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Macromoléculas compuestas por una secuencia de ***aminoácidos*** formada por una o varias cadenas polipeptídicas. Cumplen todas las funciones que se llevan a cabo en las células, es decir órdenes contenidas en el ADN, como transporte, movimiento, etc. La actividad de una proteína está determinada p...

Macromoléculas compuestas por una secuencia de ***aminoácidos*** formada por una o varias cadenas polipeptídicas. Cumplen todas las funciones que se llevan a cabo en las células, es decir órdenes contenidas en el ADN, como transporte, movimiento, etc. La actividad de una proteína está determinada por su ***estructura tridimensional***, determinada por la secuencia de aminoácidos, determinada por la secuencia de bases del ADN. ***Función*** → Tarea que realiza ***Actividad*** → Si la proteína funciona o no funciona #### Jerarquías Estructurales 1. 2. 3. 4. ***[Estado Nativo:]*** Luego de la estructura terciaria, es el estado termodinámico más estable de la proteína con menor energía libre, lleva a cabo la función de la proteína. **[Chaperonas:]** Facilitan el plegamiento de proteínas recién sintetizadas, parcialmente plegadas o repliegan proteínas mal plegadas y las estabilizan evitando su agregación. Pueden ser ***chaperonas moleculares***, se unen temporalmente a la proteína no plegada, la estabilizan y evitan su agregación y degradación. (ej: Hsp70. Hsp90, Bip), o ***chaperoninas***, complejos supramoleculares, que unen la proteína y durante un tiempo proveen un ambiente necesario. ***[Mal plegamiento:]*** Si se muta una de las bases en el ADN, se modifica el plegamiento. Este modifica toda la forma de la proteína, entonces no se obtiene la forma adecuada para cumplir con su actividad, por lo tanto, no se podrá degradar. Produciendo una acumulación de estas proteínas dando como resultado diferentes enfermedades. ***[Complementariedad Molecular:]*** Las proteínas no interactúan por enlaces covalentes, se hace mediante interacciones débiles, uniéndose mediante un ligando. Pueden ser Antígeno -- Anticuerpo, Enzima -- Sustrato, Proteína -- Proteína, etc. 2\. Biomembranas Todas las membranas se caracterizan por su permeabilidad selectiva, por poseer transportadores y proteínas, y que su función sea aislar reacciones bioquímicas que no pueden estar libres en el citoplasma. #### Estructura Su estructura se explica mediante el modelo de mosaico fluido, compuesto de una bicapa lipídica con proteínas asociadas. La bicapa lipídica se forma de tres compuestos principales - - - - #### Propiedades de la Bicapa Fosfolipídica **[Movimiento:]** ***Difusión lateral***, los lípidos pueden desplazarse por las dos hemicapas de la membrana, pueden ***rotar***, el lípido da vueltas sobre sí mismo, y pueden ***flexionarse***, orientar su cola para un lado o para otro. El ***flip-flop***, el lípido pasa de un a hemicapa a la otra, [el flip flop espontáneo no existe], ya que no es termodinámicamente favorable, si lo pueden hacer gracias a transportadores. **[Fluidez:]** La membrana puede adoptar dos consistencias, de ***gel cristalino***, menos fluida y más ordenada, o ***líquida***, menos ordenada y más fluida. Hay varios factores que influyen: ***Temperatura*** Baja → Gel Alta → Líquido --------------------------- ---------------------- ---------------------------- ***Composición Química*** A.C. Saturados → Gel A.C. Insaturados → Líquido ***Largo de Cadena*** Larga → Líquida Corta → Gel ***Colesterol*** T. Alta → Gel T. Baja → Líquida **[Asimetría:]** Hay dos tipos de asimetría, la asimetría ***de bicapa*** refiere a la distinta composición lipídica entre ambas hemicapas, mientras que la asimetría ***de membrana,*** contempla también la distinta composición de proteínas e hidratos de carbono entre ambas hemicapas. **[Biogénesis de Membrana:]** El retículo endoplásmico se desparrama por toda la célula, tiene puntos de contacto con las demás organelas, lo que favorece poder transportar los lípidos producidos a las membranas. **[Espesor:]** Mientras más larga es la cadena, más espesa resulta la membrana. **[Curvatura:]** La forma está determinada genéticamente. Cada fosfolípido tiene una cabeza polar y una cola hidrofóbica, dependiendo de la proporción entre el tamaño de la cabeza y la cola. inducen distintas curvaturas: - - - #### Proteínas Asociadas a la Membrana Las proteínas se pueden clasificar en; proteínas ***integrales***, que interactúan con el núcleo hidrofóbico de la bicapa, y proteínas ***periféricas***, que no interactúan con el núcleo. Si quiero separarlas de la membrana: - - Hay algunas proteínas que pueden desplazarse como quieran, mientras que algunas interaccionan con el lado citoplasmático, por ejemplo con el citoesqueleto de actina, y por lo tanto se encuentran ancladas. También hay proteínas que pueden moverse en una sola dirección, y hay otras que forman clusters (agrupaciones de proteínas) y solo van a poder moverse entre un cluster y otro. ***[Vectorialidad de Membrana:]*** Refiere a la orientación y dirección específica de los procesos que ocurren en la membrana plasmática. Ciertas funciones de la membrana, como el movimiento de iones o la transmisión de señales, tienen una dirección preferente, lo que es esencial para mantener gradientes, polaridad celular y la correcta comunicación entre diferentes compartimentos celulares. Por ejemplo, los azúcares y los puentes de sulfuro siempre se encuentran en el dominio extracelular debido a que el citoplasma es altamente reductor por lo que rompería los puentes disulfuro formando de nuevo los dos hidroxilos. 3-4. Transporte a través de Membranas Hay dos mecanismos principales de transporte, ***activos***, requieren energía y transportan solutos en contra de los gradientes, o ***pasivos***, se producen de manera espontánea, no requieren energía. #### Activos - a. b. c. d. - a. b. #### Pasivos - - a. - - b. 5-6. Compartimentos Celulares Cuando se evolucionó a la célula eucariota, se desarrolló un *sistema de endomembranas*, compartimentos funcionalmente diferentes determinados por las proteínas que los componen. Todas las proteínas se sintetizan en los ribosomas y se tienen que desplazar hacia los distintos compartimentos para llegar a la organela en la cual tiene que cumplir su función. Cuando se sintetizan tienen una ***señal de clasificación***, un péptido con una secuencia que le indica a dónde ir, este péptido necesita alguien que lo reconozca, un ***receptor de clasificación***. Hay tres mecanismos para el movimiento de una proteína: 1. 2. 3. El transporte puede ser de tipo ***post-ancional***, donde la proteína se sintetiza completamente en el citosol y después ingresa a la organela o, ***co-transicional***, donde la proteína se va sintetizando mientras va ingresando la organela, esa translocación permite el ingreso de proteínas plegadas o no plegadas. ### Transporte Regulado El interior del núcleo es topológicamente equivalente al citosol. En el núcleo se encuentran los ácidos nucleicos, rodeados de una doble membrana que contiene poros, ***poros nucleares***, con un entramado de filamentos intermedios conocidos como ***lámina nuclear.*** Los poros nucleares están formados por 30 proteínas, conocidas como ***nucleoporinas***. Por el poro nuclear van a pasar un montón de cosas como macromoléculas, por ejemplo el ARN que tiene que salir del núcleo para traducirse en el citosol. Los poros nucleares forman un canal a través del cual pueden pasar macromoléculas. Este transporte está mediado por un gradiente de nucleótidos GDP-GTP. Las proteínas no tienen un péptido señal, solo una secuencia de localización nuclear NLS, ubicado en cualquier parte de la proteína. Las importinas receptoras en el citosol reconocen la ***NLS*** y la llevan hacia el poro nuclear, donde interactúan con las fibrillas citosólicas para facilitar el ingreso al núcleo. Una vez dentro, la proteína Ran unida a GDP (Ran-GDP) participa, allí hay un ***intercambiador GEF***, que reemplaza *GDP por GTP en Ran*, permitiendo a la proteína ser liberada y reciclada. Si las proteínas salen del núcleo, las proteínas que participan son las exportinas, que reconocen una señal de exportación y llevan a cabo el mismo mecanismo en sentido inverso, regulado igualmente por Ran-GTP. ### Transporte Transmembrana Este transporte necesita de un ***traslocador***, ya que va desde un espacio a otro topológicamente diferente. Es un transporte *unidireccional*, del citosol a la organela. #### Mitocondria La función principal de la mitocondria es la síntesis de ATP a través de la fosforilación oxidativa. Aunque posee su propio ADN, y ribosomas para sintetizar algunas de sus proteínas, la mayoría de las proteínas mitocondriales son codificadas por el ADN nuclear, sintetizadas en el citosol, y luego importadas a la mitocondria. La importación de estas proteínas es un proceso postraduccional, en el cual las proteínas deben ingresar a la mitocondria en un estado ***desplegado***. La señal de localización hacia la matriz mitocondrial se encuentra en el [extremo amino] de la proteína y suele consistir en una alfa hélice con aminoácidos hidrofóbicos. Esta es reconocida por un complejo de proteínas en la membrana externa de la mitocondria llamado complejo ***TOM***, que incluye un receptor y un translocador. Para que la proteína ingrese, atraviesa la membrana interna, gracias al complejo ***TIM23***. - Una vez en la matriz mitocondrial, la proteína atraviesa la membrana interna con la ayuda del complejo TIM23. Durante la translocación, las chaperonas citosólicas se desprenden, y chaperonas adicionales en la matriz mitocondrial,previenen el plegamiento prematuro de la proteína, también utilizando energía. Tras completar la translocación, una peptidasa señal corta la secuencia de señal, permitiendo que la proteína se pliegue en su forma funcional. La energía para este proceso proviene de la hidrólisis de ATP y del gradiente de protones entre el espacio intermembrana y la matriz mitocondrial. Los protones acumulados generan una diferencia de potencial, cuyo reingreso facilita la síntesis de ATP y la translocación de proteínas. #### Peroxisomas Los peroxisomas no tienen ADN ni ribosomas propios, lo que significa que todas las proteínas necesarias deben ser importadas desde el citosol después de su síntesis, se realiza postraduccionalmente. La señal de localización peroxisomal, ***PTS1***, es una secuencia de tres aminoácidos ubicada en el [carboxilo terminal]. Esta secuencia es reconocida por el receptor ***PEX-5***, se une a ella y se dirige hacia la membrana del peroxisoma, donde interactúa con otro componente del complejo de importación, ***PEX-14***, PEX-5, que forman un complejo translocador que permite el paso de la proteína hacia el interior del peroxisoma. La proteína entra plegada, por lo tanto no se necesitan chaperonas. El complejo translocador se recicla para ser reutilizado en el citosol, esto es facilitado por PEX-12, PEX-1 y PEX-6. Este complejo utiliza ubiquitinación y energía derivada de ATP para desanclar a PEX-5 de la membrana del peroxisoma, permitiendo que vuelva al citosol y participe en nuevas rondas de importación de proteínas. #### Retículo Endoplasmático Es un proceso co-traduccional, a medida que la proteína se va a sintetizando la proteína se va traslocando al retículo. Se necesita de una señal de clasificación ubicada en el [amino terminal], el receptor que reconoce a la secuencia señal se denomina ***Partícula de Reconocimiento de la Señal*** (***SRP***). El SRP reconoce la secuencia señal y se une a ella por su sitio de reconocimiento, como es una bisagra, el SRP envuelve al complejo formado por las subunidades del ribosoma, este tiene un sitio de pausa de la traducción que se une al ribosoma en el sitio donde normalmente se unirían los factores de elongación, impidiendo su acción y deteniendo temporalmente la síntesis de la proteína. La pausa es esencial para evitar que la proteína se sintetice completamente en el citosol, lo que impediría su translocación al retículo endoplásmico. También evita que proteínas potencialmente dañinas para la célula se activen en el citosol. Una vez formado este complejo SRP-ribosoma, se une a un receptor específico en la membrana del retículo, provocando un cambio conformacional que permite la interacción con el translocador ***Sec61***, facilitando así el paso de la proteína naciente al interior del RE. El Sec61 transporta a la proteína al retículo, un poro acuoso, y como el péptido señal es hidrofóbico, se ancla en la membrana del retículo, permitiendo la traslocación. La proteínas sintetizadas en el retículo, pueden luego ir al aparato de Golgi, lisosomas, membrana plasmática, y otras van a ir en vesículas secretoras que van a salir de la célula, esto se conoce como **[Vía Secretora]**. Una vez sintetizada la proteína en el retículo, va a sufrir una serie de procesos que sirven como un control de calidad: 1. 2. 3. 4. **[Puentes de Disulfuro:]** Estabiliza la estructura terciaria de las proteínas, ocurre por la enzima disulfurosa del retículo. Cuando hay dos grupos sulfidrilos próximos produce su oxidación, y un enlace entre los azufres. Si los puentes de disulfuro se establecen de forma lateral, la proteína no puede plegarse correctamente, quien corrige los errores es la disulfuro isomerasa. **[N-Glicosilación:]** Se añade un grupo de azúcares a un aminoácido, pero no al terminal. Se añaden presintetizarse en la membrana del retículo, donde un lípido llamado dolicol actúa como base para la adición de distintos carbohidratos en el lado citosólico. Esta cadena se traslada al interior del retículo, donde se le agregan 14 residuos de azúcar. La oligosacaril transferasa transfiere este grupo de azúcares a la asparagina de la proteína. La tunicamicina, puede inhibir este proceso al bloquear la adición de azúcares al dolicol, impidiendo el plegamiento correcto de la proteína. **[Ubiquitinación:]** La proteína ubiquitina se une a las lisinas de la proteína mal plegada ***y la marca para su degradación en el proteasoma***, estructura que degrada proteínas en la célula. Asegura que las proteínas mal plegadas no se acumulen y causen daño celular. La ubiquitinación puede ocurrir en diferentes formas dependiendo de la cantidad de ubiquitinas añadidas y su localización en la proteína, lo que también puede influir en el destino de la proteína. ##### Sistema Ubiquitina-Proteasoma 1. 2. 3. 4. 5. ##### Respuesta al Estrés del Retículo Endoplasmático ***1. Acumulación de Proteínas Mal Plegadas y Estrés del Retículo:*** Cuando las proteínas no se pliegan correctamente en el retículo endoplasmático, se produce estrés del retículo, que activa una serie de cascadas de señalización celular destinadas a restaurar la homeostasis. ***2. Respuesta de Proteínas Mal Plegadas:*** Intenta reducir la acumulación de proteínas mal plegadas. Si la respuesta funciona, la célula sobrevive, si falla, la célula puede sufrir apoptosis. Esta respuesta se activa a través de tres vías: - - - 7-8. Tráfico Vesicular Las vesículas se forman en el compartimento dador a través de la ***gemación***, sale del compartimento y es direccionada al compartimento diana, donde se fusionan y vierten el contenido. Este proceso implica la participación de varias proteínas y ***GTPasas*** que regulan el ensamblaje, el direccionamiento y la fusión de las vesículas con sus membranas diana. GTPasas Involucradas: - - - - ##### Vesículas Cubiertas - - - **[Formación de Vesículas Clatrina:]** La ARF se activa, las ***adaptinas*** (AP1, AP2, AP3) reconocen las secuencias de clasificación en las proteínas de carga. La membrana se fusiona gracias a la dinámica, que estrangula el cuello de la vesícula mediante la hidrólisis de GTP. 4. **[Formación de vesículas COPII:]** La SAR1 se activa en la membrana del RE, las proteínas ***Sec23 y Sec24*** actúan como adaptadoras, mientras que ***Sec13 y Sec31*** forman el enrejado. Después de fusionarse, la ***Rab*** las direcciona, y las proteínas ***SNARE***, permiten la fusión de la membrana de la vesícula con la del compartimento diana. - #### Aparato de Golgi Su función principal es la modificación, clasificación, y distribución de proteínas y lípidos que provienen del RE, entre ellas la glicosilación. Existen dos modelos que proponen el transporte de las proteínas a través de las cisternas del Golgi: a. b. Cuando llegan a la red trans Golgi sufren una última clasificación diseccionándolos a diferentes sitios, uno de ellos los lisosomas. En los ***lisosomas*** se produce la degradación enzimática de casi todos los compuestos celulares, formados por una única membrana con proteínas de membrana y proteínas solubles en su interior, hidrolasas ácidas. Todas las enzimas hidrolíticas lisosomales tienen una señal ***manosa 6-P***, que los direcciona a los endosomas. Esta señal se incorpora en la cisterna Cis Golgi por la unión secuencial de dos proteínas, Nacetilglucosamina Fosfotransferasa y UDP Nacetilglucosamina. Una vez fusionada la vesícula con el endosoma, se disminuye la afinidad del receptor por la manosa 6 fosfato ya que el endosoma tiene menor pH que la red trans golgi, separando la enzima del fosfato. Por otro lado, el receptor de manosa vuelve hacia la red trans Golgi en una vesícula especial, vesícula de retromero. Vías que aportan materiales a los lisosomas: 1. 2. 3. **[Endocitosis:]** Material extracelular y lo introducen en su interior a través de vesículas que se forman de la membrana plasmática. El endosoma temprano está cerca de la membrana plasmática y actúa como un centro de distribución, comunicándose con la membrana, el aparato de Golgi, o moviéndose hacia el interior de la célula a través del citoesqueleto, madurando y transformándose en un endosoma tardío. Cuando este se fusiona con un lisosoma, se forma un endolisosoma, donde ocurre la degradación de compuestos. Lo degradado se libera al citosol para ser reciclado, mientras que el lisosoma se regenera para futuros ciclos. Este proceso es iniciado por la señalización de ubiquitina, que marca a las proteínas para su degradación. Cuatro complejos de clasificación endosomal llamados ESCRT (0, 1, 2 y 3) actúan secuencialmente para formar estas vesículas internas. Las vesículas intraluminales que se liberan al exterior de la célula se denominan exosomas, y tienen funciones importantes en la comunicación celular. Hay varios tipos de endocitosis según el material que se introduce en la célula: 1. 2. 3. 4. **[Exocitosis:]** Es el proceso inverso, las vesículas formadas en la red trans-Golgi se fusionan con la membrana plasmática, liberando su contenido al exterior. La exocitosis puede ser de secreción constitutiva, de manera continua en todas las células, o secreción regulada, requiere de una señal extracelular para liberar el contenido de la vesícula. 9\. Núcleo y Organización del Genoma ***Mecanismos Genéticos Básicos:*** El ADN es transcrito a una molécula de ARN, que luego en el citosol es traducida para dar una proteína. El ADN a su vez es reserva genética, tiene que ser replicado, el ARN puede ser retrotranscrito a una molécula de ADN. **[Estructura Molecular de los Ácidos Nucleicos:]** Se tiene una ***ribosa***, formada por cinco carbonos, en la posición 5' se tiene un *enlace fosfato*, mientras que en la posición 3' se tiene un *oxidrilo*. El oxidrilo también puede ocupar la posición 2', si ambas están ocupadas, corresponde a una ***molécula de ARN***, mientras que si solo se encuentra en la 3', es un ***ADN***. Por último se tiene unida una base, estas pueden ser ***purinas*** (Adenina y Guanina) o ***pirimidinas***, que tienen posibilidad de resonancia de electrones (Uracilo, Timina y Citosina). ##### Características del ADN 1. 2. 3. 4. ***La molécula de ADN se compone por dos hebras, mientras que la de ARN por una sola,*** por esta razón, el ADN es mucho más estable, ya que no tiene grupos oxidrilos que puedan ser atacados. Aunque es altamente estable, puede desnaturalizarse, es decir, pueden separarse las hebras, la adenina y timina se componen de dos puentes de hidrógeno, y guanina-citosina por tres. #### Gen Secuencia completa de ácidos nucleicos necesaria para tener un ***producto génico funcional***, el producto génico funcional generalmente se asocia con proteínas pero también puede ser una molécula de ARN. Además un gen incluye las secuencias de ADN necesarias para la síntesis de un ***transcrito***, es decir, secuencias necesarias potenciadoras que favorezcan la transcripción de ese gen, ***sitios promotores*** de la transcripción de ese gen, sitios que indican la poliadenilación del ARNM, y sitios que indican la eliminación de intrones en la secuencia codificante. #### Cromosomas Dónde están los genes. En el caso de los cromosomas procariontes, se compone de una molécula única de ADN bicatenario (dos hebras) de manera circular, se une a proteínas no histónicas (que regulan la replicación y la transcripción). Por otro lado, el cromosoma eucarionte se compone de una molécula de ADN bicatenario lineal, con secuencias codificantes y no codificantes y proteínas histónicas y no histónicas. Este gen eucarionte posee secuencias de ***intrones*** (no codificantes) y ***exones*** (codificantes). El gen en sí (donde dice secuencia completa) se transcribe para producir ARN funcional o proteína. El promotor o secuencia promotora ayuda a posicionar la ***ARN polimerasa*** para iniciar el proceso de transcripción. Esta secuencia incluye una **[TATA]** (secuencia llena de adeninas y timinas, ya que requieren menos energía que las uniones guanina-citosina) y secuencias reguladoras, que no están pegados al gen, pero cuando el ADN se dobla, interactúan para aumentar la eficiencia de la transcripción. La disposición de los cromosomas varía según el ciclo celular eucarionte, ya que están unidos a proteínas y su disposición cambia durante las diferentes fases, que incluye las etapas G1, S, G2 y mitosis. - - - - Cada cromosoma tiene regiones específicas que cumplen funciones para el correcto funcionamiento del genoma durante el ciclo celular. 1. 2. Cada cromosoma también contiene ***orígenes de replicación***, que son secuencias específicas donde se inicia la replicación del ADN. Allí, durante la fase S, se forman las burbujas de replicación que permiten la duplicación del ADN. Estas secuencias en tándem pueden ser de ***ADN satélite*** (1 a 500 pares de bases) o ***ADN microsatélite*** (1 a 13 pares de bases), estas repeticiones pueden surgir debido a errores en el proceso de replicación del ADN, y una vez establecidas, se heredan. Son de gran utilidad para por ejemplo, pruebas de paternidad, y están asociadas a enfermedades genéticas como las neuromusculares. ***Transposones:*** Secuencias transponibles en el genoma, son secuencias de ADN que tienen la capacidad de moverse de un lugar a otro dentro del cromosoma, o a un cromosoma diferente. Pueden tener efectos positivos o negativos en la evolución y la variabilidad genética. ***Plásmidos:*** Moléculas de ADN que se replican de manera independiente del cromosoma principal. Proporcionan funciones adicionales, como por ejemplo la resistencia a antibióticos. #### Cromatina El ADN está empaquetado mediante la interacción con ***histonas***. Las histonas son proteínas básicas compuestas de tres alfa-hélices, forman un octámero compuesto por las histonas H2A, H2B, H3 y H4. El ADN se enrolla alrededor de este octámero, formando ***nucleosomas***, la unidad fundamental de empaquetamiento del ADN. Cada nucleosoma está compuesto por el ADN que da aproximadamente dos vueltas alrededor del octámero de histonas, con un segmento espaciador de ADN entre nucleosomas consecutivos. La interacción entre el ADN y las histonas es muy estable, esto se debe a que las histonas están cargados positivamente, y el ADN de forma negativa, y por lo tanto interactúan electrostáticamente (además de puentes de hidrógeno y enlaces iónicos que refuerzan el empaquetamiento del ADN). Esta estructura es esencial para la compactación del ADN dentro del núcleo y para la regulación de la accesibilidad del ADN durante procesos como la replicación y la transcripción. Entonces, el ADN se encuentra en segmentos enrollados alrededor del núcleo del octámero, en nucleosomas. Además de ser importante para la compactación del ADN, también regula la accesibilidad del ADN para procesos como la transcripción. - Los nucleosomas interactúan mediante las ***colas de las historias***, pueden interaccionar entre sí, o con proteínas. Son interacciones de tipo no covalente, las colas de las histonas están cargadas de manera positiva, y el ADN, de manera negativa. La histona H1 es quien estabiliza las interacciones, y ayuda a que el ADN se compacte más. #### Modificaciones Post Traduccionales de Histonas Las modificaciones postraduccionales son clave para la regulación de la cromatina y expresión génica, estas modificaciones pueden ser la acetilación, metilación, fosforilación y ubiquitinación. Las modificaciones son *covalentes y reversibles*, permitiendo una regulación dinámica. Las enzimas como las histona acetiltransferasas (HATs) añaden grupos acetilo a las histonas, mientras que las histona deacetilasas (HDACs) los eliminan, modulando así la accesibilidad del ADN a las enzimas de transcripción. Un ejemplo: La acetilación de lisinas en las colas de histonas neutraliza su carga positiva, reduciendo la interacción con el ADN y permitiendo una estructura de cromatina más abierta, accesible para la transcripción. 10\. Transcripción y Traducción ***Dogma Central de la Biología Ampliado:*** La transcriptasa reversa permite que de una cadena de ARN, se transcriba una cadena de ADN. +-----------------------------------+-----------------------------------+ | **ARN** | **ADN** | +===================================+===================================+ | \- Formado por una ribosa | \- Formado por una desoxirribosa | | | | | \- La adenina se une a uracilo | \- La adenina se une a timina | | | | | \- Puede ser cadena simple o | \- Cadena doble que se enrolla | | plegarse sobre sí mismo | sobre sí misma | +-----------------------------------+-----------------------------------+ Transcripción ------------- Síntesis de ARN, se copia un determinado fragmento de la secuencia de nucleótidos de ADN a una secuencia de nucleótidos de ARN, ocurre en el núcleo. Se da en tres etapas: 1. 2. 3. #### ARN Mensajero Se traduce en proteínas, y se va a transcribir a partir de una unidad de transcripción, que es el gen que está en el ADN. Estos genes pueden expresarse con diferentes eficiencias. #### ARN polimerasa Se une a la doble cadena de ADN en un sitio activo específico, que tiene magnesio, donde se produce el primer desenrollamiento de la cadena de ADN. Los ribonucleótidos se unen entre ellos gracias a la *complementariedad molecular*. Mientras más se elonga la cadena de ARN, más se desprende de la cadena de ADN, y así hasta llegar al final de la transcripción. La síntesis de ARN se da en sentido 5 ́→ 3 ́. Hay tres tipos de ARN polimerasas en células eucariontes: 1. 2. 3. ***Promotor:*** Secuencia especial de nucleótidos de ADN que le indica a la ARN polimerasa donde iniciar la transcripción. Se determina la ***secuencia consenso***, que en este caso va a ser la secuencia promotora, se ubica antes del sitio de inicio de la transcripción, es una cadena doble y asimétrica que le permite la orientación a la polimerasa y determina la velocidad de la transcripción. #### Transcripción en Células Procariontes El proceso ocurre en el citosol, asociado a la membrana plasmática. La ARN polimerasa se une a un factor ***sigma***, que da inicio a la transcripción, se une al promotor de la cadena de ADN, y se forma el complejo de inicio de la transcripción. Se abren las cadenas de ADN y se sintetiza un pequeño fragmento, como si fuese un control de calidad para ver si está todo correcto. Si todo es correcto comienza el proceso de transcripción. El factor sigma se desprende y la polimerasa avanza en la transcripción de ARN. Cuando se encuentra con la ***horquilla de terminación***, la polimerasa se desprende del ADN y el ARN, y por lo tanto, se deja de transcribir. - ### Transcripción en Células Eucariontes La secuencia ***TATA*** será la secuencia promotora, y la que da inicio a la transcripción. La proteína ***TBP*** se une a la TATA, y a un factor de inicio de transcripción, el factor **[TFIID]**. Se une al promotor y facilita que pueda abrirse la doble cadena de ADN. Una vez todas las proteínas están unidas, ese sitio se denomina Sitio de Ensamblaje del Complejo de Inicio de Transcripción. La polimerasa reconoce ese complejo, e intervienen factores para modular la transcripción: - - - La polimerasa sintetiza diez nucleótidos, como un control de calidad, si todo es correcto, el factor H fosforila la cola de la polimerasa, indicando que tiene que desensamblar el complejo de factores de transcripción. La polimerasa se libera del sitio promotor y continúa la transcripción. ***Elongación:*** La ARN polimerasa II se desplaza a lo largo de la cadena de ADN para sintetizar ARNm. La cola de la polimerasa se forma por 52 repeticiones de 7 aminoácidos, esta tiene la capacidad de fosforilarse en las posiciones 5 y 2 de cada serina en la repetición. Cuando se fosforila en posición 5, se libera el complejo de inicio de la transcripción, haciendo que la ARN polimerasa avance a lo largo de la cadena de ADN. - La fosforilación en posición 2 puede pasar al mismo tiempo que la fosforilación en posición 5. Es importante para reclutar proteínas que llevan a cabo la maduración del ARNm. Se cortan intrones y se unen exones (splicing alternativo), así el ARNm sólo tiene las secuencias codificantes necesarias para la proteína. Luego de que el ARN está transcrito, se produce la poliadenilación. Se desfosforila la serina en posición 5, la 2 no. #### Corte y empalme El splicing alternativo es un proceso en el que ***se cortan intrones y exones***, en lugares donde no se da un intrón o exon completo. Sirve para generar proteínas muy similares a otras, aunque con pequeñas diferencias (isoforma de la proteína). [Los intrones se eliminan, y los exones se unen.] Se produce por una adenina que se desaparea. - **[Poliadenilación en 3\':]** En la ***finalización de la transcripción,*** la ARN polimerasa se encuentra con una secuencia consenso que señala el final del proceso, allí se reclutan proteínas que le indican a la polimerasa detener la transcripción. Esto deja un hidroxilo libre en el ARN, donde una ***poli-A polimerasa*** añade una cola de aproximadamente 250 adeninas. Si bien esta cola no está codificada en el genoma, es importante ya que le da estabilidad al ARNm y lo protege de la degradación por exonucleasas. Ya maduro, el ARNm se transporta del núcleo al citosol a través de los poros nucleares, gracias al Ran, y la GTPasa involucrada en el transporte nuclear. Este proceso asegura que solo los ARNm completamente procesados y maduros se utilicen en la traducción. **[Código Genético:]** Proceso por el cual la secuencia de nucleótidos del ARNm se traduce en aminoácidos de la proteína. Cada triplete de aminoácidos se llama ***codón*** y codifica un aminoácido específico. En total hay 64 combinaciones de tripletes, pero solo 20 se codifican, por lo tanto, algunos aminoácidos son codificados por más de un codón. El codón que da inicio, es la secuencia **[AUG]**, que codifica metionina, es el primer aminoácido de todas las proteínas eucariotas. Los codones de terminación no codifican para ningún aminoácido y detienen la traducción, son **[UAA, UAG y UGA.]** **[Marco de lectura:]** Forma en la cual los nucleótidos se leen para sintetizar la proteína. El marco de lectura de inicio es AUG, sí se comienza en otro triplete, podría resultar en una secuencia de aminoácidos completamente distinta, lo que daría lugar a una proteína no funcional. ### ARN de Transferencia Intermediaria entre la secuencia de nucleótidos del ARNm y la secuencia de aminoácidos de una proteína. Sintetizado por la polimerasa III, es una molécula corta. El ARNt tiene un sitio de unión al aminoácido, y un ***anticodón***, que se une al codón correspondiente del ARNm. **[Apareamiento de Bases:]** Cada aminoácido puede ser codificado por más de un codón, y existen varios ARNt para cada aminoácido. Las dos primeras posiciones del codón son específicas, si alguna de estas bases no es correcta, el ARNt no se va a unir. Sin embargo, la tercera posición del codón es más flexible y se denomina posición de balanceo, lo que permite que el ARNt se una al ARNm incluso si la tercera base no es exactamente complementaria. Esto es posible gracias a la existencia de bases modificadas en el anticodón del ARNt, que permiten una mayor flexibilidad en el emparejamiento. Este mecanismo de balanceo es esencial para la eficiencia y precisión de la traducción en la síntesis de proteínas. La activación de aminoácidos es esencial para la síntesis de proteínas, donde cada ARNt se une a un aminoácido específico.Todo esto es catalizado por la aminoacil-ARNt sintetasa, que es específica para cada aminoácido. La activación ocurre en dos etapas: 1. 2. La aminoacil-ARNt sintetasa asegura la alta precisión de este proceso, incluyendo un mecanismo de corrección que elimina aminoácidos incorrectos. #### Ribosomas Síntesis de proteínas, se forman de ARN ribosomal (ARNr) y proteínas. Los ribosomas traducen del código genético del ARNm en una cadena polipeptídica. El ribosoma se forma de dos subunidades: - - El ***sitio A, aminoacilo***, es donde entra el ARNt que lleva el aminoácido que será incorporado a la cadena polipeptídica, el ***sitio P, peptidilo***, es donde el ARNt está unido a la cadena polipeptídica en formación, y el ***sitio E, exit***, es donde el ARNt es expulsado del ribosoma luego de entregar su aminoácido. ### Traducción **[Iniciación:]** Se forma un complejo entre la subunidad menor del ribosoma, el ARNt que lleva metionina y el factor de inicio de la traducción. El ARNm se une a la subunidad menor del ribosoma mediante la ***caperuza***, y este se desplaza a lo largo del ARNm hasta encontrar el codón AUG. Tiene actividad de GTPasa, hidroliza GTP, asegurando la correcta unión del ARNt al codón AUG y facilitando la formación del complejo de iniciación. **[Formación del Complejo de Iniciación:]** Tras la hidrólisis del GTP, el factor de iniciación se libera y la subunidad mayor del ribosoma se ensambla con la subunidad menor, completando el ribosoma funcional. **[Elongación:]** La subunidad mayor posiciona el sitio A, P y E. El ribosoma lee el codón siguiente en el ARNm y recluta el ARNt correspondiente al sitio A. El grupo amino del aminoácido en el sitio A ataca al grupo carboxilo del aminoácido en el sitio P, formando un enlace peptídico. El aminoácido en el sitio A se transfiere a la cadena polipeptídica en crecimiento. El ARNt en el sitio P, ahora vacío, se mueve al sitio E para ser expulsado. El ribosoma avanza para liberar el sitio A, permitiendo la entrada de un nuevo ARNt. ***Regulación de la Elongación:*** Se tienen dos factores de elongación; a. b. **[Finalización:]** Finaliza cuando este encuentra un codón de parada (UAA, UAG o UGA), en ese sitio se une una proteína de liberación al sitio A del ribosoma. Esta proteína tiene una estructura que imita la del ARNt, y así poder encajar en el sitio A. La cadena polipeptídica se libera del ribosoma catalizado por la peptidil transferasa. Las subunidades mayor y menor se desensamblan y se separan del ARNm y ARNt marcando la finalización de la traducción. **[Polirribosomas:]** Las proteínas pueden ser traducidas por múltiples ribosomas al mismo tiempo, formando un polirribosoma. Cada ribosoma se une al ARNm en el sitio de inicio y traduce el mismo segmento de ARNm en paralelo. Permite tener múltiples copias de una proteína a partir de una sola molécula de ARNm **[Variaciones del Código Genético:]** En realidad existen 21 aminoácidos, ya que uno es una [variante de la serina], ***selenocisteína***. Esta se incorpora con un mecanismo post-traduccional. Aunque el UGA es el codón stop, puede ser recodificado para incorporar selenocisteína en presencia de un bucle especial en el ARNm. Este bucle se une a un factor de traducción que facilita la incorporación de un ARNt con selenocisteína en el sitio A del ribosoma. Esto muestra que el código genético en algunos contextos es flexible. Durante la exportación del ARNm maduro del núcleo, los complejos de unión a exones marcan los bordes de los exones en los sitios de corte. Si un ARNm con un intrón no eliminado sale del núcleo, el ribosoma puede leerlo incorrectamente como parte del mensaje, para ello, estos complejos se disocian al alcanzar el codón de parada. Sin embargo, si el ribosoma encuentra un codón de parada que no marca realmente el final de un ARNm maduro, el error se detecta. En respuesta a estos tripletes sin sentido, el ribosoma recluta proteínas Upf, que reconocen el codón incorrecto, desencadenando la desensamblación del ribosoma y la degradación del ARNm y la proteína defectuosa. Este mecanismo funciona como un control de calidad para evitar la acumulación de ARNm defectuosos o proteínas malformadas en la célula. 11-12. Regulación de la Expresión Génica Cada tipo celular sintetiza y acumula diferentes combinación de RNA y proteína, vía de regulación de la expresión génica - La expresión génica se modifica durante el desarrollo embrionario, aunque en células adultas también puede modificarse en condiciones patológicas (cáncer) o en respuesta a señales extracelulares (hormonal, ambiental) Niveles de regulación 1. 2. a. b. c. d. e. La transcripción de un gen depende de: Secuencias reguladoras en los genes codificantes [Factores de transcripción:] proteínas de regulación génica que se unen específicamente a las secuencias reguladoras. - - - - - - - Las características de las secuencias reguladoras en los genes codificantes un ***promotor***: una secuencia de DNA que especifica donde se une el RNA pol para iniciar la transcripción. están alrededor del sitio +1 - - - ***secuencias reguladoras*** Procariontes operadores (une FTR) otro para FTA Eucariotas [amplificadores]: sitios de unión para FTA. de 50-200pb. Son elementos de control de transcripción a larga distancia, alejados al +1. en cuanto a donde se encuentran es muy variado. si están lejos, pueden actuar por la formación de bucles qué acercan las regiones [elementos proximales del promotor (EPP)]: están cerca de +1, máximo a 100 pb 5' o 3'. poseen 6-10pb. Son anclajes de amplificadores distantes (anclan por ejemplo, un enhancer lejano, para que puedan cumplir su función de aumentar la transcripción). [silenciadores]: reprimen la transcripción. por unir FTR interfiriendo con la formación del complejo de iniciación de transcripción, o por prevenir la unión de FTA a sus diana. [barrera]: evitan que las secuencias de control de un gen interfieran en un gen vecino. más específicamente, evitan qué la heterocromatina se expanda a genes qué deben ser expresados, osea, los mantiene laxos. [aislantes]: otra secuencia qué impide interferencia a genes vecinos. estos, impiden qué las proteínas reguladoras de genes afecten a genes inadecuados. ***métodos de estudio de proteínas y secuencias reguladas (SR)*** *análisis de movilidad o de retraso en gel* [detectar proteínas que se unen a una secuencia de DNA.] Cuando una proteína se une a un fragmento de DNA enlentece su movimiento en gel sometido a un campo eléctrico. A partir de secuencia específica ya sintetizada marcada radiactivamente, que se incuban con la muestra donde se supone la presencia de la proteína. En un gel de poliacrilamida se siembra en una calle el fragmento de DNA radioactivo solo y en otra incubado con las proteínas. Luego de la electroforesis, en la primera calle habrá una única banda, mientras que en la segunda, hay tantas bandas como proteínas de unión haya (mientras + PM, + retraso en gel (- migración)). - - *afinidad al DNA*. pegar en la columna fragmentos complementarios. Primero, separar las proteínas de unión a DNA y la columna posee una matriz con DNA: lavando con sc de baja salinidad eluyen las proteínas que no se unen a DNA y lavando con sc de media o alta salinidad así eluyen las unidas. Luego, poner la secuencia complementaria exacta de la proteína en la matriz: lavando con salinidad media, eluyen las proteínas que no reconocen específicamente estas secuencias (se unen débilmente) y con salinidad muy alta eluyen las proteínas específicas. *huella de DNA* [determinar secuencia de DNA reconocidas por una proteína (RG conocida).] una proteína unida al DNA lo protege de nucleasas, entonces con un fragmento de DNA con sitio de reconocimiento para la proteína, se utilizan nucleasas qué corten a nivel de las uniones fosfodiéster que cortaran toda la secuencia excepto donde esté la proteína. Se marca en un extremo el DNA con p32, se expone a nucleasa y se obtienen fragmentos. Se desnaturaliza el DNA, separando las dos cadenas y se separan los fragmentos con una corrida electroforética. revelo mediante autorradiografía: 3 zonas: una de mayor PM, una de menor PM y en el medio un vacío/ huella sin ningún revelado ya que la nucleasa no pudo actuar en la región de la proteína reguladora. - - ***interruptores genéticos (proteínas RG y secuencias reguladores)*** *procariontes* El principal mecanismo para controlar la producción de una proteína en una célula es la iniciación de la transcripción. La transcripción y traducción pasan simultáneamente en tiempo y espacio (no hay organelas). La expresión génica está regulada según cambios en él medio nutricional y físico, las bacterias sólo sintetizan proteínas necesarias para sobrevivir en x condiciones. Los genes de las proteínas qué intervienen en la misma vía metabólica están organizadas en una estructura llamada ***operón***, por eso son regulados coordinadamente. Un operón consiste de un promotor, un sitio operador, a veces un sitio activador, y los genes involucrados en una vía metabólica juntos. también los genes que codifican pRG son parte, aunque está corriente arriba. Estas proteínas a su vez están reguladas por moléculas pequeñas difusibles qué al unirse cambian su conformación inhibiendo o induciendo su unión a las secuencias reguladoras. ***El operón triptófano de la E.Coli:** codifica para enzimas de la biosíntesis del AA triptófano.* Cuenta con un promotor, un operador donde se une la proteína represora de TRP y se sintetiza un mRNA policistrónico que se traduce para 5 enzimas. La activación o inhibición de los genes de está vía metabólica depende de los nutrientes y factores en él medio. - - Este es un control negativo, ya qué cuando la proteína represora está activa, los genes están inactivos. ***El operón LAC**. codifica para la síntesis de enzimas que intervienen en la degradación de la lactosa, un disacárido fuente de energía si no hay glucosa.* Cuenta con promotor, un operador donde se une LAC y un activador donde se une CAP. El activador es él CAP (proteína activada por catabolito) y un represor es él LAC y según la cc de glucosa y lactosa en él medio, cambia como actúa él operón: poca glucosa, CAP se une y si hay poca lactosa, LAC se une. - Control negativo y positivo, cuando una proteína activadora se une al sitio regulador del DNA *eucariontes* cada gen se regula individualmente La ***RNApol II*** transcribe para mRNA codificante de proteínas. dicha enzima necesita de 5 FT generales y posee un complejo mediador, capaz de aumentar él área de contacto para pRG, (cientos para cada gen) El empaquetamiento como cromatina del DNA brinda mayores posibilidades de regulación transcripcional. La capacidad de doblarse y formar bucles es importante porque hay regiones reguladoras a distancia de miles de pb en ambas direcciones y él sheer número de proteínas qué hay. El mediador y FT generales son iguales para todos los genes transcritos por la pol II. Sin embargo, las pRG (activadoras, represores, etc) y las posiciones de sus secuencias de unión son diferentes para cada gen. El estado de la cromatina es esencial para ver si se puede empezar. El mediador puede unirse a complejos remodeladores de cromatina y a enzimas modificadoras de histonas, qué son las que marcan la cola de histonas para desenrollar o enrollar la cromatina. Las ***proteínas activadoras*** aumentan la velocidad de transcripción Directo: atraen, ubican y modifican FT generales, mediador y RNApol II para él inicio Indirecto: promueven mods en la cromatina a nivel del promotor, atrayendo CRC y EMH. pueden crear códigos de histonas qué favorecen la formación de eucromatina. - Los cambios en la cromatina duran la asociación de la pRG. Genes que activan y desactivan rápidamente en respuesta a señales externas. Otras veces persiste más tiempo, incluso llega a heredarse a la siguiente generación celular. La ***represión genética*** puede funcionar por - - - Las ***proteínas de regulación génica*** generalmente se unen cooperativamente entre ellas al DNA.en sc estarían todas separadas, pero al unirse entre ellas actúan conjuntamente, formando complejos varios. El complejo (activador o represor) depende de la secuencia reguladora intrínseca como de las pRG presentes. Cada gen se expresa o reprime sólo cuando está presente la combinación necesaria de pRG. La actividad de pRG (o FT) se regula por diferentes mecanismos - - - - - - - ***[regulación epigenética de la expresión génica:]*** La epigenética son cambios heredados en él fenotipo celular que no son resultado de cambios en la secuencia de DNA. Las [mods en colas de histonas], formando heterocromatina. El patrón de cambio está hecho por EMH y son replicados en otros nucleosomas por proteínas "lectoras" de código. Estas proteínas además atraen metilasas de DNA "de novo" ya qué actúan reconociendo secuencias no metiladas previamente (a diferencia de las metilasas de mantenimiento). se genera un patrón de metilación de DNA qué es capaz de atraer proteínas de unión a grupos metilos de DNA. Los grupos metilo y la proteína de unión son las responsables de interferir con la iniciación de la transcripción. La [metilación del DNA con metil transferasas]: la reacción ocurre en posición 5 de citosina, dando 5-metilcitosina. solo ocurre si en la secuencia le sigue una guanina, pero no en toda secuencia CG se metila. contribuye a la represión génica - *Impronta genética:* proceso en él cual un gen se marca bioquímicamente con metilos indicando su origen parental. somos diploides. depende de la metilación de ADN. por lo general, la expresión de la mayoria de los genes depende de ambos alelos M y F. sin embargo, los genes improntados dependen del origen parental. por lo general están implicados en él desarrollo fetal, por ejemplo el qué da Igf2. está en él alelo paterno, si muto él materno él raton crece normal, pero viceversa no crece mucho. la metilación por implantacion puede silenciar o activar él gen. en este caso, activa. esto es porque en él alelo paterno, él amplificador puede actuar en la SR del gen Igf2 ya qué él elemento aislante está metilado y por ende no puede unirse la proteína necesaria para impedir la unión FTA-promotor. sin la metilación, él aislante no dejaría qué él activador se una al promotor ***[Alteraciones ]*** [Alteración espontánea] en el DNA - [Alteraciones a nivel de cromosoma total] → pueden modular la expresión génica - ***[Controles post-traduccionales:]*** cualquier control después de qué la RNApol se une al promotor e inicia la transcripción. - - - - - - Las regiones 5\`y 3\` no traducidas del mRNA maduro: contiene caperuza y poli A respectivamente, ambas con secuencias no codificantes llamadas "UTR" (untranslated regions). las UTR son muy importantes para la regulación de expresión génica [Unidades de transcripción] *simples:* tienen un solo sitio poli A y un solo patrón de C/E. así, se obtiene un único mRNA y una proteína. *complejas*: poseen diferentes patrones de C/E. de un pre-mRNA obtengo más de uno maduro. ***mecanismos de regulación a nivel del mRNA*** *maduración alternativa / C/E alternativo* 1 Regulación específica a tipos celulares. El gen de la a-tropomiosina. de un único pre-mRNA, haciendo C/E en diferentes puntos creó diferentes mRNA para diferentes tipos de célula. Las proteínas serán una familia isoformica. 2\. Respuesta a señales de desarrollo o ambientales. Explica el mayor volumen proteómico vs genómico. C/E se regula por proteínas positiva o negativamente; represores o silenciadores de maduración evitan qué la maquinaria madurativa acceda, así él intron, por ejemplo, queda incluido. Los potenciadores de maduración favorecen la entrada de la maquinaria empalmosomica. La inclusión de un exón en algún tipo celular vs otro tipo es resultado de la influencia combinada de varios represores y potenciadores del C/E. *regulacion del punto de corte y adicion poli A* La regulación del **[corte y adición de la cola poli-A]** en el mRNA permite generar diferentes proteínas, porque afecta el extremo carboxiterminal, *por ejemplo*, la producción de anticuerpos en los linfocitos B. Si no están estimulados, los anticuerpos se anclan a la membrana por el extremo ***hidrofóbico***, mientras que si se estimulan con un antígeno, se secretan anticuerpos con extremo ***hidrofílico***. Es posible esto gracias a dos sitios de corte del RNA, el subóptimo, no estimulado, y el óptimo, cuando aumenta la concentración de Cstf, favoreciendo el corte en el sitio correcto. *edición del RNA* La **[edición del RNA]** altera la secuencia nucleotídica, se usa un RNA de guía y se aparea con uno a editar, *por ejemplo*, la desaminación de adenina a inosina, catalizada por la enzima ADAR. Esto puede modificar la secuencia de la proteína o su estabilidad. *control de exportación del núcleo* El **[control de calidad]** en la exportación del RNA fuera del núcleo asegura que los RNA dañados sean degradados. Sin embargo, virus como el VIH escapan a este control al utilizar ***proteínas virales*** como la REV, que facilita la exportación de RNA viral no procesado, permitiendo que se ensamblen nuevos virus. *regular la localización del mRNA* *estabilización y degradación del mRNA* La estabilidad y degradación del mRNA es clave para su regulación. ***Si el mRNA es más estable, se sintetizan más proteínas.*** La degradación suele comenzar con el acortamiento de la cola poli-A, seguido de la eliminación de la *[caperuza 5\' o la degradación de 3\' a 5\']*. El inicio de la traducción se regula gracias a la interacción entre la caperuza 5\' y la poli-A. Hay virus que usan un mecanismo alternativo llamado ***traducción dependiente de IRES***, que no requiere la caperuza, permitiendo que el virus traduzca su RNA. En situaciones de estrés, la síntesis de proteínas puede inhibir mediante la fosforilación del factor eIF2, impidiendo su activación. *control de inicio mediado por elF2* ***silenciamiento génico por RNA de interferencia*** El ***silenciamiento génico*** mediante RNA de interferencia incluye miRNA y siRNA. Ambos clivan el mRNA para inhibir la expresión de genes. Los miRNA regulan múltiples mRNA y actúan mediante un apareamiento imperfecto. Los siRNA, generados en respuesta a RNA foráneo, se aparean de manera perfecta, lo que provoca una degradación rápida del mRNA. Ambos procesos se llevan a cabo a través del complejo RISC. 13-14. Microscopía Un microscopio es un instrumento que permite observar objetos demasiado pequeños para ser distinguidos a simple vista. Hay dos grandes tipos de microscopía, la microscopía *óptica* y la microscopía *electrónica.* Microscopía Óptica ------------------ Los dos tipos de microscopios ópticos son; ***directo***, la fuente de luz está abajo atraviesa la muestra, llega el objetivo y llega a los oculares, o ***invertido***, hay una fuente de luz arriba, atraviesa la muestra y los objetivos están por debajo. La microscopía tiene tres parámetros básicos, la ***magnificación***, la ***resolución*** y el ***contraste***. Tanto la magnificación como la resolución son propios del microscopio, mientras que el contraste, también depende del individuo. El fundamento de los microscopios es la *[interacción luz-luz y la interacción luz-materia]*, es mediante estos, que el microscopio produce el aumento. La luz se describe mediante dos modelos, el modelo de partícula, y el modelo de onda. Este último describe a la luz como un componente oscilante que se desplaza en el espacio. Para definir a una onda electromagnética se usan dos parámetros: - - ***Interacción Luz-Materia:*** la luz interacciona con la materia, en la reflexión, la luz rebota en la superficie del material, en la transmisión, la luz atraviesa el material, y en la absorción, se absorbe por el material, y luego se emite con otra longitud de onda (fluorescencia). Gracias a estas interacciones es que se forman las imágenes en los microscopios. Es el lente objetivo el que capta la luz modificada luego de atravesar la muestra y la magnifica para formar la imagen. **[Magnificación:]** Indica cuántas veces se amplía la muestra, se combina la magnificación del aparato con la ocular para calcular la magnificación total del sistema óptico. **[Resolución:]** Capacidad de distinguir dos puntos separados. El [límite de resolución] es la distancia mínima a la que dos puntos pueden observarse separados. Esta resolución depende de la ***apertura numérica***, definida como la capacidad del objetivo de un microscopio para captar luz. Es inversamente proporcional con el límite de resolución, ya que *a menor límite, mayor poder resolutivo. Un objetivo que tenga mayor apertura numérica, reduce el límite de resolución.* - **UNA IMAGEN MÁS MAGNIFICADA NO INDICA MAYOR RESOLUCIÓN** **[Contraste:]** Diferencia de intensidad o brillo entre un punto de la imagen y su fondo. Se puede ajustar mediante el sistema de iluminación y el diafragma del condensador, si está abierto *maximiza la resolución pero reduce el contraste*, mientras que uno cerrado *mejora el contraste pero disminuye la resolución.* +-----------------------------------------------------------------------+ | *Apertura Numérica→* NA=(sen α) ***n*** | | | | *Limite de Resolucion→* d~o~ [\$= \\frac{0,61\\.\\ | | \\lambda}{\\text{AN}}\$]{.math.inline} | | | | *Poder resolutivo→* R = d~o~^-1^ | +-----------------------------------------------------------------------+ La microscopía óptica, no es solo de campo claro: #### Microscopio de Campo Oscuro Dispersión de la luz al interactuar con la muestra, usando un anillo de campo oscuro en el condensador, haciendo que pase únicamente la luz proveniente de los bordes del haz. *Se puede observar un fondo oscuro y las estructuras brillantes*, ya que solo las áreas donde la luz se desvió aparecen iluminadas. #### Microscopio de Contraste de Fases *Observación de células vivas.* Funciona al comparar las ondas de luz que han interactuado con la muestra, sufriendo un desfase, con las ondas que no lo han hecho. La interacción luz-materia, como el cambio en la velocidad y fase de la luz al atravesar estructuras con diferentes índices de refracción, genera un contraste sin necesidad de colorantes. Este método es útil para observar detalles internos de células vivas sin dañarlas, permitiendo estudiar procesos dinámicos en tiempo real. #### Microscopio de Fluorescencia Para observar estructuras que se encuentran por debajo del límite de resolución gracias a la emisión de luz por parte de moléculas fluorescentes. Cuando una molécula se irradia con una longitud de onda específica, los electrones se excitan. Cuando se desexcitan, emiten una longitud de onda mayor, causando la florescencia, emiten luz sobre un fondo oscuro. Los fluorocromos, como por ejemplo DAPI o Rodamina, son moléculas que se utilizan para marcar estructuras específicas, permitiendo una visualización detallada y específica de componentes celulares. Los fluorocromos pueden ser: 1. 2. 3. 4. La **inmunofluorescencia** es una técnica, donde las células se fijan y permeabilizan para permitir la entrada de anticuerpos o fluorocromos. Implica que las células pierdan viabilidad. Si se quiere estudiar proteínas en células vivas, se utilizan proteínas fluorescentes, como por ejemplo la GFP (proteína verde fluorescente), que permiten el seguimiento dinámico de proteínas en tiempo real dentro de células vivas, sin necesidad de fijación, lo que es crucial para estudios sobre la función y localización de proteínas en su estado natural. #### Proteína GFP (Green Fluorescent Protein) Se compone de once láminas beta que forman un centro cromóforo, lo que le da su fluorescencia. Para excitar la GFP (que emite en verde), se utiliza luz azul, que tiene una mayor energía debido a su menor longitud de onda. Sin embargo, la luz de excitación es mucho más intensa que la de emisión, por lo que en microscopía de fluorescencia se prefiere un fondo negro para un mayor contraste. Este contraste se logra mediante un sistema de ***epiiluminación***. ***Microscopio de Epifluorescencia:*** Se utiliza una lámpara de mercurio que genera una luz blanca que contiene todas las longitudes de onda. Con un filtro de excitación se elige la longitud de onda para excitar a un fluorocromo. Si se quiere observar fluorocromos de diferentes colores, se cambia el cubo con el filtro de excitación, y el filtro de emisión, se ajusta para esa longitud de onda. #### Técnica FRET *[Transferencia de Energía por Resonancia de Fluorescencia.]* Transferencia de energía entre dos fluorocromos, un donador y un aceptador, cuyas emisiones deben coincidir. las moléculas se deben encontrar cerca. El FRET sirve para estudiar la interacción entre moléculas y detectar cambios conformacionales en una proteína. #### Técnica FRAP *[Recuperación de la Fluorescencia después del Fotoblanqueo]*. Estudiar la dinámica de las proteínas dentro de una célula. Se fotoblanquea una parte de la célula (se destruye el fluorocromo) con radiación, y se observa como la fluorescencia se recupera con el paso del tiempo. Se recuperan mediante otras proteínas fluorescentes que se transportan hacia la zona blanqueada. Esta técnica se utiliza para medir la velocidad de transporte y difusión de moléculas en una célula. Microscopía Electrónica ----------------------- La microscopía electrónica tiene un poder resolutivo mucho mayor al microscopio óptico, debido a que no usa lentes de cristal. Utiliza un ***haz de electrones***, que tiene una longitud de onda mucho menor (0.004 nm). *No tiene fuente de luz, tiene cañón de electrones, no tiene lentes condensadores, tienen electroimanes* que proyectan los electrones hacia la muestra, si o si debe trabajarse en condiciones de vacío, lo que implica que la microscopía electrónica es ***únicamente para células muertas y delgadas***. - #### Tipos de Microscopía Electrónica 1. 2. También existe la ***microscopía crioelectrónica***, en la que la muestra resulta congelada luego de unos segundos, lo que permite observar moléculas de manera directa sin necesidad de una fijación química.