Presentación I - BCyMH II - 2024 - - Medicina (6).pptx

UNIDAD I Naturaleza del gen y el genoma Lic. Mario Santiago Zetina  Gen como una unidad de herencia Los primeros estudios revelaron que los genes son factores discretos que se retuvieron durante la vida de un organismo y luego se transmitieron a su progeni...

UNIDAD I Naturaleza del gen y el genoma Lic. Mario Santiago Zetina  Gen como una unidad de herencia Los primeros estudios revelaron que los genes son factores discretos que se retuvieron durante la vida de un organismo y luego se transmitieron a su progenie. Los genes residen en los cromosomas y están formados por ADN. Se le conoce como genoma al cuerpo colectivo de la información genética que está presente en una especie. Los genes son segmentos de ácido desoxirribonucleico (ADN) que contienen el código para una proteína específica cuya función se realiza en uno o más tipos de células del cuerpo.  Proyecto del Genoma Humano –PGH- El Proyecto del genoma humano (PGH) fue un programa de investigación colaborativo e internacional cuya meta era la del mapeo (cartografía) y entendimiento completo de todos los genes de los seres humanos. Todos nuestros genes juntos se conocen como nuestro "genoma". El PGH ha revelado que existen probablemente alrededor de 20,500 genes humanos. La secuencia humana completa ahora puede identificar sus ubicaciones. Este producto final del PGH ha dado al mundo un recurso de información detallada sobre la estructura, organización y función del conjunto completo de genes humanos  Aspectos básicos Un cromosoma contiene de cientos a miles de genes. Cada una de las células humanas normales contiene 23 pares de cromosomas, es decir 46 cromosomas. Un rasgo es una característica determinada genéticamente (por genes) y suele estar determinado por más de un gen. Algunos rasgos están causados por genes mutados, los cuales pueden haber sido heredados o ser el resultado de una nueva mutación. Estudios de Gregor Mendel La ciencia de la genética comenzó en la década de 1860. Objetivo principal era aparear (cruzar), plantas de guisantes que tenían distintas características hereditarias y determinar el patrón por el cual estas características eran transmitidas a la descendencia. Utilizó guisantes ya que podía comparar una variedad de semillas que darían lugar a plantas con características distintas.  1. Las plantas presentan distintos factores de herencia (genes). Cada planta individual posee dos copias de un gen que controla el desarrollo de cada rasgo (ambos padres). A las formas alternativas de un gen se le conoce como alelo. Conclusiones de 2. Cada célula reproductiva (gameto) producida por una planta contiene sólo una copia de un Mendel aplicados en gen para cada rasgo. Por tanto, cada uno de los alelos que rigen cada rasgo en una planta fue heredado de la progenitora y el otro alelo la terminología fue heredado del progenitor. de la genética 3. Los alelos se separan (o segregan) el uno del otro durante la formación de los gametos. moderna 4. La segregación del par de alelos para un rasgo no tiene ningún efecto sobre la segregación de alelos para otro rasgo. Es decir, que un gameto particular, puede recibir un gen paterno que indica el color de la semilla y un gen materno que rige la forma de la semilla. A esto se le conoce como la ley de la distribución independiente de Mendel.  Cromosomas Cromosoma: estructura que alberga el ADN en la célula, los cuales contienen los elementos necesarios para procesos de replicación y segregación. Los cromosomas están hechos de cromatina, un material que consiste en ADN y proteínas asociadas. Cromosomas homólogos: es cada uno del par de cromosomas que tiene un organismo eucariota diploide, y que empareja entre sí durante la meiosis  Análisis genético en Drosophila Investigación realizada por Thomas Hunt Morgan Período de reproducción rápido. Producen 1000 huevos durante su vida. Fáciles de albergar y criar y muy económicas de mantener. Alelo silvestre o tipo salvaje: alelo que se encuentra con más frecuencia en la población general. Mutación: cambio en la secuenca del ADN. 85 distintas mutaciones. Descendencia con alteraciones (mutaciones) heredadas. Se considero que si pudieran surgir variantes de genes genéticamente diferentes en poblaciones aisladas, esto daría lugar a nuevas especies.  Dogma Central de la Biología  ADN y su relación con las proteínas Las proteínas no solo son los componentes esenciales que forman los músculos, tejido conjuntivo, piel y otras estructuras. También son necesarias para producir enzimas. Por tanto, toda la estructura y funcionamiento del organismo depende del tipo y de las cantidades de proteínas que sintetice. La síntesis de proteínas se controla a través de los genes, que se hallan contenidos en los cromosomas. Refrescando la memoria con conceptos básicos Genotipo: combinación única de genes o composición genética de una persona. Es decir, es el conjunto completo de instrucciones con el que el organismo de esa persona sintetiza sus proteínas y, por tanto, con el que ese organismo debe construirse y funcionar. Fenotipo: estructura y función reales del organismo de una determinada persona. Es la expresión y/o manifiesto del genotipo en una persona en el mayor de los casos. Cariotipo: imagen del conjunto completo de cromosomas de las células de una persona. Muchas veces el fenotipo no está ligado al genotipo ya que también el entorno (enfermedades y la alimentación) pueden influir en este. Diferencia entre ADN y ARN ¿Dónde se encuentra el ADN? Lo encontramos en dos lugares dentro de cada célula: en mayor medida, en el núcleo de la célula (cromosomas) y en menor medida, en las mitocondrias. De ahí los términos utilizados como ADN nuclear y ADN mitocondrial. En la reproducción sexual, los organismos heredan la mitad de su ADN nuclear del padre y la mitad de la madre. No obstante, los organismos heredan todo su ADN mitocondrial de la madre. Esto ocurre porque sólo los óvulos, y no los espermatozoides, conservan su mitocondria durante la fecundación. Este ADN es pequeño y circular. Sólo tiene 16.500 pares de bases más o menos. Y codifica diferentes proteínas que son específicas de la mitocondria.  ACTIVIDADES SEMANA ENTRANTE Hoja de Evaluación trabajo no. examen 1 corto  Corto no. 1 – Sección B - Indique 5 organelos de la célula eucariota con sus respectivas funciones. Indique diferencia entre aneuploidía y euploidia y de un ejemplo de cada uno de ellos. Mencione 4 diferencias entre el ADN nuclear y ADN mitocondrial. ¿Qué indica el principio de segregación independiente? Posteriormente mencione como lo aplico Mendel al estudio de los guisantes. ¿Qué es un alelo silvestre? Posteriormente, indique por qué se pierde un alelo silvestre.  Corto no. 1 – Sección A - Indique 5 organelos de la célula eucariota con sus respectivas funciones. ¿Qué es el proyecto del genoma humano y cuál fue su importancia en la actualidad? Mencione 3 diferencias entre el ADN y ARN. ¿Qué indica el principio de segregación independiente? Posteriormente mencione como lo aplico Mendel al estudio de los guisantes. La síntesis de proteínas se controla a través de los genes, que se hallan contenidos en los cromosomas. El ADN se condensa en forma altamente organizada en los cromosomas La longitud total del ADN en un individuo es mayor a 1000 veces la longitud de su propia célula, por tal razón la molécula de ADN es trenzada y plegada de manera compacta, con la ayuda de proteínas para ajustarse al espacio dentro de la célula bacteriana. Una célula eucariota tiene mucho más ADN que una bacteria, y está organizado en el núcleo como múltiples cromosomas, que varían ampliamente en tamaño y número en diversas especies. ¿Qué hace una célula eucariota para condensar su ADN en los cromosomas? Se facilita mediante ciertas proteínas llamadas histonas.  Las histonas presentan carga positiva porque contienen una alta proporción de aminoácidos con cadenas laterales básicas. Las histonas se asocian con el ADN, que presenta una carga negativa debido a sus grupos fosfato para formar estructuras llamadas nucleosomas. La unidad fundamental de cada nucleosoma consiste en una estructura de ocho moléculas de histonas (dos por cada uno del cuadro tipos de histonas), semejantes a las perlas de un collar, con 146 pares de bases de ADN envueltas alrededor del núcleo proteico en forma de disco. Los nucleosomas funcionan como pequeños carretes, evitando que el ADN se enrede.  El enrollamiento del ADN en los nucleosomas representa el primer nivel de organización de la estructura cromosómica. La cromatina conduce a la formación de un cromosoma condensado. En la cromatina extendida, esas fibras forman largos lazos enrrollados que se mantienen unidos por las proteínas de andamiaje (distintas histonas) ayudando a mantener la estructura cromosómica. La condensina son grupos de proteínas requeridas para la compactación cromosómica. La condensina se une al ADN y lo envuelve en lazos enrollados que son compactados en un cromosoma mitótico o meiótico.  Síntesis de proteínas Las proteínas están compuestas de una larga cadena de aminoácidos encadenados uno tras otro. Hay 20 aminoácidos distintos disponibles que pueden usarse para la síntesis de proteínas. La estructura tridimensional, resultado de una cadena de aminoácidos es la que determina la función en el cuerpo. Dado que el plegado está determinado por una secuencia de aminoácidos precisa, cada secuencia distinta da como resultado una proteína distinta. Las instrucciones para la síntesis de proteínas están codificadas en el ADN.  Codificación La información está codificada en el ADN por la secuencia en que se organizan las bases (A,T,G y C). El código está escrito en tripletes. Cada secuencia de tres bases en el ADN codifica instrucciones específicas, tales como la adición de un aminoácido en una cadena. Por tal razón, la secuencia de aminoácidos en una proteína está determinada por el orden de los tripletes de bases del gen que codifica esa proteína en la molécula de ADN. El proceso por el que la información del código genético se convierte en una proteína incluye la transcripción y la traducción.  Representa el 98% de la secuencia del genoma. Corresponde a las porciones del genoma de un organismo que no codifica aminoácidos. Se sabe que algunas secuencias de ADN no ADN no codificante cumplen roles funcionales, como codificant la regulación de la expresión génica, mientras que otras áreas no codificantes no tienen e función conocida. Entre las funciones conocidas están que regula los genes para saber dónde tienen que activar o no y cómo se empaqueta el ADN en los cromosomas. Las secuencias repetidas de ADN no codificantes en los extremos de los cromosomas forman telómeros  Secuencia repetida del ADN que posee la capacidad de moverse y replicarse dentro del genoma. Pueden clasificarse en función de su mecanismo de movilización: 1. elementos simples como los ADN ADN transposones (se mueven en forma de ADN) y 2. retrotransposones (se movilizan utilizando una molécula de ARN intermediario y una actividad reverso móvil transcriptasa. Estos elementos activos se replican en nuestro genoma, y debido a su movilidad aleatoria, son capaces de integrarse dentro de genes causando entre otros efectos la generación de enfermedades genéticas como hemofilia, distrofia, cáncer, etc. Por tanto, son considerados como un claro ejemplo de potencial mutagénico en nuestro genoma. A su vez, han sido clave para la evolución del genoma dela especie humana, responsables de generar nuevos genes, e incluso ser domesticados para realizar una función celular determinada como la enzima telomerasa. Son considerados como un motor heredable de la evolución del genoma humano. Mutaciones, clonación y transgénicos  ¿Qué es una mutación? Son los cambios estables en la cadena de ADN que son capaces de ser heredados. Pueden producirse a partir de errores en la replicación del ADN durante la división celular, la exposición a mutágenos o una infección viral. Las mutaciones en la línea germinal (nivel de óvulos y espermatozoides) pueden transmitirse a la descendencia, mientras que las mutaciones somáticas (las que ocurren en las células del cuerpo), no se transmiten. Las mutaciones dan lugar a pequeños cambios, grandes cambios (causan enfermedad) o ser silentes.  Tipos de mutaciones Se da en 3 niveles: Molecular (génicas o puntuales): Ocurre en la secuencia del ADN, es decir, en sus propias bases nucleotídicas, por algún cambio en los elementos fundamentales que las componen. Cromosómico: Se altera un segmento de cromosoma (es decir, se altera mucho más que un gen) y puede perderse, duplicarse o cambiar de lugar gran cantidad de información. Genómico: Afecta a un conjunto de cromosomas determinado: ocasiona excesos o faltas de cromosomas, y esto varía sustancialmente el genoma entero del organismo.  Mutaciones genéticas Existen dos tipos: Por sustitución de bases: son alteraciones en la secuencia de nucleótidos de un gen y se conocen dos clases: transiciones o transversiones. Por pérdida o inserción de nucleótidos: son modificaciones en donde se puede perder o agregar una base nitrogenada, la cual es importante para codificar a una proteína específica y por lo tanto cambia el mensaje del material genético.  Mutaciones cromosómicas Deleción: Pérdida de un fragmento de cromosoma. Duplicación: Repetición de un fragmento de cromosoma. Inversión: Cambio de sentido de un fragmento del cromosoma. Translocación: Cambio de posición de un segmento de cromosoma. Inserción: implica la adición de uno o más nucleótidos en un segmento de ADN.  Provocan un cambio en la dotación cromosómica, de modo que hay un Mutacione número distinto de cromosomas en las células. No hay un cambio en el s material genético, sino una separación anormal de los cromosomas. genómica s Euploidia: alteración de cromosomas que afecta a juegos de los cromosomas completos. Aneuploidía: uno o varios cromosomas resultan afectados, pero no el genoma. Trisomía: sucede porque los cromosomas no se separan durante la meiosis, de modo que existe un  Aislamiento y análisis de células mutantes Existen distintos métodos, entre estos: electroforesis, secuenciación, clonación, hibridación y reacción en cadena de polimerasa. Electroforesis Es una técnica de laboratorio que se usa para separar moléculas de ADN, ARN o proteínas en función de su tamaño y carga eléctrica. Se usa una corriente eléctrica para mover las moléculas a través de un gel o de otra matriz.  Clonación El procedimiento consiste en insertar un gen de un organismo, a menudo denominado "ADN exógeno", en el material genético de un portador denominado vector. Algunos ejemplos de vectores incluyen bacterias, células de levadura, virus o plásmidos, que son pequeños círculos de ADN transportados por bacterias. Una vez que se ha insertado el gen, el vector se pone bajo condiciones de laboratorio que promueven su multiplicación, lo cual hace que el gen se copie muchas veces.  Clonación El término clonación describe una variedad de procesos que pueden usarse para producir copias genéticamente idénticas de un ente biológico. El material copiado, que tiene la misma composición genética que el original, se conoce como clon. Los investigadores han clonado una gran variedad de materiales biológicos, entre ellos genes, células, tejidos e incluso organismos enteros, tales como una oveja.  Tipos de clonación Clonación de organismos enteros o Clonación de animales o Clonación de plantas Clonación de genes o Clonación de insulina humana (bacterias) o Producción de proteínas recombinantes Clonación de células o Células madre embrionarias o Células madre inducidas (pueden reprogramarse para comportarse como células madre pluripotentes mediante la introducción de ciertos genes. Clonación molecular Clonación de animales en peligro de extinción  Hibridación Es el proceso en el que dos moléculas complementarias de una sola hebra de ADN y/o ARN se unen y forman una molécula de doble cadena. La unión depende del apareamiento apropiado de las bases entre las dos moléculas de una sola hebra. En biología molecular, una sonda de hibridación es un fragmento de ADN o ARN de longitud variable que puede ser marcado radioactivamente o por fluorescencia. Las sondas se utilizan en el estudio de muestras de ADN o ARN para detectar la presencia de secuencias de nucleótidos que son complementarias a la secuencia de la sonda. Reacción de Método de laboratorio que sirve para hacer muchas copias de un trozo determinado de ADN a partir de una cadena de muestra que tiene cantidades diminutas de este ADN. Con la reacción en cadena de la polimerasa se amplifica polimerasa (multiplica) ese trozo de ADN para que se pueda detectar.  Secuenciación de Sanger Pasos: a. Preparación del ADN: hibridación b. Adición de Primer c. Reacción de secuenciación d. Extensión de la cadena e. Separación por electroforesis capilar f. Detección y lectura g. Montaje de secuencia  Importancia del Método de Sanger Diagnóstico de enfermedades genéticas: enfermedades hereditarias, fibrosis quística, anémica de células falciformes, entre otras. Medicina personalizada: tratamiento de cánceres y enfermedades raras. Desarrollo de terapias génicas: terapias génicas. Investigación del cáncer: tratamiento dirigido que atacan mutaciones específicas. Estudios de farmacogenómica: creación de perfiles genéticos que pueden predecir la respuesta a ciertos tratamientos y evitar reacciones adversas. Secuenciación del genoma humano Microbiología clínica: identifica patógenos y estudia resistencia a los antibióticos. Prenatal y diagnóstico preimplantacional: permite la detección de enfermedades genéticas antes del nacimiento o incluso antes de la implantación en tratamientos de fertilidad.  Mapa genético Un mapa genético es una representación gráfica que muestra la disposición de los genes y otras secuencias significativas a lo largo de un cromosoma. Este tipo de mapa puede ayudar a identificar la ubicación de genes relacionados con enfermedades y otras características hereditarias. Este tipo de mapas se usan para localizar e identificar el gen o grupo de genes que determina un rasgo heredado en particular. Los mapas génicos se han utilizado con éxito para encontrar el gen responsable de los trastornos hereditarias causados por la mutación de un solo gen.  Importancia del mapa genético Se aísla el ADN de esas muestras y se examina para encontrar patrones únicos (secuencias de pares de bases que solo aparecen en los miembros de la familia que tienen la enfermedad o rasgo y que se conocen con el nombre de marcadores). Los marcadores de ADN no identifican por sí mismos el gen responsable de la enfermedad o rasgo; pero sí dan pistas fiables sobre la localización exacta del gen en el cromosoma. Esto es gracias al proceso de recombinación que se da en las células reproductivas. La recombinación ocurre durante el desarrollo de óvulos y espermatozoides: los cromosomas pareados que componen el genoma de una persona intercambian tramos de ADN (algo así como barajear). Si un gen en particular está cerca de un marcador de ADN, es probable que ambos permanezcan juntos durante la recombinación y pasen juntos de padres a hijos. Así pues, si cada miembro de la familia con un rasgo determinado también hereda un marcador de ADN particular, es muy probable que el gen responsable esté cerca de ese marcador. Reemplazo de genes y animales transgénicos Un animal transgénico se puede definir como aquel cuyo genoma ha sido modificado por la introducción de un ADN exógeno o por la deleción de un fragmento de ADN propio. El ADN exógeno puede ser un gen de otra especie o una secuencia nucleotídica manipulada de la misma especie. El nuevo gen introducido se denomina transgén y, normalmente, se encuentra integrado de forma estable en el genoma del animal transgénico.  Ejemplos de animales transgénicos Ratones Knockout: Se utilizan en investigación para estudiar la función de genes específicos. Estos ratones tienen genes desactivados (knockout) para analizar los efectos de la pérdida de estos genes en el organismo. Peces fluorescentes (GloFish): Originalmente desarrollados para monitorear la contaminación del agua, estos peces contienen genes de medusas o corales que los hacen brillar en varios colores bajo luz ultravioleta. Cerdos transgénicos: Se han creado cerdos que expresan genes humanos para estudiar enfermedades humanas y producir órganos compatibles para trasplantes (xenotrasplantes). Cabras productoras de proteínas: han sido modificadas para producir proteínas humanas, como la antitrombina, en su leche, que se utiliza para tratar trastornos de coagulación. Mosquitos anti-malaria: creados para portar genes que reducen la capacidad de transmitir la malaria, con el objetivo de controlar la propagación de esta enfermedad.  Corto no. 2 1. Indique una diferencia que hay entre las siguientes técnicas de biología molecular: Electroforesis, hibridación y Secuenciación de Sanger. 2. ¿Qué diferencia hay entre cultivo celular primaria, explante primario y cultivo histotípico? 3. Detalle los 3 niveles de mutación que existen. 4. Mencione 3 diferencias entre ADN nuclear y ADN mitocondrial 5. ¿Qué diferencia existe entre clonación y transgénico?  Cultivo celular Se le conoce como cultivo celular al conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células in vitro, manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Se refiere al crecimiento y mantenimiento de células en condiciones controladas fuera del organismo vivo. Las células pueden ser de origen animal, vegetal o microbiano. Se utilizan para estudios biológicos, investigación médica, producción de vacunas, entre otros. Se distinguen cuatro tipos de cultivo celular: 1. Cultivo de órganos 2. Explantes primarios 3. Cultivo celular primario 4. Cultivo histotípicos y organotípicos  Cultivo de órganos Este tipo de cultivo permite mantener, al menos en parte, la arquitectura característica del tejido “in vivo”. Se conservan las interacciones histológicas, lo cual permite mantener los tipos celulares diferenciados, por lo que representan una buena réplica del tejido de origen. Uno de los problemas que tiene este tipo de cultivo es que la proliferación celular se limita a las células embrionarias de la periferia y no se pueden propagar.  Explante primarios Muestra de tejido tomada directamente del organismo y colocada en un medio de cultivo. Puede contener varios tipos celulares y se utiliza para iniciar un cultivo celular primario. Se coloca un fragmento de tejido o de órgano en la interfase sólido-líquido de un soporte de vidrio o de plástico. Las células se adhieren a la superficie y las células de la periferia del explante pueden migrar y proliferar por la superficie del soporte. Explante es un tejido vivo separado de su órgano propio y transferido a un medio artificial de crecimiento.  Cultivo celular primario Se puede obtener a partir de explantes primarios o de suspensiones de células disgregadas. La disgregación celular se realiza por métodos enzimáticos o mecánicos. En estos cultivos se pierden las interacciones célula-célula y las interacciones de la célula con la matriz extracelular. Sin embargo, las células son capaces de proliferar y la población celular crece notablemente. Cuando las células ocupan toda la superficie disponible se dice que han alcanzado la confluencia. En esta etapa, las células establecen contactos entre ellas que inhiben su proliferación y el crecimiento se detiene. Por eso, al cabo de un tiempo hay que trasplantar las células a un nuevo soporte. Esta operación se denomina subcultivo o pase.  Cultivo histotípicos y organotípicos Son cultivos de un solo tipo celular que consigue alcanzar una elevada densidad celular (tal y como ocurre en los tejidos). Los cultivos organotípicos constan de varios tipos celulares que interaccionan entre sí de una forma que intenta parecerse lo más posible a la original. El objetivo final de este tipo de cultivos es la creación “in vitro” de tejidos u órganos completamente funcionales que puedan ser utilizados en injertos o en trasplantes. Cultivo Histotípico: Se refiere a la cultura de células que intentan replicar la organización y la estructura de un tejido específico, manteniendo la interacción celular y la morfología característica del tejido original. Cultivo Organotípico: Va un paso más allá del cultivo histotípico al incluir múltiples tipos celulares que imitan la estructura tridimensional y la función de un órgano específico. Estos cultivos suelen utilizarse para estudiar interacciones celulares complejas y respuestas fisiológicas.  Cultivo celular secundario Se refiere al cultivo de células que se derivan de un cultivo primario. Estas células ya han sido subcultivadas varias veces y han perdido algunas de las características originales de las células primarias, pero aún pueden ser utilizadas para estudios de largo plazo. En resumen, los cultivos celulares y explantes primarios se utilizan para estudiar células en un Las células muestran distintas propiedades según su origen. Ejemplo: fibroblastos (sintetizan fibras) secretarán colágeno, las células derivadas de tejido muscular esquelético generarán fibras musculares, las células nerviosas extenderán prolongaciones (axones) eléctricamente excitables que podrán conectarse (establecer sinapsis) con otras células nerviosas.  Línea celular Cultivo donde se seleccionan aquellas células que tienen una mayor capacidad de crecimiento, y se van volviendo uniformes en su genotipo y fenotipo, que tienen el potencial de multiplicarse indefinidamente. Pueden ser conservadas y almacenadas en nitrógeno líquido (a -196 °C) por un período muy largo de tiempo, reteniendo su viabilidad y siendo un buen modelo experimental para las primeras etapas de una investigación La uniformidad genética en una línea celular puede mejorarse por clonado celular, a través del cual se aísla una sola célula, la que prolifera para formar una colonia de células clonales (idénticas). CLONACION MOLECULAR  ADN recombinante Es la mezcla in vitro de diferentes secuencias derivadas de varias fuentes biológicas, el cual se obtiene a través de protocolos experimentales; proceso que es inspirado por la recombinación genética que ocurre naturalmente dentro de la célula. Se basa principalmente en la clonación molecular, la cual consiste en insertar un fragmento de ADN de interés en una molécula (vector) capaz de replicarse independientemente en una célula huésped. Esta herramienta ha hecho posible clonar fragmentos de ADN humano en vectores plasmídicos.  Los plásmidos son pequeñas moléculas circulares de ADN aisladas de bacterias con capacidad de replicación autónoma. Por tanto, cuando se insertan secuencias de ADN humano en plásmidos, es posible obtener grandes cantidades de ADN recombinante tras la replicación exponencial de las bacterias. Los fragmentos de ADN utilizados para crear moléculas de ADN recombinante son generados por digestión con endonucleasas, cortan secuencias de reconocimiento en forma escalonada generando extremos cohesivos de una sola hebra que pueden asociarse. Extremos se unen por medio de una ADN ligasa. De esta forma dos fragmentos distintos de ADN (un  Clonación de secuencias de ARN Se hace a partir de una copia de ADN por medio de la transcriptasa inversa. EL ADN producido (ADN complementario –ADNc) se liga al vector de ADN. Se utiliza cuando el propósito es la clonación de un gen codificante específico en eucariotas y no es posible clonarlo directamente del ADN. Esto debido a que los genes eucarióticos están interrumpidos por secuencias no codificantes o intrones. La clonación de ADNc permite que el ARNm correspondiente a un solo gen sea aislado. Se hace para estudiar la expresión de un gen, para producir proteínas en el tratamiento de una enfermedad genética, hormonas, vacunas y como herramienta  Vectores de clonación Se utilizan diferentes vectores para clonar ADN en hospedadores bacterianos, entre ellos: plásmidos, fagos, cósmidos, cromosomas artificiales de bacterias (BACs), cromosomas artificiales de levaduras (YACs), entre otros. La selección depende del propósito de la investigación o aplicación, sin embargo, es necesario que como mínimo cada vector posea origen de replicación propio; contenga un marcador de selección; un gen con función indicadora (identificar cambios fenotípicos, si el fragmento a clonar quedó insertado correctamente, y secuencias diana únicas de restricción).  Plásmidos ADN circular aislado de ADN. Su importancia radica en que puede replicarse de manera independiente del cromosoma bacteriano y que posee un origen de replicación propio. Dada esta capacidad se utiliza en ingeniería genética para la clonación de fragmentos de ADN de diferente procedencia. Posee sitios de reconocimiento por enzimas que le permiten la inserción de segmentos de ADN foráneo. Existen secuencias dentro de los plásmidos que son reconocidas en un mismo segmento por diferentes endonucleasas, conocidos como polylinkers, sitios que facilitan el uso de estos vectores.  El polylinker facilita la manipulación genética al permitir a los investigadores cortar y pegar ADN de diferentes fuentes en el vector de clonación utilizando diversas enzimas de restricción. Esto es crucial para técnicas como la clonación molecular, donde se requiere insertar genes específicos en vectores para su expresión en células hospedadoras.  + vectores de clonación Fagos: son virus que tienen la capacidad natural de infectar bacterias y soportan la inserción de fragmentos grandes (hasta 15 kb). Cósmidos: Son el híbrido entre fa- gos y plásmidos que combinan la acción de estos dos vectores además de tener la capacidad de inserción de fragmentos muy grandes (aproxima- damente 45 kb). Cromosomas Artificiales Bacterianos BACs: Son clones genómicos de gran tamaño que se mantienen de forma estable en Escherichia coli. Pueden servir como fuente de secuencias promotoras específicas de genes, debido a que con frecuencia son lo suficientemente grandes para contener un gen completo y sus elementos reguladores asociados. Cromosomas Artificiales de Levaduras YACs: Son vectores tipo plásmido que pueden ser propagados en dos tipos diferentes de hospederos, amplificarse en bacterias y emplearse para la clonación y manipulación de gran- des insertos de ADN (hasta 3 Mb) en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Los YACs se pueden adaptar con los marcadores seleccionables apropiados y se pueden transmitir a células de diferentes organismos, lo que permite la generación de animales transgénicos. Desnaturalización y renaturalización del ADN  Es la técnica que permite la formación de complejos bicatenarios no naturales de ADN:ADN y ADN:ARN. Se usa para conocer si está presente o ausente una determinada secuencia de ADN, ARN o una proteína en una muestra problema; generalmente, para detectar al híbrido se emplea una sonda marcada y esta tiene una Hibridació secuencia complementaria a la que se n está buscando. El reconocimiento de secuencias específicas de nucleótidos en materiales clínicos permite facilitar y efectuar análisis epidemiológicos rápidos y detallados; por tanto, la hibridación es un avance crucial en el diagnóstico e identificación de diferentes patologías de importancia en la actualidad.  Aspectos a considerar en la hibridación La desnaturalización de una molécula de ADN se lleva a cabo por métodos físicos, como el calor donde el aumento de la temperatura debilita las fuerzas que mantienen unidas las hebras del ADN desestabilizando la estructura de la doble hélice; por métodos químicos, como el tratamiento con un ácido o base, debido a que el apareamiento de bases disminuye o se debilita por valores de pH alejados de la neutralidad, con la consiguiente desnaturalización del ADN, o mediante el empleo de agentes químicos donde los grupos amino y carbonilo de ciertos compuestos compiten en la formación de enlaces de hidrógeno con los grupos propios de las bases, facilitando así la ruptura de sus apareamientos y la separación de las hebras. Bajo condiciones controladas este suele ser un proceso reversible.  La temperatura necesaria para desnaturalizar una molécula determinada de ADN se denomina temperatura de desnaturalización o melting, por lo cual se conoce como Tm y corresponde a la temperatura en donde la mitad del ADN está presente en forma de cadenas simples (desnaturalizado), siendo una medida de la estabilidad estructural de la molécula de ADN y es directamente dependiente de la cantidad de G-C (G: guanina, C: citosina). A mayor cantidad de pares de G-C mayor será el valor del Tm; su valor depende también del pH, la fuerza iónica del medio y de la longitud de la molécula de ADN. Si una muestra de ADN se lleva a temperaturas de ebullición (93°C o más) se desnaturalizará, es decir sus cadenas se separarán. Si la muestra se enfría las cadenas se volverán a hibridizar. Cabe destacar que las cadenas complementarias cortas tenderán a hibridar más rápido que las moléculas largas. UNIDAD II NÚCLEO CELULAR  Núcleo celular El núcleo es el organelo más prominente de la célula. El ADN de las células se localiza dentro del núcleo (eucariotas). La envoltura nuclear está formada por dos membranas concéntricas que separan el contenido nuclear del citoplasma circundante. Estas membranas tienen una separación de 20 a 40 nm que se unen a intervalos para formar los poros nucleares. Cada poro nuclear consiste en un complejo molecular que se compone de muchas copias de aproximadamente 30 proteínas diferentes. Los poros nucleares regulan el paso de materiales entre el nucleoplasma y el citoplasma.  Matriz nuclear Está compuesta por tres elementos: uno periférico formado por el conjunto de lámina-complejos de poro, los restos nucleolares y una serie de estructuras fibro-granulares que ocupan buena parte del volumen nuclear muchas veces llamados red interna o matriz interna. La matriz nuclear constituye la estructura compleja que proporciona el soporte físico para los procesos de replicación, procesamiento y transporte del RNA en eucariotas.  Lámina nuclear El núcleo presenta una red fibrosa de filamentos proteínicos, denominada lámina nuclear, la cual forma un revestimiento interno de la envoltura nuclear. La lámina nuclear sirve de sostén a la membrana nuclear interna y puede tener otras funciones importantes, como la organización del contenido nuclear. También, desempeña una función en la duplicación del ADN y en la regulación del ciclo celular. Algunas enfermedades humanas genéticas se asocian a los genes que codifican las proteínas que conforman la lámina nuclear, entre ellas las distrofias musculares y el envejecimiento prematuro (progeria)  Matriz nuclear interna Contiene proteínas que se unen al ARNm y pre-mensajero, así como a los ARN de bajo peso molecular ricos en uridina y también restos de dios ARN. Entre las funciones que realiza están: duplicación del ADN, transcripción no nucleolar y el procesamiento postranscripción del pre-ARNm.  Envoltura nuclear Está formado por dos membranas, una externa y una interna constituidas como todas las membranas biológicas por dobles capas de fosfolípidos y proteínas. En la membrana externa se pueden adherir ribosomas que sintetizan proteínas no citosólicas, entre ellas, proteínas de secreción. La envoltura nuclear ha sido llamada como cisterna perinuclear y tiene la particularidad de estar perforada por poros que permiten el tránsito de moléculas entre el citosol y el nucleoplasma.  Procesos que se llevan a cabo en el núcleo Replicación: capacidad del ADN de elaborar una copia exacta de sí misma. Las moléculas de ADN están formadas por secuencias de nucleótidos llamadas genes, que contienen las instrucciones codificadas químicamente para producir las proteínas que necesita la célula. El núcleo controla la síntesis de proteínas transcribiendo su información en moléculas de ARN mensajero (ARNm). El ADN se asocia con el ARN y con ciertas proteínas, formando un complejo conocido como cromatina.  Diferencia entre eucromatina y heterocromatina 1. Eucromatina Posee un menor grado de empaquetamiento (ADN). Estado más compatible con la actividad génica y la transcripción. Conformación más flexible y frecuentemente asociada a ARN polimerasas que permite la expresión genética. Forma más abundante durante la interfase superando el 90% de toda la cromatina. 2. Heterocromatina Se encuentra en regiones centroméricas y algunas veces en regiones teloméricas. Presentan un mayor grado de empaquetamiento.  Nucleosomas Constituyen el primer nivel de compactación de la cromatina dentro del núcleo. Se encuentra compuesto por un grupo de proteínas básicas llamadas histonas que se agrupan formando un octámero, el cual abarca alrededor de 146 pb de ADN. Subunidad de repetición básica de la cromatina condensada dentro del núcleo de la célula.  Nucléolo Estructura esférica que se encuentra en el núcleo de la célula cuya función principal es producir y ensamblar los ribosomas de la célula Sitio de síntesis y procesamiento del pre-ARNr y del ensamblado de las subunidades del ribosoma. El nucleolo no contiene cromosomas. Consta de centro fibrilares, componente fibrilar denso y componente granular. Está constituido por los genes ADNr, proteínas y ARNr.  Región Organizadora de los Nucléolos (NOR) Son bucles de ADN ribosómico (ADNr) que tienen por misión la codificación del ARN ribosómico para realizar la síntesis de las proteínas. Las NOR se localizan en un determinado número de cromosomas, que varía dependiendo de cada especie de eucariotas. Aparecen ocupando una posición subterminal en los brazos cortos de 5 cromosomas acrocéntricos (en humanos son los cromosomas 13,14,15, 21 y 22. En los eucariotas, las regiones NORs están implicadas en la organización de los nucléolos (formados por ARN ribosómico y proteínas). Ensamblaj e de las subunidad es ribosomal es  UNIDAD III DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR  DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGIA MOLECULAR Replicación del ADN La propuesta de Watson-Crick presenta como es el comportamiento del ADN durante su replicación. Según dicha propuesta cada hebra dúplex debe consistir en una hebra completa heredada del dúplex parental y una hebra complementaria completa recién sintetizada. Mecanismos sugeridos para la replicación: 1) Semiconservativa 2) Conservativa 3) Replicación dispersa  Replicación semiconserv ativa Cada hebra duplicada contiene una hebra de la estructura parental.  Replicación conservativa Las dos hebras originales permanecerían juntas al igual que las dos hebras recién sintetizadas, dando como resultado una de las hijas dúplex contendría solo ADN parental, mientras que la otra contendría ADN recién sintetizada.  Replicación dispersa Las hebras parenterales se dividirían en fragmento y las nuevas hebras se sintetizarían en segmentos cortos, luego los viejos fragmentos y los nuevos se unirían para formar una hebra completa.  Replicación de ADN en células bacterianas Comienza a partir de un sitio específico en el cromosoma llamada origen. El origen de replicación es una secuencia específica donde se unen varias proteínas para iniciar el proceso de replicación. Una vez iniciada la replicación procede hacia afuera desde el origen en ambas direcciones (bidireccionalmente) El par de segmentos replicados se juntan y se unen al ADN no replicado llamado horquillas de replicación el cual tiene dos sitios. 1) la doble hélice parental experimenta una separación de la hebra y 2) se están incorporando nucleótidos en las hebras complementarias recién sintetizadas. Las dos horquillas se mueven en direcciones opuestas Replicación ADN en eucariotas  Origen de la replicación del ADN Las células eucariotas replican su genoma en pequeñas porciones denominadas replicones. Cada replicón tiene su propio origen a partir del cual las horquillas de replicación avanzan hacia afuera en ambas direcciones. La replicación en una célula humana comienza en aproximadamente 10,000 a 100,000 orígenes de replicación distinto. Aproximadamente 10 a 15% de los replicones participan activamente en la replicación en cualquier momento dado durante la fase S del ciclo celular. En células de mamíferos, la replicación está ligada a la actividad de los genes en la región y/o estado de compactación. La presencia de histonas acetiladas, que están estrechamente relacionadas con la transcripción génica es otro factor para determinar la replicación temprana de los loci genéticamente activos. Las regiones más altamente compactadas y menos acetiladas del cromosoma están empaquetadas en heterocromatina, y son las últimas regiones en ser replicadas. En conclusión, se podría decir que la replicación en los cromosomas eucariotas comienza en muchos sitios a lo largo del ADN.  Horquilla de replicación Las actividades que ocurren en las horquillas de replicación son bastante similares, independientemente del tipo de genoma que se replica, ya sea viral, bacteriano, arqueas o eucariótico. Todos los sistemas de replicación requieren helicasas, proteínas de unión a ADN de hebra simple, topoisomerasas, primasa, ADN polimerasa y ADN ligasa. Existen cinco tipos de ADN polimerasas en células eucariotas de mamíferos La polimerasa γ replica el ADN mitocondrial (exclusiva) Polimerasa β en la reparación del ADN (crucial en la corrección de daños menores en el ADN, como los nucleótidos mal emparejados o dañados). El resto tiene funciones replicativas. La polimerasa α está estrechamente relacionada con la primasa, y juntas inician la síntesis de cada fragmento de Okazaki o dicho de otra manera la replicación. La polimerasa δ pprincipalmente responsable de la síntesis de la cadena rezagada durante la replicación del ADN.. La polimerasa ε principalmente responsable de la síntesis de la cadena líder durante la replicación del ADN.