Resumo da Prática de Microbioma Humano PDF

Prática de Microbioma Humano Esterilizar – eliminar microog Desinfetar- reduzir nº de microorganimos Métodos de esterilização: Autoclave  Autoclave: e usada para esterilizar (nao se pode meter plastico la dentro)....

Prática de Microbioma Humano Esterilizar – eliminar microog Desinfetar- reduzir nº de microorganimos Métodos de esterilização: Autoclave  Autoclave: e usada para esterilizar (nao se pode meter plastico la dentro).  Utiliza-se tambem a estufa para esterilizar, tornando a soluçao esteril.  Utiliza-se a filtraçao com filtro para esterilizar soluçoes que nao resistem a esterilizaçao na autoclave. Estufa de esterilizaçao e secagem  Para criar um ambiente esteril usamos uma camara de fluxo de ar laminar com luz UV. Esta esteriliza a superfície e os filtros filtram todo o ar que entra na camara.  Se nao tivermos a camara de fluxo de ar laminar usamos o bico de bunsen. Camara de fluxo de ar laminar Bico de Bunsen  A radiaçao gama e amplamente usada para esterilizar materiais plasticos novos, especialmente aqueles que nao suportam altas temperaturas (penetra superfícies e elimina microrganismos.  Ja a radiaçao ultravioleta esteriliza apenas superfícies (nao penetra). O alcool pode ser usado como antisséptico para feridas (tecidos vivos) e como desinfetante para superfícies (materiais). O antisseptico e menos agressivo, para nao danificar as celulas, enquanto o desinfetante elimina microrganismos e pode ser prejudicial a tecidos vivos. Ambos reduzem a carga microbiana, mas o desinfetante nao esteriliza totalmente. Página 1 de 10 Os alimentos nao sao estereis, mas usamos metodos de preservaçao para reduzir microrganismos, tais como:  Pasteurização: Criada por Pasteur, aquece o leite a temperaturas moderadas para reduzir microrganismos. Exposiçao ao ar, durante alguns dias, ou recipientes nao estereis podem voltar a ficar contaminados. Fervura  Ultrapasteurização (UHT): Aquece o leite a altas temperaturas por segundos, eliminando todos os microrganismos e prolongando a validade. Ciclo de fervura  Tindalização: Alterna aquecimento e arrefecimento em ciclos (3 vezes) para eliminar microrganismos e esporos, usada em conservas. Os que resistiram ao 1º ciclo sao depois eliminados no 2º ou no 3º ciclo.  Altas pressões: Esteriliza alimentos como sumos, preservando sabor e nutrientes, destruindo microrganismos sem calor. Existem diferentes tipos de meios de cultura (sao utilizados para cultivar e multiplicar microrganismos em laboratorio), entre eles existem:  Meios sólidos: Contem agentes solidificantes, como o agar sangue, permitindo o crescimento de colonias visíveis.  Meios líquidos: Nao possuem agentes solidificantes e sao usados para o cultivo em suspensao. TRANSFERÊNCIA DE MEIO SÓLIDO PARA MEIO LÍQUIDO Com uma ansa esterilizada, recolher um pouco de cultura do meio sólido. Mergulhar a ansa no meio líquido, agitando-a para soltar o inóculo. TRANSFERÊNCIA DE MEIO LÍQUIDO PARA MEIO LÍQUIDO Recolher um pouco de cultura em meio líquido, utilizando uma pipeta de Pasteur esterilizada. Deitar algumas gotas num tubo com meio líquido.  Meios gerais: Ricos em nutrientes, permitem o crescimento de uma ampla variedade de microrganismos.  Meios específicos: Formados de acordo com as necessidades de microrganismos específicos. Podem ser subdivididos em: → Meios seletivos: Contem substancias que favorecem o crescimento de certos microrganismos enquanto inibem outros. Por exemplo, o meio Página 2 de 10  MacConkey permite o crescimento de enterobacterias (Gram-negativas), mas inibe outras, como as Gram-positivas, devido a presença de sais biliares. → Meios diferenciais: Permitem distinguir entre microrganismos com base nas suas características metabolicas. No caso do meio MacConkey, e possível identificar bacterias fermentadoras de lactose (coliformes), que mudam a cor do meio devido a alteraçao do pH, e aquelas que nao fermentam lactose O meio agar-sangue e um meio geral, enriquecido com sangue, que fornece nutrientes adicionais para o cultivo de microrganismos, especialmente os que apresentam crescimento lento e sao difíceis de cultivar. Esse tipo de meio tambem e diferencial, pois permite distinguir entre bacterias com diferentes capacidades de hemolise (quebra de globulos vermelhos):  Sem hemólise: Apenas a colonia e visível, sem alteraçoes na cor ao redor.  Hemólise parcial (alfa-hemólise): A area ao redor da colonia adquire uma coloraçao esverdeada.  Hemólise completa (beta-hemólise): A area ao redor da colonia torna-se transparente, substituindo a coloraçao original da placa. Meios de cultura: MacConkey e agar sangue, respetivamente Uma cultura pura e composta apenas por um tipo específico de microrganismo, todos originarios de uma unica celula (mesma celula), ou seja, geneticamente identicos e com as mesmas características visíveis. Para obter uma cultura pura, fazemos o isolamento a partir de uma colónia individualizada (unica colonia que cresceu em meio de cultura). O processo de isolar uma colonia e crucial para garantir que a cultura seja pura, sem contaminaçao de outros tipos de microrganismos. 1º Sementeira- replicar de uma cultura para outra. Página 3 de 10 Existem diferentes metodos de sementeira utilizados para isolar colonias de microrganismos e obter culturas puras. Metodos de sementeira:  ESGOTAMENTO - Por estria: Espalha-se a amostra em traços sucessivos para separar as celulas e formar colonias individuais (usa-se toda a cultura).  ESGOTAMENTO- Com espalhador de vidro: A amostra e espalhada uniformemente na superfície do meio de cultura, facilitando o crescimento de varias colonias. Por estria  Em toalha (com zaragatoa): A zaragatoa e usada para cobrir toda a superfície do meio, criando um tapete de celulas. Recolher uma colonia e fazer uma suspensao em soro fisiologico. Inocular o meio solido, passando a zaragatoa segundo varias direçoes, de forma a se obter uma cultura homogenea.  Por incorporação: A amostra e misturada com o meio líquido, depois solidificado para contar microrganismos na amostra.  Com semeador de vidro (ou descartável) – com uma pipeta de Pasteur esterilizada, recolher uma gota de inoculo, deitar numa placa com meio solido, espalhar com o semeador. Com o mesmo semeador, voltar a passar numa segunda placa, e depois, da mesma forma, numa terceira placa. Inoculação em profundidade v Por picada – recolher uma colónia bem isolada e inocular em meio sólido contido num tubo de ensaio, espalhando a cultura na rampa e, por fim, espetando o fio no agar 2º A coloração de Gram e um dos metodos mais importantes para identificar e classificar bacterias, baseado nas diferenças nas paredes celulares das bacterias Gram-positivas e Gram-negativas. – COLORAÇÃO DIFERENCIAL Esta distingue as bacterias com base na estrutura da parede celular:  Gram-positivas: Tem uma camada espessa de peptidoglicano, que retem o corante violeta cristal e as deixa roxas.  Gram-negativas: Possuem uma camada de peptidoglicano mais fina e uma membrana externa. Durante o processo, o alcool ou acetona remove a camada de lipopolissacarídeo (LPS), fazendo com que essas bacterias percam a cor e fiquem incolores, mas ao aplicar o corante safranina ficam rosas. Página 4 de 10 Processo de coloraçao de Gram: 1. Preparação a fresco: Organismos vivos são usados para observar características como motilidade (movimento), morfologia (forma) e associação das bactérias. 2. Fixação e coloração: Após preparar um esfregaço da cultura bacteriana:  Violeta cristal (primeiro corante) colora todas as bactérias de roxo.  Lugol (mordente) ajuda a fixar o violeta cristal nas células bacterianas.  Álcool ou acetona (diferenciador) remove a cor da camada externa das Gram- negativas, mas não afeta as Gram-positivas. tira a camada de lps das gram negativas  Safranina (segundo corante) colora as Gram-negativas de rosa, enquanto as Gram-positivas permanecem roxas. Resumo: Coloração de gram- diferencial - violeta cristal - mordente (lugol)- fixa o corante - alcool acetona- tira a camada de lps das gram negativas - safranina (coloraçao rosa as bacterias q tinham sido descoloradas)- gram negativas (a partir do momento que as bactérias são coradas e fixadas, morrem) MAC CONKEY CRESCE SÓ GRAM NEGATIVAS !!!!!!! AGAR SANGUE CRESCE TUDO !!!!!!! Página 5 de 10 Variaçoes da coloraçao:  Coloraçao simples- azul de metileno  Para anaeróbias: Utiliza-se uma versao modificada, chamada coloraçao de Gram modificada por Burg.  Para micobactérias: Como as micobacterias nao podem ser bem coradas com a coloraçao de Gram devido a sua parede celular especial, utiliza-se a coloraçao de Ziehl-Neelsen, que usa dois corantes para identificar essas bacterias resistentes. bacterias alcool-acido-resistentes - Mycobacterium Identificação bioquímica: Ex: galerias epi GRAM POSITIVO- TESTE CATALASE : Galerias api straph: catalse + Galerias api strep: catalase – Usa-se enzima catalase -> desdobra o peroxido de hidrogenio em agua e hidrogenio. GRAM NEGATIVO – TESTE OXIDASE: Galeria api 20E: oxi – Galeria api 20NE: oxi + DIFICULDADES DOS API: - o inoculo nao estava em cultura pura (e então o conjunto de reações bioquímicas obtido não se referia a uma determinada bactéria, mas ao conjunto das reações das duas, ou mais, bactérias na mistura) - o microrganismo isolado difere do perfil característico para a espécie e não consta do catálogo. - contaminação Página 6 de 10 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE BACTÉRIAS O gene do RNA ribossomal 16S e a unica sequencia disponível para a maioria das especies bacterianas, incluindo estirpes tipo e um grande numero de bacterias nao cultivadas – primers de Escherichia coli. Pode fazer-se porque escolhemos, é o de rotina, a identificação bq Usa-se para identificar microorganismos e antimicrobianos. Queremos estudar o microbioma -> sequenciação metagenomica- identificar tudo o que queremos ver RÁCIO – para ver se é puro ou não 1. ESTRAÇÃO DNA 2. Lise das celulas: O primeiro passo e a rutura das celulas para liberar o DNA. Isso pode ser feito usando um detergente ou soluçao que destrua as membranas celulares. 3. Separaçao de moleculas: Depois, outras moleculas, como proteínas e RNA, sao separadas do DNA. 4. Tratamento com RNase: A RNase e usada para degradar o RNA, garantindo que apenas o DNA fique na amostra. 5. Purificaçao do DNA: O DNA e entao purificado atraves de um tratamento com protease, que quebra proteínas, e pode ser passado por uma coluna de purificaçao com uma membrana que prende o DNA, separando-o de impurezas. 6. Precipitação para ter um RNA puro 7. Centrifugar 8. Quantificação do DNA – absorvância: nanodrop (quantidades pequenas) e eletroferese- aplicar corrente elétrica p separar de acordo com o peso e a carga – gel agarosa, poliacrilamida, amido 9. AMPLIFICAÇÃO DO DNA- PCR Gene Rrna 16s – SÓ BACTÉRIAS - todas as bactérias Gene Rrna 18s e ITS (região intergenica entre 2 RNA) – EUCARIOTAS Página 7 de 10 Componentes para reações moleculares: Durante a amplificaçao de DNA (como na reaçao em cadeia da polimerase ou PCR), alguns reagentes essenciais sao usados para fazer copias do DNA: 1. Catiões divalentes (como MgCl2- tampão): Essenciais para a atividade da DNA polimerase. 2. dNTPs (desoxinucleotídeos): Fazem parte da estrutura do DNA: o dATP (adenina); o dCTP (citosina); o dGTP (guanina); o dTTP (timina). 3. DNA polimerase termostável: É a enzima que faz a replicação do DNA. Ela pode funcionar a altas temperaturas, essenciais para o processo de PCR. 4. Primer forward e reverse: São pequenos pedaços de DNA que servem como pontos de partida para a replicação do DNA. O primer forward vai para uma direção, enquanto o reverse vai para a direção oposta. 5. DNA molde: É o DNA que será copiado durante a reação. 6. Termociclador 230- proteínas 260- dna 280- rna Página 8 de 10 FEZES Extraçao do dna Dirige-se para procariotas 16Rrna S – informaçao do microbiota – e.coli Existem varios métodos de teste de suscetibilidade aos antimicrobianos usados para determinar a eficacia de antibioticos e outros agentes antimicrobianos contra microrganismos, tais como:  Método de Difusão em Disco (Kirby-Bauer): Discos com antimicrobianos sao colocados na placa, e a zona de inibiçao (onde as bacterias nao crescem) ao redor de cada disco indica se a bacteria e sensível ou resistente. – metodo mais utilizado  Microdiluições: Diluiçoes sucessivas do antibiotico feitas em placas de microtitulagem, e determinaçao da CMI (concentraçao mínima inibitoria)- menor quantidade de antimicrobioano necessaria para inibir o crescimento da bacteria.  Método das fitas (E-test): Utiliza fitas com gradientes de antimicrobianos para determinar a CMI (concentraçao mínima inibitoria) e, em alguns casos, a CMB (concentraçao mínima bactericida). Nota: MIC=CMI (concentração mínima inibitória) - menor concentraçao de antimicrobiano que inibe o crescimento do organismo MBC=CMB (concentração mínima bactericida) - menor concentraçao de antimicrobiano que mata o microrganismo Nota sobre o método de difusão em disco (kirby-bauer): Resistente: Quando um microrganismo nao e afetado por um antimicrobiano, independemente da sua concentraçao. Sensível: Quando um microrganismo e inibido ou morto por uma certa concentraçao Halo pequeno: No teste de difusao geralmente indica resistencia Halo grande: No teste de difusao pode indicar a sensibilidade, no entanto nao indica sempre sensibilidade, e deve-se verificar sempre os valores da tabela de interpretaçao Página 9 de 10 Antibióticos vs Antimicrobianos:  Antibióticos: substancias produzidas por organismos vivos (como bacterias) para matar ou inibir o crescimento de outros microrganismos. Nao podem incluir antibioticos.  Antimicrobianos: substancias sinteticas ou naturais que atuam contra uma variedade de microrganismos, como fungos e vírus, e nao so contra bacterias. Podem incluir antibioticos Bactericidas vs Bacteriostáticos:  Bactericidas: antimicrobianos que matam as bacterias  Bacteriostáticos: antimicrobianos que inibem o crescimento das bacterias, mas nao as matam diretamente ❖ Escolhemos sempre antimicrobianos que sejam sensíveis a bacteria que estamos a tratar, para garantir a eficacia do tratamento Página 10 de 10