Repetitorium Biochemie I Stoffwechsel PDF

Juli 2023 HMJK REPETITORIUM BIOCHEMIE I ____________________________________________________________________________________ STOFFWECHSEL Die Glykolyse wird nicht durch Glucose allosterisch reguliert. Lactose (Milchzucker) ist ein Dissaccharid, das aus einem Molekül Glukose und einem Molekül Galaktose zusammengesetzt ist. Acetyl-CoA kann grundsätzlich nicht zur Synthese von Glukose eingesetzt werden, weder im Rahmen der Glukoneogenese noch durch einen anderen menschlichen Stoﬀwechselweg. Der Km-Wert (MIchaelis-Konstante) eines Enzyms gibt an, bei welcher Substratkonzentration die halbe Maximalgeschwindigkeit der Umsetzung erreicht wird. Der Km-Wert ist also ein Maß für die Substrataﬃnität (je kleiner der Km-Wert, desto größer die Aﬃnität), aber nicht für die Umsatzgeschwindigkeit. Disulfidbrücken werden von Cystein-Resten in der Peptidkette ausgebildet. Ohne Cystein in der Kette, können also keine Disulfidbrücken gebildet werden. Lipoproteine dienen der Verteilung und Rückführung (zur Leber) lipophiler Stoﬀe. Man findet sie in Blut und Lymphe, sie sind aber nicht Bestandteil von Membranen (dort findet man nämlich stattdessen die verschiedenen Gruppen der Membranlipide). Chylomikronen werden von den Enterozyten hergestellt und danach in die Lymphe abgegeben. Über den Ductus thoracicus erreichen sie schließlich die Blutbahn. Alle anderen Typen von Lipoproteinen werden hingegen von der Leber gebildet oder sind Abbauprodukte der ursprünglich von der Leber synthetisierten Lipoprotein-Varianten. Lipide in Lipoproteinen sind immer und ausschließlich hydrophob. In der Atmungskette werden von Komplex zu Komplex Elektronen weitergegeben. Glkcose und Fructose sind Strukturisomere, d.h. sie haben dieselbe Summenformel. Beide sind Hexosen, haben also sechs C-Atome. Glycerin-3-phosphat ist kein modifizierter Zucker. Cholesterin wird in der Zelle in Form von unpolaren Cholesterinestern gespeichert, die sich im Zytosol zu Lipidtröpfchen zusammenlagern. Zur Biosynthese des Cholesterins werden ausreichenede Mengen von Acetyl-CoA, ATP und NADPH benötigt. Das Schlüsselenzym der Cholesterin-Biosynthese ist die HMG-CoA-Reductase [3-Hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA- Reductase]. Es wird durch Statine kompetetiv gehemmt. Sekundäre Gallensäuren enthalten keine konjugierte Aminosäure mehr, also kein Glycin oder Taurin. Phosphatidylinositol gehört zur Gruppe der Glycerophospholipide. Die Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase (LCAT) wird durch das Apoprotein A-I aktiviert. Wird ein Cerebrosid vollständig hydrolasiert, so erhält man Sphingosin, einen Kohlenhydratrest und eine Fettsäure. Ölsaeure ist eine einfach ungesättigte Fettsäure, die nicht essentiell ist. Die Zellen des braunen Fettgewebes haben ein plurivakuläres Zellplasma. Page 1 of 26 Juli 2023 HMJK Glucose-6-phosphatase ist nicht im Zytosol, sondern im Endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisiert. Die von-Gierke-Krankheit beruht auf einem Defekt des Enzyms Glucose-6-phosphatase. Die Glykogen-Synthase verknüpft aktivierte Glucose-Einheiten mit 1,4-glykosischen Bindungen. Die Glykogen-Phosphorylase spaltet die Bindungen zwischen den Zuckermolekülen phosphorolytisch, so dass Glucose-1-phosphat entsteht. Das Enzym Glucose-6-phosphatase kommt nur in Leber und Niere vor (nämlich den beiden Organen, die zur Glukoneogenese befähigt sind, Die Freisetzung von Insulin führt zur Aktivierung der Glykogen-Synthase. Die TAG-Lipase (Triacylglycerin-Lipase) wird auch “hormonsensitive” Lipkes genannt, weil sie durch Adrenalin und Glukagon aktiviert wird. Zum Aufbau von TAG benötigen die Adipozyten Glycerin. Dieses wird aus einem Zwischenprodukt der Glykolyse hergestellt. Beim Abbau eines Moleküls Acetyl-CoA im Citratzyklus entstehen zwei Moleküle CO2. Fettsäuren werden zu Acetyl-CoA abgebaut, was nachfolgend in den Citratzyklus eingeschleust werden kann. Da aus Acetyl-CoA keine Glucose aufgebaut werden kann, lässt sich aus dem Abbau von Fettsäuren keine Glukoneogenese betreiben. Einzige (praktisch aber irrelevante Ausnahme) sind ungeradzahlige Fettsäuren, bei deren Abbau neben Acetyl-CoA auch ein Molekül Propionyl-CoA entsteht, welches in die Glukoneogenese eingeschleust werden kann. Bei der oxidativen Phosphorylierung wird ADP zu ATP phosphoryliert. Der tägliche Umsatz an ATP liegt etwa bei der halben Körpermasse. Die Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase reduziert Dihydroxyacetonphosphat zu Glycerin-3- phosphat, einen Metaboliten der Synthese von TAGs (Triacylglycerinen, Neutralfetten) und verknüpft so die Kohlenhydrat- mit dem Lipidstoﬀwechsel. Sie ist daher ein wichtiges Enzym im Stoﬀwechsel der Adipozyten im Fettgewebe. Die Glycerinkinase, die ebenfalls die Bildung von Glycerin-3-phosphat katalysiert, wird hingegen nur in Leber und Niere exprimiert. Die LDH (Lactat-Dehydrogenase) katalysiert den letzten Schritt der anaeroben Glykolyse, nämlich die Umwandlung von Pyruvat in Lactat. Die Zelle kann in der Glykolyse pro Molekül Glucose netto zwei Moleküle ATP gewinnen. Im Pentosephosphatweg wird kein ATP generiert. Der Phosphatrest an Position 1 des 1,3-Bisphosphoglycerats kann direkt auf ein ADP übertragen werden (gemischtes Säureanhydrid, “energiereiche” Bindung). Es handelt sich um eine Substratkettenphosphorlylierung. Zur Glokogensynthese wird Glykogenin als Startpunkt benötigt. Glukagon stimuliert den Abbau von Glykogen durch die Glykogenphosphorylase. In dieser Reaktion wird kein Wasser, sondern Phosphat benötigt. Es handelt sich um eine Phosphorolyse, nicht um eine sonst übliche Hydrolyse. Der Abbau des Glykogens erfordert außerdem das “Debranching Enzyme”. Der gesamte Glykogenstoﬀwechsel läuft im Cytosol ab. Das Enzym Acyl-CoA-Cholesterin-Acyltransferase (ACAT) katalysiert die intrazelluläre Veresterung von Cholesterin mit Fettsäuren. Phosphatidylserin gehört zur Gruppe der Glycerophospholipide. Page 2 of 26 Juli 2023 HMJK Diacylglycerin ist ein wichtiger “second messenger”. Die Synthese der Leukotriene wird durch Acetylsalicylsäure nicht gehemmt. Freie Fettsäuren werden im Blutplasma überwiegend an Albumin gebunden, nicht an Lipoproteine. Wird ein Cholesterinester durch die Cholesterinesterase gespalten, so erhält man Cholesterin und ein Molekül Fettsäure. Glukose hat exakt die gleiche Molmasse wie Fructose, da es sich um Strukturisomere handelt. Glukose hat eine kleinere Molmaße als Lactose, da Glucose ein Monosaccharid ist, Lactose jedoch ein Disaccharid aus Glukose und Galaktose. Ribose hat eine kleinere Molmasse als Glukose, da Ribose eine Pentose ist (5 C-Atome), während es sich bei Glukose um eine Hexose (6 C-Atome) handelt. Saccharose hat eine größere Molmaße als Glukose, da es sich um ein Disaccharid handelt. Allosterische Regulatoren der Glykolyse sind ATP, AMP, Citrat und Fructose-1,6-bisphosphat, nicht aber Acetyl-CoA. Beim Abbau von Häm wird Fe2+ bei der Spaltung von Häm in Biliverdin durch das Enzym Hämoxygenase freigesetzt. Erythropoetin (EPO) fördert die vermehrte Reifung von Erythrozyten, indem es unter anderem die Apoptose der Vorläuferzellen unterbindet. Eine Eisenmangelanämie ist charakterisiert durch: relativ kleine Erythrozyten (MCV), verminderten Hämoglobingehalt (MCH) und erniedrigtes Serum-Ferritin. Hämosiderin ist ein Eisenspeicher, der abgebautes Ferritin enthält. Im Zuge einer Biotransformation werden körperfremde und körpereigene Substanzen hydrophiler gemacht. Primäre Gallensäuren werden mit Glycin oder Taurin konjugiert. Ubichinon ist ein Polyisopren. Die innere Mitochondrienmembran enthält Cardiolipin. Das Apolipoprotein B48 ist charakteristisch für Chylomikronen. Das Apolipoprotein B100 ist dagegen charakteristisch für LDL-Partikel. Chylomikronen transportieren hauptsächlich Lipide (Fette und Cholesterin) aus der Nahrung vom Darm zum peripheren Gewebe. Chylomikronen werden im peripheren Gewebe nicht durch Endozytose aufgenommen, sondern schrittweise abgebaut. Cholesterin ist kein Bestandteil der inneren Mitochondrienmembran. Die primären Gallensäuren liegen in der Leber überwiegend als Anionen vor. Die LCAT verestert Cholesterin mit einer Fettsäure. Biologische Membranen werden von einer Lipiddoppelschicht gebildet. Je höher der Anteil ungesättigter Fettsäuren ist, desto fluider sind die Membranen. Cholesterin ist wegen seiner Page 3 of 26 Juli 2023 HMJK stabilisierenden Eigenschaften ein wichtiger Membranbestandteil (nicht aber Cholesterinester!). Biologische Membranen enthalten keine freien Fettsäuren. Lipoproteine sind nicht von einer biologischen Membran umgeben, sondern von einer einfachen Schicht aus Membranlipiden (außen hydrophil, innen aber hydrophob). Die Phosphoglukomutase wandelt Glucose-1-phosphat und Glucose-6-phosphat ineinander um. Glucose-6-phosphatase kommt nur in der Leber und den Nieren vor. Die Verzweigungen in der Glykogenkette sind wichtig, um einen schnellen Abbau zu gewährleisten. Die mitochondriale Pyruvatcarboxylase ist ein Schlüsselenzym der Glukoneogenese. Transaldolase und Transketolase sind Enzyme des nicht-oxidativen Zweigs des Pentosephosphat- Wegs. Muskel-Glykogen kann nicht als Speicher zur Aufrechterhaltung des Blutglukosespiegels dienen, da Muskelzellen aufgrund des Fehlens der Glukose-6-phosphatase keine Glkcose ins Blut abgeben können (im Gegensatz zu Leber und Niere). Eikosanoide enthalten 20 C-Atome (eikosi ist altgriechisch für 20). Acetylsalicylsäure hemmt die Biosynthese der Prostaglandine. Die enzymatische Reaktion der zytosolischen Phospholipase A2 führt zur Freisetzung von Arachidonsäure. Eine Cyclooxygenase ist verantwortlich für die Produktion von Leukotrienen. Die ATP-Synthase, die im Mitochondrium ATP bildet, nutzt als Energiequelle den Protonengradienten der inneren Mitochondrienmembran. Die Ausbildung einer Disulfid-Bindung zwischen zwei Molekülen Glutathion ist eine Redoxreaktion. Die Regeneration des Glutathions durch Reduktion der Disulfidbrücke erfolgt mittels NADPH. Ein Mangel an Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase führt zu einem zu geringen NADPH-Spiegel und deshalb zu erhöhten Mengen an oxidiertem Glutathion (weil die Regenerierung zu langsam abläuft). Glutathion wird nicht an den Ribosomen gebildet, sondern mit Hilfe zweier spezieller Enzyme synthetisiert (Glutamat-Cystein-Ligase und Glutathionsynthase). NAD+ spielt vorwiegend bei katabolen Stoﬀwechselreaktionen eine Rolle. Es ist die oxidierte Form des Elektronenüberträgers. Es wird bei anaerober Glykolyse durch die Lactatdehydrogenase regeneriert. Fructose-2,6-bisphosphat ist ein allosterischer Regulator der Glukoneogense. Beim Glykogenabbau wird anorganisches Phosphat benötigt, weil die Spaltung der glykosidischen Bindungen phosphorolytisch erfolgt (nicht hydrolytisch, wie es meist der Fall ist). Kohlenhydrate besitzen eine Carbonylgruppe, und zwar entweder eine Aldehyd-Gruppe oder eine Keto-Gruppe. Proteine, Kohlenhydrate, Alkohol und Fette haben jeweils unterschiedliche Brennwerte bezogen auf das Trockengewicht, das heißt, sie haben eine unterschiedliche “Energiedichte”. Page 4 of 26 Juli 2023 HMJK Als energieliefernde Stoﬀe nimmt der Mensch stark reduzierte Substanzen auf (z. B. Fette, Kohlenhydrate usw.), die dann im Stoﬀwechsel stufenweise oxidiert werden. Die dabei frei werdende nutzbare Energie wird hauptsächlich in Form von ATP oder auch als Reduktionsäquivalente gebunden. Die Hexokinase-Reaktion ist aufgrund der Kopplung mit der Spaltung einer “energiereichen” Bindung des ATP insgesamt exergon und kann daher freiwillig in Richtung der Bildung des Glukose-6-phosphats ablaufen. Cholsterin hat mehrere wichtige Funktionen im Stoﬀwechsel: (1) wichtiger Membranbestandteil (zur Stabilisierung, siehe Praktikumsversuch mit Digitonin), (2) Vorstufe von Signalstoﬀen (Steroidhormone), (3) Vorstufe eines Vitamins (Vitamin D3), (4) Vorstufe von Emulgatoren (Gallensalze). Cholesterin hat jedoch keine Bedeutung im Energiestoﬀwechsel, dient also nicht als Energielieferant. Phosphorsäure-Esterbindungen (kurz: Phosphoester-Bindung) finden sich unter anderem in allen Nucleinsäuren (dort als Diphosphoester-Bindungen) und in Nucleotiden, nicht jedoch in Nucleosiden oder einzelnen Basen. Eisenstoﬀwechsel: Folgende Zuordnungen sind richtig: Fe3+/Transferrin, Fe3+/Ferritin, Fe2+/ Vitamin C, Fe3+/Methämoglobin, Fe3+/Hephästin Der Pentosephosphatweg läuft im Zytosol ab. Die Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase ist das Schlüsselenzym dieses Stoﬀwechselweges. Es wird NADPH erzeugt, das gleichzeitig den weiteren Durchfluss durch den Stoﬀwechselweg hemmt. Im nicht-oxidativen Zweig des Pentosephosphatwegs werden Frutose-6-phosphat und Glycerinaldehyd-3-phosphat gebildet. Wenn ein Mensch seit einigen Stunden keine Nahrung zu sich genommen hat, ist zu erwarten, dass wenig Fructose-2,6-bisphosphat vorliegt, cAMP als “second messenger” erhöht ist und die alpha-Untereinheit des mit dem Glukagon-Rezeptor assoziierten G-Proteins aktiviert ist. Das Enzym Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase verknüpft Metabolite des Kohlenhydrat- und Fettstoﬀwechsels und ermöglicht die Bildung von Speicherfett im Fettgewebe. Im Pentosephosphatweg wird kein ATP gebildet. Das Zwischenprodukt der Glykolyse 1,3-Bisphosphoglycerat kann ein ADP-Molekül phosphorylieren, wobei ATP gebildet wird. Dies Reaktion ist eine sogenannte Susbtratkettenphosphorylierung. Die Cholesterin-Biosynthese findet im Zytosol statt. Sie wird durch Statine gehemmt. Beim Diabetes mellitus Typ I produzieren die Patienten bereits im frühen Jugendalter nicht mehr genug Insulin. Insulinmangel führt zu einer verringerten Aufnahme von Glukose durch entsprechende Glukose- Transporter in der Zellmembran. Insulinmangel führt zu einem verstärkten Abbau des Speicherfetts im Fettgewebe (Lipolyse). Bei Insulinmangel kommt es zu einer unnötigen Glukoneogenese in der Leber. Bei unbehandeltem (oder schlecht eingestelltem) Diabetes mellitus kommt es zu einer verstärkten (und physiologisch unnötigen) Biosynthese von Ketonkörpern. Typische Bausteine in biologischen Membranen sind: Phosphatidylethanolamin, Ganglioside, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, aber nicht Cholesterinester. Letztere finden sich im Inneren von Lipoproteinen und in Zellen in Lipidtröpfchen als Cholesterin-Speicherform. Alle primären konjugierten Gallensäuren enthaltene eine Säureamidbindung. Page 5 of 26 verfälscht die freies kann Zellmembran freies Glycerin Glycerin nicht passieren Werte Juli 2023 - HMJK Zytoplasmatisches HMG-CoA ist ein Zwischenprodukt der Cholesterin-Biosynthese. Phosphatidyl-Inositol gehört zur Gruppe der Glycerophospholipide. Glutathion ist ein wichtiges Antioxidans. Obwohl es sich um ein Peptid handelt, wird es nicht am Ribosom, sondern durch zwei spezielle Enzyme synthetisiert. Es liegt zytosolisch vor und besteht aus den Aminosäuren Glutamin, Cystein und Glycin, wobei Glutamin und Cystein über eine Isopeptid-Bindung verknüpft sind. NADPH/H+ entsteht im oxidativen Zwei des Pentosephosphatwegs. Das Schrittmacherenzym wird durch hohe Konzentration an NADPH gehemmt. Der Ablauf des reversiblen Zweigs ist mit der Glykolyse verbunden. Im irreversiblen Zweig entsteht CO2. Die innere Mitochondrienmembran enthält zahlreiche Cardiopilin-Moleküle. Diacylglycerin ist ein bedeutender “second messenger”. Im Blutplasma kann Glycerin ohne Bindung an ein Transportmolekül transportiert werden. FS Stearinsäure ist keine essentielle Fettsäure. > gesättigte - Zelluläres Cholesterin wird enzymatisch nicht abgebaut. Sphingophospholipide enthalten kein Cholesterin, sondern als Grundbestandteil ein Molekül Sphingosin. Gallensäuren sind Derivate des Cholesterins. Die Biosynthese von Cholesterin wird durch Statine gehemmt. Glykogen ist weniger osmotisch aktiv als die entsprechende Zahl von einzelnen Glukose- Molekülen und verhindert daher ein Anschwellen und Platzen der Zellen. Die Glykolyse kann in ausnahmslos allen Zellen ablaufen. Energiebereit Of Stellung - Die Hauptaufgabe der Glykolyse in den Erythrozyten ist die Bereitstellung von ATP. ApoB48 (48% Länge) ist die verkürzte Form des ApoB100 (100% Länge). ApoB48 wird von den Darmzellen produziert und ist ein Strukturelement der Chylomikronen. ApoCII in VLDL aktiviert die Lipoproteinlipase. Diacylglycerin wirkt im Zytosol als “second messenger”. FAD ist ein Coenzym bei Dehydrierungen. Es nimmt Elektronen auf und wird dabei zu FADH2 umgewandelt (FAD ist also die oxidierte Form, FADH2 die reduzierte). Es enthält im Gegensatz zu NAD+ kein Adenosin. Es ist kein Spurenelement. Glykolipide enthalten immer Sphingosin. Die Glykogen-Phosphorylase baut Glykogen ab, indem sie die Bindungen zwischen den Glukose- Molekülen phosphorolytisch spaltet. Sie wird durch Interkonvertierung reguliert. Der Abbau des Glykogens in der Leber wird durch Glukagon stimuliert und durch Insulin gehemmt. Die Phosphofructokinase I (PFK-1) wird durch ATP allosterisch gehemmt. Aus Fettsäuren können keine Zucker (also auch keine Glukose) gewonnen werden. Dies gilt typischerweise für den tierischen Organismus und den Menschen. Page 6 of 26 Juli 2023 HMJK Arachidonsäure ist eine vierfach ungesättigte Fettsäure. Cholesterin ist das Ausgangsmolekül der Mineralcorticoide. Die primären Gallensäuren werden in der Leber gebildet. Fettsäuren werden im Blutplasma an Albumin gebunden transportiert. Cholsterin dient nicht als Energiespeicher. Die Synthese von Cholesterin benötigt ausreichende Mengen von Acetyl-CoA, ATP und NADPH. Die Biosynthese von Cholesterin wird durch Insulin über einen Signaltransduktionsweg stimuliert. Der Protonengradient über die innere Mitochondrienmembran wird benutzt, um Energie für die F1F0-ATP-Synthase bereitzustellen. Monosaccharide können nicht durch Hydrolyse in kleinere Moleküle gespalten werden. Für die Resorption von Fructose in die Enterozyten ist der Transporter GLUT5 zuständig (der also quasi eigentlich falsch benannt wurde). Ölsaeure ist eine einfach ungesättigte Fettsäure. Die vollständige Hydrolyse eines Glykolipids der Nervenzelle ergibt Sphingosin, eine Fettsäure und mindestens ein Kohlenhydrat-Molekül. Sekundäre Gallensäuren enthalten kein Glycin oder Taurin mehr. Cholesterinester sind wichtig für den Transport des Cholesterins in Lipoproteinen (weil sie vollständig hydrophob sind und daher im Inneren der Lipoproteinen transportiert werden, was die Transportkapazität erhöht) und für die Speicherung von Cholesterin in Zellen (weil freies Cholesterin nicht gespeichert werden kann, es würde in die Zellmembran eindringen). Cholesterinester sind jedoch keine Bestandteile biologischer Membranen. Glycerinaldehyd-3-phosphat wird in der Glykolyse direkt oxidiert. Glykogen enthält ein Protein als zentralen Bestandteil. Der Glykogenspeicher der Leber wird durch Insulin aufgebaut und durch Glukagon abgebaut. Die Glykogen-Synthase verwendet Glukose-6-phosphat als Substrat (und damit als Ausgangsbaustein für die Synthese). Die Galaktokinase ist eine Transferase (das triﬀt auf alle Kinasen zu!). Eine hohe Enzym-Substrat-Spezifität wird durch einen niedrigen Km-Wert angezeigt. Die Cyclooxygenase verwendet molekularen Sauerstoﬀ. Oxidoreduktasen katalysieren Reeoxreaktionen und brauchen daher einen Elektronenüberträger als Co-Substrat bzw. prosthetische Gruppe. Zytosolisches HMG-CoA ist ein Zwischenprodukt der Cholesterin-Biosynthese. Hingegen ist mitochondriales HMG-CoA ein Zwischenprodukt der Synthese von Ketonkörpern (die Cholesterin- Synthese findet im Zytosol statt, die Synthese der Ketonkörper hingegen in der Mitochondrienmatrix). In der Membran des ER ist ein Cholesterin-bindendes Protein lokalisiert. Page 7 of 26 Juli 2023 HMJK Die Ringform der Glukose stellt ein Halbacetal dar. Die Ribose ist eine Pentose und gleichzeitig eine Aldose. Die Reaktion der Pyruvatkinase bildet ein Molekül ATP (man beachte, dass dieses Enzym sozusagen “falsch” benannt wurde). Aus dem Endprodukt der Glykolyse, dem Pyruvat, wird mit Hilfe des Pyruvat-Dehydrogenase- Komplexes Acetyl-CoA gewonnen, das wiederum in den Citrat-Zyklus eingeschleust wird. Die Pyruvatcarboxlyase wird durch Acetyl-CoA stimuliert. ATP kann in der Substratketten-Phosphorylierung gewonnen werden. Fleischreiche Ernährung führt zu einer erhöhten Säureausschedung im Harn (vermehrt gebundene Protonen). Dies liegt unter anderem an der Aminosäure Cystein, bei deren Abbau Schwefelsäure gebildet wird. Insulin hat nach seiner Freisetzung eine sehr kurze Lebensdauer (Halbwertszeit nur wenige Minuten). Die einsatzbereiten Insulin-Moleküle wurden posttransnational modifiziert. Alle Lipoproteine besitzen eine monomolekulare Schicht aus Membranlipiden (das heißt nach außen hin polar, zum Inneren jedoch umpolar, denn das Innere eines Lipoproteins ist völlig umpolar, es handelt sich NICHT um einen Membranvesikel!!). Die “energiereichen” Bindungen im ATP sind die Phosphorsäure-Anhydrid-Bindungen zwischen dem alpha- und dem beta- und zwischen dem beta- und dem gamma-Phosphat. Nicht “energiereich” ist dagegen die Phosphorsäureester-Bindung zwischen alpha-Phosphat und der Hydroxylgruppe der Ribose. ATP stellt chemische Energie für Biosynthese-Reaktionen zur Verfügung. Die von der Pyruvatkinase katalysierte Reaktion ist unter physiologischen Bedingungen irreversibel. Riboflavin ist ein Bestandteil von FAD, nicht von NAD+ (letzteres besitzt ein Nikotinsäureamid). Vitamine sind häufig Bausteine von Coenzymen. Sowohl die ACAT als auch die LCAT katalysieren die Bildung von Cholesterinestern. Glycin ist ein typischer Bestandteil der primären Gallensäuren. Cardiolipin ist ein wichtiger mitochondrialer Membran-Bestandteil (und zwar ausschließlich in der inneren Mitochondrienmembran zu finden). Phosphatidyl-Inositol gehört zur Gruppe der Glycerophospholipide. Acetylsalicylsaeure hemmt die Synthese der Thromboxane. ApoB48 und ApoB100 entstehen durch das sogenannte RNA-Editing. Chylomikronen transportieren vorwiegend Triacylglyceride. Ein verminderter Abtransport von VLDL aus der Leber kann zu einer Fettleber führen. Nach einer Glukose-reichen Mahlzeit wird im Gesunden die Aktivität der Phosphofructokinase 1 erhöht (was dann zu einem erhöhten Durchfluss durch die Glykolyse führt). Nicht erhöht werden die Aktivitäten der Enzyme Glykogen-Phosphorylase (Glykogen-Abbau), Pyruvat-Carboxylase (Glukoneogenese), Glukose-6-phosphatase (Glukoneogenese) und TAG-Lipase (Abbau des Page 8 of 26 Juli 2023 HMJK Speicherfetts im Fettgewebe). Diese Enzyme werden vielmehr inhibiert. Diese Enzyme würden im Hungerzustand (also auf ein Glukagon-Signal hin) aktiviert. Der Adipozyt gewinnt aus Dihydroxyacetonphosphat (Glykolyse-Zwischenprodukt) in einem Schritt das zur Fettsynthese notwendige Glycerin-3-phosphat. Die vollständige Hydrolyse eines Gangliosids liefert ein Sphingosin, eine Fettsäure und mehrere Moleküle Kohlenhydrat. Galaktose wird ausgehend von UDP-Galaktose zu UDP-Glukose umgewandelt. Beim juvenilen Diabetes mellitus kommt es durch Zerstörung der beta-Zellen des Pankreas zu einem absoluten Insulinmangel. Charakteristische für diese Erkrankung ist eine erhöhte Wasserausscheidung. Typ-II-Diabetiker hingegen produzieren (jedenfalls im Anfangsstadium der Erkrankung) ausreichend Insulin, welches jedoch aufgrund einer Insulinresistenz nicht voll wirksam wird (die Rezeptoren an den Zielzellen reagieren nicht mehr ausreichend auf den Insulin- Stimulus). Für eine glykosidische Bindung gilt: Sie wird ausgehend von einem oder mehreren anomeren C- Atomen geknüpft. Es müssen nicht unbedingt zwei Zuckermoleküle verbunden werden (siehe die Bindung der Basen an Ribose und Desoxyribose und die Glykosylierung von Proteinen durch N- oder O-Glykosylierung). Die Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase liefert indirekt einen wichtigen Beitrag zum Oxidationsschutz einer Zelle. Die von ihr katalysierte Reaktion ist unter physiologischen Bedingungen irreversibel. Fructose wird vom Darmlumen mittels GLUT5 apikal in den Enterozyten transportiert und basolateral mittels GLUT2 in die Blutbahn abgegeben.Die wichtigsten Fructosequellen in der Ernährung sind Obst und Honig (Fruchtzucker/Fructose) sowie der übliche Haushaltszucker (Rohr- und Rübenzucker/Saccharose, ein Disaccharid aus Glukose und Fructose). Der Fructose- Abbau erfolgt vorwiegend in der Leber, und zwar im Zytosol. Fructose wird dort mit Hilfe der Fructokinase zu Fructose-1-phosphat phosphoryliert. Linolensäure ist eine mehrfach ungesättigte Fettsäure (drei Doppelbindungen). Die innere Mitochondrienmembran enthält kein Cholesterin. Cholesterin beeinflusst die Fluidität der Membran. Cholesterin kann intrazellulär in Form von Cholesterinestern gespeichert werden (mit Hilfe des Enzyms ACAT). Muskel-Glykogen dient allein als Energiespeicher des Muskels und kann nicht zur Aufrechterhaltung des Blutzuckerspiegels herangezogen werden. Die Glykogen-Synthase kann aktivierte Glucose-Einheiten über 1,4-glykosidische Bindungen verknüpfen. Beim Gesunden führt ein erhöhter Blutglucosespiegel (vermittelt durch Insulin) zum Einbau von zusätzlichen GLUT4-Transportern in die Zellmembran von Muskelzellen. Die Cholesterinesterase katalysiert die Freisetzung von Cholesterin aus Cholesterinestern. Die Bildung der primären Gallensäuren erfolgt in der Leber, die der sekundären Gallensäuren dagegen im Darm durch dort vorhandene Bakterien. Galaktose wird durch das Enzym Laktose im Dünndarm freigesetzt. Die apikale Resorption der Galaktose in die Enterozyten erfolgt mittels derselben Transporter wie die Resorption der Glukose. Page 9 of 26 Juli 2023 HMJK In der Leber wird Galaktose durch das Enzym Galaktokinase zu Galaktose-1-phosphat umgewandelt. ATP kann in der Glykolyse hergestellt werden, treibst sonst endergone Reaktionen an, stellt Phosphatgruppen für Kinase-Reaktionen zur Verfügung und übrträgt chemische Energie bei Biosynthese-Reaktionen. Cholesterinester sind nicht in biologischen Membranen lokalisiert (man findet sie im Inneren von Lipoproteinen als Transportform und Fetttröpfchen im Zytosol als Speicher). Lipasen, Proteasen, Nuklearen, Phosphatasen und Glykosidasen haben gemein, dass sie alle Substrate mit Hilfe von Wasser spalten, d.h. es handelt sich um Hydrolasen. Bei der McArdle-Krankheit ist die Glykogen-Phosphorylase des Muskels betroﬀen. IRP1 (iron regulatory protein 1) bindet an so genannte IREs in mRNAs und beeinflusst dadurch deren Stabilität und Translation. In den Mitochondrien wird ATP mittels oxidativer Phosphorylierung gebildet. In der Glykolyse können netto durch Substratketten-Phosphorylierung zwei Moleküle ATP pro Molekül Glukose gewonnen werden. PROTEINE und ENZYME Das Pankreasgewebe ist vor den eigenen Verdauungsenzymen Trypsin und Chymtrypsin geschützt, weil diese erst im Darm durch limitierte Proteolyse aus den entsprechenden Vorstufen Trypsinogen bzw. Chymotrysinogen freigesetzt werden. Limitierte Proteolyse bedeutet den unvollständigen Abbau eines Proteins. Der Serinproteaseinhibitor (Serpin) alpha1-Antitrypsin wird nicht im Pankreas synthetisiert und ist nicht der physiologische Inhibitor des Trysins, sondern er wird als typisches Plasmaprotein von der Leber hergestellt und wirkt hemmend auf das Enzym Elastase. In einer Serum-Elektrophorese werden die Proteine nach Größe, Form und Ladung aufgetrennt. Bei der Aufreinigung eines Proteins stehen die beiden Größen Ausbeute und Aufreinigung in keinem Verhältnis zueinander, d.h. man kann von der einen nicht auf die andere schließen. Die Löslichkeit von Proteinen hängt unter anderem vom pH-Wert und der Ionen-Konzentration ab. Es gibt zwei Möglichkeiten, bestimmte Proteine in einem Proteingemisch spezifisch zu quantifizieren (also die Fragen zu beantworten: Ist das betreﬀende Protein vorhanden? Wieviel des betreﬀenden Proteins ist vorhanden?). Handelt es sich um ein Enzym, lässt sich spezifisch dessen Aktivität messen und anhand der Aktivität auf die Menge schließen (Beispiel: Bestimmung der “Leberenzyme” im Blut, um eventuelle Leberschäden beurteilen zu können). Handelt es sich um ein Nicht-Enzym-Protein, lässt sich die Bestimmung mit Hilfe von Antikörpern durchführen, also mit sogenannten Immunoassays wie dem ELISA. Eine weitere Methode zur Bestimmung der Konzentration einzelner Proteine in einem Gemisch ist der Mancini-Test (Immundiﬀusionstest). Um ein Proteingemisch mit Hilfe einer Elektrophorese auftrennen zu können, müssen sich die enthaltenen Proteine in Größe, Form und/oder Ladung unterscheiden. Die Quantifizierung der Gesamtproteinmenge kann mittels Farbreaktionen erfolgen wie etwa der Biuret-Reaktionen. Bei dieser Methode werden im stark basischen Milieu die Stickstoﬀe der Peptidbindung deprotoniert und erhalten dadurch ein weiteres freies Elektronenpaar. Damit kann Page 10 of 26 Juli 2023 HMJK eine Komplexverbindung mit Cu2+ Ionen gebildet werden (vier Peptidbindungen verbinden sich mit einem Kupferion), was einen leicht photometrisch messbaren blauen Farbkomplex ergibt. Da eine sehr hohe Hydroxid-Ionen-Konzentration vorliegt und zweiwertige Kupferionen mit OH- Ionen das sehr schwer lösliche Kupferhydroxid bilden, müssen die Kupferionen in der Färbelösung durch Bindung an Tartrat-Ionen (Salze der Weinsäure) gebunden werden. Bei der Reaktion gehen die Kupferionen dann direkt in den Komplex mit den Peptidbindungen über, ohne in Kontakt mit den Hydroxidionen zu kommen. Mit der Methode des Aussalzens kann man Plasmaproteine ausfällen. Diese Methode funktioniert für alle Globulinfraktionen. Die Serinproteasen des Pankreas zerstören normalerweise nicht das Pankreasgewebe, weil sie erst im Darm durch limitierte Proteolyse aktiviert werden (z. B. Umwandlung des inaktiven Chymotrypsinogen in das aktive Chymotrypsin). An der Ausbildung von Sekundärstrukturen in Proteinen sind ausschließlich Wasserstoﬀbrücken- Bindungen zwischen den Peptidbindungen beteiligt, jedoch nicht die Atome der Seitenketten, also keine ionischen oder hydrophoben Wechselwirkungen. Disulfid-Brücken werden zwischen den Seitenketten zweier Cystein-Reste gebildet (nicht zwischen Methionin-Resten). Die N-terminale Aminogruppe eines Proteins ist bei physiologischem pH-Wert überwiegend protoniert, liegt also als NH3+ vor. Die Maximalgeschwindigkeit Vmax ändert sich bei einer kompetitiven Hemmung nicht. Hydrolasen sind Enzyme, die eine Bindung durch Anlagerung von Wasser spalten. Sie kehren die Reaktion der Kondensation also um. Beispiel: Glucose-6-phosphatase. Limitierte Proteolyse führt zur funktionellen Form von Glucagon, Caspase, TRH und Kollagen. Isoenzyme katalysieren die gleiche biochemische Reaktion. Sie können sich in ihrer organspezifischen Verteilung unterscheiden, ebenso in ihrer Regulation. Da sie strukturell unterschiedlich sind, besitzen sie unterschiedliche Aminosäure-Sequenzen und unterschiedliche Struktur. Daher unterscheiden sie sich auch in ihrem isoelektrischen Punkt. Hexokinase und Proteinkinase A sind typische Vertreter der Gruppe der Kinasen. Die Wechselzahl kcat eines Enzyms gibt an, wie viele Substratmoleküle pro Sekunde an einem Enzymmolekül umgesetzt werden. Substratanaloga führen in enzymatisch katalysierten Reaktionen zu einer kompetitiven Hemmung (Beispiel: Statine hemmen kompetitiv die HMG-CoA-Reductase). Dabei ändert sich die Maximalgeschwindigkeit Vmax nicht. Die Lactatdehydrogenase ist ein Tetramer, deren Untereinheiten in jeweils zwei Typen (H-Form und M-Form) vorkommen. Dadurch bilden sich die fünf möglichen Isoformen der LDH. Die zytoplasmatische Phospholipase A2 spaltet den Acylrest in der mittleren Position aus dem Phospholipid heraus, wobei ein Lysophospholipid und eine Fettsäure freigesetzt werden. Viele Enzyme, die Bindungen spalten, sind Hydrolasen, sie benötigen also Wasser für die Reaktion. Dazu zählen unter anderem Proteasen, Glykosidasen, Nukceasen, Lipasen und Phosphatasen. Glykoproteine enthalten kovalent gebundene Zuckerketten. Porine gehoeren zu den Membranproteinen. Page 11 of 26 Juli 2023 HMJK Für die Ausbildung der Tertiärstruktur spielen die Seitenketten der Aminosäuren eine wichtige Rolle. Disulfidbrücken entstehen durch Oxidation von Cystein-Seitenketten. Kollagen enthält Hydroxprolin. Tyrosin enthält eine Hydroxylgruppe. Lysin kann posttranslational modifiziert werden. Die Seitenkette von Asparagin kann glykosyliert werden, nicht jedoch die von Arginin. Die Eﬃzienz einer Proteinaufreinigung (im Praktikum Ausfällung der gamma-Globulinfraktion) wird durch zwei Größen beschrieben: den Anreicherungsfaktor und die Ausbeute. Diese beiden Größen haben keine Verbindung untereinander! Das heißt: Aus der Betrachtung der einen Größe sind keine Rückschlüsse auf die Güte der anderen Größe möglich!! Die Bestimmung von Enzymaktivitäten und ELISAs sind Methoden der spezifischen Mengenbestimmung eines Proteins in einem Gemisch von Proteinen. Sowohl der pH-Wert als auch die Ionenkonzentration (Ionenstärke) bestimmen, wie gut ein Protein unter den gegebenen Bedingungen löslich ist. Die Biuret-Methode zur quantitativen Messung des Proteingehalts misst die Zahl der vorhandenen Peptidbindungen, da jeweils vier deprotonierte Peptidbindungen einen Komplex mit einem Kupferion bilden. Serin und Threonin können phosphoryliert werden. Die Struktur eines beta-Faltblattes wird nur durch Wasserstoﬀbrückenbindungen stabilisiert. Die direkte Wirkung von Vitamin-K-Antagonisten beruht in der Hemmung der gamma- Carboxylierung von Glutamat-Seitenketten mehrerer Gerinnungsfaktoren. Wenn ein Patient mit Diabetes mellitus von Typ I vorübergehend die Insulininjektionen überdosiert, kommt es zu einer Hypoglykämie. Ein hoher Km-Wert bedeutet eine niedrige Aﬃnität des Enzyms zum Substrat. Die Wechselzahl kcat hingegen lässt keine Rückschlüsse auf die Aﬃnität zu. Enzyme können die Lage eines Reaktionsgleichgewichts niemals verändern, sondern sie beschleunigen die Einstellung des Gleichgewichts. Phosphatasen und Nuclearen haben gemeinsam, dass sie Esterbindungen spalten. Proteinabbau: Antithrombin III ist ein Serpin und ein wichtiger Regulator von Proteasen. Der Abbau von Proteinen im Proteasom ist energieabhängig. Proteolyse kann sowohl extrazellulär als auch intrazellulär stattfinden. Der Begriﬀ Exopeptidase bezeichnet Enzyme, die die Pepitdkette von einem der Enden her abbauen, im Gegensatz zu Endopeptidasen, die Peptidbindungen im Inneren eines Peptids spalten. Exopeptidasen haben nichts mit dem Extrazellulärraum zu tun. Die Phosphoglyceratkinase katalysiert eine Reaktion, die zu den Substratkettenphosphorylierungen gehört. Glykoproteine enthalten kovalent gebundene Zuckerketten. Es gibt auch glykosylierte Enzyme. Page 12 of 26 Juli 2023 HMJK Sowohl die Hexokinase als auch die Phosphofructokinase gehören zu den Kinasen. Alle Kinasen gehören zur Enzymklasse der Transferasen. Die Peptidbindung ist eine Säureamid-Bindung. Die katalytische Triade der Protease Trypsin wird von den Aminosäuren Aspartat, Histidin und Serin gebildet. Die SDS-PAGE (Natrium [Sodium]-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese trennt ein Proteingemisch ausschließlich nach der Größe der Proteinmoleküle auf (nicht nach der Ladung, da durch das Tensid geladene SDS die eigenen Ladungen des Proteins abgedeckt werden, so dass alle Proteine in der Mischung die gleiche Ladungsdichte aufweisen). Troponin I ist ein wichtiger Proteinmarker zur Diagnose eines Myokardinfarkts. Es handelt sich nicht um ein Enzym und muss deshalb mit Hilfe eines Immunoasays quantifiziert werden. Um dem gezielten Abbau im Proteasom zugeführt werden zu können, müssen Proteine durch kovalente Bindung an Ubiquitin markiert werden (Ubiquitinylierung). Die Primästruktur (Sequenz) von Kollagen weist viele hydroxylierte Prolin- und Lysin-Seitenketten auf. Die meisten Enzyme sind Proteine, aber es gibt Ausnahmen in Form von sogenannten Ribozymen, die von RNA-Molekülen gebildet werden (ein Beispiel für ein Ribozym ist das Ribosom, da die Knüpfung der Peptidbindung von der großen rRNA katalysiert wird). Allosterisch regulierte Enzyme sind häufig Schlüsselenzyme in Stoﬀwechselwegen. Enzyme können auch membranständig sein. Die Assoziation eines Proteins mit oder an Membranen kann auf unterschiedliche Weise verwirklicht sein. Integrale Membranproteine durchspannen entweder die gesamte Membran einfach oder mehrfach oder sind über einen Lipidanker in der Membran gebunden und somit fest assoziiert. Periphere Membranproteine hingegen sind typischerweise an integrale Membranproteine gebunden und dadurch indirekt mit der Membran assoziiert. (Beispiel: Rezeptoren wie die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren sind typischweise integrale (Trans-) Membranproteine ebenso wie die alpha- und gamma- Untereinheiten der gekoppelten G-Proteine, die einen Lipidanker haben. Als peripher zu klassifizieren ist hingegen die beta-Untereinheit der G-Proteine, da sie nur aufgrund der Bindung an die anderen Untereinheiten mit der Membran assoziiert ist.) Prolin besitzt wie fast alle proteinogenen Aminosäuren ein chirales C-Atom (trotz der Ringbildung der Seitenkette mit der Aminogruppe). Hydroxprolin gilt nicht als proteinogene Aminosäure, weil die Hydroxylierung posttranslational erfolgt. Das bedeutet, dass zunächst ein ganz gewöhnliches Histidin am Ribosom in the wachsende Peptidkette eingebaut wird. (Im Gegensatz dazu gilt Selenocystein als proteinogene Aminosäure.) Serin und Threonin können phosphoryliert werden (nämlich an der Hydroxylgruppe der Seitenkette). Das beta-Faltblatt ist eine Sekundärstruktur innerhalb einer Peptidkette und wird als solche ausschließlich durch Wasserstoﬀbrücken-Bindungen stabilisiert. Die Löslichkeit von Proteinen ist vom pH-Wert und der Salzkonzentration abhängig. Proteine können in einem Proteingemisch mit Hilfe von Antkörpern spezifisch nachgewiesen werden. Page 13 of 26 Juli 2023 HMJK Angenommen, bei einer Aktivitätsmessung erreicht Enzym A unter sonst gleichen Bedingungen eine höhere Maximalgeschwindigkeit als Enzym B. Daraus lässt sich korrekt ableiten, dass Enzym A eine größere Wechselzahl kcat als Enzym B hat. Nicht schlussfolgern lässt sich, welches Enzym die höhere Substratspezifiät besitzt, ob es sich um Isoenzyme handelt, ob sie zur gleichen Enzymklasse gehören oder ob und welche Cofaktoren benötigt werden. Enzyme beschleunigen die Einstellung des Gleichgewichts einer chemischen Reaktion, indem sie die Aktivierungsenergie herabsetzen. Die Lage des Gleichgewichts können sie jedoch nicht beeinflussen. Als typische Katalysatoren werden sie in der Reaktion nicht verbraucht, sondern gehen unverändert aus der Reaktion hervor (sie werden nur zwischenzeitlich verändert). Isoenzyme katalysieren dieselbe Reaktion, haben aber eine unterschiedliche Struktur. Die Aufnahme von Glukose und Galaktose in Enterozyten ist ein sekundär-aktiver Transportprozess. Folgende Zuordnungen zwischen Wirkstoﬀ und direktem Angriﬀspunkt sind korrekt: Aspirin - Cyclooxygenase Heparin - Antithrombin III EDTA - Calcium Streptokinase - Plasminogen Nicht zutreﬀend ist jedoch die Zuordnung: Cortisol - Fibrinogen. An der Einleitung der Apoptose (programmierter Zelltod) sind Caspasen beteiligt. Trypsin gehoert zur Enzym-Hauptklasse der Hydrolasen. Die Wechselzahl kcat gibt an, wie viele Susbtratmoleküle von einem Enzymmolekül pro Sekunde umgesetzt werden. Ein hoher Km-Wert beschreibt eine niedrige Aﬃnität des Enzyms zum Substrat. NADH ist ein Coenzym von Oxidoreductasen. Die Fructokinase ist eine Transferase (wie alle Kinasen). Alle Proteine besitzen einen isoelektrischen Punkt. Proteine im Zytosol sind niemals glykosyliert (weil sie gar nicht im Lumen des ER und im Golgi- Appart waren, wo die Glykosylierungen stattfinden). Histon-Proteine sind sehr basische Proteine, das bedeutet, dass sie viele Arginin- und Lysinreste enthalten und daher einen sehr hohen ioselektrischen Punkt aufweisen. Die Aminosäure Threonin kann posttranslational durch Phosphorylierung modifiziert werden. Sie kann nicht hydroxyliert werden. Die Seitenkette des Threonins ist unter physiologischen Bedingungen ungeladen. Eisen wird in der Form von Fe2+ über DMT1 in Mucosazellen des Darms aufgenommen. Die Speicherung des Eisens in Ferritin benötigt die Oxidation von Fe2+ zu Fe3+. Transport von Eisen im Blut erfolgt durch die Bindung von Fe2+ an Apotransferrin. IRP1 (Iron regulatory protein 1) wirkt auf Resorption, Speicherung und Verwertung von Eisen durch Regulierung der Translation. Caspasen sind typische Vertreter der Cystein-Proteasen. Der Abbau poly-ubiquitinylierter Proteine erfolgt gezielt im Proteasom. Page 14 of 26 Juli 2023 HMJK Die Glykosylierung von Proteinen erfolgt im ER (Beginn der N-Glykosylierung) und im Golgi- Apparat (weitere N-Glykosylierung und alle Typen von O-Glykosylierung). In einem Protein liegt die freie Carboxylgruppe unter physiologischen Bedingungen deprotoniert als COO- Gruppe vor (negativ geladen). Die Tertiärstruktur eines Proteins entsteht unter anderem durch ionische Wechselwirkungen. Arachidonsäure wird durch zytoplasmatische Phospholipase A2 (PLA2) aus der Zellmembran freigesetzt. Hexokinase besitzt für Glukose und Fructose unterschiedliche Km-Werte. Die Enzyme der Glykolyse sind alle im Zytoplasma lokalisiert. Pepsin besitzt ein pH-Optimum von etwa pH 2. Die ACAT verwendet Cholesterin als Substrat. Lysozym wirkt bakterizid, weil es das Murein der Bakterienzellwand spaltet. Lysozym ist ein Enzym, kein Antibiotikum. Es hemmt nicht die Translation in Bakterien und fördert nicht die Apoptose (bei Prokaryoten gibt es keinen programmierten Zelltod). Trypsin ist eine Serinprotease, die aus einem Zymogen durch limitierte Proteolyse gebildet wird. Bei der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) erfolgt die Auftrennung des Proteingemischs aufgrund der Größe. Albumin trägt wesentlich zum onkotischen Druck bei. Die Peptidbindungen in Proteinen sind Säureamid-Bindungen. Disulfid-Bindungen in einem Protein werden durch Cystein-Seitenketten gebildet, nicht von den Seitenketten des Methionins. Hydroxyprolin tritt erst posttranslational in einem Protein auf. Asparagin-Seitenketten können posttranslational an der Amidgruppe glykosyliert werden (dies ist die einzige Möglichkeit einer N-Glykosylierung von Proteinen). Methionin ist eine Schwefel-haltige Aminosäure. Lysin ist eine typisch basische Aminosäure. Die Quartästruktur der Lactat-Dehydrogenase besteht aus vier Untereinheiten. Je nach Isoform des Enzyms handelt es sich um Homotetramere oder Heterotetramere. Histon-Proteine enthalten vorwiegend basische Aminosäuren. Enzyme sind Katalysatoren und gehen daher aus der Reaktion unverändert hervor. Der Km-Wert lässt sich eindeutig aus dem Lineweaver-Burk-Plot ablesen. Troponin ist ein wichtiger Proteinmarker nach einem Herzinfarkt. Folgende Zuordnung eines Enzyms zu seinem direkten Produkt ist korrekt: Glukokinase - Glukose-6-phosphat Nicht korrekt sind: Page 15 of 26 Juli 2023 HMJK Fructokinase - Fructose-6-phosphat Galaktokinase - Galaktose-6-phosphat Pyruvatkinase - Phosphoenolpyruvat Phosphoglyceratkinase - Glycerin-2-phosphat Alpha1-Anti-Trypsin hemmt physiologisch die Elastase. Sie wird wie alle Serumproteine (abgesehen von den Immunglobulinen) von der Leber gebildet. Folgende Zuordnungen von Enzym zu Enzymklasse treﬀen zu: Lactat-Dehydrogenase - Oxidoreductase Trypsin - Hydrolase Enolase - Lyase Hexokinase - Transferase Nicht zutreﬀend ist hingegen die Zuordnung: Glykogen-Phosphorylase - Ligase (korrekt ist: Transferase) Histone spielen eine wichtige Rolle bei der Ausbildung der Chromatin-Struktur. Bei der Trennung und Analyse von Proteingemischen gilt: Die Ausfällung ist eine Methode zur Anreicherung einzelner Proteine, aber nicht zum Nachweis Bei einem typischen ELISA wird ein Enzym benötigt (jedoch zwei Antikörper) Der Zahlenwert des Anreicherungsfaktors ist nicht begrenzt. Die Ausbeute kann hingegen maximal 100% betragen. Die Bestimmung der Enzymaktivität ist ein hochspezifisches Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung einzelner Proteine (sofern diese Enzyme sind). Bei physiologischem pH-Wert liegt die Carboxyl-Gruppe von Aminosäuren überwiegend deprotoniert vor (also negativ geladen). Hydrophobe Wechselwirkungen und Van-der-Waals-Kräfte sind wichtig für die Stabilisierung der Tertiärstruktur von Proteinen. Protein-Disulfid-Isomerasen können die Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen zwei Cysteinresten katalysieren. Die Glykosylierung von Proteinen findet im ER und im Golgi-Apparat statt. Die Aminosäuren in einem Protein sind über Säureamid-Bindungen verknüpft (denn die Peptidbindung ist eine Säureamid-Bindung). Alle Enzyme des Citratzyklus sind im Matrixraum der Mitochondrien lokalisiert. Das Linewaever-Burk-Diagramm stellt einen doppelreziproken Verlauf der Enzymkinetik dar. Schrittmacherenzyme eines Stoﬀwechselweges werden oft durch Interkonversion reguliert. Oxidoreductasen verwenden als Coenzym unter anderem NAD+, NADP+ und FAD. Aus dem Michaelis-Menten-Diagramm können die Werte von Vmax und Km NICHT eindeutig abgelesen werden. Thrombin, Trypsin, Elastase und Plasmin sind Serin-Proteasen, nicht aber Pepsin (das nämlich eine Aspartat-Protease ist). Bei der Regulation von Enzymaktivitäten wirkt die allosterische Regulation vergleichsweise am schnellsten. Sie ist deutlich schneller als die Interkonversion. Am langsamsten wirkt die Änderung der Enzymmenge mittels Induktion der Transkription der entsprechenden Gene. Page 16 of 26 Juli 2023 HMJK Im Harn werden innerhalb von 24 Stunden (“pro Tag”) bei normaler Ernährung (Mischkost) durchschnittlich etwa 60 mmol Protonen ausgeschieden. Diese Protonen liegen überwiegend gebunden an Puﬀerbasen vor (nämlich gebunden an Ammoniak und Dihydrogenphosphat). Deshalb kann die Ausscheidung von Protonen über den Harn nicht durch eine einfache pH-Wert- Messung bestimmt werden (diese würde nur die Konzentration der freien Protonen ergeben). Statt dessen muss der Harn titriert werden, um auch die gebundenen Protonen erfassen zu können. Bei der Substratkonzentration, die dem Km-Wert entspricht (kurz “beim Km-Wert”) wird die halbe Maximalgeschwindigkeit der Umsetzung erreicht. Das bedeutet, dass die Hälfte der aktiven Zentren der Enzyme besetzt sind. Der Km-Wert ist ein Maß für die Aﬃnität eines bestimmten Substrats zum Enzym (je größer der Km-Wert, desto kleiner die Aﬃnität!!), wobei typischerweise verschiedene Substrate, die von demselben Enzym umgesetzt werden können, unterschiedliche Km-Werte aufweisen. Ebenso haben Isoenzyme oft unterschiedliche Km-Werte für das gleiche Substrat. Coenzyme gehen im Gegensatz zu Enzymen nicht unbedingt unverändert aus der Reaktion hervor. Coenzyme können als Cosubstrat wie andere Substrate an das Enzym binden und sich dann wieder lösen oder als prosthetische Gruppe fest an das Enzym gebunden sein (fest gebunden bedeutet nicht immer kovalent gebunden, beispielsweise ist FAD zwar eine prosthetische Gruppe, ist aber nicht kovalent gebunden). Coenzyme sind typischerweise eher kleine Moleküle, also keine Makromoleküle. Viele Vitamine sind Coenzym-Vorstufen. Das bedeutet, das Vitamin liefert das chemische Gerüst, das der Mensch nicht selbst aufbauen kann. Die Struktur wird aber meist noch etwas modifiziert. In Glykoproteinen sind die Zuckerketten kovalent an Aminosäureseitenketten gebunden. Die Verknüpfung erfolgt entweder N-glykosidisch über die Seitenkette von Asparagin oder O- glykosidisch über die Seitenkette von Serin, Threonin oder Tyrosin. Das enzymatische Anhängen der Zuckerketten erfolgt im ER und im Golgi-Apparat. Proteine können über Lipidanker (z. B. Geranyl-, Farnesyl-Ketten) in der Membran verankert werden. Das Enzym Carboanhydrase ist wichtig zur Beschleunigung der Gleichgewichtseinstellung zwischen gelöstem CO2 und HCO3- im Blut. Trypsin kann durch Serpine (Serinprotease-Inhibitoren) gehemmt werden, da es sich um eine Serin-Protease handelt, das bedeutet, im aktiven Zentrum befindet sich ein wichtiger, am enzymatischen Mechanismus beteiligter Serin-Rest. Wie alle Proteasen gehört Trypsin zur Klasse der Hydrolasen. Es spaltet Peptid-Bindungen bevorzugt auf der Carboxyl-Seite der basischen Aminosäuren Lysin und Arginin. Trypsin spaltet innerhalb einer Peptidkette und wird deshalb als Endopeptidase bezeichnet. Manche von Enzymen katalysierte Reaktionen sind unter physiologischen Bedingungen irreversibel. Das bedeutet, dass die jeweilige Reaktion unter diesen Bedingungen sehr weit auf der einen Seite liegt, so dass die Reaktion “praktisch” vollständig in eine Richtung abläuft. Solche irreversiblen Reaktionen bilden häufig wichtige Kontrollpunkte in Stoﬀwechselwegen. Alle Aminosäuren enthalten mindestens zwei Kohlenstoﬀatome (nämlich selbst die kleinste Aminosäure Glycin). Wenn die Substratkonzentration deutlich größer als der Km-Wert ist (also [S]>>Km), wenn also eine klare Sättigung mit Substrat vorliegt, so hängt die Reaktionsgeschwindigkeit nur noch von der Gesamt-Enzymkonzentration und von kcat ab, denn Vmax=[E] x kcat. Biotin ist der Cofaktor für Carboxylierungsreaktionen (Ausnahme: bestimmte Blutgerinnungsfaktoren, die eine gamma-Carboxylierung an Glutamt-Seitenketten mit Hilfe von Vitamin K erhalten) und ist dabei fest an das Enzym gebunden, bildet also eine prosthetische Gruppe. ATP, NADP+, NADH sind hingegen typische Vertreter von Co-Substraten, d.h. sie sind nicht fest an das Enzym gebunden. Page 17 of 26 Juli 2023 HMJK Bei einer Plasmaprotein-Elektrophorese (wie im Praktikum durchgeführt) können bei pH 8,6 größere Proteine schneller in Richtung Anode (Pluspol) wandern, wenn sie mehr negative Ladungen als die kleineren Proteine haben (viele Aspartat- und Glutamat-Reste). Nach gelelektrophoretischer Auftrennung lässt sich in einer Plasmaprobe ein Protein spezifisch anfärben, indem man das gesuchte Enzym ein Substrat zu einem Farbstoﬀ umwandeln lässt (im Praktikum mit Lactat-Dehydrogenase, Sichtbarmachung der LDH-Isoformen nach Auftrennung mittels Gelelektrophorese). Nicht geeignet wäre hingegen eine unspezifische Anfärbung (wie am zweiten Versuchstag durchgeführt). Die Markierung mit Ubiquitin ist Voraussetzung dafür, dass Proteine im Proteasom abgebaut werden können. Sie steht in keiner Beziehung zum Abbau im Lysosom. Die Lactat-Dehydrogenase (LDH) ist ein Tetramer und besteht aus H- und/oder M-Untereinheiten. Sie gehört zur Enzymklasse der Oxidoreductasen. Die LDH kann als Marker zur Diagnose eines Herzinfarkts herangezogen werden. Die Aktivität der LDH im Plasma erhöht sich nach Hämolyse. Die Lipoproteinlipase wird durch das Apolipoprotein CII aktiviert. In Sphingolipiden ist die Fettsäure als Säureamid gebunden. MOLEKULARBIOLOGIE Eine Primase ist ein Enzym, das im Verlauf der Replikation (Verdoppelung des Erbmaterials zur Vorbereitung der Zellteilung) die RNA-Primer bereitstellt. Diese sind notwendig, weil DNA- Polymerasen im Gegensatz zu RNA-Polymerasen immer ein bereits vorhandenes freies 3’-Ende benötigen, also einen Strang nicht de novo synthetisieren können. Die RNA-Primer werden später durch RNasen abgebaut und durch DNA ersetzt. Am Prozess der Transkription sind beteiligt: Promotor, Template-Strang, RNA-Polymerase und NTPs, aber keine DNA-Polymerasen. DNA kann in DNA kopiert werden (beispielsweise im Zuge der Replikation). RNA kann in DNA umgeschrieben werden (Reverse Transkription). DNA kann in RNA umgeschrieben werden (Transkription). RNA kann in Proteine umgesetzt werden (Translation). ABER: Proteine können NICHT in RNA rückübersetzt werden. Die Funktionen von RNA (unterschiedlichen Typen von RNA) im Körper umfassen Informationsspeicherung, katalytische Aktivität, Aminosäure-Transport und strukturelle Komponente von größeren Komplexen. RNA ist aber im Gegensatz zu Kohlenhydraten, Fetten und Proteinen kein Energiespeicher. Das Ribosom ist ein Ribonucleoprotein-Komplex. ATP wird bei der Replikation NICHT als Nukleotid eingebaut, denn ATP ist ein Ribonucleotid. Bei der Replikation (DNA-Synthese!) werden aber Desoxyribonucleotide benötigt. Umgekehrt kann dATP nicht in RNA eingebaut und auch nicht von Kinasen als Substrat verwendet werden. Die DNA-abhängige RNA-Polymerase II bildet die Vorstufe der zur Proteinbiosynthese benötigten mRNA. Sie synthetisiert nicht RNA-Primer, sie stellt keine tRNAs her, und sie transkribiert nicht die rRNA-Gene. Page 18 of 26 Juli 2023 HMJK Ein Nukleosom enthält ein Oktamer aus vier verschiedenen Histon-Proteinen. Histon-Proteine spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genaktivität. Modifikationen an Histonen können sehr stabil sein. Modifikationen an Histonen beeinflussen den Verpackungsgrad von DNA. Spezifische Histonmodifikationen dienen als Bindestelle für weitere Proteine. DNA-Polymerasen benötigen immer eine Matrize, synthetisieren den neuen Strang immer in 5’-3’- Richtung (das bedeutet, der Matrizenstrang wird immer in 3’-5’-Richtung abgelesen), brauchen immer eine freie 3’-OH-Gruppe (im Gegensatz zu RNA-Polymerasen) und stellen immer ein semikonservatives Produkt her. Als Bausteine verwenden sie ausschließlich Desoxynucleotide. RNA-Polymerasen brauchen keinen Primer, synthetisieren immer in 5’-3’-Richtung, benötigen NTPs und lesen in 3’-5’-Richtung ab. Bei einer PCR wird keine Helikase benötigt. BLUT Hämoglobin besteht aus vier Untereinheiten und kann dementsprechend vier Moleküle O2 binden. Zur O2-Bindung muss das komplexierte Eisen als Fe2+ vorliegen (Oxidationsstufe 2, sogenannte Ferroform). Wird das Fe2+ in Fe3+ oxidiert (Oxidationsstufe 3), kann es nicht mehr O2 binden. Dieses “kaputte” Haemoglobin wird als Methämoglobin bezeichnet. Es kann durch die Methämoglobin-Reductase wieder in funktionelles Hämoglobin überführt werden. Etwa 65% des funktionellen Eisens im Körper sind an Hämoglobin gebunden. EDTA kann nur in vitro (im Reagenzglas) als Gerinnungshemmer eingesetzt werden, jedoch nicht zur Behandlung im Organismus (da es völlig unspezifisch Ionen komplexiert und daher giftig ist). Acetylsalicylsäure und Vitam-K-Antagonisten sind nicht in vitro wirksam, da sie bestimmte Komponenten benötigen, um ihre Wirksamkeit zu entfalten. Diese sind in der künstlichen, unphysiologischen Umgebung in vitro nicht vorhanden. Heparin muss direkt in die Blutbahn eingebracht werden (entweder intravenös oder subkutan gespritzt), kann jedoch nicht oral eingenommen werden, da es im Verdauungstrakt zersetzt wird und außerdem aufgrund seiner Größe nicht von den Darmzellen resorbiert werden könnte. Es wirkt im Gegensatz zu Vitamin-K-Antagonisten sofort, also ohne Verzögerung, indem es an Antithrombin III bindet und dessen Hemmwirkung (u.a. auf Thrombin) erheblich verstärkt. Bei der Serum-Papierelektrophorese werden die Proteine nach Größe, Form und Ladung getrennt. Bei einer typischen, nicht kompensierten metabolischen Acidose ist der pH-Wert des Blutes erniedrigt, und es befindet sich zu wenig Bicarbonat im Blut. Sie kann bei gestörter Nierenfunktion und bei starken Durchfällen auftreten. Die Gerinnungsfaktoren II (Prothrombin), VII, IX und X benötigen in ihrer aktiven Form einen modifizierten Glutamat-Rest in der Kette, nämlich gamma-Carboxyl-Glutamat, das mit Hilfe einer Vitamin-K-abhängigen Carboxylase gebildet wird. Das Enzym Plasmin löst Fibringerinnsel direkt auf. Page 19 of 26 Juli 2023 HMJK Der abschließende Schritt der Blutgerinnung besteht in einer Quervernetzung von Fibrin- Aggregaten, so dass unlösliches Fibrin-Polymer gebildet wird. Bei diesem Schritt verbindet eine Transamidase die Seitenketten eines Glutamin- und eines Lysinrestes des Fibrins unter Abspaltung von Ammoniak und unter Bildung einer Isopeptidbindung. Die O2-Bindungskurve des Hämoglobins verschiebt sich nach rechts (also zu geringerer O2- Aﬃnität) durch Erhöhung des CO2-Gehalts, Absinken des pH-Werts (mehr Protonen) und eine Erhöhung der 2,3-Bisphosphoglycerat-Konzentration (Höhenanpassung). Hämoglobin: Bei einer Thalassämie kommt es zu einer verringerten Synthese des Globins. Die Bindetasche des Häm wird von hydrophoben Seitenketten ausgekleidet. Wenn diese aufgrund einer Mutation durch hydrophilere Seitenketten ersetzt werden, so kann Häm nicht mehr ausreichend gebunden werden, und es kommt zu einer verminderten O2-Aﬃnität. Nitrite, Nitrate und eine Reihe von Medikamenten (z. B. Chloroquin) können eine Methämoglobinämie auslösen. Glutathion und die Methämoglobin-Reductase verhindern einen zu hohen Spiegel an Methämoglobin in den Erythrozyten. Bei der Hämochromatose wird zu viel Eisen aufgenommen und im Körper gespeichert. Es gibt keinen Mechanismus, um Eisen aktiv auszuscheiden. Eisenverluste sind nur über einen Blutverlust möglich. Der CO2/Bicarbonatpuﬀer des Blutes bildet ein oﬀenes Puﬀersystem. Er hat eine größere Puﬀerkapazität als der Hämoglobin-Puﬀer. Er weist unter physiologischen Normalbedingungen auch eine höhere Konzentration als der Hämoglobin-Puﬀer auf. Die Carboanhydrase ist für eine schnelle Einstellung des Puﬀergleichgewichts wichtig. Der physiologische pH-Wert des Blutes entspricht jedoch nicht dem Puﬀeroptimum des CO2/Bicarbonat-Puﬀersystems. Die beste Puﬀerwirkung bei physiologischem pH-Wert (ca. 7,4) weist die Aminosäure Histidin auf, da der in ihrer Seitenkette enthaltene Imidazolring einen pKs-Wert von ca. 7 hat und damit besonders nahe am zu puﬀernden pH-Wert liegt. Fötales Hämoglobin hat eine höhere Sauerstoﬀaﬃnität als das Hämoglobin eines Erwachsenen. Molekularer Sauerstoﬀ bindet nur an Hämoglobin mit Fe2+. Eisen wird als Fe3+ in Ferritin gespeichert. Im Blutplasma wird Eisen an Transferrin gebunden transportiert. Humanes Ferritin besitzt eine Ferroxidase-Aktivität. Wenn Plasmaproteine aus einer Blutserumprobe elektrophonetisch wie im Praktikum bei pH 8,6 aufgetrennt werden, so erfolgt die Auftrennung nach Größe und Ladung. Albumin wandert dabei immer am schnellsten (abgesehen von der sehr kleinen Präalbumin-Fraktion), weil es besonders klein im Vergleich zu den anderen Serumproteinen ist. Serumprobe und Plasmaprobe lassen sich in einem Elektropherogramm daran unterscheiden, wie ausgeprägt das “Tal” zwischen der beta- und der gamma-Globulin-Fraktion ist, da genau dort das Fibrinogen läuft (das bedeutet: Wenn ein deutliches “Tal” zu sehen ist, handelt es sich um eine Serumprobe, wenn das “Tal” kaum zu sehen ist, handelt es sich um eine noch Fibrinogen enthaltende Plasmaprobe). HbF hat eine höhere Aﬃnität zu Sauerstoﬀ als HbA. 2,3-Bisphosphoglycerat verschiebt die Sauerstoﬀbindunngskurve nach rechts. HbS-Fasern (Sichelzellanämie) schädigen die Zellmembran der Erythrozyten und führen dadurch zu Mikrothromben und zur Hämolyse. Thromboxane fördern die Aggregation von Thrombozyten. Page 20 of 26 Juli 2023 HMJK Ein Mechanismus der Bildung von Arteriosklerose besteht darin, dass Makrophagen vermehrt oxidierte LDL bilden. Die häufigste Ursache einer Hypoproteinämie ist eine verminderte Produktion von Plasmaproteinen in der Leber. Die gesinnungshemmende Wirkung von Heparin beruht darauf, dass es an Antithrombin III bindet und dessen Hemmwirkung dadurch erheblich verstärkt. Hämoglobin ist die Komponente des Nicht-Bicarbonat-Puﬀers mit der höchsten Puﬀerkapazität. Eine Linksverschiebung der Sauerstoﬀ-Bindungskurve des Hämoglobins tritt bei einer Alkalose ein. Gerinnungshemmstoﬀ bzw. Gegenspieler der Blutgerinnung sind: Antithrombin III, Heparin, Gewebsplasminogenaktivator und aktiviertes Protein C (APC), aber nicht Thromboxan A2 (TxA2). Vitamin-K-Antagonisten vermindern oder unterbinden indirekt die Calcium-Bindefähigkeit einiger bestimmter Gerinnungsfaktoren. Heparin bindet an Antithrombin III und verstärkt dessen Wirkung. EDTA kann in vitro (im Reagenzglas, im Laborversuch) als Hemmstoﬀ der Gerinnungskaskade eingesetzt werden, aber nicht in vivo (im Organismus). EDTA als allgemeiner Ionen-Chelator hätte schwerwiegende Nebeneﬀekte. Glykiertes Hämoglobin gibt Auskunft über den Blutzuckerspiegel der letzten zwei bis drei Monate (Langzeitwert; die zeitliche Rückschau ergibt sich aus der durchschnittlichen Lebensdauer von Erythrozyten). Ordnet man die Puﬀersysteme des Blutes nach abnehmender in vivo-Puﬀerkapazität, so ergibt sich folgende Reihenfolge: Bicarbonat/CO2 - Hämoglobin - Plasmaproteine - Dihydrogenphosphat/Hydrogenphosphat (kurz “Phosphat”, aber eigentlich falsche Bezeichnung). Thalassämien und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase-Mangel sind zwei Beispiele für hämolytische Anämien. Glykiertes Hämoglobin (HbAc-Wert) ist ein guter Indikator zur langfristigen Beurteilung des Blutzuckerspiegels. Personen mit homozygot defekter Methämoglobin-Reductase bilden ohne Behandlung eine erhebliche Zyanose aus. Beta-Thalassämie und Sichelzellanämie treten erst nach der Geburt ein, da dann die gamma- Globin-Ketten durch beta-Ketten ersetzt werden. Da die Membran der Erythrozyten schlecht für Protonen durchlässig ist, gelangen die Säureäquivalente als CO2 in die Zellen. Heparin ist vielfach negativ geladen, also ein Polyanion. Es kann durch ein Polykation (Protamin) neutralisiert werden. IMMUNBIOLOGIE Die Strukturen eines Antikörpers, die die Antigenspezifität bestimmen, befinden sich im N- terminalen Bereich der Proteinketten. Page 21 of 26 Juli 2023 HMJK Die Reifung der T-Lymphozyten findet nicht im Knochenmark, sondern im Thymus statt. Am klassischen Weg der Aktivierung des Komplementsystems sind Immunglobuline (Antikörper) beteiligt. Es wird ein “Membrane attack complex” gebildet, der letztlich die Zelllyse vermittelt. Am alternativen Weg des Komplementsystems sind keine Antikörper beteiligt. Dendritische Zellen weisen auf ihrer Oberfläche sowohl MHC-I- als auch MHC-II-Komplexe auf. Immunglobuline der Klasse M (IgM) weisen zehn Bindungsstellen für Antigene auf. IgE haben zwei Antigen-Bindungsstellen. IgG sind die häufigsten Antikörper im Blut. Am besten Plazenta-gängig sind Antikörper der Klasse G (IgG). Alle Immunglobuline enthalten Disulfidbrücken. B-Lymphozyten sind die Vorstufe von Plasmazellen. MHC-I-Komplexe finden sich typischerweise auf den Oberflächen aller kernhaltigen Zellen. Makrophagen exprimieren nach der Aktivierung sowohl MHC-I als auch MHC-II auf ihrer Oberfläche. Defensine sind kleine Peptide, die der Abwehr von Mikroorganismen dienen. Es handelt sich nicht um Antikörper. Basophile Granulozyten schütten unter anderem Histamin, Serotonin und Heparin aus, die in intrazellulären Granula gespeichert sind. Das Komplementprotein C3b wird für die Opsonierung eines Pathogens benötigt. Ein reifer T-Lymphozyt trägt entweder CD4- oder CD8-Proteine auf seiner Oberfläche. Die Bindungsfähigkeit eines Antikörpers zu seinem Antigen wird im wesentlichen durch Hypermutationen im variablen Bereich bestimmt. Der Fc-Teil eines Antikörpers enthält Disulfidbrücken. Er kann glykosyliert werden. Er enthält Erkennungs- und Bindestellen für Rezeptoren. Er kann zur Herstellung klassenspezifischer Antikörper benutzt werden. Die Immunglobuline der Klasse IgA besitzen größtenteils vier Antigenbindungsstellen. IgE-Antikörper stimulieren Mastzellen. Antikörper der Klasse IgE binden mit dem Fc-Teil an Mastzellen. B-Lymphozyten besitzen Moleküle der MHC-II-Klasse auf ihrer Zellmembran. Bei einer passiven Immunisierung werden Antikörper gespritzt. Hypervariable Regionen in einem Antikörper gibt es sowohl in der schweren H-Kette als auch in der leichten L-Kette. Immunglobuline bestehen größtenteils aus beta-Faltblatt-Sekundärstrukturen. Page 22 of 26 Juli 2023 HMJK Der Fc-Teil von Antikörpern enthält Disulfidbrücken zwischen den schweren Ketten, bildet den konstanten Teil, kann glykosyliert werden, enthält Erkennungs- und Bindestellen für Rezeptoren und kann zur Herstellung klassenspezifischer Antikörper herangezogen werden. Die Antigen-Spezifitaet von Antikörpern liegt immer in der N-terminalen Region. Die einzige Antikörperklasse, die Plazenta-gängig ist, sind die IgG. Eine J-Kette findet sich nur bei den Antikörper-Klassen M und A. Antikörper sind charakteristisch für die erworbene Immunantwort. Dendritische Zellen besitzen auf ihrer Oberfläche sowohl MHC-I- als auch MHC-II-Proteine. IgE stimulieren Mastzellen. Im Praktikum wurde ein sogenannter “Sandwich-ELISA” durchgeführt. Wichtig ist dabei, dass die verwendeten Antikörper zwar dasselbe Zielmolekül (Insulin) erkennen, aber verschiedene Bindestellen an diesem Antigen haben. Im Gegensatz zur typischen Vorgehensweise in der Immunhistochemie gibt es beim Sandwich-ELISA keine direkte Interaktion zwischen dem ersten und dem zweiten Antikörper. IgG besitzen als typische “Y-förmige” Antikörper jeweils zwei schwere und zwei leichte Ketten. Die Immunglobuline der Klasse A besitzen ein J-Peptid. Fc-Rezeptoren von Makrophagen binden an Antigen-Antikörper-Komplexe. Die Zellmembran aller Kern-haltigen Zellen besitzen MHC-I-Proteine an der Oberfläche. Das gilt nicht für den MHC-II-Komplex. Für die Opsonierung eines Pathogens wird das Komplementprotein C3b benötigt. Perforine werden von zytotoxischen T-Zellen produziert. Die Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers wird als Paratop bezeichnet. An ihrer Ausbildung ist der variable Abschnitt der schweren Kette beteiligt. Die Bindungsstelle wird durch somatische Rekombination in den Genen für die schweren und leichten Ketten gebildet. Sie wird beim sogenannten “Klassen-Switch” nicht verändert. Das Komplementsystem gehört nicht zur erworbenen Immunität. B- und T-Lymphozyten entstehen aus einer gemeinsamen lymphoiden Vorläuferzelle. Die Reifung der T-Lymphozyten erfolgt im Thymus (daher der Name!). Dendritische Zellen haben sowohl Proteine des MHC-I als auch des MHC-II an der Oberfläche. Immunglobuline der Klasse IgA besitzen vier Antigen-Bindungsstellen. B-Lymphozyten entwickeln sich während der Hämatopoese aus sogenannten lymphoiden Vorläuferzellen. Die Immunglobuline der Klasse IgG sind als einzige Klasse Plazenta-gängig. Fibrinogen und CRP sind bedeutende Akut-Phase-Proteine. Granzyme und Perforine werden von zytotoxischen T-Zellen produziert und abgegeben, nicht jedoch von T-Helferzellen. Page 23 of 26 Juli 2023 HMJK Interferone werden vor allem zur antivrialen Immunabwehr sezerniert. Lösliche Antikörper sind charakteristisch für die erworbene Immunantwort. Die Spezifität von Antikörpern wird immer am N-terminalen Bereich bestimmt, unabhängig von der Antikörper-Klasse. Die im Praktikum durchgeführte Insulinbestimmung mittels eines Sandwich-ELISA benötigt ein Enzym (Peroxidase), einen ersten und einen zweiten Antikörper sowie ein Farbsubstrat, aber keinen kompetitiven Inhibitor. Der CD4-Corezeptor befindet sich in der Membran von T-Helferzellen. Sowohl die leichte L-Kette als auch die schwere H-Kette besitzen hypervariable Regionen. Im Körper am häufigsten sind Antikörper der Klasse IgA. Im Blutplasma mit weitem Abstand am häufigsten sind dagegen Antikörper der Klasse IgG, gefolgt von IgA und IgM. Aktivierte Makrophagen sezernieren unter anderem Interleukin 1b, IL-6 und den Tumor-Nekrose- Faktor. Das Komplementsystem gehört zur angeborenen Immunität. Immunglobuline der Klasse IgM besitzen einen pentameren Aufbau und haben daher zehn Antigen-Bindungsstellen. Fibrinogen ist ein typisches Akut-Phase-Protein. B-Lymphozyten besitzen wie alle Kern-haltigen Zellen Proteine des Typs MHC-I auf ihrer Oberfläche. Der CD8-Corezeptor befindet sich in der Zellmembran zytotoxischer T-Zellen. T-Lymphozyten, die MHC-Molekül-Komplexe mit ausreichend hoher Spezifität erkennen, resultieren aus positiver Selektion. Die löslichen Immunglobuline der Klasse IgG werden von Plasmazellen gebildet. Dendritische Zellen sind Antigen-präsentierende Zellen. Immunglobuline der Klasse IgG besitzen KEIN J-Peptid. Antikörper werden posttranslational glykosyliert. MHC-Moleküle der Klasse II werden von Antigen-präsentierenden Zellen exprimiert. MHC- Moleküle sind Proteine, die im ER bereit gehalten und dort mit Peptidfragmenten beladen werden, danach wandern sie über den Golgi-Apparat und von dort abgeschnürte Vesikell an die Zellmembran. Am stärksten in der Muttermilch vertreten ist die Antikörper-Klasse IgA. Aktivierte Makrophagen sezernieren Zytokine zur Auslösung der Akut-Phase-Antwort. IgA und Lysozym tragen zur Immunabwehr in Schleimhäuten bei. Makrophagen und dendritische Zellen besitzen zahlreiche Toll-like-Rezeptoren. Der klassische Weg der Aktivierung des Komplementsystems benötigt IgG oder IgM. Der alternative Weg geht hingegen von Proteasen aus und erfolgt ohne Beteiligung von Antikörper- Molekülen. Page 24 of 26 Juli 2023 HMJK IgM besitzen eine hohe Avidität (da sie insgesamt 10 Bindestellen haben). T-Lymphozyten entwickeln sich aus lymphoiden Vorläuferzellen. Neutrophile Granulozyten spielen wegen ihrer Phagozytose-Aktivität eine wichtige Rolle im Immunsystem. Makrophagen gehören zu den Antigen-präsentierenden Zellen. Natürliche Killerzellen gehören zum angeborenen Immunsystem. B-Lymphozyten reifen im Knochenmark. Beim im Praktikum eingesetzten Sandwich-ELISA stimmt das Fab-Fragment des ersten Antikörpers nicht mit dem Fab-Fragment des zweiten Antikörpers überein, da die beiden Antikörper zwar dasselbe Antigen (im Versuch Insulin) erkennen, aber unterschiedliche Bindestellen benutzen. Das Antigen muss also mindestens zwei verschiedenen Epitope haben. Am zweiten Antikörper muss Biotin gebunden sein, damit eine stöchiometrische Kopplung mit dem Enzym Peroxidase erfolgen kann. Nur dann ist die gebildete Menge an Farbstoﬀ proportional zur vorhandenen Insulinmenge. Nach Zugabe der Peroxidase muss mindestens ein Waschschritt erfolgen. Die Farbstoﬀbildung wird vor der Auswertung im “Plate Reader” durch Zugabe von Säure gestoppt. Dendritische Zellen aktivieren sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Lymphozyten. Die Einteilung der Immunglobuline in fünf Klassen erfolgt aufgrund der schweren Ketten. SIGNALTRANSDUKTION Rezeptortyrosinkinasen phosphorylieren nach Aktivierung eigene Tyrosin-Reste auf der zytosolischen Seite (daher der Name!). Gleiches gilt für den strukturell verwendeten, wenngleich etwas vom Grundschema abweichenden Insulinrezeptor. Rezeptortyrosinkinasen übertragen keine Phosphatgruppen auf Serin- oder Threoninreste. Diese werden ausschließlich von Serin/Threoninkinasen phosphoryliert. Phosphodiesterasen spalten den “second messenger” cyclo-AMP (cAMP) und deaktivieren ihn dadurch. Aktivierte Untereinheiten von G-Proteinen deaktivieren sich nach gewisser Zeit selbst, indem das gebundene GTP zu GDP hydrolysiert wird. “Second messenger” werden intrazellulär gebildet und wirken ausschließlich innerhalb der Zelle. Aktivierte G-Proteine haben immer ein GTP gebunden. Im inaktivierten Zustand tragen sie dagegen ein GDP, das nämlich durch eine intrinsische GTPase-Aktivität aus dem GTP mittels Hydrolyse gebildet wurde. cAMP (5’,3’-cyclo-AMP) ist der typische Hungermetabolit, der aufgrund eines Glukagon- oder Adrenalinsignals aus ATP gebildet wird und dann an die regulatorischen Einheiten der Proteinkinase A bindet, wodurch diese aktiviert wird (einfach zu merken: cAMP bindet an die PKA). Insulin ist ein Antagonist des Glukagons. Es senkt intrazellulär die Konzentration des “second messenger” cAMP. Es besteht aus einer A- und einer B-Kette, die über Disulfidbrücken Page 25 of 26 Juli 2023 HMJK miteinander verbunden sind. Es hemmt die Lipolyse. Der Insulinrezeptor gehört zur Gruppe der Tyrosinkinasen, nicht zu den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Der “second messenger” cAMP wird durch die Adenylatcyclase synthetisiert.Er wird direkt aus ATP gebildet. Im Zytosol aktiviert cAMP die Proteinkinase A. Es wird schließlich durch eine Phosphodiesterase abgebaut. Als typischer “second messenger” interagiert cAMP nicht mit den schlussendlichen Eﬀektoren, sondern indirekt. Das bedeutet, dass beispielsweise cAMP die Proteinkinase A aktiviert, diese wiederum Transkriptionsfaktoren phosphoryliert und dadurch eine Induktion der Genexpression oder eine Regulation anderer Proteine erfolgt. cAMP ist nur “messenger”, also kein direkter Eﬀektor. Die Verbindung cAMP ist der typische “second messenger” eines primären Glkcagon-Signals. cAMP ist ein “second messenger”. Er wird durch das Enzym Adenylatzyklase gebildet und später durch eine Phosphodiesterase abgebaut. cAMP wird aus ATP gebildet. Hohe Konzentrationen an cAMP inhibieren die Glykogensynthese (denn cAMP ist das typische “Hungersignal”, ausgelöst durch die Bindung des “Hungerhormons” Glukagon). Page 26 of 26

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