PCR ve Kullanım Alanları PDF

TIBBİ BİYOLOJİ PCR ve Kullanım Alanları Prof. Dr. Fatma Filiz ARI  Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) Polymerase Chain Reaction (PCR) DNA’da hedef bir bölgenin tercihli olarak, tüp içinde ve kısa sürede çoğaltılması metodudur. "Hücresel DNA replikasyonunun i...

TIBBİ BİYOLOJİ PCR ve Kullanım Alanları Prof. Dr. Fatma Filiz ARI  Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) Polymerase Chain Reaction (PCR) DNA’da hedef bir bölgenin tercihli olarak, tüp içinde ve kısa sürede çoğaltılması metodudur. "Hücresel DNA replikasyonunun in vitro tasarlanmış şeklidir" Her tip DNA’yı, hatta sınırlı miktardaki ve yeterince saf olmayan DNA’ları (ör: fosil) çoğaltmak için uygun yöntemdir. Moleküler Biyolojide çığır açan bir buluştur 1985’de Kary Mullis ve arkadaşları tarafından geliştirilmiştir. (1993 Nobel Kimya ödülü)  PCR’ın Kullanım Alanları Temel Bilimde: Genom haritalama, Gen klonlama ve Gen ekspresyonu Klinikte: Genetik hastalıklarda hasta ve taşıyıcı tanısında Prenatal tanıda Klinik örneklerden viral ve bakteriyal patojenlerin direk tanısı, Antibiyotik direnç ve virülans genlerin saptanması Adli tıpta: (Cinayet yerindeki az miktarda kan, diğer dokular veya spermden elde edilen DNA ile suçlu tespiti, babalık davalarının aydınlatılması) Tarım ve Gıda Sanayisinde: Bitki hayvan ırklarının tespitinde ve GDO’lu ürünlerin tanısında Evrimsel çalışmalarda: Fosil DNA’ların incelenmesinde (Donmuş ve 40.000 yaşında bir mamut DNA’sı çoğaltılabilmiştir)  PCR ile iki primer arasında kalan DNA bölgesi çoğaltılır PCR amplifikasyonu için hedef DNA dizisinin bilinmesi önemlidir. Bir çift Primer dizisinin (18-25 bazlık oligonükleotid) bu bölgeye spesifik hazırlanması ve genom üzerinde başka bir DNA bölgesine bağlanmamaları gerekir. PCR’da Thermus aquaticus bakterisinden izole edilmiş ısıya dayanıklı bir DNA polimeraz olan Taq DNA polimeraz enzimi kullanılır.  o 1. Denatürasyon : çift zincirli kalıp DNA’nın 90-95 C’de denatürasyonu o 2. Bağlanma : Denatüre DNA zincirlerine 50-60 C’de primerlerin bağlanması o 3. Uzama: Taq DNA polimerazın 72 C’de primerlerin 3’-OH ucuna dNTP’lar ekleyerek yeni DNA zincirlerini sentezlemesi PCR cihazında bu 3 aşamanın 30-35 kez tekrarlanması ile hedef DNA’nın çok sayıda kopyası elde edilir  PCR reaktiflerinin özellikleri (miktarı ve kalitesi) PCR döngüsü (ısı dereceleri ve süreler) Fiziksel koşullar (kontaminasyon ve inhibitör varlığı) Personel deneyimi ve dikkati PCR’ın başarılı olmasını etkileyen faktörlerdir PCR ANİMASYON https://www.youtube.com/watch? v=iQsu3Kz9NYo&ab_channel=CanalDivulga ci%C3%B3n Yüklü biyomoleküllerin (nükleik asitler ya da proteinler), elektriksel akım kullanılarak bir matriks (jel) içerisinde ayrıştırılması işlemine “jel elektroforezi” adı verilir. Electro=Elektrik Phoresis= Göç-taşıma Migration-Carry accross İsveçli Biyokimyacı Arne Tiselius Elektroforez tekniğinin geliştirilmesi ve özellikle serum proteinlerinin karmaşık yapısıyla ilgili keşifler 1948 Nobel Kimya ödülü  Elektroforez esnasında uygulanan elektrik akımı, Negatif yüklü DNA parçalarını Agaroz jel matriksin porları içinde negatif kutuptan, pozitif kutba hareket etmeye zorlar. DNA parçalarının jeldeki hareketi: uygulanan akım şiddetine, moleküllerin büyüklüğüne ve şekline bağlıdır. Jelde büyük moleküller yavaş, küçük moleküller daha hızlı ilerler Agaroz Jelde DNA parçalarının ayrışması Agaroz Jelde DNA parçalarının ayrışması  Agaroz Agaroz, bir kırmızı alg türü olan Agar agar’dan izole edilen bir heteropolisakkarittir. (Bitkisel jelatin olarak adlandırılır ve gıda sanayisinde kıvam arttırıcı olarak kullanılır) Toz halde ticari ürün olarak satılan Agaroz sıcak suda çözünür ve soğutulduğu zaman polimerde karşılıklı hidrojen bağlarının oluşumu ile yarı-katı jel yapısı oluşur. Agaroz Jelin Hazırlanması Agaroz Jel Elektroforezi Ekipmanı PCR ile çoğaltılan DNA’ların Elektroforez ile saptanması  PCR ürünü DNA’ların görüntülenmesi Bu amaçla Ethidium Bromid (EtBr) kullanılır. EtBr nükleik asitlerin bazları arasına bağlanarak DNA bantlarının jelde saptanmalarını sağlayan florasan bir boyadır. Agaroz jel solüsyonuna eklenir ve örnekler jelde yürütüldükten sonra UV tablasına yerleştirilen jelde DNA ile bağlanan EtBr floresan ışıma yaparak DNA’yı tespit edilmesini sağlar. PCR ürünü DNA bantlarının değerlendirilmesi Agaroz jel elektroforez Animasyonu https://www.youtube.com/watch?v=ZLNItK9kJtM Birden fazla ve farklı hedef DNA dizilerinin çoğaltılması Gerçek Zamanlı PCR, geleneksel PCR metodundan farklı olarak reaksiyon tüpü içinde çoğaltılan DNA miktarının eş zamanlı olarak tespitine ve miktarının ölçülmesine olanak veren bir PCR yöntemidir. Analiz için eklenen floresan problar amplifikasyon süreci devam ederken DNA artışının bir grafiğini verir (jel elektroforezine ihtiyaç duyulmaz).