenomen) Het kan gecontroleerd worden met bijvoorbeeld antibiotica- restistentiegenen, het LacZ gen voor blauw-wit screening etc. Bacteriofagen Bacteriofagen kunnen ook gebruikt worden als vector en worden gebruikt voor kloneringen van grotere fragmenten (> 4kbp), voorbeeld voor de aanmaak van gen-bibliotheken. Bacteriofagen zijn +/- 4kbp lang, ds en lineair. In het geval van fagen krijgt men geen kolonies, maar plaques. Dit zijn zones die helder worden t.g.v. de lyse van bacteriën. Plaques zijn zuiverder te screenen dan bacteriekolonies, ze geven minder achtergrond. Het bekendste voorbeeld is faag lambda! Pagina 17 van 55 Fagen hebben een lytische en lysogene cyclus om de levenscyclus voort te kunnen zetten. - Lytische cyclus: Gedurende deze cylcus gaat de faag zijn DNA injecteren in de bacterie en met behulp van de machenerie van de bacterie zijn eigen DNA gaan vermenigvuldigen zodanig nieuwe faagdeeltjes worden gevormd in de bacterie. De bacterie barst open (lysis), waardoor de nieuwe fagen vrijkomen en andere bacteriën kunnen worden geïnfecteerd. DUS: Snelle productie van nieuwe fagen en vernietiging van de gastheercel. Cl repressor inactief - Lysogene cyclus: Gedurende deze cyclus gaat de faag zijn DNA integreren in het chromosoom van de bacterie (=profaag). Deze stap noemt lysogenie, gedurende deze stap is het faag-DNA inactief. Ondertussen gaan bacteriën zich vermenigvuldigen en dus het faag- DNA wordt ook doorgegeven aan de dochtercellen van de bacterie. Onder bepaalde omstandigheden (vb. stress) kan de profaag zich activeren en uit het chromosoom snijden waardoor de lytische cylcus wordt gestart. DUS: Integratie en latentie, met mogelijkheid tot omschakeling naar lysis. Cl repressor actief Gebruik van bacteriofagen in praktijk voor kloneringsdoeleinden: Het faag-DNA wordt geïntegreerd in het gastheer-DNA (lysogenie). In de lysogene toestand integreert het lambda DNA in het bacterieel chromosoom en wordt gerepliceerd als deel van het bacterieel DNA. Lambda fagen gaan in de lysogene cyclus wanneer de cI repressor actief is. Deze repressor zet de faag-genen tijdelijk uit. Sommige lambda vectoren hebben een mutatie in dit cI repressor gen, waardoor het eiwit temperatuurgevoelig is (cI857 mutatie). Een bacteriële stam die zo een mutante faag draagt, kan gegroeid worden als lysogeen bij lage temperatuur en de lytische cyclus kan geïnduceerd worden door de temperatuur te doen stijgen. De stijgende temperatuur inactiveert de repressor. Voor kloneringen is dus enkel de lystische route vereist. Bij de infectie van de bacterie komt lambda extrachromosomaal voor, in een plasmide-achtige toestand. Dit kan doordat de cos-eindjes (cohesive ends) aan de 5’ kant, die complementair zijn aan elkaar, overlappen zoals de eindjes van restrictie-fragmenten. De cos-eindjes worden van elkaar gescheiden door het lambda-DNA op te warmen, wanneer het DNA dan snel wordt afgekoeld krijg je lineair, monomeer lambda-DNA. Bij lage temperatuur bewegen de eindjes trager, daardoor duurt de re-annealing veel langer. Replicatie van lambda DNA: In een faagdeeltje is het DNA lineair, met sticky ends (cos-ends). Wanneer het bacteriecellen infecteert, zal het DNA circulariseren door de overlappende cos-eindjes. Het DNA heeft wel nog openingen, die in vivo dichtgemaakt worden door een ligase. Wanneer de faag in de lytische cyclus gaat, wordt het circulair DNA gerepliceerd zoals een plasmide, men noemt deze vorm van replicatie theta replicatie. Nadien is er een switch naar de ‘rolling circle’ replicatie. Bij deze vorm van replicatie, draait de template rond, terwijl er een lange lineaire DNA molecule wordt gemaakt, die Pagina 18 van 55 verschillende kopijen van het lambda-DNA bevat (end-to-end). Ondertussen worden de genen afgeschreven in 2 aparte structuren: - De kop: waar het DNA in terecht zal komen - De staart: wordt nadien aan het hoofd gehangen Na de replicatie en de productie van kop-en staart-eiwitten volgt het packaging proces (inpakproces). Specifiek enzymen die de cos-sites herkennen op de multimere lineaire molecule, knippen het DNA asymmetrisch waardoor de cos einden ontstaan. Het gebied tussen twee cos-einden wordt verpakt in de faagkop, dit is 1 lengte-eenheid van het lambda genoom. Nadien wordt de staart eraan gehangen en wordt een matuur faagdeeltje gevormd dat wordt vrijgezet uit de bacterie door cellyse. Cos-eindjes Het proces dat voorbeeld faag lambda doet bij bacteriën wordt in vitro nagebootst voor kloneringen mogelijk te maken. Er wordt een mix van mutante fagen (wel hoofd, geen verpakkingseiwitten en geen hoofd, wel verpakkingseiwiten) gebruikt zodanig fagen in vitro gevormd worden en vervolgens worden deze toegevoegd aan een bacteriecultuur in soft agar waardoor plaques ontstaan (lytische cyclus). Voorbeelden van lambdavectoren in praktijk: Een eerste soort lambdavectoren zijn de insertie-vectoren, afgeleid van wt lambda DNA waarbij: - Ongewenste restrictie-sites zijn verwijderd - De lengte van het faag-DNA is gereduceerd tot min 37kbp - Hierdoor kan er maar fragmenten toegevoegd worden van 14 kbp (TOTAAL 51kbp = max lengte van een Een tweede soort insertvector) zodanig wel nog leefbare faagpartikels worden geproduceerd met essentiële genen. NADEEL: maximale kloneringscapaciteit van 14kbp (meer dan capaciteit van een plasmide, maar voor bepaalde toepassingen te weinig) Pagina 19 van 55 lambdavectoren zijn de substitutievectoren, hierbij wordt tijdens het kloneren een stuk van de vector vervangen door het insert. Stuffer fragment Deze vector heeft 2 restrictieplaatsen i.p.v. 1 voor insertie. Wanneer er geknipt wordt met deze twee restrictie-enzymen wordt er een stuffer fragment verwijderd uit de vector. In het voorbeeld (figuur) knipt men de vector met BamHI en de worden de bekomen fragmenten gescheiden m.b.v. gelelectroforese. Het stuffer fragment wordt weggegooid en de armen worden gemengd met de restrictiefragmenten die moet gekloneerd worden. Ligatie van het mengsel levert recombinant faag-DNA op, dat in faaghoofden kan verpakt worden m.b.v. het in vitro verpakkingsproces. Op deze manier wordt de kloneringscapaciteit sterk verhoogd, de armen zijn samen 29 kbp in lengte, waardoor men fragmenten tot (51-29kb =) 22kbp kan kloneren. Bijkomend voordeel is dat de armen alleen samen 29 kb zijn en daarom te klein om verpakt te kunnen worden. Hierdoor kunnen armen die niet geligeerd werden geen leefbare fagen opleveren, waardoor je een positieve selectie krijgt van recombinanten. Overzicht kloneringsproces in lambda: Pagina 20 van 55 Algemeen NADEEL: een faag heeft een beperkte insertcapaciteit tot max 22kbp! Cosmiden Een cosmide is een plasmide dat de cos sites van faag lambda bevat, een ORI, een selectiemerker en een kloneringssite. Pagina 21 van 55 Knippen, ligeren en zuiveren van de recombinante cosmiden gebeurt zoals bij een normaal plasmide. I.p.v. een transformatie van de bacteriën zal de ligatiemix via het in vitro verpakkingsproces zoals bij lambda fagen verlopen. Hiervoor moet het cosmide voldoende groot zijn. De vector zelf is 5.4 kb (te klein voor verpakking), maar met insertie van een fragment met een grootte van 32 tot 45 kb is het wel mogelijk. Dit heeft als voordeel dat er een positieve selectie is voor vectoren mèt (voldoende groot) insert. Je krijgt hier GEEN faag-productie (geen productie van koppen en staarten), dus geen plaque vorming. Het cosmide repliceert als plasmide en men werkt met kolonies op agar (met antibioticum voor selectie, bv. ampicilline). Voordelen: - Propagatie en zuivering zoals bij plasmiden - De vector is klein t.o.v. het insert, dit maakt het makkelijker om nadien het fragment (insert) eruit te halen mbv restrictiedigest. (Bij lambda-vectoren zullen veel van de RE-sites waarmee je het fragment eruit wil knippen ook voorkomen in de vector, bij cosmiden is deze kans kleiner. De fragmenten zullen ook veel duidelijker gescheiden worden in een elektroforese.) M13 vectoren M 13 is een filamenteuze faag die E. coli infecteert en een F-type plasmide dragen. De faag hecht zich aan de F-pilus op het oppervlak van bacteriën. Het faag-genoom is circulair enkelstrengig DNA van ± 6kb. Pagina 22 van 55 Eens de faag zich in de cel bevindt, vindt de synthese van de complementaire streng plaats, zodat dubbelstrengig dsDNA ontstaan, dit is de replicatieve vorm. Van deze dubbelstrengige replicatieve vorm wordt opnieuw een circulaire enkelstrengige DNA kopij geproduceerd. Na een aantal replicatieronden is er een ophoping van faag DNA in de cel. Tegelijkertijd vindt er expressie van de faaggenen plaats. De producten van deze genen binden aan het enkelstrengig DNA, waardoor er faagpartikels ontstaan. Dit gebeurt terwijl het enkelstrengig DNA al door de celmembraan steekt. De lengte van het filamenteuze faagdeeltje wordt bepaald door de DNA molecule. Er is dus geen verpakkingslimiet voor M13. Het faagdeeltje wordt echter fragieler wanneer grote DNA fragmenten worden geïnsereerd. Te kennen: Deze vector wordt gebruikt voor alle toepassingen van enkelstrengig DNA waarbij de capaciteit onbeperkt is! Klonering in gist Gistcellen zijn de kleinste eurkaryote cellen waarvoor ook vectoren bestaan voor klonering. De gist-vectoren die het meest gelijken op bacteriële pasmiden, zijn de gist-episomale plasmiden (YEp). Deze plasmiden hebben een E. coli ‘origin of replication’ en twee antibioticum-resitentiegenen en kunnen daarom gebruikt worden als shuttlevectoren die op te groeien zijn in zowel prokaryote als eukaryote cellen. Ze kunnen onafhankelijk repliceren in gist aan een hoog copy-number (25 tot 100 kopijen per cel). Pagina 23 van 55 In gist maakt men geen gebruik van antibiotica merkers zoals in prokaryoten, omdat er slechts weinig fungiciden beschikbaar zijn. Men doet selectie op basis van nutritie door zgn. auxotrofe mutaties zoals vb. LEU2. Sommige gisten ontbreken het gen voor de aanmaak van het AZ leucine. Wanneer deze gist getransformeerd wordt met een plasmide met Leu2 als auxotrofe selectiemerker, zullen enkel die gisten overleven op een voedingsbodem zonder leucine, die een vector hebben opgenomen. Hoe kan je een plasmide voor gisten herkennen? De ORI van gisten heeft de naam ARS of CEN - ARS: gist - CEN: gist met centromeer (mitotisch stabieler) Voorbeelden van kloneringsvectoren voor gisten: 1) YRp = Yeast replicating plasmids ARS: Autonomously replicating sequences Onstabiel: worden niet efficiënt doorgegeven aan dochtercellen 2) YCp = Yeast centromere plasmids CEN = gist-centromeer sequenties Mitotisch stabiel Laag ‘copy number’ -> interessant voor expressie van toxische eiwitten 3) YIp = Yeast integrating plasmids Sequenties homoloog aan het gistgenoom Voor stabiele integratie in het gistgenoom door homologe recombinatie (op specifieke plaats) Yeast Artificial Chromosomes (YACs) Deze vectorsoort wordt gebruikt voor het kloneren van grote DNA-sequentie, volledige genen of gedeelten van chromosomen. YAC’s zijn lineaire moleculen zie beschikken over centromeer- en telomeersequenties. Ze worden gerepliceerd in gistcellen en bezitten auxotrofe selectiemerkers. TRP1 en URA3 zijn voorbeelden van zulke selectiemerkers. Auxotrofe selectie is gebaseerd op het feit dat de gebruikte gistcel bepaalde essentiële voedingsstoffen niet zelf kan aanmaken (de gist is bv. Trp1- en/of Ura3-). De ontbrekende genen voor het aanmaken van deze voedingsstoffen Pagina 24 van 55 worden aangeleverd door de YAC, zodat enkel die gisten overleven die een YAC in zich dragen. SUP4 is een suppressor van het tyr-tRNA gen. Bij het knippen met SnaBI wordt deze suppressor vernietigd. Dit zorgt voor een selectie van recombinante vectoren over lege vectoren, vectoren die geen insert hebben in het SUP4, zullen een actieve suppressie doen van het tyr-tRNA, zodanig dat er geen tyrosine kan ingebouwd worden in gisteiwitten. Hoe kan je YAC-vectoren herkennen? Aan de telomeeruiteinden (gele fluo) NADEEL: problemen met de stabiliteit van het insert, waardoor herschikkingen gebeuren door recombinatie Procedure: Grote chromosomale fragmenten worden bereid door partieel restrictie-digest van genomisch DNA. Met behulp van een restrictie-enzym verwijdert men het stuffer fragment tussen de 2 telomeren, waardoor men 2 armen bekomt, elk met een selecteerbare merker (hier A en B). Het insert wordt tussen de twee armen geligeerd. Met de recombinante moleculen transformeert men gistcellen (Saccharomyces cerevisiae). Selectie gebeurt door complementatie met auxotrofe merkers: beide armen moeten aanwezig zijn. Bacterial Artificial Chromosomes Pagina 25 van 55 Zijn grote bacteriële vectoren, gebasseerd op bacteriofaag P. Bacterial Artificial Chromosomes zijn gebaseerd op het F-plasmide. Deze vectoren kunnen inserten groter dan 100 kb bevatten (tot 600 kb). Ze zijn stabieler dan YACs. Dit soort vectoren werd gebruikt bij het Genome Sequencing Project. Plantenvectoren Om vreemde genen in planten te introduceren maakt men voornamelijk gebruik van Agrobacterium tumefaciens. De pathogeniteit van deze bacterie wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van het Ti plasmide = tumorinducerend plasmide. De tumor wordt geproduceerd door de transfer van een 23kb fragment van dit plasmide, het T-DNA in de plantencellen. Dit DNA wordt geïntegreerd in het chromosomaal DNA van de plant. NADEEL: De plasmide is groot en moeilijk om mee te werken. Gevolg er wordt gewerkt met een intermediare vector in E.coli, een klein plasmide dat een deel van het T-DNA fragment bevat. De recombinante intermediaire vector wordt dan overgebracht in A. tumefaciens door conjugatie. In de A. tumefaciens vindt er recombinatie plaats tussen de homologe T-DNA sequenties op de intermediaire vector en op het Ti-plasmide. Het intermediair plasmide kan niet repliceren in A. tumefaciens, dus antibioticum selectie levert bacteriën op die het co-geïntegreerd plasmide bevatten. Te kennen voor het examen: - Het is een vector om een gen tot expressie te brengen in plantencellen. - Bla: om recombinant plasmide in E.coli te isoleren. - Neo: om selectie van plantencellen te doen die de vector uit E.coli hebben opgenomen. - T: zorgt ervoor dat overdracht kan plaatsvinden naar het genoom van de plant. Virale vectoren Zie hoofdstuk eukaryote expressie Pagina 26 van 55  Adenovirus  humane cellen Baculovirus  insectcellen Herpesvirus  vertebraatcellen Retrovirus  zoogdiercellen (voorbeeld HIV) Vaccinia virus  zoogdiercellen OVERZICHT VECTOREN TE KENNEN!! Plasmiden: routinematig tot 4 kb (betaglobine gen is een onderdeel van hemoglobine) Lambda insertievectoren: 14 kb max Lambda substitutievectoren: tot 22kb max Cosmiden: tot 45 kb M13: onbeperkt, toepassingen waarvoor enkelstrengig DNA vereist is en faagdisplay YAC en BAC: 100-600 kb (voor stukken van een chromosoom) Hoofdstuk 3: Moleculaire klonering Er horen oefeningen bij dit hoofdstuk  OP EXAMEN!!! Theorie is om de oefeningen te kunnen maken! Pagina 27 van 55 Algemeen schema van een eenvoudige klonering van een vreemd DNA fragment in een plasmide-vector. Recombinant DNA = DNA van twee verschillende organismen gecombineerd Genen lopen van 5’ naar 3’ = zinnig Promotor is de bindingsplaats voor RNA-polymerase Als er geen restrictie-knipplaatsen aanwezig zijn, kunnen deze ook ingebouwd worden door: PCR Pagina 28 van 55 Als de sticky-ends of blunt-ends niet volledig compatibel zijn tussen fragment (insert) en de vector kan men gebruik maken van korte oligonucleotiden: Linkers en adaptors - Linkers zijn korte, synthetisch gesynthetiseerde dubbelstrengs DNA-moleculen met specifieke herkenningssites voor restrictie-enzymen. Ze worden aan de uiteinden van DNA-fragmenten geligeerd om deze compatibel te maken met restrictieplaatsen in een vector. - Adaptors zijn kort, enkel- of dubbelstrengs DNA met één plakkerig uiteinde en één stomp uiteinde. Ze worden gebruikt om stompe uiteinden van een DNA-fragment om te zetten in plakkerige uiteinden, waardoor ligatie efficiënter wordt. Een andere manier om sticky ends toe te voegen aan blunt end DNA moleculen, is door gebruik te maken van het Terminaal deoxynucleotidyl Transferase (TdT). Deze gaat één soort deoxynucelotidyl trifosfaat nt toevoegen aan de 3’ OH-einde en verloopt zonder complementaire template. Pagina 29 van 55 Er zijn twee manieren van ligatie om fragment en vector met elkaar te laten binden: - Fragment en vector hebben sticky ends (21°C, 1u) - Fragment en vector hebben blunt ends (14°C, overnacht) Waarom is blunt-end ligatie bij een lagere temperatuur en duurt het proces langer? Bij een lagere temperatuur is er minder beweging waardoor atypische bindingen kunnen voorkomen worden. Omdat er minder beweging is moeten de fragmenten tijd genoeg hebben om elkaar te vinden en te binden. Om vervolgens de recombinante vector (vector + insert) te laten binnendringen in bijvoorbeeld een bacteriecel wordt gebruik gemaakt van: - Elektroporatie (elektrocompetente cellen) - Hittoschok (calciumchloride competente cellen) In beide gevallen zal de bacterie tijdelijk poriën vertonen in de celwand, waarlangs het DNA naar binnen kan. Nu heeft de bacterie tijd nodig om dit “vreemd” materiaal te verwerken. Dit gebeurd in een vloeibaar medium met extra glucose en zonder AB voor 40-45 minuten (EXAMEN!!!). Algemeen overzicht voor alle oefeningen: Pagina 30 van 55 CIP (Calf Intestinal Phosphatase) en SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase) zijn enzymen die veel worden gebruikt bij moleculaire klonering om fosfaatgroepen van de 5'-uiteinden van DNA of RNA te verwijderen. CIP wordt gebruikt voor fosfaatgroepen bij het fragment te verwijderen en SAP wordt gebruikt om fosfaatgroepen te verwijderen bij de vector. Hoofdstuk 4: Universele klonering en DNA-assemblages Pagina 31 van 55 Universele klonering: Universele klonering is een methode waarmee één DNA-fragment in eukaryote of prokaryote cellen kan worden gekloneerd zonder het gebruik van restrictie-enzymen om het insert in de vector te plaatsen. GEVOLG: universele klonering kan uitgevoerd worden met alle fragmenten. Er bestaan verschillende soorten universele kloneringen: - TA klonering - TA-topo klonering (rest moeten we niet kennen) TA klonering = is een techniek die gebaseerd is op dat sommige DNA polymerase (Taq-polymerase) een niet-template specifieke terminale transferase activiteit hebben, waarbij ze enkel deoxyadenosine (A) hangen aan de 3’ einden van elk PCR product. Hierdoor heeft het PCR-product een enkel 3’dA overhangend nucleotide. Door gebruik te maken van een gelineariseerde vector met overhangende 3’ deoxythymidine (dT), kan men met een ligase het PCR product gemakkelijk kloneren in deze vector. DUS: Om DNA-fragmenten in een vector te kloneren door gebruik te maken van complementaire overhangende basen. Vector van TA-klonering: typische eigenschap de T-overhang aan de 5’ kant in de vector. De vector wordt gebruikt om vb. PCR-fragmenten te kloneren (Een PCR-fragment kan niet lang bewaard worden, maar door deze te plaatsen in vector kan deze langer gestockeerd worden.) Bij PCR wordt er altijd door Taq-polymerase een A gehangen aan de 3’ kant van het amplicon. Deze A is complementair met de vector waardoor er niet meer geknipt moet worden met een restrictie-enzym. De vector moet alleen nog gesloten worden door gebruik te maken van het enzym ligase. Het PCR-fragment kan in twee richtingen/ oriëntaties ingebouwd worden in de vector. Om die reden zijn er promotoren aanwezig met twee verschillende richtingen. Wat zijn T7 en SP6? Faagpromotoren Waarom zijn er nog steeds zoveel restrictieplaatsen nodig? Om fragment achteraf uit de vector te halen. TA-topo klonering Pagina 32 van 55 = is een verbeterde variant van TA-klonering die gebruik maakt van topoisomerase-enzymen (ligase-enzymen) om DNA-fragmenten snel en efficiënt in een vector te ligeren. Aan de T-overhang aanwezig aan de 5’ kant in de vector hangt het enzym topoisomerase. Het is een recombinase die in staat is om het fragment open en dicht te doen. Het enzym topoisomerase (afkomstig van Vaccinia virus) bindt op de duplex DNA op welbepaalde plaatsen en klieft de fosfodiëster binding na een 5’-CCCTT in één streng. De energie die vrijkomt wordt gebruikt om het gat (gebroken fosfodiësterbinding) terug toe te maken. Deze vector wordt ook gebruikt voor de klonering van PCR-fragmenten met een A- overhang aan de 3’ uiteinde. Omdat topoisomerase al aanwezig is moet er geen ligatie door een externe ligase plaatsvinden. Het enzym topoisomerase hangt met zijn 274’ste aminozuur, tyrosine aan de T-overhang van de vector. Tussenvectoren zijn vectoren die hierboven zijn beschreven en worden gebruikt voor de stockage van PCR-fragmenten (DNA fragmenten). Dit omdat - PCR-producten weinig stabiel zijn en niet lang kunnen gestockeerd worden. - Vectoren makkelijker geknipt kunnen worden met RE dan lineaire fragmenten - Bacteriën zijn makkelijker invriesbaar (-80°C) en makkelijker te amplificeren. DNA-assemblages: Pagina 33 van 55 DNA-assemblages worden gebruikt om meerdere DNA-fragmenten op een bepaalde volgorde samen te voegen voor verdere analyse. Het is moeilijk om met de traditionele klonering meerdere fragmenten/ inserten in een bepaalde volgorde toe te voegen aan de vector. Om die reden wordt gebruik gemaakt van DNA-assemblagetechnieken. Er bestaan verschillende DNA-assemblage technieken: - Gibson assemblage - Golden Gate assemblage Gibson assemblage klonering Deze techniek maakt het mogelijk om meerdere DNA-fragmenten naadloos samen te voegen/ te verbinden in één enkele isotherme reactie. Deze techniek maakt gebruik van drie enzymen: - DNA-polymerase - DNA-exonuclease - DNA-ligase (thermostabiel) 1. Voorbereiding van de fragmenten en vector: De fragmenten worden voorbereid door met behulp van PCR overlappende eindes toe te voegen om een goede overlap en samenvoeging te hebben van de verschillende fragmenten. 2. Samenvoegingsreactie: De voorbereide DNA-fragmenten worden gemengd met een DNA-polymerase, DNA-exonuclease en DNA-ligase in één reactiebuis. a. Het exonuclease knabbelt aan de 5’-uiteinden van de fragmenten waardoor hun complementaire sequenties bloot komen te liggen, zodat binding kan plaatsvinden tussen de overlappende regio’s (DNA-polymerase herstelt het teveel dat is afgeknabbeld door DNA-exonuclease in de richting van 5’ naar 3’ op basis van een template). Het enzym DNA-ligase sluit de breuken (fosfodiësterbinding tussen fosfaatgroep en OH-groep) waardoor de fragmenten nu samengevoegd zijn tot een groter construct. 3. Transformatie en controle: Het groter construct wordt geplaatst in een gastheerorganisme, voorbeeld bacteriën (transformatie). De getransformeerde cellen worden vervolgens gekweekt en de resulterende kolonies kunnen worden onderzocht om de aanwezigheid van het gewenste construct te bevestigen. Voorbereiding fragmenten: met behulp van gedesignde primers met PCR. Pagina 34 van 55 GROEN van de bovenste primer: complementair aan de vector PAARS van de onderste primer: complementair aan fragment 2 Voorbereiding vector: - Vector wordt geknipt met geschikte RE + zuivering op gel - Inverse PCR (omgekeerde PCR) + zuivering op kolom + knippen met DpnI om ongeknipt plasmide te verwijderen De primers voor de inverse PCR zijn aangeduid in het rood op onderstaande tekening - DpnI klieft in het midden van zijn herkenningsplaats door de twee strengen van DNA waardoor blunt-ends worden verkregen - Knipt alleen als het fragment gemetyleerd is! PCR-fragmenten zijn niet gemetyleerd waardoor we enkel PCR-fragmenten over gaan hebben. Beperkingen Gibson Assembly - Identieke sequenties geven fouten (vb. 2x dezelfde terminator of promotor in verschillende fragmenten) Om deze obstakels te omzeilen is het vaak nodig een stapsgewijze assemblage uit te voeren om fragmenten met identieke eindjes niet tegelijkertijd in dezelfde assemblagereactie te plaatsen. - Eindes mogen geen secundaire structuur hebben, anders geen annealing met volgende fragment (OPL: stuk sequentie van volgende fragment eraan hangen) - Combinatorische assemblage: voor aanmaak van bibliotheken met sequentievarianten, net door de variaties in sequentie is overlap moeilijk (OPL: andere assemblage methode) GEVOLG: niet geschikt voor combinatorische assemblage omdat je voor elke variant primers moet gaan ontwikkelen! Voorbeeld: zie dia 24 in ppt 9 Golden Gate assemblage klonering Golden Gate Assembly-kloneren is een assemblagetechniek gebaseerd op het principe van type IIs-restrictie-enzymen, die DNA knippen buiten hun herkenningssite. Pagina 35 van 55 Deze techniek maakt gebruik van Type IIs restrictie-eznymen (vb. Bsa I) (gaat klieven) en T4 DNA-ligatie (gaat plakken). Elk fragment heeft na het klieven met RE overhangende eindes verkrijgen – cohesieve uiteinden genoemd. 1. Type Ils-enzymen wordt geselecteerd 2. Constructie van de vector: er wordt een vector of plasmide ontworpen of geselecteerd en deze wordt gelineariseerd en behandeld met fosfatase om zelfligatie te voorkomen 3. De DNA-fragmenten en de gelineariseerde vector worden gemengd in aanwezigheid van de juiste type IIs-restrictie-enzymen en een DNA-ligase-enzym. De cohesieve uiteinden van de DNA-fragmenten en de vector zijn compatibel, waardoor ligatie kan plaatsvinden. De overhangende eindes hebben een grootte van 1 – 5 nt. Een RE dat een 4-base overhang geeft, genereert tot 256 verschillende mogelijke eindjes. Dit laat toe om meerdere DNA-fragmenten te assembleren in dezelfde reactie met 1 restrictie-enzym. Deze unieke overhangende eindjes worden ‘fusion sites’ genoemd. 4. Het reactiemengsel wordt geïncubeerd bij een specifieke temperatuur om de ligatie van de DNA-fragmenten aan de vector te vergemakkelijken. Het resulterende construct wordt vervolgens getransformeerd in een gastheerorganisme, zoals bacteriën, voor replicatie en vermeerdering. Type IIs restrictie-enzymen : - Niet palindromisch, maar directioneel (specificiteit) - Knippen buiten herkenningsplaats - Veroorzaken variabele overhangs Insert: Er wordt naar binnen geknipt Pagina 36 van 55 Restrictie-enzym heeft herkenningsplaats in het lichtblauwe gedeelte van het insert, maar omdat deze verder knipt dan zijn herkenningsplaats gaat deze klieven in het oranje en paarse gedeelte van het insert. Vector: Er wordt naar buiten geknipt Restrictie-enzym heeft herkenningsplaats in het lichtblauwe gedeelte recht van het oranje en paarse gedeelte van de vector, maar omdat deze enzymen verder knippen dan hun herkenningsplaats gaat deze klieven in het oranje en paarse gedeelte van de vector. De vectoren zijn commercieel beschikbaar, of kan je zelf aanmaken. De vector en DNA-fragmenten worden na knippen aan elkaar gehangen met DNA ligase. Dit proces gebeurt ‘naadloos’: er worden geen ongewenste nucleotiden toegevoegd tussen de verschillende fragmenten en de restrictieplaatsen worden geëlimineerd in het finale construct. Het proces is niet omkeerbaar omdat de BsaI-herkenningsplaatsen verdwenen zijn. Voordelen van de Golden Gate: Deze techniek is wel geschikt voor combinatorische assemblage (voor het aanmaken van bibliotheken) Pagina 37 van 55 Het zwarte driekhoekje is de Type IIs herkenningsplaats, in het geval van de vector wordt er naar buiten toe geknipt, in het geval van de inserts wordt er naar binnen toe geknipt. In beide gevallen zal de herkenningsplaats zelf verwijderd worden. De licht gekleurde vierkantjes zijn de compatibele overhangende sequenties. De volledige assemblage mix wordt getransformeerd in bacteriën en er wordt vervolgens geselecteerd van transformanten door de blauw-wit screening waarbij de witte kolonies gewenst zijn. Beperkingen van de Golden Gate: - Er mogen geen andere Type IIs sites toegelaten zijn in vector of fragment - Bij BsaI: overhang slechts 4 nt: moeilijk om elke overhang verschillend te maken Vergelijking Gibson assembly en Golden Gat assembly Hoofdstuk 5: Recombinante expressie in prokaryoten Prokaryoten = bacteriën Pagina 38 van 55 Recombinant = combinatie van DNA uit verschillende organismen Transgene expressie = expressie op een vreemde plaats (niet typisch, in dit geval: in bacteriën) Transgeen organisme = organisme dat een vreemd gen draagt (hier is het organisme: bacterie) Voor- en nadelen van eiwitexpressie in prokaryoten Voordelen: - Makkelijk op te zuiveren - Makkelijk op te kweken Nadelen: - Sommige bacteriën vormen inclusion bodies (=aggregaten van eiwitten in het cytoplasma) - Geen posttranslationele modificatie Factoren die expressie van gekloneerde genen beïnvloeden Transcriptie - Sterkte promotor: hoeveelheid mRNA (hoe sterker de promotor hoe meer mRNA) - cDNA ipv genomisch DNA kloneren - Basensamenstelling van het DNA: GC-inhoud Translatie - Shine-Dalgarno sequentie (Kozak sequentie in euk) – er is context nodig zodanig de juiste startcodon wordt gebruikt = RBS sequentie - AUG moet aanwezig zijn (startcodon) - Codon gebruik: afhankelijk van de beschikbare tRNA’s (‘codon bias’: bepaalde codons komen meer voor dan andere) Aard van het eiwit - Stabiliteit van het eiwit - Locatie van het product: inclusion bodies! - Signaalsequenties: secretiesignaal - Posttranslationele modificatie (vooral glycosylatie bij expressie: niet geschikt om in prokaryoten tot expressie te brengen) Verschillende stappen voor expressie 1. Klonering van het expressieconstruct (GOI in (expressie)vector plaatsen) 2. Transformatie van cellen (recombinante vector in cellen brengen) 3. Zuivering van het eiwit Er is een andere transcriptie terminatie in prokaryoten als eukaryoten. Voor eiwitten optimaal op te zuiveren wordt soms gebruikt gemaakt van fusie-eiwitten of ‘tags’ deze worden gehangen aan de C- of N-terminus van het GOI eiwit. Pagina 39 van 55 Toepassingen van de fusie-tags: - Verbeterde oplosbaarheid - Zuivering met affiniteitschromatografie - Lokalisatie eiwit: signaalsequentie voor het sturen van het eiwit naar bepaalde celcompartimenten - Verbeterde expressie van het eiwit - Verbeterde detectie o ‘epitoop tag’ – detectie met AL (c-myc of HA) o GFP – detectie met fluorescentie Algemeen schema voor het aanbrengen van fusie-eiwitten aan GOI. In onderstaan voorbeeld hangt het fusie-eiwit aan de C-terminus van het GOI eiwit. Verschillende voorbeelden van purificatie-tags dus affiniteitstags: - Polyhistidine tag met als affiniteitskolom nikkel of cobalt - GST tag (glutathione-S-transferase) met als affiniteitskolom glutathion - Streptavidine tag met als affiniteitskolom avidine In plaats van tags die ervoor zorgen dat eiwitten opgezuiverd kunnen worden met affiniteits- chromatografie kan ook een secretie signaal gebruikt worden. Deze zorgen ervoor dat de aangemaakte GOI eiwitten buiten de cel migreren. Deze toepassing kan niet altijd omwille van de inclusion bodies!!! Verschillende toepassingen van recombinante expressie in prokaryoten Pagina 40 van 55 Overzicht 1. Productie recombinante farmaca a. Insuline – diabetes mellitus b. tPA – myocardiaal infarct c. Factor VIII – hemofilie patiënten d. GH – allerlei syndromen met groeiachterstand e. EPO – behandeling anemie f. FSH – onvruchtbaarheid 2. Productie recombinante vaccins a. HepB 3. Creëren van specifieke mutaties: verbeterde eiwitten Gewassen bepaalde kenmerken of resistentie geven tegen een bepaalde bacterie vb. Insuline Insuline is een klein hormoon afkomstig uit de pancreas en staat in voor de regulatie van de bloedsuikerspiegel. Er zijn twee ziekten die een probleem hebben met dit kleine hormoon namelijk: - Diabetes type I (of IDDM: Insulin dependent diabetes mellitus) – probleem met de synthese, opslag of vrijstelling van insuline in de pancreas (wel tekort aan insuline) - Diabetes type II – probleem met binding van insuline op de receptor in de doelcel OF probleem met signaaltransductie binnen deze doelcel (geen tekort aan insuline) In 1982: humane DNA code in bacteriën voor eiwitproductie – voordelen: - Goedkoper - Grote hoeveelheden - Zuiver van virussen en andere eiwitten - Geen allergische reacties tegen dierlijke of plantaardige eiwitten Conditionele expressie in prokaryoten = expressie uitvoeren wanneer het uitkomt – cellen worden eerst opgekweekt = induceerbare (Lactose / IPTG) of represseerbare (Tryptofaan en arabinose) expressie Deze mechanismen zorgen ervoor dat bacteriën niet continue eiwitten aanmaken, maar op bepaalde tijdstippen. Pagina 41 van 55 Induceerbaar operon In bacteriën komt van nature zo’n mechanisme voor, namelijk het Lac-operon. Als er GEEN lactose aanwezig is in bacteriën staat het lac-operon uit – geen genexpressie. Als er WEL lactose aanwezig is in bacteriën staat het lac-operon aan – wel genexpressie. De aan- of afwezigheid van lactose wordt gecontroleerd door een constitutieve repressor (een repressor die altijd van nature aan staat). Wanneer er GEEN lactose aanwezig is (bovenste afbeelding) in bacteriën is de repressor actief waardoor deze gaat binden op de operator waardoor geen genexpressie plaatsvindt (obstakel voor RNA-polymerase die bindt op de promotor). Wanneer er WEL lactose aanwezig is in bacteriën (onderste afbeelding), fungeren deze als inducer waardoor de repressor inactief is waardoor deze niet bindt met de operator waardoor er wel genexpressie plaatsvindt. In de praktijk wordt IPTG gebruikt in plaats van lactose, dit omdat lactose wordt afgebroken door beta-galactosidase dat door de gastheer-bacterie wordt aangemaakt. Cultuur wordt gegroeid tot voldoende densiteit in afwezigheid van de inducer, als er voldoende cellen zijn, wordt de inducer toegevoegd voor genexpressie. Dit mechanisme vermijdt selectieve druk in de bacterie. Lac operon is een induceerbaar operon: we kunnen het induceren door toevoeging van IPTG Represeerbaar operon In bacteriën komt van nature zo’n mechanisme voor, namelijk het tryptofaan-operon. Tryptofaan is een aminozuur die bacteriën kunnen aanmaken waardoor het operon wordt onderdrukt of gerepresseerd. Als er GEEN tryptofaan aanwezig is in bacteriën staat het operon aan – wel genexpressie. Pagina 42 van 55 Als er WEL lactose aanwezig is in bacteriën staat het operon uit – geen genexpressie. De aan- of afwezigheid van tryptofaan wordt gecontroleerd door co- repressor (een repressor die altijd van nature uit staat). Wanneer er GEEN tryptofaan aanwezig is in bacteriën (bovenste afbeelding) is de repressor inactief waardoor deze niet gaat binden met de operator waardoor er wel genexpressie plaatsvindt. Wanneer er WEL tryptofaan aanwezig is in bacteriën (onderste afbeelding) is de repressor actief waardoor deze wel gaat binden met de operator waardoor er geen genexpressie plaatsvindt. Tryptofaan operon is een represseerbaar operon: we kunnen het onderdrukken/ represseren door toevoeging van tryptofaan. Een ander voorbeeld van tryptofaan is arabinose, dat ook een represseerbaar operon is. Om deze twee mechanismen te gaan gebruiken in de praktijk wordt het fluo paarse gedeelte vervangen door onze GOI. Hoofdstuk 6: Recombinante expressie in eukaryoten Eukaryoten = gisten, insectcellen, zoogdiercellen en plantencellen Hebben altijd een promotor EN terminator – promotor is altijd constitutief actief uitgezonderd bij een induceerbaar systeem!! Pagina 43 van 55 Wanneer doen we expressie in eukaryote cellen? - Expressie in prokaryoot lukt niet - Zuivering van het eiwit uit de prokaryoot lukt niet (inclusion bodies!!) - Eiwit uit de prokaryoot is niet functioneel - Uitgebreide posttranslationele modificatie nodig - Onmiddellijk koppeling aan een functionele studie Expressie in gisten Gisten zijn eencellige fungi en hebben verschillende voordelen: - Groeien snel - Makkelijk te manipuleren - Glycosilatie van eiwitten - Geen pyrogene toxines - Kloneren van zeer grote fragmenten (YAC: ~100kbp) - Kunnen wel aan posttranslationele modificatie doen 3 voorbeelden van gisten: - Bakkersgist of Saccharomyces cerevisiae - Komagataella phaffi (vroeger Pichia pastoris) Hoge expressie door methanol en alcohol oxidase (Paox en Taox) Indien methanol aanwezig is – alcohol oxidatie – genexpressie Indien methanol afwezig is – geen alcohol oxidatie – geen genexpressie DUS: kan groeien op methanol als C-bron – en hebben een zeer hoge expressieniveau - Schizosaccharomyces pombe – juiste opvouwing van het eiwit 2 “soorten” vectoren voor expressie in gisten: YEp (Yeast Episomale plasmids) Het is een shuttle vector want kan gebruikt worden in eukaryote als prokaryote cellen. ADHII = alcohol dehydrogenase II CYC1 = cytochroom c1 GAL1 = galactokinase 1 YAC (Yeast Artificial Chromosomes) – insert tot +/- 100kbp Pagina 44 van 55 Transformatie van de gistcellen met de recombinante vector - Conjugatie - Elektroporatie - Gebruik van sferoplasten (= zijn cellen zonder celwand – deze is enzymatisch verwijderd) waarbij DNA wordt binnengebracht met gebruik van ethyleenglycol en CaCl². Na de fusie laten ze de sferoplasten weer een celwand aanmaken door ze in een stabiliserend medium te brengen. Expressie in insectcellen – Baculovirus Het baculovirus is een virus dat insecten infecteert. De meest gebruikte soort is Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). Het virus heeft een dubbelstrengs DNA- Pagina 45 van 55 genoom dat relatief groot is, waardoor het geschikt is om grote genen in te voegen ook bevat het staafvormig capside. Het baculovirus-expressiesysteem gebruikt genetisch gemodificeerde baculovirussen om een recombinant eiwit te produceren in insectencellen of insecten. Het gen dat het eiwit codeert dat je wilt produceren (doelgen) wordt gekloneerd in een plasmidevector die een sterke virale promotor bevat, zoals de polyhedrine (polh)-promotor. Deze promotor is zeer krachtig en wordt normaal gesproken gebruikt door het virus om zijn polyhedrine-eiwit in grote hoeveelheden te produceren. Dat eiwit staat in normale omstandigheden in voor de vorming van een matrix waarin de virusdeeltjes worden ingebed. Voor de klonering met behulp van het baculovirus wordt het gen dat codeert voor die polyhedrine eiwitten vervangen door het GOI, maar wordt wel nog altijd gebruik gemaakt van de polyhedrine promotor. Bij de klonering van insecten/ insectcellen wordt vaak gebruikt gemaakt van de insect cellijn Sf9. Hierbij wordt “vreemd” DNA onder controle gezet van een polyhedrine promotor. Om het GOI in te brengen in insecten/ insectcellen wordt volgend mechanisme toegepast: - Enerzijds hebben we het baculovirus DNA: AcMNPV - Anderzijds hebben we een transfer vector met GOI Er wordt in beide onderdelen gekliefd met restrictie-enzymen waarbij homologe/ complementaire delen tegenover elkaar komen te staan. Het gen voor de aanmaak van polyhedrine eiwit wordt gekliefd uit het baculovirus DNA en wordt vervangen door het GOI dat is geknipt uit de transfer vector. De transfer vector en het gen voor het polyhedrine eiwit worden verwijderd. Complementaire delen Complementaire delen Onderstaande afbeelding kunnen herkennen en uitleggen! 1. Plaatsen van GOI in de transfervector 2. Transfer vector combineren met baculovirus DNA en wordt op een plaat gezet met insectcellen (Sf9) Pagina 46 van 55  3. De transfer vector en baculovirus DNA gaan met elkaar recombineren met de vorming van recombinante virusdeeltjes. 4. De recombinante virusdeeltjes komen uit de cel via budding en gaan nieuwe cellen gaan infecteren. 5. Wanneer er te veel recombinante virusdeeltjes aanwezig zijn in de cel gaat de cel kapot waardoor plaques ontstaan op de plaat. EXAMENVRAAG: Benoem alle onderdelen die je herkent en geef de algemene werking van deze vector weer. EXTRA: Wat is een trombine cut: een trombine is een protease klievingsplaats en is een proteolytisch enzym – dit enzym kan de tag na eiwitzuivering van het recombinant eiwit halen voor voorbeeld studies te kunnen uitvoeren op het recombinant eiwit. Pagina 47 van 55 Gele restrictieknipplaatsen: tag hangt aan de C-terminus Roze restrictieknipplaatsen: tag hangt aan de N-terminus Polyhedrine promotor GOI GST-tag Polyhedrine promotor GST-tag GOI Expressie in zoogdiercellen – episomale vector Bij deze expressie wordt er een onderscheid gemaakt in drie groepen - Niet replicerende plasmiden Bij deze groep is er transiënte expressie (tijdelijke expressie) waarbij geen selectiemerker nodig is dit omdat expressie maar van korte duur is (1-2 dagen) Pagina 48 van 55  - Wel replicerende plasmiden met virale replicons Bij deze groep is er een zeer hoge transiënte expressie waarbij sommige expressievectoren zich episomaal kunnen repliceren (dus afhankelijk van het genoom van de gastheer). Dit is vaak in COS cellen. Transiënte transfectie In deze replicon-vectoren zit een ‘Origin of replication’ afkomstig van virussen die lytische infecties veroorzaken. Deze virussen repliceren zich tot een zeer hoog copy-number en worden dan vrijgesteld met 1000en virusdeeltjes tegelijk (vb. CMV: Cytomegalovirus, SV40: Simian Virus, RSV: Rous Sarcoma Virus, EBV: Epstein Barr Virus). Permanent - Insertie in het genoom transfectie Er is permanente expressie in het genoom van de gastheer door permanente/ constitutieve transfectie. Ook kan het insert (GOI) op een andere manier in het genoom worden gebracht, namelijk retrovirale vectoren. e * Transfectie = het binnenbrengen van de recombinante vector met behulp van: lipidenpartikels, gene gun of nanopartikels Manieren om recombinant plasmide in te brengen in zoogdiercellen: - Fysische transfectie = directe transfectie o Elektroporatie en ultrasone golven o Gene gun : metaalpartikels (goud of wolfram) bekleed met DNA die met hoge snelheid in de targetcellen worden gebracht o Micro injectie Pagina 49 van 55 - Chemische transfectie o Ca-fosfaat o Vorming van polyplexen = polykationische stoffen  DEAE – dextraan : diethyl amino ethyl – dextraan  Synthetische polyamines : organische moleculen met meerdere aminegroepen  meer positieve ladingen om te binden met DNA  Dendrimeren : complexe moleculen (bolvormig of sterachtig) met meerdere aminegroepen  Polyethylenimines (PEI’s) : lineaire of vertakte koolwaterstofketens met N elke derde positie o Vorming van lipoplexen = fosfolipide vesikels  Liposomen : artificiële fosfolipide vesikels  lipofectie Transfectiemethoden algemeen: Transductie = het transformeren van cellen met behulp van een virus Bactofectie = het transformeren van cellen met behulp van een bacterie (vb. plantencellen met agrobacterium tumefaciens) Retrovirale vectoren = andere manier van insertie in het genoom te doen HIV is het meest bekende retrovirus dat bestaat uit RNA dat wordt voor verder gebruik omgezet naar cDNA met behulp van RT (reverse transcriptase), ook wordt in het genoom van HIV gekliefd zodanig er geen infectieuze viruspartikels ontstaan. Pagina 50 van 55 5’ – en 3’ LTR = long terminal repeats = sterke promotoren voor de transcriptie van de structurele genen gag, pol en env Gag = structuur eiwitten Pol = enzymen (RT, integrase) Env = spikes (envelope) Vork = verpakkingseiwitten (psi) De retrovirale vector kan herkend worden aan 5’ LTR, 3’ LTR en psi Eukaryote expressie algemeen – design van het contruct - Sterke constitutieve promotor (virale promotor, polyhedrine promotor, Paox promotor, …) - Inclusie van een intron: verhoogt expressie - Polyadenylatiesignaal: voor export naar het cytoplasma, stabiliteit, terminatie - Verwijderen van 5’ - en 3’ UTR (stukken in het RNA die niet vertaald worden) o 5’ UTR kan meerder AUG’s bevatten o 3’ UTR kan regulatorische sequenties bevatten die stabiliteit verminderen van mRNA - Optimaliseren translatie: Kozak sequentie - Doelsignaal vb. signaalpeptide – het eiwit moet geglycosyleerd worden Induceerbare systemen in de eukaryoot In de prokaryoot hadden we volgende induceerbare en represseerbare systemen: - Lac-operon met lactose of IPTG = induceerbaar operon (stimuleert transcriptie & translatie) - Tryptofaan-operon of arabinose = represseerbaar operon (blokkeert transcriptie & translatie) Ook in de eukaryoot bestaan gelijkaardige systemen Pagina 51 van 55 Dan is de promotor NIET constitutief actief, maar wordt geactiveerd op het gewenste moment!!! Eukaryote cellen bevatten geen lac-operon dus moet eerst in de cellen worden gestoken, wat op twee manieren kan: - LacI kan toegevoegd worden in trans: apart van het plasmide - LacI kan toegevoegd worden in cis: mee in het plasmide Lac-operon met IPTG Als het LacI is toegevoegd aan de eukaryote cel kan het GOI worden toevoegd. Als de LacO (operator) ook mee wordt toegevoegd tussen de promotor en het gekloneerde gen, wordt transcriptie van het reporterconstruct geblokkeerd. Wanneer er GEEN IPTG aanwezig is in de eukaryoten (bovenste afbeelding) is de repressor actief waardoor deze gaat binden op de operator waardoor geen genexpressie plaatsvindt (obstakel voor RNA-polymerase die bindt op de promotor). Wanneer er WEL IPTG aanwezig is in de eukaryoten (onderste afbeelding), fungeren deze als inducer waardoor de repressor inactief is waardoor deze niet bindt met de operator waardoor er wel genexpressie plaatsvindt. Tetracycline (of doxycycline)-operon met tetracycline (of doxycycline) Het tetracycline operon komt van nature niet voor in eukaryote cellen, maar in prokaryote cellen. Sommige bacteriën bevatten een operon die resistentie veroorzaakt tegen het antibioticum tetracycline. Wanneer bacteriën deze resistentie bevatten gaan ze kanalen gaan blokkeren zodanig tetracycline niet tot in de celkern kan geraken waardoor de bacteriën niet sterven door dit antibioticum. Van dit mechanisme wordt gebruik gemaakt in induceerbare eukaryote systemen. Pagina 52 van 55 Wetenschappers gebruiken gemodificeerde versies van het bacteriële tetracycline-operon om genexpressie in eukaryote cellen te regelen. Systeem 1 – hoe het normaal voorkomt in bacteriën – induceerbaar operon (ACTIVEERT) = hoge expressieniveaus toxisch want cellen gaan kapot, waardoor systeem wordt aangepast naar systeem 2. TetR bestaat uit twee delen: DNA-bindend domein (DBD) en transactivator (TA) Transfectie in eukaryote cellen Indien tetracycline NIET aanwezig is – repressor is actief waardoor deze bindt met de operator – transcriptie en translatie kan NIET plaatsvinden Indien tetracycline WEL aanwezig is – bindt met de repressor waardoor de repressor inactief is en niet bindt op de operator – transcriptie en translatie kan WEL plaatsvinden. Systeem 2 – Tet-off systeem – represseerbaar operon (INHIBEERD) = tet-transactivator systeem (tTA) Omdat hoge expressieniveaus van de respressor echter cytotoxisch zijn, gaat men op een andere manier te werk. Men zet de repressoren om in activatoren (dit geldt ook voor het LacI/LacO systeem). Hiervoor gebruikt men enkel het DNA-bindend domein van TetR en men fuseert het met het transactivatiedomein VP16 van het Herpes Simplex Virus, zodat het zogenaamde tTA –eiwit wordt gevormd. Dit eiwit is niet langer een repressor, maar een activator. Het bekomen systeem noemt men het tet-transactivator systeem of tTA. Tetracycline zal hier de expressie inhiberen i.p.v. activeren Pagina 53 van 55 Bij dit systeem wordt de transactivator van tetracycline vervangen door een transactivator afkomstig van het Herpes Simplex virus. Hierdoor fungeert TetR niet meer als repressor, maar als activator Transfectie in eukaryote cellen Indien tetracycline NIET aanwezig is – repressor is inactief waardoor deze niet bindt met de operator – transcriptie en translatie kan WEL plaatsvinden Indien tetracycline WEL aanwezig is – bindt Tc met de repressor waardoor de repressor actief is en wel bindt op de operator – transcriptie en translatie kan NIET plaatsvinden. Niet alle cellen kunnen constant opgekweekt worden met tetracycline - GEVOLG er wordt nog een aanpassing gedaan van dit systeem in systeem 3! Systeem 3 – Tet-on systeem – induceerbaar operon (ACTIVEERT) = reverse transactivator systeem (rtTA) Bij dit systeem wordt er een mutatie veroorzaakt in het DNA bindend domein (DBD) wat ervoor zorgt dat cellen niet constant gekweekt moeten worden in tetracycline. Door de mutatie gaat DBD pas binden met het DNA als er een kleine hoeveelheid tetracycline wordt toegevoegd. Als er geen tetracycline aanwezig is gaat DBD niet binden aan het DNA. Pagina 54 van 55  Transfectie in eukaryote cellen Indien tetracycline NIET aanwezig is – repressor is actief waardoor deze bindt met de operator – transcriptie en translatie kan NIET plaatsvinden want DBD bindt NIET aan het DNA Indien tetracycline WEL aanwezig is – bindt Tc met de repressor waardoor de repressor inactief is en niet bindt op de operator – transcriptie en translatie kan WEL plaatsvinden want DBD bindt WEL aan het DNA Pagina 55 van 55