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Resumos Biologia do Desenvolvimento Humano Caso 1 – Fertilização Fertilização Formação de um zigoto diploide a partir de dois gâmetas haploides Eventos: Gametogénese – formação dos gâmetas o Estrutura e conteúdo funcional Direcionamento do espermatozoide...

Resumos Biologia do Desenvolvimento Humano Caso 1 – Fertilização Fertilização Formação de um zigoto diploide a partir de dois gâmetas haploides Eventos: Gametogénese – formação dos gâmetas o Estrutura e conteúdo funcional Direcionamento do espermatozoide Contacto e reconhecimento entre espermatozoide e oócito o Têm de ser da mesma espécie Regulação da entrada do espermatozoide o Limitar a entrada a apenas um espermatozoide Fusão do material genético do espermatozoide e oócito o Transmissão do material genético dos progenitores Ativação da expressão genética e do metabolismo do zigoto o Iniciar o desenvolvimento Gametogénese No ser humano, este processo começa por volta das 2 semanas, quando um conjunto de células são escolhidas para formar a linha germinal o Este conjunto de células primordiais germinativas vão dar origem às gametas É na 8ºsemana que há diferenciação do sexo  Gametogénese feminina Oogónio – estrutura formada através das PGCs (células germinativas primordiais) Este vai se multiplicar inúmeras vezes até formar o oócito primário Depois vamos ter a meiose, parando na prófase I A partir da puberdade, este oócito da prófase I vai retomar a meiose 6 meses a 1 ano antes da ovulação, o oócito primário termina a 1º meiose, dando origem a duas células diferentes: corpo polar e o oócito secundário O oócito secundário só depois de ser fertilizado pelo espermatozoide é que vai completar a sua divisão A gametogénese humana tem uma característica diferente de outras espécies: no início as mulheres têm cerca de 7 milhões de células germinativas. Este número vai decair muito rapidamente, tendo no início da puberdade cerca de 300 mil células germinativas. Destas vai haver uma seleção e apenas cerca de 400 é que são libertadas durante a ovulação Nota: A gametogénese humana tem uma característica diferente de outras espécies: no início as mulheres têm cerca de 7 milhões de células germinativas. Este número vai decair muito rapidamente, tendo no início da puberdade cerca de 300 mil células germinativas. Destas vai haver uma seleção e apenas cerca de 400 é que são libertadas durante a ovulação Principais características da gametogénese feminina A proliferação celular é exclusiva de estadios pré-natais (até às 10 semanas de desenvolvimento) A meiose apenas é completa mediante fertilização por espermatozoide Existem divisões mitóticas assimétricas, oq vai garantir que apenas se forme 1 gâmeta maduro por cada célula precursora Óvulo/oócito O oócito está envolvido por camadas com função protetora e nutritiva: Cumulus – rico em ácido hialorónico; vai ancorar o oócito à parede do folículo Corona radiata – região mais interna do cumulus Zona pelúcida – constituída por glicoproteínas ZP Nota: A zona pelúcida tem células germinativas O cumulus (e corona radiata) tem células somáticas Conteúdo funcional do oócito Para além do material genético do núcleo, também existem outros conteúdos/ componentes no citoplasma que vão ser importantes para ativar o óvulo após a fecundação, através da produção de energia e biomoléculas, num estágio inicial. Mais tarde, o material genético do zigoto irá ter essas funções. Como conteúdo citoplasmático temos: Mitocondria (para produzir energia) RNA polimerases (para transcrever DNA) DNA polimerases (para replicar DNA) Ribossomas (para produzir proteínas) tRNA histonas (para proteger o DNA nuclear) Desoxirribonucleosídeos Trifosfatos (para replicar DNA) Morfogénicos o Fatores que auxiliam no desenvolvimento do oócito o Exemplo: fatores parácrinos RNAs maternais – vão assegurar a produção de proteínas que vão ser essenciais para o desenvolvimento do zigoto, no início da fertilização e antes do material genético do zigoto ser transcrito durante a oogénese temos a acumulação de RNAs maternais no oócito depois da fertilização temos um decaimento dos RNAs maternais mais tarde vamos ter transcrição do RNA no zigoto esta transição de RNAs maternais para RNAs zigóticos denomina-se de transição maternal zigótica A Descoberta de mRNAs Maternais Eles foram descobertos em Drosofilas Gametogénese masculina Está dividida em 3 fases: Proliferação por divisão mitótica o A espermatogonia inicial começa a dividir-se Redução do material genético por meiose (início da puberdade) Maturação por espermiogénese Principais características da gametogénese masculina: Temos proliferação celular contínua ao longo da vida As divisões mitóticas simétricas vão assegurar que são obtidos 4 gâmetas maduros a partir de cada célula precursora O tamanho e forma dos gâmetas é muito diferente da célula estaminal que lhe deu origem Espermatogénese (do espermátide ao espermatozoide) Inicialmente vamos ter a formação do acrossoma a partir das vesículas do aparelho de Golgi Depois vai ser formado o flagelo De seguida vai haver deslocamento das mitocôndrias para o segmento intermédio Extrusão da maioria do conteúdo citoplasmático Espermatozoide Está dividido em: Cabeça – constituída por: o Núcleo (23 cromossomas; 1 cromatídeo) o Acrossoma (vesícula contendo enzimas digestivas para dissolver as barreiras protetoras do oócito) Segmento intermédio – constituído por: o Mitocôndrias (para produzir energia) o Um par de centríolos (estes permanecem no ovo) Cauda – tem como função dar mobilidade ao espermatozoide, sendo mediado pelo axonema (microtúbulos e proteínas motoras do flagelo) o É constituída por 9 pares de microtúbulos. As dineinas são proteína motoras que constituem os microtúbulos o Sempre que é necessário haver contração, há um conjunto de dineinas que são ativas e outras que ficam inativas, alternando entre si. o Este processo vai gastar energia A estrutura funcional do espermatozoide permite: Deslocar-se até ao oócito Penetrar o oócito Depositar o material genético no oócito Diferenças entre a gametogênese masculina e feminina Produção contínua na gametogênese masculina, enquanto na feminina é até ao período pré-natal Estrutura funcional final, tamanho e conteúdo diferem 1 célula estaminal origina 1 gâmeta feminino ao passo que 1 célula estaminal origina 4 gâmetas masculinos Percurso do espermatozoide até ao óvulo Características importantes: O espermatozoide consegue mover-se (motilidade do flagelo) Existência de contrações musculares no útero que ajudam na movimentação do espermatozoide Existência de termotaxia nos espermatozoides (conseguem detetar as diferenças de temperatura, movimentando-se para locais mais quentes) o existem 2 sensores: TRPM8 e opsins o detetam diferenças de temperatura de cerca de 100 milésimas de ºC Existência de quimiotaxia, ou seja, o óvulo secreta hormonas e pequenos péptidos que vão atrair os espermatozoides o A acumulação de cálcio dentro da célula leva à ativação da motilidade do espermatozoide em direção à maior concentração de ligando. Também vai provocar a produção mitocondrial de ATP e ativação da dineína nos flagelos Reotaxia: Os movimentos ciliares no tubo uterino geram um fluxo que transporta os óvulo/ovo em direção ao útero e gera um movimento contra-corrente do espermatozoide em direção ao óvulo o É ativado pelo sensor CatSper que faz com que o espermatozoide passe de um batimento simétrico pra um assimétrico  Capacitação É o processo final de maturação do espermatozoide Ocorre ao longo de todo o percurso até ao óvulo Isto é possível devido a passar num meio rico em albumina, cálcio e bicarbonato no útero o Inicialmente, a albumina vai ser responsável por remover o colesterol contido na membrana do espermatozoide o Isto vai permitir com que haja entrada de cálcio e bicarbonato o Ambos vão ativar a enzima SACY que vai ser responsável por converter ATP em cAMP o Por sua vez, o aumento de cAMP vai ativar a PKA (proteína quinase A) que vai fosforilar a tirosina quinase o Isto vai provocar, por um lado, a capacitação do espermatozoide e por outro lado, em conjunto com o cálcio (que aumenta atividade da dineina) provoca a hiperativação dos espermatozoides Reação do acrossoma Esta reação é necessária para a penetração do espermatozoide através das camadas protetoras do oócito A membrana externa do acrossoma funde-se com a membrana citoplasmática, que é digerida, expondo o conteúdo acromossomal Existe uma vesícula na zona anterior do espermatozoide que contém um conjunto de enzimas hidrolíticas que são libertadas e vão ajudar o espermatozoide a entrar no óvulo Nota: reacção do acrossoma –fertilização bem sucedida ligação à zona pelúcida com acrossoma intacto –não há fertilização Reconhecimento e Fusão Membranar dos Gâmetas As glicoproteínas da zona pelúcida reconhecem seletivamente espermatozoides da mesma espécie A ZP2 é a glicoproteína responsável por mediar a ligação do espermatozoide à zona pelúcida no ser humano (no ratinho é a ZP3) Fusão membranar dos gâmetas A reação acrossomal expões ligandos/recetores específicos, como o Izumo Por sua vez, as proteínas Juno vão reconhecer este recetor Isto vai provocar a internalização do espermatozoide Após a entrada de um espermatozoide no oócito, os receptores Juno são excluídos da membrana celular de forma a prevenir a ocorrência de poliespermia, ligando-se a outros espermatozoides e neutralizando-os Nota: em fertilização in vitro (injeção intracitoplasmática não ocorre perda do Juno Geração de ondas de cálcio Após a entrada do espermatozoide vamos ter libertação de iões de Ca2+ do retículo endoplasmático, devido à ação enzimática da phospholipase C zeta Processo da oscilação de cálcio: A enzima phospholipase C zeta vai transformar a PIP2 em IP3 A IP3 provoca a libertação de Ca2+ do retículo endoplasmático, através da sua ligação a um canal de cálcio Baixas concentrações de Ca2+, libertado pelo RE, induzem a abertura dos canais seguintes, progressivamente, ao longo da membrana do RE Quando são atingidas altas concentrações de cálcio, os canais são inibidos, fechando o É neste momento que se completa o pulso Os níveis de Ca2+ perto do canal inibido baixam, até que se atinge uma concentração baixa, capaz de voltar a induzir a abertura do canal –inicia-se um novo pulso no mecanismo de oscilações Nota: estas ondas de cálcio auxiliam no bloqueio da poliespermia de duas formas: A onda de cálcio leva à despolarização da membrana no oócito, levando esta a ter uma carga negativa (não acontece em humanos, ocorre em ouriços do mar por exemplo) Pode provocar o bloqueio lento da poliespermia, através da reação dos grânulos corticais Reação dos grânulos corticais É um dos mecanismos de prevenção da poliespermia Após a onda de cálcio, há um conjunto de vesículas, chamadas de grânulos corticais que vão se aproximar e fundir-se com a membrana, libertando o seu conteúdo: o Cortical granule serine protease (CGSP) que vai ajudar a clivar recetores de espermatozoide na zona pelúcida e liberta o envelope vitelínico da membrana celular o Polissacáridos – ao serem hidratados causam afastamento da zona pelúcida o Peroxidases (OVOP e Udx1) e transglutaminases (TG) – endurecem o envelope vitelínico, dando origem ao envelope de fertilização o Ovastacin – protéase que cliva o receptor ZP2, oq impede a ligação de espermatozoides Nota: No ouriço do mar, a formação do envelope vitelínico após a fertilização, remove os espermatozoides excedentários (bloqueio da polispermia) - mutação no ZP2 não impede o reconhecimento entre espermatozoide e ovo. Contudo vai impedir a clivagem, pelo que continua no estadio de 2 células Ativação do ovo É mediado pelo cálcio É o processo em que o ovo começa as suas atividades metabólicas Inicialmente vamos ter a tradução de RNAs maternais que vão ser importantes para a síntese de proteínas Contudo, com o avançar do desenvolvimento do embrião, os RNAs maternais começam a ser degradados e a transcrição começa a ser feita pelo próprio zigoto (transcrição zigótica) Durante este processo vão haver várias divisões mitóticas Nota: a actinomicina é um inibidor de RNAs maternais, oq vai provocar uma diminuição da síntese de proteínas Fusão dos pronúcleos Durante a fertilização vamos ter a fusão do núcleo do espermatozoide e do óvulo Isto vai ser possível devido ao ASTER (formado a partir do centríolo paternal) - chatgpt a salvar hahaha Caso 2 - Gastrulação Do zigoto até à gastrulação 1º semana Na fertilização temos a libertação dos grânulos corticais que vão libertar enzimas que modificam a zona pelúcida e a membrana, criando um envelope de fertilização As divisões celulares vão se dar dentro deste envelope, que é semirrígido Enquanto temos estas divisões, o zigoto vai ser empurrado pelas células ciliadas da trompa de Falópio até ao útero Nota: as mitoses que ocorrem nesta altura são rápidas e não têm checkpoints. Logo, os erros que possam haver não são detetados nem reparados. É por isso que 60-70% das fecundações que ocorrem no ser humano são perdidas nas duas primeiras semanas (não chegam a implantar), devido a haver uma maior probabilidade de ocorrerem erros  Ao fim de mais ou menos 3 dias temos a formação da morula A partir de um determinado momento, dá-se a primeira diferenciação celular que vai formar uma camada de células na periferia, chamada de trofoblasto. O embrioblasto vai estar noutra ponta, sendo também uma camada de células o A esta “““estrutura””” damos o nome de blastocisto As células embrionárias estaminais expressão 3 genes/fatores de pluripotência diferentes: Oct4, Sox2 e Nanog o Estes fatores regulam-se entre eles o A expressão destes 3 genes é característica destas células e se forçarmos a sua expressão numa célula adulta, ela vai transformar-se e adquirir propriedades estaminais (Induced pluripotent stem cells) Nota: O envelope de fertilização tem um papel importante para evitar gravidezes ectópicas  No final da 1º semana vamos ter a eclosão da zona pelúcida, que vai permitir a implantação na parede do útero o A implantação ocorre sempre a partir da região do embrioblasto, por ser a região que necessita de ser protegida mais rapidamente 2º - 3º semana O blastocisto, no trofoblasto, tem recetores membranares que são capazes de reconhecer proteínas da membrana do endométrio o Há zonas/regiões do endométrio que têm espinócitos que vão detetar a presença do blastocisto, facilitando a ligação deste com o endométrio Durante a fase de invasão, no momento em que a camada de trofoblasto receber sinais oriundos do endométrio, esta vai diferenciar-se em mais células, originando duas camadas: o Citotrofoblasto – é 1 camada de células internas o Sicíciotrofoblasto – tem 1 membrana celular e mais que 1 núcleo O citoplasma do Sicíciotrofoblasto vai libertar enzimas que vão digerir a parede do endométrio até chegar aos vasos sanguíneos do endométrio Isto vai fazer com que hajam “poças” de sangue no tecido Por sua vez, o citotrofoblasto vai lançar vilosidades que vão ligar-se a estas poças de sangue, oq vai originar a formação da placenta (vai ser a primeira fonte de alimento do embrião) - inicialmente temos o blastocisto (constituído por células totipotentes (conseguem dar origem a todo o embrião e às estruturas extraembrionárias)) - este vai dar origem ao trofoblasto e às células embrionárias estaminais (são células pluripotentes) - o epiblasto vai dar origem ao embrião - o hipoblasto vai dar origem à endoderme primitiva, endoderme extraembrionária e ao saco vitelino Formação da linha primitiva 15 dias depois da fertilização temos a formação da linha primitiva Vai definir oq é rostral e caudal Encontra-se dentro do endométrio Ela vai alongar-se através de mecanismos de extensão-convergente A cavidade amniótica vai enxer-se de líquido e o saco vitelino vai diminuir, tornando-se o primeiro sistema excretor (é muito rudimentar) Nota: o corpo do embrião está completamente formado a partir das 8 semanas da fecundação Nota: ventralmente, ao longo da formação da linha primitiva, temos um aglomerado de células que se vai juntando e proliferando até formar um tecido completo. Vai haver também formação de um novo tecido: o endoblasto Wnt8c e Vg1 Num embrião, todas as células na margem expressavam Wnt8c Contudo, apenas uma pequena porção das células expressa Vg1 o É desta porção de células que a linha primitiva tem origem O Vg1 e o Wnt8c apenas vão induzir a formação da linha primitiva na região posterior, devido a expressarem o fator Nodal o Isto acontece devido a esta zona não existir Cereberus, que está contido no hipoblasto O Nodal vai induzir transformações ao epiblasto, fazendo com que as células desta camada delaminem e expressem FGF Isto vai fazer com que haja formação de células, que vão constituir o endoblasto Por sua vez, o endoblasto vai deslocar o hipoblasto (contendo o inibidor Cereberus), oq permite a continuação da progressão da linha primitiva  Churchill Este fator é importante para parar o avanço da linha primitiva. O processo ocorre do seguinte modo: O hipoblasto (para além do Cereberus) também expressa FGF8 Este vai se acumulando no hipoblasto e atuando no epiblasto até chegar num limiar que vão provocar a ativação do Churchill Por sua vez, o Churchill vai provocar a tivação do Sip1 que vai inibir a progressão da linha primitiva Nota: Brachyury e Tbx6, ambos factores de transcrição que especificam mesoderme Organizador embrionário o organizador embrionário (na galinha é o nó de Hensen ) encontra-se na ponta da linha primitiva, mais especificamente no lábio dorsal do blastóporo é uma fonte de inibidores de BMP e de Wnt o inibidores de BMP: Chordin, Noggin, Sonic hedgehog, Cerberus, Follistatin o inibidores de Wnt: Dickkopf então, basicamente esta região (o organizador embrionário) vai estar inibida de BMP e de Wnt, oq vai permitir organizar o organismo Spemann’s Experiments Neste estudo, foi transplantado a região do lábio dorsal do blastóporo e colocado na região ventral de outro embrião, tendo sido originado um novo embrião Então, observou-se que estas células conseguiram organizar as células que existiam na zona ventral para originar células que originariam um novo embrião Logo, chegou-se à conclusão que o organizador embrionário é capaz de induzir um eixo secundário em tecido competente Por outro lado, também foi observado que as propriedades do organizador variam ao longo do tempo o Por exemplo, um organizador que já tenha induzido a parte do sistema nervoso perde a capacidade de voltar a induzir a sua produção, mesmo que seja transferido para outro embrião Gastrulação É a passagem da bástula pra gástrula Decorre no sentido Anterior -> Posterior, ao longo do tempo Durante este processo há formação de 3 camadas: o Ectoderme – camada mais externa o Mesoderme – camada intermédia o Endoderme – camada mais interna Assim que há formação da linha primitiva, as células do epiblasto vão começar a migrar através dela em direção ao blastocélio o Contudo, antes de migrarem sofrem uma transição epitélio-mesênquima Transição epitélio-mesenquima As células epiteliais estão bem aderias à membrana basal, têm junções entre elas fortes e estáveis Isto tem de ser quebrado pra que as células se desprendam e sejam libertadas da membrana basal Existe um conjunto de proteínas de adesão que estão presentes nas células epiteliais (como por exemplo E-caderina, Desmoplakin, β-catenina e α-catenina) que precisam de ser perdidas e ser substituídas por outras moléculas A migração das células ocorre de forma diferente, dependendo da sua localização inicial o As células da ponta migram no sentido rostral o As células de baixo migram pros lados o Foi descoberto que as primeiras células que migram passam pelo nó de Hensen e originam a endoderme da faringe (tubo digestivo anterior) o As seguintes passam também pelo nó, deslocam-se anteriormente, ficando entre o epiblasto e a endoderme, formando a mesoderme cardíaca, a da cabeça (mesoderme précordal) e a notocorda Então, a ordem de formação e migração das células é: Primeiramente, as células vão formar a endoderme e a mesoderme central/axial As seguintes formam a mesoderme paraxial Depois formam a mesoderme lateral E as últimas formam a mesoderme extraembrionária Nota: os destinos celulares já estão pré definidos ao longo do eixo A-P da linha primitiva - L: lateral - R: rostral - A: anterior - P: posterior - D: distal - V: Ventral Como é que esta movimentação das células ocorre? As células movem-se por quimio-atração o Elas são atraídas por FgF4 e repelidas por FGF8b A zona caudal é rica em FGF8 e a zona rostral é rica em FGF4 Regressão do nó de Hensen Enquanto a mesoderme continua a ingressar, a linha primitiva regride, deslocando o nó de Hensen do centro da área pelúcida para uma posição mais posterior Há medida que o nó de Hensen se move posteriormente, a notocorda vai se formando Nota: Sonic Hedgehog (Shh) é produzido na notocorda Assimetria esquerda-direita A maioria dos nossos órgãos internos são assimétricos Os órgãos assimétricos derivam da endoderme e do folheto esplâncnico da mesoderme lateral - o coração às 7 semanas já tem a curvatura característica, sendo que à 8 semana já tá formado com a sua orientação - a assimetria esquerda- direita começa entre as 5-7 semanas. Contudo, por volta das 3 semanas já temos genes que são expressos de forma assimétrica, nomeadamente no organizador Como é que esta assimetria é originada? O nodal é o principal fator que vai causar esta assimetria o Ele é expresso do lado esquerdo, fazendo com que haja formação de vários órgãos e estruturas importantes, como por exemplo o coração o Foi testado a expressão de nodal de ambos os lados, tendo como resultado a randomização da posição do coração (ou seja, tanto podia ficar do lado esquerdo como do direito) Foi observado que nos ratinhos existem monocílios que rodam na mesma direção, criando um fluxo para a esquerda no meio extracelular - tanto do lado direto como do esquerdo existem células com cílios não móveis, enquanto as células de baixo têm cílios móveis - então, vamos ter um fluxo do lado direito para o esquerdo, originado pelos cílios móveis, que vai empurrar os cílios das células da esquerda, oq provoca uma modificação da estrutura da membrana dos cílios, abrindo os canais de Ca2+. Isto vai permitir a entrada de cálcio nas células - por sua vez isto vai provocar a degradação do mRNA do gene Crl2, um inibidor do Nodal  - na galinha, o Caronte (homólogo do Cerl2) é ativado pelo Shh (Sonic hedgehog) - do lado direto, o Shh não está presente devido à existência de um ativador do BMP: a activina - o BMP por sua vez vai inibir o Shh - O BMP também inibe o fator Nodal - por outro lado, do lado direto vamos ter formação de Fgf8 que vai estimular a expressão de cSnR (snail), um inibidor de Pitx2 - O Pitx2 é um fator expresso do lado esquerdo, por estimulação do fator Nodal Nota: A expressão diferencial de genes no lado esquerdo do embrião ativa assimetricamente uma cascata de expressão genética ao longo do tempo Mesoderme paraxial O fator Nodal é oriundo da parte central do nó e vai estar assimetricamente na mesoderme lateral Contudo, na mesoderme paraxial, este não vai causar assimetria dos órgãos o A mesoderme paraxial dá origem ao esqueleto, músculos… Isto acontece devido à existência de um gene, chamado de terra/ dmrt2 o este vai impedir que o fator nodal atue, não havendo assim assimetria nesta camada Síndrome de Kartagener Nesta síndrome, existe uma mutação na dineína, oq torna os cílios imóveis Se não há movimento dos cílios, a disposição dos órgãos fica randomizada Também vai causar outros problemas: infertilidade nos homens (espermatozoides não conseguem mover-se), origina sinusite e infeções respiratórias (o aparelho respiratório não tem cílios que fazem a limpeza das secreções) Caso 3 – Neurulação Neurulação Ocorre entre a 3ª e 4ª semana É o processo pelo qual as três regiões da ectoderme se tornam morfológicas e funcionalmente distintas A ectoderme vai dar origem à: o Epiderme ▪ Através de altos níveis de BMP o Células da crista neural ▪ Através de níveis intermédios de BMP o Placa/tubo neural ▪ Através de baixos níveis de BMP e expressão de fatores de transcrição Sox É um processo que progride da região anterior para a posterior Processos envolvidos no desenvolvimento do sistema nervoso central Indução da placa neural Formação do tubo neural o Neurulação primária o Neurulação secundária Padronização o Dorso-ventral o Antero-posterior Os morfogénios são extremamente importantes para que estes processo Morfogénios São proteínas produzidas/codificadas através de genes que sofrem muitas modificações que vão implicar a maneira que vão atuar (por exemplo, a Shh precisa de ser alterada através do colesterol) Atuam de maneira parácrina (à distância), em norma Existem 4 grandes grupos: o Wnt o Shh (Sonic hedgehog) o Fgf o TGFβ ▪ BMPs, TGFβs, activina, Nodal o Notch ▪ Delta, Jagged ▪ É o único que atua de forma justácrina A ação depende da: o concentração (gradiente de sinalização) o propriedades da matriz extracelular French Flag Model Lewis Wolpert criou este modelo Ele descobriu que à medida que as células vão se afastando da origem do morfogénio, a concentração do morfogénio vai diminuindo Isto vai fazer com que a respostas das células a estes sejam diferentes - as primeiras células conseguem saturar todos os recetores com os morfogenios - a disponibilidade vai diminuído à medida que nos vamos afastando do local de origem, pelo que as últimas células não conseguem saturar totalmente - esta sinalização (da ligação dos morfogenios aos recetores) é traduzida para dentro da célula, dando origem a mensageiros secundários que - à medida que os mensageiros secundários viajam para o núcleo e ligam-se de acordo com a cinética e afinidade de cada um dos recetores secundários, vamos ter a definição da identidade que cada uma das células vai tomar - logo, não é o morfogene em si que vai determinar a identidade da célula, mas sim a sua concentração Indução da placa neural Há medida que na foice de Kollers começa a ser expresso o Nodal, o hipoblasto começa a lançar sinais que inibem esta sinalização, entre eles o Cerberus Numa região mais anterior do hipoblasto, começa a ser expresso também o Fgf8 O Fgf8 vai ter ação na região mais medial do epiblasto Com esta sinalização e a abolição do sinal do Nodal vamos ter a expressão de dois genes pré-neurais: ERNI e o Sox3 Estes dois genes são fundamentais para que as células do epiblasto comecem a adotar características neuronais Há medida que a mesoderme (que vai dar origem à notocorda) começa-se a formar, através da ação do Fgf8, a mesoderme começa a lançar sinais: Bra e o Tbx6L Estes dois fatores vão auxiliar na indução da formação da placa neural na zona anterior Os fatores ERNI e Sox3 também vão ter um papel importante na formação da placa neural: o Estes vão ser os responsáveis por ativar a expressão Churchill que, por sua vez, ativa o Sip1 (SMAD- interacting protein), proteína que vai ser responsável pela paragem do avanço da linha primitiva A partir deste momento a notocorda vai ter o papel principal para a formação da placa neural A Sip1 vai interagir com a SMAD1, oq modela a sinalização do BMP Nota: a parte mais cefálica é originada através da sinalização do Fgf8. A notocorda vai ser importante para a formação da placa neural Organizador embrionário fonte de inibidores de BMP e de Wnts responsáveis pela indução da placa neural Através de uma experiência, foi verificado que na zona onde o Noggin é expresso não vai haver capacidade de expressão do BMP7 nem do Smad1 (componente essencial para a expressão de Smad1 É esta zona (região antero-central do epiblasto) onde há expressão do Noggin que vai originar a placa neural Sinalização FGF/BMP/WNT - as células que estão na zona medial do epiblasto vão estar submetidas à sinalização de FGFs, dando origem ao epitélio neuronal - as células da zona lateral estão sob influência do WNT. Este vai inibir a sinalização de FGFs. Isto vai permitir que haja sinalização de BMP, dando origem à epiderme  Nota: A especificação neural é reversível no início da gastrulação o Podemos alterar a expressão de células neurais ou a formação da epiderme A especificação neural é irreversível no final da gastrulação o Não é possível alterar o destino das células, devido a estas já estarem “comprometidas” Formação do tubo neuronal Depois da especificação, o tecido necessita de sofrer modificações morfogénicas para passar de uma estrutura bidimensional para uma estrutura tridimensional Este processo envolve várias etapas: o Primeiramente vamos ter a elongação e folding: ▪ Enquanto temos divisão celular da epiderme, vai ocorrer extensão das células da placa neural, alargando o espaço. Isto provoca um alongamento da placa neural, oq empurra as outras camadas adjacentes ▪ Por sua vez, a notocorda vai “ligar-se” (com alguma rigidez) à zona mais medial da placa neural: Medial Hinge Point (MHP) ▪ As forças físicas da divisão celular da epiderme vão empurrar as outras células ▪ Ao mesmo tempo, as células da MHP vão receber sinais para mudar a sua forma de maneira que façam com que haja constrição destas células o Este processo de constrição vai provocar a elevação da crista neural o Com o decorrer das forças físicas da divisão celular da epiderme e da constrição das células da região MHP, a vai ser promovida a dobra da placa neuronal, oq faz com que as pontas do futuro tubo (bordas da placa neuronal) comecem a convergir, oq irá formar o tubo neural o Ao mesmo tempo, com esta convergência vamos ter a formação de outra dobra, desta vez na região Dorsolateral Hinge Point (DLHP) o As células desta região vão começar a constringir, fazendo com que a superfície desta região vá diminuindo o Quando as dobras se juntam vamos ter a formação da epiderme o Entre a camada da epiderme e do tubo neural vamos ter formação das células da crista neural  Importância dos níveis de BMP neste processo São necessários níveis estritamente regulados de BMP para haver formação do tubo neural: o Níveis extremamente elevados inibem a constrição apical das células e, consequentemente, a formação das dobras neurais o Níveis muito reduzidos de sinalização de BMP provocam dobras demasiado acentuadas Nota: isto foi provado através de uma experiência: Quando foi utilizado um recetor constitutivo de BMP (ou seja, há expressão contínua de BMP) a placa neural não dobrava, ficava reta Por outro lado, quando foi utilizado um recetor dominante recetivo (captura todos os elementos que participam na sinalização de um determinado gene, não sendo capaz de traduzir o sinal) houve um fechamento exagerado da placa - no MHP vamos ter a ação do Shh (produzido pela notocorda) que vai baixar os níveis de BMP - nas zonas que vão dar origem ao DLHP vamos ter a secreção de Noggin, que vai impedir que a sinalização do BMP seja máxima - o BMP é secretado pela epiderme - é a interação destes fatores que vai fazer com que os níveis de BMP sejam os ideias em cada região  - as células que fazem a divisão entre os dois tecidos começam a expressar Notch - as células da epiderme imediatamente ao lado destas vão expressar o fator Delta - com o avançar o processo (sinalização de BMP e das forças físicas) vamos ter a expressão de marcadores específicos da crista neural: Msx1/2 e o Snail2 - é isto que vai permitir a diferenciação das células epiteliais em células mesenquimais (são estas células que conseguem migrar) Moléculas de adesão As células têm um “código tridimensional” que faz com que só determinadas moléculas liguem-se em determinadas células As caderinas são proteínas de adesão que vão ser importantes para regular as moléculas que se vão ligar nas células o As células epiteliais vão expressar a E-caderina o As células da placa neural vão expressar a N-caderina À medida que os BMPs vão fazendo a sua ação e que ocorrem estes movimentos morfogénicos do tubo os tecidos vão se afastando São as caderinas que vão permitir que haja ligação da epiderme com a epiderme e do tecido neural com o tecido neural o Isto permite que haja o fechamento do tubo neural e a formação da camada da epiderme - assim que o tubo fecha, as células que irão originar a crista neural deixam de expressar E-caderina e começam a expressar a caderina-6B - é o fator Snail2 que faz com que a E-caderina deixe de ser expressa - isto vai permitir a dispersam/migração das células percursoras da crista neural Células da crista neural Inicialmente vamos ter células a expressar dois genes: GBX2 e AP2A (marcadores do … neural crest cells DÚVIDAAAAAAAAAA) À medida que a dobra vai se formando e que os sinais de WNT, FGF, BMP e Notch vai ocorrendo, as células (que irão dar origem às células da crista neural) vão se especificando, havendo expressão dos fatores Sox2, AP2A, PAX3, ZIC1/2 e MSX1/2 Assim que o tubo neural está praticamente fechado (o tubo neural só fecha quando as células do tubo neural saem), vamos ter a expressão de genes para a diferenciação de células epitelial em células da mesoderme, permitindo que as células migrem. Este processo é chamado de delaminação o Para que isto aconteça é extremamente importante a expressão do SNAIL, FOXD3, do TWIST e do SLUG – estes genes vão ativar todos os outros genes necessários para que ocorra a migração celular A partir deste momento, as células da crista neural SOX9 e principalmente SOX10 o O SOX10 é o marcador universal da crista neural o Sem este, as células não conseguem diferenciar-se neste tipo celular  As células da crista neural são a razão pela qual existem vertebrados As células da crista neural podem dar origem a: Fecho do tubo neural – neurulação primária O modo como se fecha o tubo neural é diferente entre ratinhos e humanos o No ratinho temos 3 pontos de encerramento o No humano temos 5 pontos de encerramento ▪ 1º ponto: entre o romboencéfalo e a espinal medula ▪ 2º ponto: ao nível do diencéfalo ▪ 3º ponto: na região mais anterior do cérebro ▪ 4º ponto: mais ou menos a meio do romboencéfalo ▪ 5º ponto: encerramento do neuroporo posterior São as caderinas que vão mediar este fecho  - as células vão criar processos citoplasmáticos umas para as outras - através destes as células vão se identificar, oq permite constituir uma rede - as células vão ser puxadas umas para as outras. Ao mesmo tempo o tecido lateral da epiderme está a dividir-se e a empurrar as células -este processo vai permitir que o tubo neural feche Tanto em humanos como em galinha, a formação do tubo neural está dividida em 3 partes: Neurulação primária – fechamento do tubo neural na região rostral Neurulação secundária – as células da mesoderme condenção, passando de células mesenquimais para células epiteliais, na região mais caudal. Estas vão constituir o tubo neural Zona de transição – temos um misto dos dois processos Neurulação secundária A neurulação não termina com o fecho do tubo neural Especialmente em animais que têm caudas, existe a necessidade de um outro mecanismo em regiões mais posteriores que permita a formação da espinal medula de modo a promover a inervação nessa região Em nós também acontece, contudo nós acabamos por perder a cauda o Existe um momento que o embrião humano tem uma cauda. Contudo, acabamos por perder devido a atuação de determinados genes Depois da neurulação primária vamos ter a secundária: o Vamos ter condensação de células mesenquimais em epiteliais o Vamos ter a formação da zona de transição mesênquima-epilélio (ocorre no sentido dorsal-ventral) o Estas células vão dar origem ao tubo neural, através do processo de cavitação  No ratinho não temos uma zona de transição o Vai ocorrer a junção dos dois tubos neuronais NMP Na zona caudal existem umas células, chamadas progenitores neuro- mesodermais Eles podem originar os dois tipos celulares: células mesodermais e células epiteliais (células neuronais) Vão ser responsáveis pela formação da mesoderme e do tubo neural posterior A diferenciação destas células vai resultar da interação entre o RA, o fgf8 e o Wnt3a o Eles vão estabelecer um gradiente transversal e longitudinal o As células NMP que vão estar sob a ação do fgf8 e do Wnt3a vão começar a expressar o Tbx6. Este, por sua vez, vai inibir a expressão do fator neural Sox2, oq redireciona estas células mesodermal. Estas células migram lateralmente e anteriormente, através da região paraxial da mesoderme, onde se vão diferenciar em células paraxiais da mesoderme, precursoras de somitos o As células sob o efeito do RA (ácido retanoico) vão ser induzidas a expressar Sox2. Elas vão migrar para uma região mais central, juntando-se com o neuroepitélio a ser desenvolvido  - no ratinho em que o Tbx6 foi retirado, observou-se na região caudal a formação de 3 tubos neurais. Isto acontece devido ao Sox2 não ser reprimido Padronização do sistema nervoso central Começa com a gastrulação As células quando vão ingressar para formarem a mesoderme, elas recebem instruções dos genes HOX para saberem que caminho vão seguir o Estes genes definem a identidade de cada segmento o Todos os animais segmentados expressam e usam este sistema de genes para estabelecer todos os segmentos do corpo o A identidade de cada um destes segmentos é fornecida pela expressão de 1 ou pela combinação da expressão de vários genes HOX ao mesmo tempo Padronização antero-posterior do SNC Os genes HOX têm um papel importante na padronização A-P o A expressão destes genes ocorre na direção 3’ para 5’ o Os primeiros genes a serem expressos são os mais anteriores o Os últimos a serem expressos são os que se localizam na região mais posterior Os genes HOX têm colinearidade espacial e temporal o A distribuição A-P da expressão e o momento de ativação dos genes Hox obedece à sua ordenação em clusters no genoma o Ou seja, isto significa que os genes que estão na posição 3’ são expressos no momento da ingressão das células na cástula Este processo é derivado do gradiente de 3 fatores: o ácido retinoico (RA), FGF e o WNT Estes genes são regulados através de repressão o os clusters inicialmente estão a ser reprimidos através da metilação da histona K27me3 o Inicialmente, vamos ter apenas ativação do primeiro gene HOX do cluster (na zona 3’) o Logo, as células que vão ter este gene ativado vão saber que vão se localizar anteriormente Esta repressão e ativação é mediada por dois grupos: o Policomb clomplex – principal repressor dos clusters ▪ Faz metilações mediadas pela lisina 27 da histona 3 oq reprime os genes HOX o Tritorax – principal ativador dos clusters ▪ Faz metilações mediadas pela lisina 4 da histona 3 Isto permite a ativação do cluster Estes mecanismos permite fazer com que hajam neurónios específicos para cada zona do nosso organismo A padronização da A-P é essencial para a coordenação do SNC com outras estruturas corporais, como o esqueleto e músculos, derivados da mesoderme Padronização D-V do SNC O SNC tem uma polaridade dorso-ventral o Na região dorsal nós temos toda a parte sensorinal enquanto que na parte ventral temos toda a parte motora (?????? Não percebi oq o stor disse) A sinalização de BMPs, Wnt e Shh é responsável por esta padronização D-V o BMPs e Wnt – assumem uma padronização dorsal o Shh – assumem uma padronização ventral a partir da notocorda ▪ Este vai ser responsável pela padronização de neurónios na zona ventral da espinal medula, envolvidos nas funções motoras ▪ Esta região ficou conhecida como floor plate ▪ Os níveis de Shh não são constantes ao longo do tempo. Isto é que vai dar a diversidade de populações de neurónios (o tempo e concentração de Shh determinam a identidade das células neuroprogenitoras ventrais  - Padronização ventral - inicialmente, o Pax6 é expresso em grandes quantidades, quando existe uma baixa concentração de Shh - à medida que a concentração do Shh vai aumentando, vamos tendo um aumento da atividade da Gli (mensageiro secundário do Shh). Isto vai provocar a ativação do gene Olig2, que é responsável por restringir a população de células Pax6 à zona dorsal (ou seja, vai inibir o Pax6 na zona ventral) - por sua vez, vamos ter também a ativação do gene Nkx2.2 - quando os níveis de Shh são muito elevados, vamos ter uma inibição do Olig2 na zona ventral. Contudo, na região intermédia, os níveis de Gli não são suficientes para ativar completamente o Nk2.2, não havendo por isso inibição do Olig - Padronização dorsal Na zona dorsal temos outro gradiente produzido através dos BMPs e Wnt o O BMP4 e 7 assumem um papel relevante Nesta zona vamos ter a produção de neurónios sensoriais - inicialmente vamos ter sinalização de BMp4 e 7, oriundo da epiderme - esta sinalização vai induzir a formação da roof plate no teto dorsal - o roof plate vai começar a expressar BMP4, 7, 5, dorsalina e activina) - vai ser a combinação destes morfogenes da família TGF-β ( BMP4, 7, 5, dorsalina e activina) que vão dar origem a todos os neurónios sensoriais dorsais - na zona dorsal vai haver expressão de Pax7, Dbx2 e Nkx6.1 - a combinação destes fatores/genes vai criar um gradiente  Estes processos ocorrem todos em simultâneo Ocorre no sentido anterior para posterior Quando a neurulação primária está a ocorrer na região encefálica, a gastrulação e os primeiros passos da indução neuronal ainda estão a ocorrer É a integração e coordenação de todos estes processos antero-posterior que vai fazer com que haja desenvolvimento e formação do tecido nervoso central e à neurulação nos embriões Caso 4 – Diferenciação da Mesoderme Paraxial: Somitogénese Somitogénese Existe uma estreita coordenação do crescimento e padronização dos tecidos embrionários ao longo do tempo: Tubo Neural e Mesoderme Paraxial A parte posterior tem células precursoras neuro-mesodermais (NMPs) (têm capacidade de dar origem ao tubo neural (neurulação secundária) e a mesoderme paraxial) Os sómitos são derivados da mesoderme paraxial Estes por sua vez vão dar origem a: cartilagem (slcerotome), tendões (syndotome) musculo esquelético (myotome), células endoteliais e derme (dermatome, que pode dar origem também ao músculo esquelético) Sómitos Estruturas epiteliais esférias geradas ao longo do eixo rostro-caudal Os sómitos foram-se aos pares e com uma periocidade muito característica de cada espécie O nº de pares de sómitos é constante e característico da espécie O seu tempo de formação é constante e característico da espécie Simultaneamente, novas células ingressam na mesoderme presomítica (PSM) posterior, gerando um gradiente de diferenciação Segmentação do embrião vertebrado Existe uma precisão temporal e espacial para a formação dos sómitos Asa células da mesoderme pré-somítica (PSM) têm informação de posição dos sómitos Relógio molecular da somitogénese Para as células/tecido perceber que passou tempo, tem de haver alternância de estados A expressão do gene hairy 1 é muito variável na PSM de embriões no mesmo estadio de desenvolvimento o Para se ver o efeito deste gene, foi feito um estudo em que se utilizou a técnica hibridação in situ o Foi marcado com roxo (não é necessário ser essa cor) as células que estão a produzir o mRNA o Com isto, foi observado que a expressão de hairy1 é muito variável, sendo recapitulado com a formação de um novo sómito Existem 3 níveis de funcionamento do relógio: o Nível basal: osciladores intracelulares ▪ Passa-se dentro da célula, isolado o Nível intermédio: sincronização local ▪ É oq se passa a nível das células vizinhas o Nível superior: controlo global – abrandamento e paragem ▪ É oq ocorre a nível de todo o organismo - Nível basal Existe a ativação dos genes hes1 e hes4, oq provoca a produção de mRNA Este vai ser traduzido, resultando numa proteína, fator de transcrição, que vai entrar no núcleo e reprimir a sua própria transcrição Este mRNA e esta proteína são degradadas muito facilmente, têm um tempo de semi-vida muito curto Se o mRNA for degradado, a proteína vai deixar de ser produzida. A que existe vai ser também degradada, pelo que os genes hes deixam de ser reprimidos O processo volte a repetir-se É um oscilador intracelular autónomo - Nível intermédio É necessário que haja sincronia nestas oscilações entre as células vizinhas Esta sincronização dá-se por sincronização justácrina Notch/Delta Existem outras vias que participam neste sistema: via de sinalização Wnt, FGF… As vias não são síncronas o Por exemplo, recentemente viu-se que quando o Wnt e o FGF estavam em fase o Notch estava em antifase o Estas diferenças de fase são essenciais para que haja a segmentação - Nível superior Então, existe um oscilador intracelular autónomo e sincronização entre células vizinhas É necessário que exista um mecanismo que trave estas oscilações: Wavefront - antes da formação de uma fenda fisiológica entre sómitos, as oscilações param e o tecido passa a ter a capacidade de se segmentar - é na parte anterior que vai ocorrer a segmentação Modelo Clock and Wavefront da Somitogénese Fgf8 – fator de sinalização parácrino, expresso na parte caudal Ácido retinóico (RA) – expresso na parte anterior Estes dois fatores são antagonistas um do outro, inibindo-se mutuamente - vamos ter um relógio que é ativado e reprimido periodicamente, que vai regular a expressão de genes que controlam a segmentação dos sómitos - vamos ter um gradiente de FGF/Wnt, originado na zona caudal, que provoca o crescimento celular. Estes fatores vão manter as células indiferenciadas e em proliferação A wavefront delimita a PSM determinada (já comprometida com a formação de sómitos) e a PSM não-determinada (onde as células ainda estão sob influência do gradiente de FGF/Wnt e não definiram sua identidade) o Neste limite, a zona da PSM já irá ter os limites dos sómitos formados, tem a identidade do sómito formada: limite anterior e limite posterior Este limite localiza-se em S-III O relógio molecular e a wavefront só “funcionam” até ao limite Tamanho do sómito O tamanho do sómito depende: o Da velocidade de regressão ou do posicionamento da wavefront ▪ Por exemplo, alterações no gradiente de Fgf8 modificam o tamanho dos sómitos ▪ Se o gradiente de fgf8 deste for estendido mais para cima (posição mais anterior), mantendo-se em cima durante mais tempo, vamos ter sómitos menores. A wavefront vai regredir mais devagar, pelo que os sómitos irão ser menores ▪ (exemplo da stora: tem uma fila de alunos que vai abrindo e fechando os olhos. O sol vai se movimentando. Quando os alunos estão ao sol e abrem os olhos, temos a “formação de um sómito”. Se o sol movimentar- se mais devagar e a velocidade de fechar os olhos for igual, os sómitos vão ser menores.) o Da frequência da oscilação ▪ Alterações à frequência do relógio modificam o tamanho dos sómitos ▪ Por exemplo, se a velocidade/freq das oscilações for maior, vamos ter um maior número de sómitos, mas com tamanho menor - SU5402 – inibidor da wavefront Mecanismos de sinalização A formação de um novo sómito envolve uma transição mesênquima-epitélio Na formação do sómito temos primeiro a formação da fenda posterior e só depois é que o sómito organiza-se na forma de esfera Quando o gradiente da wavefront já se deslocou pra longe da PSM determinada, dá se a ativação dos genes Mesp o Estes genes só são expressos na zona anterior no limite da wavefront Os genes Mesp são ativos quando: o Os níveis de Notch são altos o Os níveis de Fgf8 e p-Erk são baixos ▪ p-Erk: o Fgf8 vai ligar-se a recetores das membranas das células, oq provoca a fosforilação do Erk, um efetor nuclear. Este, tal como o fgf8, também sofre de feedback negativo, havendo por isso oscilação ▪ Níveis altos de p-Erk mantêm as células indiferenciadas e na região da PSM não-determinada O Mesp, ao ser expresso, vai haver tradução de mRNA e, por sua vez, este vai ser traduzido numa proteína: Ripply O Mesp também vai inativar o Notch O Ripply vai inibir o Tbx6 Ao deixar de haver Tbx6 a PSM deixa de ter características de não-determinada (ou seja, não segmentada e imatura) e passa a ser determinada, permitindo assim que haja a formação de sómitos (retângulo vermelho a tracejado na imagem): - essas células vão ficar agregadas no mesmo sómito quando este for formado - o tecido já tem uma segmentação molecular antes de ter uma segmentação física - já há um conjunto de células que têm características comuns, oq faz com que elas fiquem agregadas no mesmo sómito  Para haver a formação da fenda: o O Mesp vai ativar o gene Eph-A4 (células da parte anterior) o Este gene, por sua vez, ativa nas células adjacentes a expressão de Ephrin B2 (células da parte posterior) o As células que expressão Eph-A4 ou Ephrin B2 repulsam-se entre si o A Ephrin B2 vai ativar também proteínas da matriz (integrinas, fibronectinas…) e vai inibir um inibidor (Cdc42) da epitelização Então, esta cascata vai provocar: o a repulsão das células da mesoderme não segmentadas do sómito o a formação da matriz extracelular necessária para a transição mesênquima epitélio Isto vai originar o sómito Diferenciação do sómito Os sómitos vão dar origem a várias estruturas: músculos, tendões, derme, ossos… Logo, tem de haver mecanismos que façam com que haja diferenciação nestas estruturas O sómito está rodeado por outros tecidos: tubo neural, ectoderme, notocorda, mesoderme lateral Por consequência, também está sujeita a uma sinalização muito rica: o A ectoderme secreta BMPs e Wnt o A notocorda e o floor plate (parte ventral) secretam Shh o A mesoderme lateral secreta BMPs O Shh vai fazer com que a zona do somito junto do tubo neural (zona ventromedial) volte a ter uma transição epitélio-mesenquima o Isto vai tornar estas células altamente migratórias o Esta zona vai denominar-se de esclerótomo o Origina o osso e cartilagem o Isto ocorre devido ao Shh ativar o PAX1  O Wnt vai fazer com que as características epiteliais se mantenham na zona dorsal do sómito. Esta zona vai denominar-se de dermomiotomo o Origina o músculo e a derme o Isto é possível devido ao Wnt ativar o PAX3 o As células das pontas do dermomiotomo vão dar origem a dois tipos de músculos: ▪ Músculo epaxial (sinalização apenas de Wnt) ▪ Músculo hipaxial (sinalização de Wnt e BMP/FGF) As células dos sómitos são muito migratórias As células da parte ventral migram à volta da notocorda, rodeando esta o Vão originar o corpo da vertebra Também há migração de células da parte dorsal para o tubo neural o Dá origem ao processo espinhoso o A notocorda é uma estrutura embrionária transitória, que vai maturar e vai integrar o núcleo polposo do disco intervertebral As células mais laterais vão migrar e dar origem às costelas Sindetoma – conjunto de células muito pequeno que vão dar origem aos tendões  - não há 1 esclerótomo que vai originar 1 vértebra. Os esclerótomos vão se re-segmentar - a vértebra adulta vai resultar da parte posterior de um sómito com a parte anterior do anterior do sómito seguinte - esta re-segmentação só ocorre com o esclerótomo - isto vai permitir que os corpos vertebrais estejam intercalados com músculos e tendões Formação do sistema nervoso periférico As células da crista neural vão migrar para formarem o sistema nervoso periférico Durante a migração elas vão encontrar os sómitos com propriedades diferentes, dependendo da zona: o Zonas com efrinas o Zonas sem efrinas Elas só vão conseguir migrar pelas zonas sem efrina o A efrina é uma repulsora das células da crista neural Isto vai fazer com que só haja formação de terminais nervosos e axónios em regiões mais anteriores dos sómitos Logo, as diferenças de expressão A/P de Efrinas nos sómitos impõem uma segmentação ao Sistema Nervoso Periférico ao condicionarem a migração das células da crista neural Mutações em genes da Somitogénese Estão associadas a malformações congénitas humanas Por exemplo, a Disotose Espondilocostal o Malformação congénica no esqueleto axial o Pessoas com estas deficiências têm mutações nos genes DLL3, MESP2, LFNG, HES7, TBX6 e RIPPLY2 o Normalmente tem de ser em homozigotia. Em heterozigotia normalmente não origina esta patologia Genes HOX Muitas vértebras diferentes são formadas a partir de sómitos morfologicamente iguais A padronização destas células (que vão dar origem às vertebras) é feita a partir dos genes HOX Clusters: é quando os genes estão alinhados num único cromossoma o Nos humanos temos 4 clusters de genes HOX responsáveis pela padronização das vértebras Colineariedade espacial: relação entre a ordem dos genes Hox no cromossoma e a região do corpo onde eles são expressos o Por exemplo, os genes 1,2 e 3 são expressos na zona anterior enquanto os genes 11, 12 e 13 são expressos na zona posterior Colinearidade temporal: relação entre a posição dos genes Hox no cluster e o momento em que eles são ativados durante o desenvolvimento o Por exemplo, os genes 1,2 e 3 são ativados, durante o desenvolvimento embrionário, muito mais cedo que os outros A ordem de ativação dos genes Hox (TEMPO) impõe a sua distribuição no ESPAÇO o Pensa-se que a espacial resulta da temporal  A colinearidade Temporal dos genes Hox envolve modificações conformacionais da cromatina ao longo do tempo, mediadas por alterações epigenéticas às histonas o Vai havendo descondensações da cromatina ao longo do tempo, por ordem (primeiro ficam os primeiros genes descondensados) o Contudo, ainda não se sabe oq controla este mecanismo Cada vertebra vai ter uma assinatura de genes HOX (conjunto de genes HOX diferentes) - por exemplo, no ratinho oq distingue as vertebras toráxias das lombares é a presença de costelas - o gene responsável por isto é o HOX a10, que é comum em todas as lombares - foi feito um experimento para comprovar isto. Ao retirarem o gene HOX a10 foi observado que todas as vertebras continham costelas. Ao adicionarem este gene em todo o lado foi observado que o ratinho não continha costelas (coiso que resume mais ou menos esta T que tá no último slide) Caso 5 - Desenvolvimento do membro Desenvolvimento do membro O botão do membro está presente à 4ª semana de desenvolvimento (que é a 6ª semana de gravidez) Inicialmente o membro cresce próximo-distalmente como uma massa uniforme de tecido Só na 8ª semana (10ª semana da gravidez) é que temos os dígitos totalmente formados As regiões mais centrais vão estar protegidas da sinalização de Fgf8 – estas regiões já vão entrar num processo de diferenciação Por outro lado, as regiões mais distais vamos ter a expressão de fgf8, havendo por isso proliferação celular Origem dos diferentes tipos de células do membro Os diferentes tipos de células migram para dentro do botão do membro à medida que este se forma o As células que vão formar a músculo advêm do somito, mais especificamente do miótomo o Vamos ter células da crista neural e do tubo neural que vão formar a enervação do membro a nível axial o Os melanócitos também advêm da crista neural Como se inicia o crescimento do botão do membro? A expressão de FGF10 na mesoderme lateral define as regiões dos membros superior e inferior o Quando se começa a ver alguma diferença na mesoderme lateral nas zonas que vão originar os membros temos a expressão de FGF10 o Morfologicamente quase não se deteta o botão O FGF10 vai: o Ativar a divisão celular o Contribuir para transição epitélio-mesenquima das células da base da somatopleura ▪ Contudo, não é só este fator que vai ser importante para esta transição o Levar à expressão de FGF8 na ectoderme, através da ativação de Wnt3a ▪ Este por sua vez vai difundir para a mesoderme lateral, contribuindo para a expressão de FGF10. Vai ser então importante para manter a expressão de FGF10 – mecanismo de feedback positivo ▪ Este mecanismo de feedback positivo vai ser importante para garantir o crescimento do tecido Nota: A expressão de FGF10 é suficiente para que haja expressão de um membro supranumerário O que distingue o membro superior do membro inferior? Oq difere os dois membros são dois fatores de transcrição da família Tbx: Tbx5 e Tbx4 o O Tbx5 é exclusivamente expresso nos membros anteriores o O Tbx4 nos membros posteriores Pensa-se que o Pitx1 vai ser o responsável pela expressão de Tbx4 O RA vai ser responsável pela expressão de Tbx5 o contudo, o RA sozinho não iria conseguir fazer com que houvesse expressão de Tbx5 - As regiões mais centrais vão estar protegidas da sinalização de Fgf8 – estas regiões já vão entrar num processo de diferenciação. É o RA que vai inibir o fgf8 - Por outro lado, as regiões mais distais vamos ter a expressão de fgf8, havendo por isso proliferação celular Genes Hox Estes genes Hox vão ser importantes para a especificação das regiões de formação dos membros O Hox4 vai criar uma condição permissiva para a ativação de Tbx5 por RA Abaixo da região de formação do membro superior tem de haver sinais que inibem a expressão de Tbx5 o O Hox9 vai inibir a expressão de Tbx5 O Hox9 sobrepõe a sua ação inibitória à ação ativadora do Hox4 – dominância posterior dos Hoxs Notas: Ainda não se identificou nenhum gene Hox que tenha um papel fundamental na formação dos membros inferiores A expressão dos Hoxs é definida durante a gastrulação Desenvolvimento das estruturas do membro ao longo dos 3 eixos Temos 3 eixos diferentes: Proximo - Distal Antero - Posterior Dorso - Ventral Eixo proximo-distal (P-D) Este eixo depende muito de uma estrutura localizada na parte mais distal do membro: crista ectodérmica apical (AER) (apical ectodermal ridge) o A AER é a zona mais espessa, na ponta distal o Na AER temos a expressão de fgf8 o Foi feito um experimento em que se retirou esta região de um embrião. Observou-se que o membro não continua a crescer. Por outro lado, fez-se a mesma experiência, contudo adicionou-se o fgf8, oq permitiu o desenvolvimento do membro. Isto informou-nos que a propriedade mais importante da AER (pelo menos para o crescimento proximo-distal do membro) é a expressão de fgf8 O fgf8 secretado pela AER vai ser importante para manter as células do mesênquima localizadas na zona de progresso (PZ) indeferenciadas e proliferativas, através da indução de fgf10 (vai manter a sua expressão na zona de progresso) o Isto vai permitir o prolongamento do botão do membro Existem vários modelos que explicam a padfronização próximo-distal do membro, sendo 2 deles: Two Gradient Model e Progress Zone Model Notas: Hemimelia: pode ser explicada por falhas nestes mecanismos, mas é algo que ainda não se sabe ao certo) - Two Gradient Model Na parte mais distal temos fgf8 e na parte mais proximal temos RA Este modelo propõe que as células na zona do tronco estão sob a ação de níveis de ácido retinóico elevados e níveis de fgf8 mais baixos Estes níveis elevados de RA vão levar à expressão de genes específicos de estruturas proximais ao tronco: os genes Meis À medida que o membro cresce as células mais distais vão ficando mais afastadas da fonte de RA. Por outro lado, vão começar a receber níveis de fgf8 da AER cada vez mais superiores. Logo, estas células mais distais, longe da atividade do RA, irão dar origem a estruturas distais O desenvolvimento da estrutura do meio do membro ainda não está bem clarificado por este modelo o Este modelo diz que a estrutura do meio forma-se quando há níveis intermédios dos dois gradientes Para além dos genes Meis (importantes para a formação de estruturas proximais) vamos ter outros genes importantes na formação de estruturas de outras zonas: o Hox11 – zona intermédia o Hox13 – zona distal Este modelo propõe que os níveis de RA, FGFs e Wnts é que regulam a expressão de genes Hox, contudo não se sabe ao certo como isto ocorre Maquinaria molecular deste modelo: o Zona proximal: temos RA que vai levar à expressão dos genes Meis1/2. Por sua vez, estes inibem a expressão da enzima Cyp26b1 o Zona distal: vamos ter a expressão de FGFs e Wnts que vão provocar a expressão do gene Hox13 e a ativação da enzima Cyp26b1. Esta enzima vai ser responsável por inibir o RA - Progress Zone Model Este modelo foi proposto antes de ser descoberto o fgf8 Ele propunha que as células em baixo da AER estavam em divisão: zona de progresso Estas células em divisão ativa ao longo do tempo vão mudando a sua identidade Quando as células saiam da AER fixavam a sua identidade Fizeram uma experiência pra comprovar este modelo: o Colocaram a zona de progresso (PZ) de um membro pequeno noutro embrião. Foi observado que aquele tecido deu origem a todas as estruturas do membro o Contudo, quando fizeram o mesmo com células da PZ de um membro mais velho observaram que não foram originadas todas as estruturas, tendo sido só formada a zona distal o Isto comprovou que as células da PZ tem noção do tempo, têm noção de quantas mais divisões celulares têm de fazer até darem origem a todas as estruturas do membro - O relógio molecular do membro O gene hairy 2 é o principal envolvido neste mecanismo Foi observado que a expressão deste gene variava muito com o tempo, na região da zona de progresso o Isto acontece devido a este gene oscilar com uma periodicidade de 6h no membro Contudo, este gene quando em contacto com o RA não oscila. Ou seja, o RA vai provocar uma constante expressão de RA o À medida que o membro cresce, o RA vai tendo cada vez menos ação nos genes hairy 2 o Por consequência, vamos ter um aumento da atuação de FGF. Este vai provocar oscilações do hairy 2 Este modelo ficou conhecido como Integrated Time-Space Model Ao longo do tempo, temos a “transição” do modelo dos dois gradientes para o modelo da zona de progresso (ps: bom que pelo que a stora diz isto ainda não está totalmente provado ;-;) Efeitos teratogénicos da Talidomida Não há crescimento total do membro (focomelias), contudo temos formação das estruturas distais Pensa-se que o modelo da zona de progresso consegue explicar isto o Significa que não há proliferação das células da zona de progresso, contudo as células continuam a contar o tempo. Ou seja, as células vão continuar a diferenciar-se, mesmo não havendo formação de novas células, pelo que as células vão formar estruturas distais Isto acontece devido à talidomida inibir a ação dos FGFs (fgf8 e fgf10) Genes Hox Os genes Hox vão conferir a identidade aos elementos do membro Estabelecimento da Zone of Polarizing Activity (ZPA) Logo no início vamos ter estabelecimento da AER através do mecanismo de feedback positivo o Fgf10 (mesenquima) vai induzir o Wnt3 e fgf8 na AER Com o aumento dos níveis de fgf8 e da proliferação celular vamos ter outros mecanismos que vão formar a ZPA: o O fgf8 vai permitir a expressão de Shh numa zona mais posterior (ZPA) o Não se conhece bem este mecanismo, contudo a hipótese atual é que o fgf8 vai inibir um inibidor do Shh (Etv4/5) Então, a AER, através do fgf8, permite que haja ativação de Shh na ZPA. Por sua vez, o Shh vai ativar um inibidor de um inibidor da ERA o Mecanismo de feedback positivo entre a ZPA e a AER Nota: Shh: Fator parácrino Centro sinalizador na parte posterior do membro Garante a manutenção da ERA Especifica o eixo anterior-posterior  - As células perto da ZPA vão receber uma concentração elevada de Shh e vão adoptar destinos posteriores, enquanto as células que se encontram mais afastadas vão receber uma concentração menor do morfogénio e adoptar destinos anteriores Nota: Morfogénios: Atuam à distância (sinalização parácrina) Ação dependente da concentração (gradientes de sinalização) O Shh produzido pela ZPA vai ser um exemplo de um morfogene Padronização dos dígitos O gradiente de SonicHedgehog produzido pela ZPA é responsável pela identidade dos dígitos o Cada um dos dígitos vai ser padronizado em função da concentração de Shh e do tempo que estão expostas O Shh é o fator essencial para a formação dos dígitos (não é necessário outro fator)  Se se adicionar outra ZPA num embrião vamos ter duplicação dos dígitos Nota: para haver formação de um novo membro tem se haver outra AER e não ZPA (a ZPA não tem capacidade de induzir um novo eixo, apenas novos dígitos) - Polidactilia: É uma anomalia congênita caracterizada pela presença de dedos extras nas mãos, nos pés ou em ambos Padronização Dorso-Ventral (D-V) Na ectoderme dorsal vamos ter a expressão de Wnt7a (é uma camadinha de células) O Wnt7a, por sua vez, ativa no mesenquima o Lmx1b. É este fator que vai ser responsável pela dorsalização A perda do Lmx1b vai provocar a ventralização do membro Engrailed-1 (En1) é expresso na ectoderme ventral e inibe a expressão de Wnt7a na face ventral o O mutante sem este fator vai perder as estruturas ventrais Este fator vai ser induzido pelo BMP Coordenação entre os 3 eixos Progressão e terminação do crescimento do membro FGF mantem a expressão de Shh. Este por sua vez ativa o Grem1 que vai manter a expressão de FGF o O Grem1 é responsável por inibir um inibidor do FGF Contudo, quando temos altas concentrações de FGF, este vai inibir o Grem1 Isto vai fazer com que haja uma diminuição da produção de FGF (o inibidor de FGF não vai ser inibido, conseguindo assim inibir a expressão de FGF) e, como consequência, uma diminuição da produção de Shh Isto vai provocar a perda desta cascata, pelo que vai ser perdida a AER e a ZPA, parando assim a proliferação celular A perda de FGF8 vai ser importante para a separação dos dígitos o FGF8 produzida pela AER previne a apoptose ao inibir RA o Grem1 previne a apoptose ao inibir BMP o Logo, quando estes dois fatores deixarem de existir no tecido interdigiral, vai haver um aumento dos níveis de RA e o BMP que vão provocar a apoptose, permitindo assim que haja separação dos dígitos Contudo, na ponta dos dígitos a AER vai se manter durante mais tempo, devido à presença de TGFβ. Este vai induzir: o SOX9 –diferenciação em cartilagem o CYP26 –degradação de RA Sindactilia e Aracnodactilia Sindactilia – temos uma fusão óssea dos dígitos o Não foi só uma questão de ausência de apoptose Aracnodactilia – não houve uma proteção adequada dos tecidos que não deveriam sofrer apoptose. Os dígitos são muito mais finos, havendo apoptose também na zona da palma da mão