Tema 6: Transmisión Sináptica PDF

1 de 70 TEMA 6: TRANSMISION SINAPTICA Transmisión sináptica := forma a través de la q las neuronas se comunican entre sí y se transmiten la información. Cuando el PA llega a la terminal sináptica, la transmisión sináptica permite hacer llegar la info a la siguiente neurona. Existen 2 tipos de sina...

1 de 70 TEMA 6: TRANSMISION SINAPTICA Transmisión sináptica := forma a través de la q las neuronas se comunican entre sí y se transmiten la información. Cuando el PA llega a la terminal sináptica, la transmisión sináptica permite hacer llegar la info a la siguiente neurona. Existen 2 tipos de sinapsis en el SN: 1. Sinapsis química (mayoritarias)— son unidireccionales => no hay continuidad entre los citoplasmas de ambas células, sino q están separadas por una hendidura sináptica (20-40 nm). En la terminal pre-sináptica hay vesículas q contienen neurotransmisores y una zona activa mientras q en la densidad post-sináptica hay receptores con los q los NTs interaccionan al ser liberados por la llegada del PA. Desde q este ultimo ocurre hasta q se registre une venta en la neurona post-sináptica transcurre un pequeño periodo de tiempo (0.3-5 ms) => se produce un retardo sináptico. 2. Sinapsis eléctrica (muchas durante desarrollo)— son bidireccionales => los citoplasmas de las células están conectados mediante uniones de hendidura (gap junction) y la distancia entre ambas es muy pequeña (3.5 nm). Esto implica q la llegada del PA a la neurona post-sináptica es inmediata y la transmisión de la señal es inmediata y sin retardo. => en las sinapsis eléctricas hay sincronía en las respuestas.  2 de 70 SINAPSIS ELECTRICAS: e.g. neuronas motoras acopladas electricamente en caracoles marinos Los caracoles marinos liberan tinta cuando se sienten atacados, en respuesta a un estimulo muy intenso en su cola (no todos los estímulos pueden inducir esta liberación de tinta). La cola del caracol está inervada por una neurona sensorial q establece sinapsis químicas con 3 motoneuronas q hacen sinapsis química con la glándula de tinta. Las motoneuronas están conectadas por uniones de hendidura, lo cual permite la respuesta sincronizada y de la misma magnitud ante el estimulo. => la corriente del PA se distribuye entre los citoplasmas de las motoneuronas => disminuye la resistencia y la diferencia de potencial. Eso pq cuanto mas citoplasma, menos resistencia => menor diferencia de voltaje (disminuye amplitud de PA) Solo cuando el estimulo es su cientemente intenso (producido por una ráfaga de PAs) se produce la despolarización de las neuronas y la estimulación de las glándulas de tinta. Se ha visto q el bloqueo de las uniones de hendidura produce la perdida de la sincronía. UNIONES DE HENDIDURA: Están formadas por la union de 2 hemi-canales, cada uno en la membrana de una de las neuronas y ambos compuestos por 6 conexinas. => la uniones de 6 conexinas genera un conexón (:= canal q si se abre crea un poro de 5nm (grande) ) y eso ocurre en ambas membranas pre- y post- sináptica. Cada conexina tiene: 4 alpha-helices (= dominios TM) ricas de a.a. hidrofóbicos y también con a.a. cargados cada 3-4 residuos q son muy conservados pq son esenciales por la interacción de ≠ unidades. Dominio M3 — la interacción de los 6 dominios M3 genera el poro hidrofílico del canal. Loop extracelular rico de Lys q permite interacción con otras conexinas N- y C- terminales se encuentran en el lado citoplasmático (intracelular) y se distinguen 2 tipos de lazos entre los dominios: Lazos citoplasmáticos — gran variabilidad lo q permite apertura/cierre de los canales Lazos extra-citoplasmáticos — conservados lo q permite interacción de 2 hemi- canales. (Pueden ser interacciones homo- o hetero- fílicas) fi  3 de 70 Alpha y beta conexinas (50% homologia entre ambas familias): Cx26, Cx32 (beta), Cx33, Cx37… (alpha) —> CX + peso molecular Solo algunas se expresan en SN La vida media de las conexinas es muy corta (3h) => hay una importante regulación de su transcripción y traducción. La conductancia (opuesto de resistencia eléctrica) es muy elevada (100 ps) cuando forman el poro El poro tiene un diámetro de 1.5 nm => permeables a pequeñas moléculas (Ca2+, AMPc, IP3…) q transmiten la señal a la célula adyacente Las uniones de hendidura pueden encostrase en conformación abierta o cerrada y, dependiendo de la naturaleza de las conexinas implicadas, el cierre puede producirse por: - ↑↑ [Ca2+] citosolico/intracelular —> Ca2+ se une a loop intracelular y cierra el poro - ↓ pH - Exceso de productos de fosfolipasas (AA) - Agentes lipofílicos (heptanol, octanos…) - Diferencia de voltaje —> la conductancia de las uniones es muy elevada pero la sensibilidad al voltaje varía en función de la conexina El cierre provoca q las células dejan de compartir sus citoplasma. Cuanto mas estrecha la curva, mas sensible al voltaje es la conexina. FUNCIONES UNIONES DE HENDIDURA: En neuronas: sincronizan las respuestas neuronales la expresión de conexinas es más elevada durante el desarrollo y disminuye cuando el SN madura. Eso pq se produce un cambio de sinapsis eléctrica a químicas, dado q las neuronas empiezan a expresar proteínas implicadas en la liberación de NT y otras moléculas implicadas en sinapsis químicas Si eso no ocurre (=> uniones de hendidura persisten) hay convulsiones en niños En astrocitos: las uniones de hendidura permiten la conexión de los citoplasmas de los astrocitos, constituyendo un ‘sumidero’ (‘complejo’) para retirar la elevada [K] o [NT] q se están liberando en sinapsis. la conexina mas abundante es Cx43 — la sustitución de esa provoca una distribución no homogénea y lenta de K Enfermedad de Charcot-Marie-Tooth Se debe a una mutación en el gen q codi ca para la Cx32, localizado en ch. X. Esta conexina se expresa en las uniones de hendidura de las células mielinizantes. Se trata de una poli-neuropatía periférica q se mani esta con debilidad muscular (en las extremidad distales primero) y dado q se expresa también en oligodendrocitos puede afectar SNC (generalmente es una enfermedad del SNP). La conducción del impulso nervioso es muy lenta pq se produce una mielinización defectuosa en las capas paranodales => la conducción en axones sensoriales y motores se ve reducida. fi fi  4 de 70 SINAPSIS QUIMICAS: Claude Bernard — observó q el veneno utilizado por los indios en la punta de sus echas producía parálisis muscular de las presas q cazaban. El veneno contenía d-tubocurarina (antagonista), q bloquea los receptores nicotinas de AcCh en el músculo. Fue el primero q entendí q tenia q haber algo químico. Ramon y Cajal — a rmaba intuyó q las neuronas eran elementos individuales y independientes (= son las unidades básicas) y q tenia q haber ciertos mecanismos de contacto/comunicación Sherrington — acuñó el termino sinapsis. Elliot y Langley — observaron q la adrenalina producía la contracción de los músculos lisos inervados por lo q dedujeron q el nervio liberaba una sustancia química q mediaba la respuesta, la noradrenalina. Acuñaron el termino mediador químico. Otto Loewi — demostró q la AcCh liberada por el nervio vago del corazón al ser estimulado enllentecía la frecuencia cardiaca. Dale — hizo la distinción entre neuronas colinérgicas parasimpáticas (q liberan adrenalina) y las noradrenérgicas simpáticas (q liberan noradrenalina) => SN simpáticos vs parasimpático. Esperimento de Otto Loewi: Introdujo 2 corazones de ranas en baños de oraganos completamente separados, ambos unidos a un polígrafo q registraba los latidos. Estimulo electricamente el nervio vago de uno de los 2 corazones, observando q este dejaba de latir. Su hipótesis era q la parada cardíaca ocurría por la liberación de una sustancia => esta sustancia debía encontrase en el medio. Paso este medio al contenedor con el otro corazón y observo q ese dejaba de latir. Posteriormente identi co la AcCh como el transmisor químico liberado por el nervio vago. fi fi fl  5 de 70 SINAPSIS QUIMICAS EN EL SNC: Se diferencian 2 tipos de sinapsis químicas en el SNC: Sinapsis simétricas — se establecen con neuronas inhibitorias (q liberan NT inhibitorios). Tienen la misma electrodensidad (grosor similar) tanto en la membrana pre- como en la post-sináptica. Sinapsis asimétricas (mas abundante)— se corresponden con neuronas excitatorias (q liberan NT excitatorios). Tienen una region post-sináptica muy electrodensa, pues su contenido proteico es mucho más elevado q en la pre-sinapsis. Hay un retraso sináptico (5ms) de PA. Para q se produzca la transmisión sináptica, la exocitosis del contenido de las vesículas pre-sinápticas debe ocurrir en la zona activa de la membrana pre-sináptica q está en frente de la region de la membrana post-sináptica en las q se concentran los receptores. La exocitosis se produce con la llegada del PA q despolariza la terminal pre-sináptica y causa la apertura de los canales de Ca dep. de voltaje. => el aumento de [Ca] intracelular, provoca la fusión de las vesículas y la liberación del NT. El NT difunde y se une a los receptores post-sinápticos generando de nuevo la despolarización de la membrana. => se produce una señal eléctrica — química — eléctrica. Entre el PA pre-sináptico y el PA post-sináptico se produce un retardo sináptico de milisegundos durante el cual se abren los canales de Ca, ocurre la exocitosis y el NT difunde a los receptores.  6 de 70 NEUROTRANSMISORES EN EL SNC: Para q una molécula pueda ser de nida un NT, debe cumplir los siguientes criterios: 1. Debe ser liberado tras la estimulación de la célula pre-sináptica. 2. Al añadir el NT exógeno a la célula post-sináptica, debe producir los mismos efectos q el NT endógeno. 3. Los antagonistas del receptor post-sináptico deben suprimir la respuesta del NT. 4. Deben existir mecanismos para la terminación de las acciones sinápticas del NT. Los NTs se agrupan en 3 familias q se diferencian en sus [ ], localización y las vesículas en las q se empaquetan: 1. Aminoácidos - Se encuentran en [ ] de umol/g tejido. - Pueden encontrase tanto vesiculados como en el citosol ( [a.a.] citosolica elevada) - Se empaquetan en vesículas sinápticas pequeñas muy próximas a la zona activa => se liberan con un único PA. - Activan receptores de naturaleza ionotrópica produciendo una respuesta extremadamente rapida. Glu — NT excitatorio GABA — NT inhibitorio q actua sobre inter-neuronas. (Se sintetiza a partir de la descaboxilación del Glu en el carbono alpha) Gly — NT inhibitorio q actua en la medula. No presenta receptor metabotrópico 2. Aminas - Se encuentran en [ ] de nmol/g tejido AcCh — se empaqueta en vesículas pequeñas q se fusionan en la zona activa => se necesita un único PA para su liberación. AcCh no se incluye en el grupo anterior pq su [ ] en el citosol es prácticamente indetectable. Estimula receptores tanto ionotrópicos como metabotrópicos. Catecolaminas (dopamina, norepinefrina, epinefrina) — en el SNP se empaquetan en vesículas densas de gran tamaño, mientras q en el SNC no está claro. Activan receptores metabotrópicos. 5HT — activa receptores metabotrópicos y ionotrópicos Histamina — es un derivado de la Hys por descaboxilación 3. Neuropéptidos (NP) - Se encuentran en [ ] de pmol/g tejido - [NP] citosolica muy baja - Se empaquetan en vesículas densas de gran tamaño y se necesita un tren de PA para su liberación dado q se liberan en las zonas peri-sinápticas o peri-activas (mas lejanas de la zona activa => mas lejanas de los canales de Ca) => se necesita una mayor entrada de Ca pq tiene q difundirse mas lejos. (mas entrada de Ca = mas PAs) - Activan receptores metabotrópicos !!! Los receptores metabotrópicos regulan la transmisión sináptica, pero NO la median. !!! La comunicación célula-célula depende de los receptores ionotrópicos. fi  7 de 70 CICLO DE UN NT CLASICO Todos los NTs se almacenan en vesículas en la célula pre-sináptica mediante transportadores vesiculares especí cos. La llegada del PA produce la exocitosis de los NTs q son liberados a la hendidura sináptica. Después de actuar sobre los receptores post-sinápticos, los NTs deben ser eliminados para bloquear la transmisión sináptica. Eso puede ocurrir mediante: - Recaptación por los astrocitos - Degradazione en la hendidura sinápticas por enzima - Difusion de la hendidura sináptica Glu también presenta receptores en la zona activa pre-sináptica (mGluR7) q ejercen acción reguladora. CICLO DE UN NEUROPÉPTIDO Los NPs actúan sobre receptores metabotrópicos q se encuentran acoplados a proteínas G => aunque su acción se desarrolla de forma más lenta, su efecto es mucho más duradero. => tienen un papel regulador. 1. Primero se expresa un precursor (proteínas de mayor tamaño sintetizadas en el soma). 2. Después estos precursores son procesados para dar lugar a >1 péptido neuro-activo (no siempre, en algunos casos). 3. Este péptido neuro-activo entra en vesículas donde se empaqueta (el folding ocurre en el interior de las vesículas electrodensas). 4. Las vesículas lo transportan desde el soma a los botones sinápticos. 5. Cuando llegan PAs, se liberan en zona péri- activa. En muchos casos, los NPs modulan la liberación de otros NTs => en algunas sinapsis hay 1 NT y un par de NPs lo cual enriquece en gran medida el proceso. e.g. neurotensina y neuromedina N. fi  8 de 70 CO-LIBERACION DE 2 NT RAPIDOS Se ha observado q existen sinapsis mixtas q liberan 2 NTs. Eso fue demostrado analizando sinapsis q se consideraban glicinérgicas: al añadir estigmina (antagonista de receptores de Gly) no se detectó el bloqueo de la sinapsis como se esperaba y se detectó una corriente insensible a la estigmina. Entonces se añadió bicuculina (antagonista de receptores GABA) y se observo q no había corriente. => algunas sinapsis liberan 2 NTs y por tanto presentan 2 tipos de receptores. 41% son Gly puras 15% son GABA puras 44% son mistas => Gly y GABA coexisten y dado q ambos son inhibitorios, la señal es la misma. Pueden existir sinapsis mixtas con NT inhibitorios y excitatorios pero en este caso uno de los 2 no difundiría.  9 de 70 RECEPTORES: Receptores ionotrópicos — median una respuesta rapida pero poco duradera. Se abren cuando el NT se une al receptor produciendo un cambio conformacional y se cierran e inactivan rápidamente en cuanto el NT se disocia. Nicotínicos — son complejos multiproteicos formados por 5 subunidades cuya naturaleza condiciona los iones q atraviesan el canal, aunque se produce principalmente el paso de Na. En el cerebro también contribuyen a la entrada de Ca. Se encuentran principalmente en las uniones neuro-musculares. Receptores metabotrópicos — median respuestas mas lenta pero duradera. Esto pq están acoplados a proteínas G (GPCRs) q activan o inhiben efectores, los cuales cambian la [ ] de intermediarios y fosforilan residuos Muscarínicos e.g. transmisión rapida y lenta en una misma neurona ganglionar (sistema para-simpatico) La llegada del PA a la neurona pre-sináptica produce la liberación de AcCh q estimula los receptores nicotínicos. En consecuencia, la entrada de Na despolariza la membrana y genera el potencial post-sináptico de forma rapida. Si se continua registrando este potencial, se observa una corriente q se desarrolla de forma mas lenta pero sostenida en el tiempo. Esto no se debe a la apertura de los receptores nicotínicos (q solo están activos mientras q la AcCh se encuentra en la hendidura sináptica) sino q se debe a la presencia de receptores muscarínicos q responden igualmente a la AcCh. Su acción produce el cierre de los canales de K de tipo M, de forma q se impide la ‘anulación’ de la carga q entra a través del receptor ionotrópico (nicotínico). La entrada de Na produce una ligera despolarización de la membrana q da lugar a la apertura de los canales de Na dep. de voltaje y la generación del PA. La activación de los receptores muscarínicos modi ca el umbral de activación, así q la neurona se vuelve mucho mas sensible y se generan trenes de PA. => aunque el receptor metabotrópico (muscarínicos) no interviene directamente en la sinapsis, sí q la regula. fi  10 de 70 NEUROTRANSMISORES NO CONVENCIONALES (NEUROMODULADORES): El NO (Oxido Nítrico) no se almacena en vesícula, sino q se difunde a través de las membranas => no se puede considerar un NT. Se puede sintetizar tanto en la pre-sinapsis com en la post-sinapsis por acción de la nNOS (oxido nítrico sintasa neuronal). Esta enzima requiere la union de la calmodulina activa, o sea unida a Ca (CaCAM) por lo q la síntesis del NO se produce por un aumento de [Ca] citosolico. Una de las dianas del NO es la guanilato ciclasa soluble q sintetiza cGMP, lo cual puede estimular canales sensibles a cGMP así como activar o inhibir quinasas y fosfodiesterasas. El NO es una especie muy inestable q se oxida en pocos segundos a nitritos y nitratos. Puede ejercer su acción en astrocitos cercanos a la sinapsis y en neuronas pre- y post-sinápticas. Modula la actividad de proteínas por nitrosilación. Se ha observado su síntesis asociada al complejo NMDA q se activa por union de Glu y permite la entrada de Ca. Así, cuando el NO se sintetiza en la post-sinapsis y difunde a la pre-sinapsis, puede considerarse un mensajero retrogrado.  11 de 70 SISTEMA ENDOCANNABINOIDE: Los cannabinoides o endocannabinoides son compuestos lipofílicos q actúan como mensajeros retrógrados y difusibles. El receptor CB1 (muy abundante en el SNC) fue descubierto mediante el estudio del sitio de acción del Δ9-tetrahidrocannabinol (componente mayoritario de la marihuana THC). Después se identi co el CB2, q se expresa en la microglía. Pues, se aislaron los agonistas := los endocannabinoides sintetizados endógenamente q se unen a ellos (moléculas producidas por el organismo q son los ligándoos de receptores CB1 y CB2): Anandamida N (N-araquidonil etanolamida) 2-araquidonilglicerol (2-AG) — endocannabinoide mas abundante RECEPTOR CB1: Se localizan en las terminales pre-sinápticas y son abundantes en el SNC (hipocampo estriado, el bulbo olfatorio, capa molecular del cerebelo). Están prácticamente ausentes en el tronco del encéfalo, encargado en la regulación de las funciones respiratoria y cardiacas => motivo por el cual la sobredosis de endocannabinoides no es tóxica. Se detecta una mayor expresión de CB1 en sinapsis inhibitoria q excitatorias. CB1 — terminales pre-sinápticas + SNC + sinapsis inhibitorias (donde negro = donde está CB1) CB2 — microglía SEÑALIZACIÓN de CB1: La forma activa de estos receptores es el dímero, normalmente homo-dímeros pero también pueden formar hetero-dímeros con receptores D2 a los q se une la dopamina. Los dímeros están acoplados a proteínas G. La subunidad Gi-alpha inhibe la subunidad alpha de la adenilato ciclasa, por lo q disminuyen los niveles de cAMP. Esto afecta a la fosforilación y actividad de las quinasas. La subunidad Gi-beta-gamma: Inhibe los canales de Ca de tipo P,Q o M por lo q se bloquea la liberación de NTs y => la transmisión sináptica. Activa los canales de K GIRK (recti cadores), por lo q producen la híper-polarización de la membrana. En consecuencia, aumenta el umbral de des-polarización y se impide q la neurona responda a los estimulo (=> se inhibe a la neurona). La fosforilación de C-terminal de CB1 por parte de GRK permite la union de beta- arrestina, lo cual induce la endocitosis del receptor. Esto activa vías dependientes de MAPK. También se ha visto q la anandamida se une y activa a TRP, canales catiónicos principalmente de Ca q son ampliamente distribuidos => aumenta [Ca] local. fi fi  12 de 70 VÍAS DE SINTESIS Y DEGRADACION DE ENDOCANNABINOIDES: (mas comunes pero no las únicas) ANANDAMIDA: La N-acetiltransferasa trans ere un acido graso (AA) en el grupo amida de la fosfatidil_etanolamina (PE), formando el N-araquidonil-PE. Después, la PLD rompe el enlace entre el fosfato y el grupo polar y libera un mono_acil_glicerol-P y la anandamida. En la vía de degradación interviene la amida-hidrolasa de ácidos grasos (FAAH) q libera la etanol_amina y el AA. 2-AG: A partir del fosfatidil_inositol (PI), la PLC rompe el enlace entre el fosfato y el DAG (diacil_glicerol). DAG es substrato de una DAG lipasa, q forma el 2-AG. La vía de degradación es catalizada por una mono_acil_glicerol lipasa (MGL) q libera el glicerol y el AA. fi  13 de 70 MODULACIÓN DE LA TRANSMISION SINAPTICA POR ENDOCANNABINOIDES: Los endocannabinoides no son NT comunes: — se sintetizan en el momento (“on demand”) — no se almacenan en vesículas sinápticas — no se liberan mediante exocitosis clásica — actúan como mensajeros retrógrados, dado q sus receptores se encuentran en la pre- sinapsis. En neuronas inhibitorias, los endocannabinoides producen la supresión de la transmisión inhibitoria inducida por des-polarización (DSI), mientras q en neuronas excitatorias provocan la supresión de la la transmisión excitatoria inducida por des-polarización (DSE). DSI — supresión de transmisión inhibitoria por des-polarización DSE — supresión de transmisión excitatoria por des-polarización Se sintetizan bajo demanda, en respuesta a 3 tipos de estimulo: 1. ↑Ca (Aumento de Ca en la post-sinapsis) — la estimulación fuerte de los receptores de Glu tipo NMDA (ionotrópicos), q lleva a la des- polarización fuerte de la membrana y activa los canales de Ca dep. de voltaje, produce el aumento de [Ca] intracelular. Esto lleva a la síntesis y liberación de 2-AG, q difunde hasta los receptores CB1 en la membrana pre- sinaptica de neuronas tanto glutamatérgicas como GABAérgicas => se inhibe la liberación de los NTs. 2. mGluR1/5 (Estimulación de receptores metabotrópicos acoplados a proteínas Gq (mGluR1/mGluR5) en la membrana post- sináptica) — la estimulación fuerte de los receptores mGluR, ante una gran liberación de Glu, produce igualmente la síntesis de 2-AG, puesto q la proteína Gq activa a la PLC-beta. Como antes, el 2-AG difunde hasta receptores CB1 en membrana pre-sináptica e inhibe liberación de Glu y GABA. 3. Combinación de ambos estímulos — la activación suave de receptores NMDA, mGlu y la des-polarización ligera de la membrana q estimula a los canales de Ca, igualmente produce la síntesis de 2-AG q como antes inhibe la liberación de los NTs. La PLC-beta actúa como un factor de coincidencia pq debe asistir ambos mecanismos a la vez. Para demostrar q la inhibición de la transmisión sináptica inducida por des-polarización está mediada por endocannabinoides, se redujo la liberación de Ca y se añadieron antagonistas receptores metabotrópicos y CB1. Inicialmente se observo en interneuronas y pues también en sinapsis excitatorias.  14 de 70 SILENCIAMIENTO PRE-SINAPTICO: Los cannabinoides pueden inducir el silenciamiento sináptico => q las sinapsis no responden a ningún estimulo durante un tiempo. Esto se estudió en neuronas glutamatérgicas q expresaban una proteína unida a GFP q emite uorescencia al pH siológico pero no a pH acido. La proteína se localiza en la membrana de las vesículas sinápticas, con la GFP hacia el lumen. Dado q las vesículas están acidi cadas, gracias al gradiente de H+ generado por las ATPasas no emiten orescencia, pero sí se detecta al producirse la exocitosis. Al añadir un endocannabinoide sintético entre 2 estímulos, se observa q la respuesta ante este ultimo es mucho menor q frente al primero e, incluso, imperceptible. El grado de inhibición q producen los endocannabinoides en los botones sinápticos depende de la cantidad de receptores expresados y de las proteínas implicada en le mecanismo. => hay una graduación de los efectos: desde silenciamiento duradero en tiempo hasta inhibición de la respuesta. Los endocannabinoides se generan en la neurona post-sináptica, se difunden en hendidura sináptica y activan receptores CB1, CB2 q se localizan en neurona pre-sináptica (mensajero retrógrados). Las sondas uorescen a pH siologico pero se apagan a pH acido => incrementó de uorescencia = exocitosis => apagado de uorescencia = endocitosis La activación de receptores CB1 induce el silenciamiento de algunas sinapsis: aquellas q responden a la des-polarización (estimulo) con la exocitosis de las vesículas. Cuando estos tipos de sinapsis son expuestas al agonista cannabinoide HU-210, dejan de hacer la exocitosis => dejan de emitir uorescencia. HU-210 = agonista cannabinoide q se une a receptores CB1 fl fl fl fl fl fi fi fl fi  15 de 70 NEUROTRANSMISIÓN DOPAMINÉRGICA EN EL SNC: Todas las catecolaminas tienen en su estructura el anillo catecol con 2 grupos OH y un grupo amino. Se sintetizan a partir de la Tyr en el citosol, pues la Tyr hidroxilasa introduce el secundo grupo hidroxilo OH dando lugar al L-DOPA. Después la DOPA descarboxilasa elimina el grupo carboxilo, generando la dopamina. A partir de la dopamina se generan la noradrenalina y la adrenalina (=noradrenalina metilada) Utilizando anticuerpos especí cos por las enzimas de síntesis de dopamina se han identi cado 8 tipos de neuronas responsable por la síntesis de dopamina, llamada catecolaminérgicas. La mayoría de sus somas se localizan en 2 regiones: sustancia nigra y área ventral tagmental. Hay ~ 400 000/600 000 neuronas dopaminérgicas en SNC (pocas respecto al total = 1011) y el 70% de estas se encuentra en la sustancia negra. 4 vias dopaminérgicas principales: 1. Vía nigro_estriatal (mas estudiada)— las neuronas de la sustancia nigra emiten sus prolongaciones hasta el estriado (región q controla los movimientos). ↓dopamina en estriado = Parkinson + Huntington ↑dopamina en estriado = esquizofrenia + síndrome de Tourette + ADHD (attention de cit hyperactivity disorder = de cit de atención y hiperactividad) 2. Vía meso_cortical — las neuronas emiten sus prolongaciones desde de el área ventral tagmental hasta la corteza. ↑dopamina en corteza = esquizofrenia + sindrome de Tourette + ADHD 3. Vía meso_límbica — las neuronas emiten sus prolongaciones desde de el área ventral tagmental hasta el núcleo accumbens (nAcb). ↓dopamina en nAcb = epilepsis ↑dopamina en nAcb = adicción a las drogas de abuso + obesidad + depresión 4. Sistema tubero_infundi_bular — en el hipotálamo hay un núcleo de neuronas dopaminérgicas q emiten sus prolongaciones a la hipó sis. Esta via se relaciona con la síntesis de prolactina y secreción de leche. ↓dopamina en hipó sis = tumores en hipó sis fi fi fi fi fi fi fi  16 de 70 Mapa de regiones del cerebro de ratón en Desarrollo (a) y adulto (b) donde se acumulan neuronas dopaminérgicas. Estas regiones fueron identi cadas mediante anticuerpos especí cos por la Tyr hidroxilasa. 70% en la sustancia nigra MECANISMOS Q AFECTAN [DA] EXTRACELULAR (DA = dopamina): La dopamina controla la locomoción (movimientos), el proceso aprendizaje y el proceso de la recompensa (adicción a las drogas de abuso — transmisión a nAcb). Q regula [dopamina] en el media extracelular? DDC (DOPA descarboxilasa) y TH (Tyr hidroxilasa) son enzimas responsables por la síntesis de dopamina y se localizan en el citoplasma. Cuando la dopamina es sintetizada, es transportada en vesículas por VMAT-2 (un transportador especi co por monoaminas) => [dopamina] en el interior de las vesicles >>> [dopamina] en el citosol. Esto evita su degradación por MAO en citosol. Cuando llega PA, la dopamina es liberada en el medio celular: Liberación tónica de dopamina (estado de reposo = en [Ca] basales): baja frecuencia (4 Hz) = liberación espontánea sin PA (vesículas se funden con membrana y liberan dopamina — [DA] = 20 nM) Liberación fásica de dopamina (estado activo): Alta frecuencia (20 Hz para q la neurona se dispare) = liberación con PA => se libera mas dopamina pq hay mas vesículas implicadas Una ves q DA esta en exterior (medio extracelular): puede actuar sobre receptores D2 de la membrana pre-sinaptica (auto-receptores) q —| TH => se auto-regula puede ser transportada al interior del citosol de la membrana pre- o post- sináptica por DAT (dopamine transporter). —> esto puede ocurrir al revés si ↑↑↑[DA] citosol si ↑↑↑[DA] citosol, DA se almacene en vesículas o es degradada por MAO fi fi fi  17 de 70 RELACIÓN DE LA DOPAMINA CON LAS DROGAS DE ABUSO: La dopamina se relaciona con mecanismos de recompensa => su liberación produce placer. Las drogas de abuso aumentan la transmisión dopaminérgica así q aumentan los niveles de dopamina. El aumento de la transmisión dopaminérgica se consigue de 2 formas: Se aumenta la estimulación de las neuronas => mas dopamina liberada Se inhibe el sistema de recaptación en la memb. plasmática => mantenimiento de la excitación Toda neurona recibe aferencias inhibitorias y excitatorias. Aferencia := sinapsis con neuronas q transmiten el impulso nervioso En una neurona aislada es fácil predecir q, si se inhibe la liberación de GABA, aumentará la excitación de la neurona dopaminérgica (y lo contrario si se inhibe la liberación de Glu). Sin embargo, en un circuito neuronal esto se complica — cuanto mayor sea la expresión de receptores dopaminérgicos, mayor es la probabilidad de volverse adicto. Hay receptores nicotínicos (alpha7nAChR) q dejan entrar Ca Los vierdes estimulan las neuronas dopaminérgicas en la sustancia nigra (AcCh o Glu) Los rojos inhiben (GABA)  18 de 70 Cada droga tiene un mecanismo distinto por el cual aumenta la [DA] en las zonas límbicas y del estriado, produciendo un aumento de la transmisión dopaminérgica. Cocaina — inhibidor de DAT => aumenta [DA] extracelular mediante inhibición de su recaptura Nicotina — activador de receptores nicotínicos => aumenta la liberación de DA Opioides — suprimen la liberación de GABA => aumenta la liberación de DA Sedantes — activadores de benzo_diace_pinas => suprimen liberación de GABA => aumenta la liberación de DA Anfetaminas — sustrato de DAT => aumenta la [DA] extracelular mediante transporte inverso —| MAO —> TH Las anfetaminas disminuyen la DA almacenada en las vesículas y aumentan su liberación a los espacios extrasinápticos => anfetamina actúa como inhibidor competitivo: Aumentan la síntesis de DA — estimulan a la Tyr hidroxilasa e inhiben a la principal enzima de degradación, la MAO (mono_amino_oxidasa) Afectan al transportador de DA en la memb. plasmatica (DAT) — bloquean el transportador => impiden la entrada de DA en la celula y producen un intercambio de DA en el citoplasma => [DA] en citosol aumenta. Impide la acumulación de DA en las vesículas sinápticas — el transporte de DA a las vesículas depende del gradiente de protones (H+). Las anfetaminas tienen un pKa de 9’9 => al entrar en las vesículas se protonan. En consecuencia, las vesículas se alcalizan y se reduce la energía disponible para introducir DA en ellas. => DA es extraída de la neurona.  19 de 70 TEMA 7: EXOCITOSIS En todas las células se produce exocitosis constitutiva = se requiere un tra co intracelular de vesículas q van a fundirse con la membrana En las neuronas hay también la exocitosis regulada = se requiere un tra co intracelular de vesículas pequeñas q contienen NTs, pero para q estas se funden con membrana hay q tener un estimulo (= entrada de Ca). Ambas exocitosis son similares: se produce la fusión de vesículas de doble membrana con la memb. plasmática gracias al complejo SNARE. EVIDENCIAS DE LA EXOCITOSIS REGULADA: La exocitosis regulada es absolutamente dependiente de Ca. Para detectar las corrientes de Ca es necesario aislar casi por completo (pues suelen ser enmascaradas por corrientes de Na). Las primera evidencias se observaron al registrar corrientes pre-sinápticas en el axon gigante del calamar. Se vio q la entrada de Ca coincidía con la des-polarización de la membrana pre- sináptica y la generación de los PAs pre-sinápticos. Ademas, se detectó una correlación no linear sino exponencial entra la [Ca] y la amplitud del PA post-sináptico (un pequeño aumento en [Ca] generaba un gran incremento de la amplitud) (↑[Ca] —↑↑↑amplitud) La corriente de Ca aparece coincidiendo con la re-polarización de la membrana => los canales de Ca se abren cuándo se produce la des-polarización pero la entrada de Ca a favor de gradiente ocurre cuando el K comienza a salir de la célula (gracias a canales K r.r.). Eso provoca un pequeño retardo entre la llegada del PA a la célula pre-sináptica y la entrada de Ca. El PA q llega a membrana pre-sináptica genera des-polarización q abre los canales de Ca. Pero medimos la corriente de Ca cuando membrana se está re-polarizando => la re-polarización facilita entrada de Ca pq se están acumulando cargas negativa al interior. fi fi  20 de 70 CANALES DE Ca DEPENDIENTES DE VOLTAJE: Los canales de Ca dep. de voltaje tienen un alto umbral => necesitamos una alta des-polarización para abrirlos (-20mV). Son complejos proteicos formados por ≠ unidades: Subunidad alpha (en todos canales de Ca)— proteina integral de membrana con 4 dominios, cada uno con 6 segmentos TM y un loop entre los segmentos 5-6 de cada dominio q forma el poro del canal y tiene a.a. negativos. El segmento 4 es el sensor de voltaje y tiene a.a. positivos. Subunidad beta (solo en canales con alto umbral)— es intracelular y su interacción con el canal modi ca sus propiedades. Cuando se expresa la subunidad beta junto con la subunidad alpha aumentan la amplitud del potencial y altera la dependencia del voltaje así q se requieren mayores des-polarizaciones para su apertura. También afecta al transporte, favoreciendo la expresión del canal en la membrana. Subunidad alpha2-delta (solo en canales con alto umbral)— es extracelular y reguladora. Favorece la expresión del canal en la zona activa y su presencia aumenta la probabilidad de liberación => la probabilidad q la vesícula se fusione con la memb. plasmática. Subunidad gamma (solo en canales con alto umbral)— sobretodos en los canales de Ca de las células musculares. En el cerebro se ha visto la existencia de la subunidad gamma2 q se expresa en terminales sinápticas y regula el tra co de receptores AMPA, pero no forma parte del canal de Ca. fi fi  21 de 70 CANALES DE Ca DE ALTO UMBRAL: — requieren despolarizaciones de alto voltaje La subunidad tiene mucha isoformas (Cav 1.1-4—L ; Cav 2.1—P/Q ; Cav 2.2—N ; Cav 2.3—R) P/Q- N- R- están situados en zona activa y relacionan con neuro-transmisión L- está situado en el músculo y es sensible a dihidropiridinas (fármacos q pueden inhibir/activar los canales de Ca) Tipo L (long lasting)— permanecen mucho tiempo abiertos. - Hay 4 isoformas y 1 de estas presenta la subunidad gamma. - Son canales importantes en células musculares y los cardiomiocitos. Se encuentran también en neurona pero no participan en la neuro-transmisión dado q se localizan en el soma o las dendritas. - La entrada de Ca está relacionada con el control de la expresión génica a excepción del canal Cαv14 q participa en la transmisión tónica (continua y pequeña) de NT en la retina. - Sus antagonistas farmacológicos son las dihidropiridinas. Tipo P/Q — solo en neuronas y se inactivan rapidamente. Su antagonistas farmacológico es la ω – agatoxina (veneno mortale de araña (ragno) q bloquea los canales de Ca tipo P/Q). Tipo N — activación lenta. Su antagonistas farmacológico es la ω – conotoxina (otro veneno q bloquea canales de Ca tipo N). Tipo R — Su antagonistas farmacológico es SNX – 482 (toxina producida por tarantula). CANALES DE Ca DE BAJO UMBRAL: — requieren despolarizaciones de menor voltaje Tipo T — existen 3 isoformas, todas formadas exclusivamente por la subunidad alpha. - La expresión y activación de estos canales esta relacionada con disparos repetidos y, como solo necesitan una des-polarización pequeña (estímulos bajos), producen una entrada tónica en las neuronas q se suma a la producida en presencia del estimulo. (se necesita poco Ca q entra para disparar neuronas) 𝛼  22 de 70 SITIOS MODULADORES DE LOS CANALES DE Ca: Los canales de Ca se regulan por Ca => Ca —| canales de Ca N- se inactivan de forma lenta => permite q entra mas Ca P/Q- se inactivan mas rapidamente P- se inactivan de forma lenta (=> son los canales Q q con eren rapidez) La entrada de Ca a través de los canales controla la exocitosis => deben estar altamente regulados. Esto se produce mediante fosforilación de ≠ residuos, lo cual aumenta la amplitud de la corriente de Ca. Las quinasas implicadas son: CAMKII — fosforila residuos en el C-terminal (aumenta el tiempo de abertura del canal) PKA — fosforila residuos en el C-terminal (aumenta el tiempo de abertura del canal) PKC — fosforila residuos en el loop intracelular entre dominios 1 y 2, y impide union de subunidad beta y G-beta-gamma (si receptor está fosforilado no se une a G-beta-gamma) Proteina beta-gamma unida a proteina G —| canales de Ca Unión de subunidad beta regula el voltaje => canales necesitan des-polarización mayor para abrirse Regulando entrada de Ca se regula la exocitosis La subunidad alpha 1 tiene: en dominios extracelulares — sitios de union por fármacos (e.g. DHP (dihidropiridina), PAA (fenilalkilamina), BZT (benzodiazepina)) q bloquean los canales de Ca en dominios intracelulares (loop entre dominio 1 y 2) — sitios de union por subunidad beta, muy próximo al de fosforilacion por PKC. Ambos mecanismos son excluyentes. En el loop intracelular entre los dominios 2 y 3 se produce la union de las proteínas SNARE q permiten la fusión de las vesículas. También aquí hay un sitio de union para el complejo Ca-CAM (Ca-calmodulina ) q regula la actividad del canal: Cuando los 4 sitios de union de Ca de CAM esta ocupados implica q la [Ca] en la célula es elevada => inhibición del canal Cuando solo 2 de los 4 sitios están unidos a Ca implica q la [Ca] en la célula es baja => se estimula la entrada de Ca (solo en canales de tipo L). Los dominios 4 son los sensores del voltaje Loop entre helices 5 y 6 forman el poro (a.a. positivo — en canales de Ca hay GluGluGluGlu) fi  23 de 70 CO – LOCALIZACIÓN DE CANALES DE CA Y SITIOS DE LIBERACIÓN: Mediante microscopía electrónica de union neuro-muscular se ha visto q los canales de Ca se expresan en la misma localización q donde se produce la exocitosis de vesículas (zona activa). => se ha visto q hay miles de vesículas y muchos sitios de liberación. Si se bloquean los canales de K con 4- aminopiridina se aumenta PA => mas vesículas liberadas. Por criomicroscopía se han separado ambas capas de la membrana pre- sináptica y se ha visto q: En la monocapa citosolica hay las vesículas anclada a esa En la otra monocapa hay las huellas o “cráteres” q dejan las vesículas y estos son los sitios donde se produce la fusión. Esos pequeños “cráteres” están rodeados de zonas punteadas, es decir, canales de Ca. EXOCITOSIS: Antes de la abertura de canales de Ca, se abren los canales de Na q generan PA. Cuando PA llega a la terminal pre-sináptica se abren los canales de Ca. => los canales de Ca se abren cuando la membrana se está re-polarizando y esto provoca un pequeño retraso (0.3 ms). Cuando entra Ca, las vesículas se funden con la membrana y aquí hay un retraso un poco mas grande (0.5 ms). Pequeño retraso sináptico (ms) — entre la entrada de Ca y la fusión de las vesículas se produce un retraso sináptico extraordinariamente pequeño, puesto q los canales de Ca se encuentran muy próximos a la zona activa (sitio de liberación de las vesículas) —> el Ca está entrando prácticamente por el mismo sitio en q las vesículas salen y eso explica el retraso muy pequeño. Ademas el Ca se debe unir de forma muy rapida a su diana, una proteína q se encuentra en la membrana de las vesículas. Cooperatividad — el sensor de Ca (proteína diana) tiene mas de un sitio de union a Ca. Ademas, la union de sucesivos iones se ve favorecida por la union previa de otros => es cooperativa. Acumulación de canales de Ca en la zona activa — la union de Ca a su diana es rapida pero la a nidad es muy baja => se necesita ↑↑[Ca] para permitir la union de Ca a sus dianas => tiene q entrar mucho Ca. —> Se ha visto q hay ↑↑↑↑[Ca] en la zona activa. => se necesita una elevada expresión co-localizada de canales de Ca en la zona activa. fi  24 de 70 CICLO VESICULAR EN LAS TERMINALES PRE-SINAPTICAS: Todo el citosol de la terminal pre-sináptica está lleno de vesículas sinápticas pero estas deben ser translocadas hasta la membrana para q se produzca sus fusión. Este movimiento depende del citosqueleto. El ciclo vesicular consta de las siguientes fases: 1. Docking o amarre — cuando las vesículas llegan a la membrana plasmática mediante interacción con ciertas proteínas y el citosqueleto de actina 2. Priming — la vesícula se prepara para q ocurra la exocitosis en cuanto entre el Ca en la celula 3. Entrada de Ca, fusión y exocitosis — se produce en la zona activa q debe coincidir con la zona de mayor densidad de receptores en la membrana post-sináptica 4. Endocitosis — al mismo tiempo q ocurre la exocitosis debe tener lugar la endocitosis de las vesículas vacías pq si en la terminal pre-sináptica solo tuviese lugar la exocitosis, la zona activa crecería de forma des-proporcionada a la membrana post-sináptica y dejaría de estar localizada frente a los receptores => la sinapsis no seria e ciente. => hay una endocitosis del trozo de membrana de igual tamaño al trozo de vesícula q se ha fundido, para reciclar las vesículas. La endocitosis es mediada por clatrina. 5. Fusion con endosomas, re-acidi cación y almacenamiento de NTs — las vesículas endocitadas pueden incorporar proteínas de membrana q deben ser eliminadas. Entonces se produce la fusión con los endosomas y re-acidi cación, a n de incorporar nuevos NTs. Así se re-inicia el ciclo El ciclo vesicular ocurre gracias a la interacción de ciertas proteínas. Algunas se encuentran en las vesículas sinápticas y otras en la membrana plasmática, en la zona activa. fi fi fi fi  25 de 70 PROTEINAS DE LAS VESICULAS SINAPTICAS: Los orgánulos más abundante en las neuronas son las vesículas sinápticas. Tienen baja densidad, lo cual ha permitido su puri cación e identi cación de las proteínas presentes en ellas. Las funciones de muchas de estas proteínas vesiculares son conocidas, pero no de todas. La densidad de proteínas en las vesículas es extraordinariamente elevada. V-ATPasa (= ATPasa vacuolar) — genera un gradiente de H+ q acidi ca las vesicles y al q se asocia el transporte de NTs al lumen, para su almacenamiento. Dependiendo del tipo de NT, el gradiente utilizado sera químicos (de concentrazione [ ]), eléctrico o ambos. Transportadores de NTs — se conocen 3 familias de transportadores y todas son proteínas integrales de membrana con 12 dominios TM con N- y C-terminales hacia el citosol. Ademas algunas proteínas están glicosiladas en la cara luminal. - SLC17 = Transportadores de aniones —> Glu, Asp y ATP - SLC18 = Transportadores de aminas —> AcCh, catecolaminas, histamina - SLC32 = Transportadores de NT inhibitorios —> GABA y Gly Rab3A — proteína G pequeña (GTPasa) esencial en el docking de las vesículas a la zona activa, pues reconoce y interacciona con otras proteínas de la zona activa y dirige ls vesículas. SV2 — proteína glicosilada en parte luminal y dirige y estabiliza la sinapto_tagmina en vesículas. Es vital pq los KO para SV2 no llegan a termino pq disminuye la [sinapto_tagmina]. Sinapto_brevina — la proteína con mas copias por vesícula (~70) dado q es fundamental para la formación del complejo SNARE, q permite la fusión. Hay tan copias para asegurar su expresión en la membrana. Sinapto_tagmina — proteína periférica q actua como sensor de Ca. No forma parte del complejo SNARE Sinapto_ sina — proteína integral de membrana q proporciona sitios de interacción para la sinapsina. Sinapsina — proteína periférica q interacciona con la sinapto_ sina y con otras proteínas integrales de membrana de vesículas (e.g. PL) o con los micro lamentos de actina de su citosqueleto. En algunos casos, permite la liberación multi-vesicular pero en general suele ser única. La fosforilacion mediada por ≠ quinasas modi ca la fuerza con la q la sinapsina interacciona con los micro lamentos o las proteínas de otras vesículas. Esta interacción es fundamental para mantener las vesículas en la terminal sináptica. La isoforma mas abundante en las sinapsis de hipocampo y la corteza es la sinapsina 1A y tiene los siguientes sitios de fosforilación: Ser, Thr en N-terminal — fosforilación por PKA, CAMKII, CAMKIV, MAPK Tyr en dominio central — fosforilación por Src Ser, Thr en C-terminal — fosforilación por MAKP, CAMKII La fosforilación en N y C- terminales disminuye la union de la sinapsina tanto a los lamentos de activa como a otras vesículas => se libera la interacción con el entramado en la terminal sináptica así q las vesículas pueden moverse => aumenta la liberación de los NTs. Cuando la fosforilación ocurre en el dominio central, los efectos son contrarios. fi fi fi fi fi fi fi fi fi  26 de 70 LA SINAPSINA 1A ORGANIZA LA LIBERACION SOSTENIDA DE NTs: En la terminal sináptica se diferencian 3 pools de vesículas, cuya organización depende de la sinapsina: 1. Pool de vesículas listo para ser liberado (RRP = Readily Releasable Pool) — está formado por un numero limitado de vesículas unidas a la membrana listas para ser liberadas => hay un numero concreto de posiciones q pueden ser ocupadas => existe un techo en la liberación. En el SNC raramente la llegada de 1 PA produce la liberación de mas de 1 vesículas => muchas vejeces no se libera ninguna pq la probabilidad de éxito es muy baja (en torno a 1 de cada 3). Sin embargo, ante la llegada de trenes de PAs sí se produce la liberación de todas las vesículas del RRP. 2. Pool de reciclaje — está formado por las vesículas endocitadas tras la fusión y la exocitosis de los NTs => son vesículas q se van a estar aproximando a la membrana => no están tan anclada al citosqueleto de actina. 3. Pool de reserva — está formado por vesículas q interacción con la actina, de manera estructurada y mediada por la sinapsina. Cuando llega un PA fuerte, la sinapsina se fosforila y las vesículas del pool de reserva se liberan.  27 de 70 Esto se ha demostrado experimentalmente mediante incubación de la sinapsis con anticuerpos frente a la sinapsina así q se impide su interacción con las vesículas => no se genera el pool de reserva. Al estimular 2 veces con una frecuencia baja (0.2 Hz), se registran en la neurona post- sináptica 2 pulsos idénticos, con la misma amplitud tanto en el control como en la sinapsis con anticuerpos => en este caso no se modi ca en absoluto la liberación pq la sinapsina es importante por las vesículas del pool de reserva pero si el estimulo es bajo solo se libran las vesículas del RRP. Al estimular 2 veces con una frecuencia mas alta (18 Hz), mientras q en el control se observa una pequeña disminución de la amplitud (no signi cativa) pq se liberan también las vesículas del pool de reserva, en presencia de anticuerpos se produce una importante caída ps no se liberan las vesículas del pool de reserva pq no hay un pool de reserva. Esto implica q al producirse el segundo estimulo no ha habido tiempo su ciente para q las vesículas estén de nuevo colocadas en las posiciones de liberación => este proceso depende de la sinapsina q está bloqueada por el anticuerpo. => se con rma q la sinapsina es la q organiza las vesículas en la terminal sináptica. La amplitud del potencial es variable en función de la cantidad de NT liberada y del numero de receptores en la post-sinapsis. fi fi fi fi  28 de 70 ORGANIZACION DE LA MAQUINA EXOCITOTICA PRE-SINAPTICA: Las proteinas fundamentales de la zona activa en la maquina exocitótica son: Proteína RIM — cumple varias funciones, mediante interacción con varias proteínas ‘organizadoras’ => presenta múltiples sitios de union. Puede interaccionar con todas o solo con alguna. - Rab3A — Rab es una proteina G => puede estar unida con GTP o GDP. Si está unida a GTP se une a RIM y participan en el docking de las vesículas - RIM-BP — RIM+RIM-BP interaccionan con canales de Ca => está implicada en la concentración de las vesículas en la zona activa - Munc13 — es una proteína fundamental en la formación del complejo SNARE, activada por Ca y por la union a DAG => se encuentra en el entorno de la membrana (aunque no lo parezca en la imagen). Su función es activar a la sintaxina y reclutar los dominios SNARE de SNAP-25. => esa interacción participa al proceso del priming. Proteínas del complejo SNARE — todas presentan un dominio SNARE. Forman estructura en alpha-hélice q se enrollan para dar lugar a una tetra-helice q permite el acercamiento de las vesículas. - Sinapto_brevina — tiene 1 dominio SNARE - Sintaxina — proteína integral de membrana q tiene 1 dominio SNARE - SNAP-25 — proteína periferica de membrana q tiene 2 dominios SNARE - Munc18 — proteína de union a sintaxina q regula su actividad T-SNARE = proteinas asociadas a membrana (SNAP-25, sintaxina) V-SNARE = proteinas asociadas a vesícula (sinapto_brevina)  29 de 70 FORMACION DEL COMPLEJO SNARE: Cuando el complejo SNARE es inactivo, la sintaxina en la membrana plasmática se encuentra plegada y unida a Munc18 q la mantiene en su conformación correcta (con dominio SNARE escondido). La llegada del Ca produce la activación de Munc13 q induce la conformación abierta de la sintaxina y disocia su interacción con Munc18, permitiendo q el dominio SNARE de sintaxina esté accesible para interaccionar con sinapto_brevina y SNAP-25, formando así el complejo SNARE. Munc18 continúa interaccionando con el N-terminal de la sintaxina. La formación de las hélices se produce desde fuera hacia dentro (desde N-terminal) así q la vesícula se acerca cada ve más a la membrana plasmática. Inicialmente, el complejo se encuentra en conformación trans y, al producirse el acercamiento/ enrollamiento, las membranas se hemi-fusionan (estado de priming). Al formarse el complejo cis, tiene lugar la fusión de la vesícula con la membrana. Termodinámica — la formación de la tetra-helice es un proceso exergónico (=> libera energía (20kcal) y es energéticamente favorable = espontáneo). Se estima q para q se produzca la fusión deben formarse al menos 3 complejos SNARE.  30 de 70 CICLO DE FUSION Y RECICLAJE DEL COMPLEJO SNARE: La vesícula puede fusionarse en cualquier circunstancia, sino q el proceso debe estar regulado. En ello es esencial el Ca, q media la intervención de la complexina y la sinapto_tagmina. Una vez se ha formado el complejo SNARE y ambas membranas se encuentran muy próximas, la union de la complexina cuando el complejo se está enrollando, impide q el complejo termine de enrollarse (impide la fusión completa) y permite la interacción de la sinapto_tagmina (sensor de Ca) con el complejo SNARE. Cuando entra el Ca, ese se une a los sitios de union de baja a nidad de la sinapto_tagmina y se produce un cambio conformacional en la sinapto_tagmina q estabiliza SNARE y permite la formación del poro de exocitosis (permite la fusión completa de la vesícula). Otras proteínas regulan la a nidad de la sinapto_tagmina por el Ca y => afectan a la liberación de los NTs. La complexina impide la fusion des-controlada y aumenta la e cacia de la entrada de Ca pq da tiempo a la sinapto_tagmina de sensar ese ion. Tras la fusión, el complejo SNARE debe separarse de nuevo para reciclar todas las proteínas q sirven en la exocitosis de la siguiente vesícula. En esto proceso intervienen las proteínas SNAPS (proteínas adaptadoras)y NSF (ATPasa q utiliza la energía liberada de la hidrolisis de ATP para disociar el complejo). Todas las proteínas del complejo SNARE son sustratos de las toxinas del género Clostridium (e.g. botulina por el botox — la botulina inhibe q NT se libera (NT = AcCh pq son motoneuronas dado q el botox actúa sobre los músculos) así q no hay contracción muscular y el músculo se queda relajado). Cuando entran en vesículas se separan sus subunidades, unidas por puentes disulfuro, y las proteasas resultantes proteolizan a las proteínas, inhibiendo la transmisión sináptica. Todas esas toxinas tienen cadena ligera (con actividad proteasa) y cadena pesada y todas estas entran en la célula por endocitosis. fi fi fi  31 de 70 SINAPTO_TAGMINA: Es el sensor de Ca. se han identi cado hasta 16 isoformas q se agrupan en 3 subgrupos: Subgrupo 1 — tienen sitios glicosilados en N-terminal (intraluminal) y en dominio citosolico tienen 2 sitios de uniones a Ca Subgrupo 2 — tienen puentes disulfuro en N-terminal — se unen a 2 Ca Subgrupo 3 — no tienen sitios de union a Ca => no se unen a Ca Solo se ha visto la partecipazione de las isoformas 1,2 y 9 (subgrupo 1) en la exocitosis regulada. El resto se encuentran en la membrana plasmatica. Cada sinapto_tagmina presenta 2 dominios de union a Ca: C2A y C2B q están formados por laminas beta antiparalelas a cuyos loops se une el Ca. C2A une 3 moléculas de Ca: - 1 Ca se une de manera fuerte pq hay 3 Asp (carga -) - 1 Ca se une de manera fuerte pq hay 3 Asp (carga -) - 1 Ca se une de manera débil pq hay Asp (-), His (+), Ser C 2 B une 2 moléculas de Ca Para q la sinapto_tagmina sea activa debe tener Ca unido a ambos sitios. Los principales residuos implicados en ello son Asp (con carga -). Parte gris en vertical = membrana de las vesículas. fi  32 de 70 A nidad por Ca: ratón mutante de sinapto_tagmina (Arg233 —> Gln) Se mutan a.a. q están en el entorno de sitio de union a Ca. Esta mutación (Arg233 —> Glutamina) no afecta a la estructura 3Dmensional de la proteína ni a la liberación espontánea de los NTs ni tampoco al numero de vesícula dispuestas para la liberación. Se utiliza ionóforo de Ca (Calcimycin) q no induce corriente eléctrica => el proceso es mas lento. La liberación inducida por Calcimycin sí q se ve retrasada en los mutantes, lo q implica q disminuye la a nidad por el Ca y se reduce la probabilidad de liberación. (El ionóforo de Ca permite su entrada en la celula => aumenta [Ca] en celula). Para determinar la disminución de la a nidad, se miden los potencial post-sinápticos (EPSC) q re ejan la cantidad de NT liberado. - En el caso del wt la liberación es rapida y luego disminuye - En el mutante se produce de forma más tardía y lenta. Eso pq se necesita mas [Ca]. Eso implica q modi cando Arg233 en el entorno del sitio de union a Ca, disminuye la a nidad con la q la sinapto_tagmina une el Ca => la a nidad depende de Arg233. Para determinar la disminución de la probabilidad de liberación se bloquean los receptores NMDA, después de sus activación por Glu, de forma irreversible con MK801 (antagonista q solo se une a receptores q ya se han activados). Eso permite q cuanto mas se estimula una neurona, mas receptores se activan => siempre menos receptores activos por el siguiente estimulo. => en cada nuevo estimulo se detectan EPSC menores pq disminuye el numero de receptores NMDA activos y, con ellos, la entrada de Ca. - En el mutante se observa q la disminución de los EPSC es mas lenta lo q implica q la liberazione de Glu es menor. Esto se debe a q estas sinapsis necesitan una mayor [Ca] q las del wt, pq la a nidad de la sinapto_tagmina está disminuida. fi fi fl fi fi fi fi fi  33 de 70 Relación entre la [Ca] extracelular o citosolica y la exocitosis: La dependencia de la liberación de los NTs en función de la [Ca] citosolica es cooperativa, o sea tiene una cinética sigmoidal. La sinapto_tagmina tiene hasta 5 sitios de union a Ca y su a nidad aumenta conforme (‘man mano che’) se unen los sucesivos iones. Esto se ha estudiado mediante indicadores de Ca con ≠ a nidad por Ca, a partir de la representación de la [Ca] frente a la velocidad de liberación de las vesículas. En función del numero de iones Ca unidos, se distinguen 3 tipos de liberación: 1. Liberación sincrónica — cuando hay 4-5 sitios ocupados. Es inducida por el PA generado en presencia del estimulo. Todas las vesículas q se pueden liberar, se liberan. 2. Liberación asincrónica — cuando hay 1-2 sitios ocupados. Es inducida por la presencia de Ca residual, incluso mucho tiempo después de q haya desaparecido el estimulo 3. Liberación espontánea — se produce de forma independiente de Ca (=> independiente de PA) => la fusión ocurre sin q tenga lugar un incremento de Ca. En esencia, el proceso de fusion y liberazione de los NTs es igual independientemente de si la liberación es estimulada o espontánea, de forma q no importa la isoforma de la sinapto_tagmina implicada y su a nidad por Ca. Sin embargo, sí se sabe q en cada caso se activan receptores post-sinápticos ≠ y q estan implicados pools de vesículas ≠. Se han propuesto 2 teoría respecto a los pools: 1. los pools se encuentran en equilibrio Vesículas liberadas sincronicamente pertenecen a pool de reserva Vesículas liberadas espontáneamente pertenecen a otro pool 2. ciertos determínales proteicos mantienen a los pools separados. Vesículas en ≠ sinapsis: - Sinapsis maduras — sincronica - Sinapsis inmaduras — espontánea Curva blu = se libera todo Curva roja = hay una primera liberación y luego sigue la liberación evocada Curva verde = liberazione sin estimulos fi fi fi  34 de 70 MODULACION BI-DIRECCIONAL DE TRANSMISION SINAP. GLUTAMATERGICA POR mGluR7: Hay 2 fenómenos q afectan la liberación de NTs: 1. [Ca] — eso depende del numero de canales de Ca abiertos => de como son regulados estos canales 2. Proceso “priming” — para preparar las vesículas para q sean listas a ser liberadas En las terminales de las sinapsis glutamatérgicas del hipocampo, entre neuronas colaterales de Scha er y neuronas de la region CA1, se expresan auto-receptores = mGluR7. Su a nidad es baja, pero se localizan en la zona activa de la pre-sinapsis => la [Glu] en la hendidura sináptica suele ser su ciente para permitir su activación. Se ha visto q mGluR7 tiene un efecto dual en la sinapsis: Efecto inhibitorio sobre la liberación de Glu — ocurre cuando mGluR7 se activa durante un periodo corto de tiempo. Está acoplado a proteínas Gi/0, cuya subunidad G-beta-gamma inhibe a los canales de Ca en la zona activa => se bloquea la fusión de las vesículas. Efecto potenciador sobre la liberación de Glu — ocurre cuando mGluR7 se activa durante un periodo prolongado de tiempo (estimulación se alarga). El receptor activa a la PLC q da lugar a DAG. DAG activa a Munc13 q incrementa el numero de vesículas reclutadas en la membrana pre-sináptica. => hay una mayor probabilidad se liberar las vesículas. En ratones KO para Munc13, no se detecta el efecto potenciador. => Los receptores mGluR7 regulan la transmisión sináptica mediante la inhibición de los canales Ca y la potenciación de la función de los complejos SNARE. ff fi fi  35 de 70 ENDOCITOSIS: La endocitosis requiere la activación coordinada de numerosas proteínas, pues debe producirse la retirada de la membrana y el reciclaje q en muchos casos implica fusión con endosomas para la selección de las proteínas vesiculares. Existen 4 tipos de endocitosis: 1. Endocitosis mediada por clatrina —> se produce cuando el numero de vesículas liberadas no es muy elevado. 2. Endocitosis en masa (Bulk endocytosis) —> se activa cuando las neuronas reciben una estimulación muy fuerte => hay una liberación elevada. Hay gran invaginación (endocitosis en masa), pero la generación de las vesículas está igualmente mediada por clatrina. 3. Endocitosis ultra-rapida (ultrafast endocytosis) —> se invagina un fragmento de membrana equivalente a 4 vesículas (vesícula de 800 nm) y esto ocurre en ms. Es necesaria la fusión posterior con los endosomas. 4. Endocitosis kiss and run —> no se produce el colapso vesicular completo, sino q la vesicular conserva su integridad y solo se forma un pequeno poro a traves del q se libera el NT. => no es necesaria la fusion posterior con los endosomas.  36 de 70 ENDOCITOSIS MEDIADA POR CLATRINA: Ocurre en las zonas per-activas (adyacentes a la zona activa). Inicialmente, la membrana comienza a invaginarse y se unen proteínas adaptadoras, mediante el reconocimiento del aumento de la [ ] de PIP2 (fosfolipido q se encuentra en regiones de invaginación). PIP2 recluta a la maquinara endocitótica q incluye: Clatrina — polimeriza y da forma a la curvatura de la membrana Sinapto_janina — es una fosfatasa de PIP2 => produce la degradación del complejo de la membrana Dinamina — es una proteína G pequeña q actúa como mecano-enzima dado q utiliza la energía de la hidrolisis del GTP para estrangular a la vesícula si q queda unida a la membrana mediante una especie de cuello. (En mutantes con dinamina afuncional, se forman estructuras en la membrana con vesículas q no consiguen disgregarse => menor vesículas liberadas). Endo lina — reconoce curvaturas en la membrana y permite la union de sinapto_janina y dinamina. => es esencial para permitir la fusion de la vescicola, mediada por las acciones de la sinapto_janina y la dinamina. Proteinas adaptadoras reconocen PL de membrana (PIP2) y proteinas de vesícula y reclutan una otra proteina (clatrina) la cual polimeriza y da forma a la curvatura de la membrana. La endo lina reconoce la curvatura y se une a este especie de cuello q se está generado. La endo lina recluta la dinamina y la sinapto_janina (fosfatasa de PIP2 q elimina P en posición 5 de péptidos para permitir el desensamblaje de la maquina endocitotica). El ultimo step es mediado por la dinamina q es una proteína G pequeña q actúa como mecano-enzima. Se localiza alrededor del cuello de vesícula y hidroliza GTP para producir el estiramiento del cuello hasta q la vesícula se separe completamente de la membrana. En mutantes de Drosophila en los q la dinamina no es capaz de hidrolizar GTP, aparecen muchas estructuras ancladas a la membrana porque el ultimo step (separación completa) no puede ocurrir sin hidrolisis de GTP. Entonces las vesículas no se funden y no salen. Ademas el numero de vesículas es mucho menor porque no se están reciclando las vesículas. fi fi fi  37 de 70 TEMA 8: ESTRUCTURA DE LA UNION NEUROMUSCULAR La union neuro-muscular es una de las sinapsis químicas mejor estudiada, dado q su tamaño permite su observación con microscopio electrónico. Ademas, es posible inervar la bra muscular con mas de un electrodo, obteniendo unos registros y caracterización de la sinapsis mucho más na. El NT implicado es la AcCh q se une a receptores nicotínicos. Las sinapsis neuro-musculares se empezaron a estudiar en peces. Los receptores nicotínicos fueron inicialmente aislados en peces torpedo. ESTRUCTURA DE LA SINAPSIS NEUROMUSCULAR: El elemento neural q inerva la bra muscular es una motoneurona periférica, mielinizada por las células de Schwann. Sin embargo, a medida q el axon de la motoneurona se aproxima a la bra muscular pierde la mielinización y se rami ca, formando el telodendro. Cada rami caciones está envuelta por una membrana de células de Schwann pero ya no están mielinizadas. En cada una hay múltiples zonas activas (múltiples botones sinápticos). En los botones sinápticos hay mitocondria + miles de vesículas q almacenan AcCh + múltiples zonas de salida con canales de Ca tipo N. Las terminales pre-sinapticas se encuentran rodeadas por células de Schwann peri-sinápticas. Cada bra muscular está inervada por una única neurona !!!!!!!!!!! La distancia entre la bre muscular y la motoneurona es de 100 nm, mas q en las sinapsis del SNC. Esta hendidura esta atravesada por una lamina basal formada por tejido conectivo. Esta lamina basal se encuentra también alrededor de toda la estructura de la sinapsis de la motoneurona. En la region post-sináptica, la membrana de la bra muscular presenta una serie de invaginaciones o crestas a n de: Evitar q la AcCh liberada por la neurona se disperse => favorece la [AcCh] en las crestas Aumentar la super cie y => permitir una mayor [receptores nicotínicos] La lamina basal también se introduce en las crestas, donde es soporte de determinadas proteínas. Los canales de NA dep. de voltaje se encuentran en la zona mas profunda de la cresta, mientras q los receptores nicotínicos se encuentran en la zona más externa. Los sitios de liberación están perfectamente alineado con la membrana post-sináptica donde se encuentran los receptores nicotínicos. En la membrana post- sináptica hay clusters de receptores nicotínicos (densidad alta de receptores). Cuando el PA llega a la membrana pre-sináptica se liberan muchísimas vesículas y se crea un potencial de placa en la membrana post-sináptica. Este potencial permite la abertura de canales de Na y ampli ca la repuesta generando el potencial post- sináptico (=> se abren los canales de Ca => contracción muscular). fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi  38 de 70 ALINEAMENTO DE CANALES DE Ca Y DERECEPTORES NICOTINICOS: La zona activa pre-sináptica está perfectamente alineada con los receptores nicotínicos en la post-sinapsis, lo cual aumenta la e cacia en la guion neuro-muscular. Esto se estudio mediante el empleo de antagonistas de los canales de Ca en la pre-sinapsis (omega(w)- conotoxina G6A = rojo) y antagonistas de los receptores nicotínicos (alpha-bugarotoxina = verde). Al superponer ambas señales se observa color amarillo, o q implica q la co-localización es perfecta. Durante el desarrollo neuro-muscular se produce esta alineación perfecta en las uniones neto-musculares y se produce una comunicación bi-direccional entre la motoneurona y la bra muscular, q lleva a la diferenciación pre- y post- sináptica. En ello interviene la proteína agrina, secretada por la motoneurona (pre-sinapsis), q es esencial para q los receptores nicotínicos se acumulan y están alineados. La agrina tiene dominios análogos a la laminina, a la follistatina y al EGF. Los dominios de tipo laminina permiten su anclaje a la lamina basal. Cuando la agrina es liberada por la pre-sinapsis, interacciona con receptores LRP4 de la post-sinapsis. Los receptores LRP4 interaccionan con unas TyrK q se encuentran en la bra muscular, las MUSK. Las MUSK se auto-fosforilan y fosforilan a los receptores nicotínicos en Tyr553, lo cual es esencial para su agrupamiento en las crestas. Hay una señalización retrograda necesaria para q la bra nerviosa se detenga cuando llega a la bra muscular. En ratones KO para MUSK se observa q la neurona sigue creciendo y no conecta con la bra muscular (el nervio atraviesa el músculo y sigue creciendo =>no se detiene para inervar. fi fi fi fi fi fi  39 de 70 SINAPSIS DE ALTA EFICACIA: La probabilidad q cuando llega PA las vesículas se liberan es siempre menor q 1 (0.3 -0.6 y 0.6 es una probabilidad muy alta). La union neuro-muscular es una sinapsis de alta e cacia => probabilidad = 1 (siempre se liberan vesículas cuando llega PA). La union neuro-muscular es una sinapsis de alta e cacia, dado q cada terminal sináptica tiene decenas de miles de vesículas sinápticas y muchas zonas activas. La llegada del PA provoca la liberación de entre 150-200 vesículas, q activan los receptores nicotínicos y provocan una des-polarización post-sináptica de ~ 75 mV. Fatt y Katz observaron q la liberación de AcCh en la placa neuro-muscular (=zona activa) ocurre de forma cuantal, pues en reposo se detectaban mini-potenciales espontáneos (mEPPs) de amplitud muy pequeña (0.5 mV) en la post-sinapsis. Al estimular en condiciones de bajo Ca y alto Mg se produce la liberación solo cuando hay un estimulo (=> no espontáneos), entonces esta sintaxis deja de ser de lata e cacia y se observan fallos = potenciales post-sinápticos de 0.5mV o múltiples de este (1 o 1.5 o 2 o… mV). Liley observó q si en la zona pre-sináptica se hace pasar una corriente (=> se des-polariza la pre-sinapsis), la frecuencia de mEPPs aumenta. Mientras q si hay una híper-polarización la frecuencia de mEPPs disminuye. => la frecuencia de mEPPs puede alterarse si se altera el potencial de membrana pre-sináptico. Ku er y Yoshikami determinaron cuantas moléculas de AcCh había en cada una de esas vesículas q se estaban liberándoos (~ 5000 AcCh q activan ~2000 receptores nicotínicos). => se necesitan 5000 moléculas de AcCh para producir una des-polarización del tamaño de 1 mEPP. Katz postuló: “la frecuencia de mEPPs esta enteramente controlada por las condiciones de la pre-sinapsis mientras q su amplitud esta controlada por las propiedades de la post-sinapsis (n° de receptores activos). Esto se debe a q en la lamina basal se encuentra la acetil_colin_esterasa q degrada una quinta parte de las moléculas de AcCh liberadas. Por otro lado, la mayor permeabilidad al Cl de la membrana de las bras musculares hace q el potencial de reposo sea inferior al normal (-90mV < -70mV). La activación de los receptores nicotínicos produce un PA su ciente (-20mV) para superar el umbral de activación de los canales de NA dep. de voltaje y producir la contracción muscular. El potencial de placa es el q se obtiene cuando se abren los canales nicotínicos. Cómo se puede saber cuales Na entran por canales nicotínicos y cuales por canales de Na? Se utilizan inhibidores especí cos de canales de Na => se observa solo el potencial de placa. El curare es un veneno q precede de una planta y actua inhibiendo a los canales de Na dep. de voltaje => impide alcanzar el umbral de activación de los canales de Na dep. de voltaje. => se produce la paralisis. Curare —| canales Na => no se genera PA. ffl fi fi fi fi fi fi  40 de 70 Los receptores nicotínicos son permeable a Na pero también a K (entra Na y sale K) aunque la permeabilidad a K es baja. En algunas condiciones tapien el Ca puede entrar por los receptores nicotínicos. Mediante estudio de patch-clamp (whole-cell) se ha estudiado todas las características de estos receptores al ser estimulado con AcCh. Se ja el potencial de membrana a -90mV ( jar el potencial signi ca q no se produce des- o híper- polarización) y se añade AcCh en una pipeta. Al nal se registran las corrientes. Resultados: se produce una corriente con amplitud de 2.7 pA (pico-amperio) y la velocidad de paso es de 17 x 106 iones/s.Ademas se observa q el tiempo de abertura de los canales nicotínicos varia. Cuando se ja el potencial de membrana a -130mV y se añade AcCh, la amplitud de esta corriente aumenta a 3.9 pA. Eso pq la entrada de Na es mucho mas favorecida para q se acerca al potencial de equilibrio de Na. fi fi fi fi fi  41 de 70 ESTRUCTURA DEL RECEPTOR NICOTINICO: El receptor tiene estructura en forma de cono, con un estrechamiento en la parte central. Son receptores ionotrópicos pentaméricos (5 subunidades): 2 subunidades alpha 1 subunidad beta 1 subunidad gamma o epsilon — gamma se expresa en estadios fetales, epsilon en adultos 1 subunidad delta Hay 2 sitios de uniones a AcCh en las subunidades alpha, cada uno formado por 6 a.a. No obstante intervienen también las subunidades beta y gamma q se encuentran adyacentes. La a nidad de os sitios de union es ≠ => la union de AcCh es cooperativa y se necesitan ambas moléculas para q el canal se abra. Ademas, en las subunidades alpha, las Cys192 y Cys193 están conservadas pq estabilizan el canal y en el N-terminal también se localiza un loop de Cys. Cada subunidad tiene 4 dominios M con ambos terminales (N- y C-) hacia el exterior. El dominio M2 forma el poro y en su interior hay a.a. negativos (Glu y Asp) q forman 3 anillos (uno en la parte externa y dos en la interna) q aportan la selectividad ionica al canal. Asi se permite el paso de cationes y se repele los aniones, tanto desde la cara citosolica al exterior (salida de K) como al revés (entrada de Na). fi  42 de 70 Hay otros 2 anillos en el segmento TM q son responsables de la apertura y cierre del canal: El anillo externo está formado por a.a. hidrofobicos (Leu) q soportan mal la estructura en alpha- hélice => forman pequeños codos. El anillo interno está formado por a.a. hidro licos (Thr y Ser) En estado de reposo, el receptor se encuentra en conformación cerrada —> las Liu se orientan de forma próxima entre si e impiden el paso de iones a través de ellas, mientras q Ser y Thr están distantes. En estado activo (se une la nicotina), el receptor tiene un cambio conformacional q aleja las Liu y aproxima las Ser y Thr, favoreciendo el transito de iones a través de los residuos hidro licos. A voltaje negativos se detectan corrientes de entrada de Na (predomina permeabilidad por Na) A voltaje positivos se detectan corrientes de salida de K Subunidad gamma: Durante el desarrollo se producen cambios en la expresión de las subunidades de los receptores nicotínicos y la subunidad gamma solo se expresa en los estadios pro-natales. Después es sustituida por la subunidad epsilon. Eso provoca una disminución en el tiempo de apertura del canal y aumenta su conductancia. Este proceso esta relacionado con la maduración de la sinapsis neuro- muscular, pues inicialmente las bras están inervadas por mas de una neurona y los receptores nicotínicos no están agrupados. Después del parto, con la individualización de las neuronas y agrupación de los receptores en las crestas comienza a expresarse la subunidad epsilon. fi fi fi  43 de 70 ACETILCOLINA (AcCh): La AcCh se sintetiza a partir de acetil-CoA y colina, por acción de la acetil_transferasa de colina. Después, es incorporada en las vesículas sinápticas a traves del transportador vesicular de AcCh, q bombea 2 protones H+ al citoplasma por cada molecula de AcCh q transporta al interior. El gradiente de H+ determina hasta cuando la AcCh puede estar dentro. El tiempo de vida media de la AcCh en la hendidura sináptica de ende de las acetil_colin_esterasas (AchE) q hidrolizan la AcCh a colina y acetato (la colina es captada por terminales post-sinápticas para q sea reutilizable). Existen 2 tipos de acetil_colin_esterasas: 1. AchE homoméricas (en SNC) — están constituidas por 1 subunidad catalítica. Pueden ser monómeros, dímeros o tetrámeros solubles o bien pueden tener en C-terminal un glico_fosfolipido q permite su anclaje a la membrana (lábil). 2. AchE heteroméricas (en uniones neuro- musculares) — están constituidas por subunidades catalíticas y estructurales. Cada subunidad catalítica está formada por un tetrámero y este, a su vez, se une a través de puentes disulfuro a una bra de colágeno. Las bras de colágeno de 3 tetrámeros se entrelazan entre si y permiten la union a la lamina basal Pseudo_colin_esterasa: butiril_colin_esterasa liberada por el hígado e implicada en la hidrolisis de ésteres ingeridos en la dieta. No se encuentra en las uniones neuro-musculares ni en el SNC. Las AchE hidrolizan de forma normal una quinta parte de la AcCh liberada. INHIBIDORES DE AchE: Actúan sobre un residuo de Ser q se localiza en el entro activo de la AchE y producen el aumento de la cantidad de AcCh en la hendidura sináptica => se inhibe su degradación. La modi cación q inducen puede ser: Reversible — carbamilación de la Ser —> neo_stigmina, so_stigmina (uso terapeutico en el tratamiento de Alzheimer) Irreversible — alquilación de la Ser —> di_ido_propil_ uoro_sfato (es un organofosforado empleado como plaguicida (pesticida) y en la guerra química. —> producen falta de oxigeno. fi fi fi fl fi fi  44 de 70 PATOLOGIAS ASOCIADAS A LA ALTERACION DE LA TRANSMISION SINAPTICA EN LA UNION NEUROMUSCULAR — SINDROME MIASTÉNICOS: La mayoría se deben a alteraciones metabólicas y algunas pueden tener carácter autoinmune, con mayor incidencia. El resto de los síndromes miasténicos congénitos son enfermedades raras. ALTERACIONES EN LA PRE-SINAPSIS: Síndrome congénito de escasez de vesículas — se debe a una disminución severa del n° de vesículas sinápticas en la placa neuro-muscular. Síndrome congénito de de ciencia del rellenado de vesículas — se debe a una alteración en los transportadores vesiculares Síndrome miasténico de Lambert-Eaton (LEMS) — es una enfermedad autoinmune en la q hay presencia de auto-anticuerpos frente a los canales de Ca tipo P/Q (92% y en algunos caso tipo N (33%)). La union de los anticuerpos produce la degradación de los canales => disminuye el n° de canales en la super cie de la pre-sinapsis. Fisiopatología — la liberación espontánea de AcCh es normal, pero la liberación regulada por Ca está disminuida pq la entrada de Ca en las terminales sinápticas es de ciente. => la transmisión sináptica inducida por la llegada de PA se ve afectada. La respuesta post- sináptica mejora con la estimulación repetida. Sintomalogía — debilidad muscular fundamentalmente en las zonas proximales de brazos y piernas, junto con alteraciones en el sistema parasimpático (sequedad de boca, impotencia, disminución de la sudoración) En el 60% de los casos, LEMS es previo a un carcinoma maligno de pulmón. Hoy en día se piensa q, como respuesta al carcinoma incipiente, el SI desarrolla anticuerpos cuyo epítopo es similar al de los canales de Ca llevando al desarrollo de la enfermedad. Tratamientos Sustancias q favorecen la liberación de AcCh — 4-aminopiridina (bloquea canales de K). El problema es q causa efectos secundarios => se utilizan derivados de este compuesto (3,4-diamino_piridina) q tienes efectos secundario solo en SNP => menos efectos secundarios. Plasmaféresis Terapia inmunosupresora fi fi fi  45 de 70 ALTERACIONES EN LA LAMINA BASAL: Síndrome congénito de de cit de acetil_colin_esterasa — es una enfermedad autosómica recesiva causada por mutaciones en las subunidades estructurales de la AchE (en las bras de colágeno): Mutaciones en el dominio de union rico en Pro (PRAD), implicado en la interacción de la bra de colágeno con la subunidad catalítica. => se impide el ensamblaje Mutaciones en el C-terminal de la bra de colágeno, implicado en el anclaje de la AchE a la lamina basal => no se forma la triple helice Fisiopatología — el de cit de AchE provoca un aumento de la vida media de AcCh en la hendidura sináptica y => los receptores nicotínicos permanecen abiertos un periodo de tiempo mayor incluso al periodo refractario de los canales de Na dep. de voltaje. En consecuencia, la caída de los mEPPs (mini- potenciales post-sinápticos excitatorios) es más lenta y eso puede permitir la apertura de canales de Na dep. de voltaje, así q un único estimulo puede generar más de un PA. Esto hace q la placa neuro-muscular esté activada más tiempo de lo normal, llevando a su degeneración y a una disminución del n° de receptores en la super cie. Sintomalogía — debilidad muscular generalizada. La severidad de los síntomas es mayor cuanto antes debuta la enfermedad. ALTERACIONES EN LA POST_SINAPSIS: Las alteraciones afectan a los receptores nicotínicos tanto a su expresión en la super cie como a su funcionalidad o su cinética. Miastenia gravis — se debe a una disminución del n° de receptores nicotínicos q se expresan en la placa neuro-muscular. La enfermedad puede tener 2 etiologías: Congénita — muy pocos casos Adquirida — origen autoinmune, con mayor incidencia Sintomalogía — debilidad muscular severa q se mani esta principalmente en los músculos faciales q controlan el movimiento de los párpados y los ojos. También puede afectar a los músculos orofaringeos y en casos muy graves a la musculatura respiratoria. Cursa con episodio de remisión - exacerbación. Mediante la union de antagonista marcados radiactivamente (bungaro_toxina) se observa q las bras musculares de los pacientes con miastenia gravis tienen menor densidad de receptores nicotínicos. fi fi fi fi fi fi fi fi fi  46 de 70 Clínica — se observa la diminución progresiva de la amplitud de los PAs al realizar ensayos de estimulación repetitiva sobre la bra muscular, de forma q a partir del tercer estimulo practicante no se detecta ningún PA. Fisiopatología — la debilidad muscular se debe a la incapacidad de contracción (pq hay menos receptores). En condiciones normales, como el n° de receptores nicotínicos q se expresan en la placa neuromotora es elevado, la amplitud del PA siempre alcanza al umbral de activación de los canales de Na dep. de voltaje. En la miastenia gravis, como hay menor n° de receptores, estos se encuentran menos concentrados en la super cie y la depleción mediada por la AchE hace q la AcCh q llega a los receptores no sea capaz de producir un PA con amplitud su ciente para alcanzar el umbral de activación de los canales de Na dep. de voltaje. NO hay alteración el la liberación de AcCh !!! Como progresivamente la placa neuro-muscular se estimula en menor medida, nalmente se produce su degeneración q provoca la reversión de las invaginaciones => ↓[canales de Na dep. de voltaje] + ↓[receptores nicotínicos]. Así, una miastenia gravis mal tratada termina por derivar en parálisis. fi fi fi fi  47 de 70 Origen autoinmune — se han identi cado auto-anticuerpos circulantes frente a los receptores nicotínicos. La union de los anticuerpos no impide ni altera la union de la AcCh a estos, sino q acorta su tiempo de vida media en la super cie de la membrana. Normalmente, la vida media de los receptores nicotínicos es de 5-7 días y después son internalizados por invaginaciones y se degradan en los lisosomas. Los anticuerpos acortan el tiempo de vida media a 2 días, por lo q la degradación es mucho mas rapida q la síntesis. => disminuye el numero de receptores nicotínicos en la post-sinapsis. El 15% de los pacientes con miastenia gravis presentan mayor propensión a desarrollar tumores benignos de timo, aunque se desconoce el porque. Al extirpar el timo, se observa una importante mejoría sintomatologica de la miastenia, lo cual se debe a q en este órgano es donde maduran los linfocitos T => se impide la generación de anticuerpos. Al introducir receptores nicotínicos de una especie A a otra B, se generan anticuerpos frente a estos y se observan los síntomas característicos de la miastenia gravis. Variante neonatal — aparece entre los 7-12 días tras el parto. En este caso, los anticuerpos frente a los receptores nicotínicos son transmitidos de la madre al feto a través de la lactancia. Tratamientos: Inhibidores de la AchE (pirido_stigmina) — al impedir la degradación de la AcCh, se compensa el de cit de receptores nicotínicos con el aumento del tiempo del agonista en la union neuro-muscular. Se observa recuperación inmediata de la movilidad Inmunosupresores (corticoides) Plasmaféresis — disminuye la cantidad de anticuerpos Timectomía — extirpación quirúrgica del timo fi fi fi