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1.#INTRODUZIONE" " La" caratteristica" biologica" principale" della" cellula" tumorale" è" la" proliferazione# incontrollata:# essa# non" ri5 sponde"al"normale"controllo"omeostatico"della"divisione"cellulare"e"si"divide"dando"luogo"a"due"...

1.#INTRODUZIONE" " La" caratteristica" biologica" principale" della" cellula" tumorale" è" la" proliferazione# incontrollata:# essa# non" ri5 sponde"al"normale"controllo"omeostatico"della"divisione"cellulare"e"si"divide"dando"luogo"a"due"cellule"figlie" che," come" la" cellula" madre," continueranno" a" dividersi" in" maniera" incontrollata," e" così" via" per" generazioni" successive,"fino"ad"arrivare"alla"formazione"di"una"massa#tumorale.# In"termini"più"rigorosi,"si"definisce"neoplasia"la"crescita(incontrollata(di(una(popolazione(cellulare"sfuggita"ai" normali"controlli"della"proliferazione,"ed"esprimente"gradi"variabili"di"fedeltà"rispetto"ai"loro"precursori." Poiché"all’inizio"quella"cellula"tumorale"era"una"cellula"normale,"i"primi"ricercatori"si"sono"chiesti"quale"sia"la" modificazione"che"determina"questa"trasformazione."Si"è"poi"scoperto"che"i"tumori"sono"una"malattia#ge? netica,"determinati"cioè"da"particolari"mutazioni"a"particolari"geni." L’elemento"cruciale"di"tutte"le"neoplasie"è"la"refrattarietà#agli#stimoli"predisposti"al"controllo"della"crescita;" questi"stimoli"non"solo"controllano"se"una"cellula"si"divida"in"maniera"adeguata,"ma"evitano"anche"che"essa" si"divida"quando"non"dovrebbe."Già"da"questi"dati"emerge"che"la"crescita"e"la"divisione"cellulare"non"sono" quindi" meccanismi" intrinseci" e" autonomi:" la" cellula" ha" bisogno" di" stimoli" esterni," per" esempio" i" fattori" di" crescita." Per"comprendere"quindi"i"geni"coinvolti"nei"tumori"occorre"conoscere"dettagliatamente"i"meccanismi"fisio5 logici"che"regolano"la"divisione"di"una"cellula." " " " # # # ! 1" !  2.#CICLO#CELLULARE#E#SUA#REGOLAZIONE# " Il"ciclo#cellulare"è"il"ciclo(degli(eventi(biochimici(e(morfologici(che( si(hanno(durante(la(riproduzione(di(una(popolazione(cellulare."Le" cellule"possono"permanere"nel"ciclo,"ossia"in"fase"G1,"S,"G2,"M,"o" uscire"dal"ciclo,"e"andare"in"fase"G0,"una"fase"stazionaria"di"attesa:" è"il"caso"delle"cellule"stabili,"che"rientrano"nel"ciclo"solo"se"stimo5 late" da" fattori# di# crescita" (GF" growth" factor);" i" fattori" di" crescita" infatti"fanno"progredire(la(cellula(durante(il(tratto(G1"(non"fanno" dividere"la"cellula!),"in"altre"determinano"l’ingresso"da"G0"a"G1"e"il" passaggio"da"G1"a"S." Le"cellule"che"si"moltiplicano"si"definiscono"“in"ciclo”;"quelle"che"non"si"moltiplicano"sono"“fuori"ciclo”."Nelle" cellule"tumorali"la"durata"delle"singole"fasi"è"fondamentalmente"uguale"a"quella"dei"citotipi"da"cui"esse"de5 rivano:"l’accrescimento#dei#tumori#è"generalmente"determinato"dal"fatto"che"un"maggior"numero"di"cellule" è"“in"ciclo”,"e"non"da"una"più"rapida"moltiplicazione"cellulare." Il"ciclo"cellulare"è"finemente"regolato# in"modo"che"gli"eventi"si"verifichino"al"momento"giusto,"nell’ordine# prestabilito,"solamente"una#volta"per"ciclo"e"soltanto"se"ci"sono"le"condizioni#necessarie"per"il"loro"compi5 mento;"tutto"ciò"è"garantito"da"punti#di#controllo,"chiamati"checkpoint.!" " PUNTI#DI#CONTROLLO# # I"punti#di#controllo"rappresentano"un"meccanismo"molecolare"che"consente"l’inizio"della"successiva"fase"del" ciclo"solo"quando"tutti"gli"eventi"specifici"della"fase"precedente"sono"stati"completati"in"modo"ottimale." Essi"sono:" il"punto#di#controllo#di#G1,"che"si"trova"ai"¾"di"questa"fase"e"che"divide"G1"in"due"sottofasi:"G1#preco? ce"(corrispondente"ai"primi"¾)"e"G1#tardiva"(corrispondente"all’ultimo"quarto);"questo"preciso"punto" di"passaggio"prende"il"nome"di"punto#di#restrizione.#In"questo"checkpoint"sono"controllati:# ! la"dimensione"della"cellula,# ! la"presenza"di"nutrienti,"ovvero"di"energia"per"progredire"nel"ciclo,# ! la"presenza"di"danni#al#DNA,"per"evitare"che"siano"presenti"errori"nel"DNA"delle"cellule"figlie,# ! la"presenza"di"fattori#di#crescita.# # ! 2" !  Se"qualcuno"di"questi"parametri"non"è"soddisfatto,"la"cellula"torna"in"G0,"anche"in"presenza"dei"fat5 tori"di"crescita,"fondamentali"per"la"transizione"G15S."Infatti,"il"fattore#di#crescita"attiva"la"via"di"tra5 sduzione"del"segnale"che"porta"alla"trascrizione"genica:"vengono"prodotti"fattori"di"trascrizione"(ri5 sposta"precoce),"che"a"loro"volta"regolano"a"cascata"la"trascrizione"di"altre"molecole"(risposta"tardi5 va)"che"permettono"la"transizione"G15S;" il"punto#di#controllo#di#S,"situato"alla"fine"della"fase"S,"in"cui"vi"è"la"duplicazione"del"DNA."In"questa" fase"si"valuta"ancora"la"presenza"di"eventuali"danni#al#DNA"avvenuti"durante"la"duplicazione;# il"punto#di#controllo#di#G2,"situato"prima"della"mitosi,"in"cui"si"vanno"a"controllare"nuovamente:# ! la"dimensione#della#cellula,# ! il"completamento#della#replicazione"del"DNA;# il" punto# di# controllo# dell’assemblaggio# del# fuso," situato" a" metà" della" mitosi," in" cui" si" valuta" l’attacco"dei"cromosomi"al"fuso,"necessario"per"il"successivo"distacco"dei"due"cromatidi.# " CICLINE#E#CHINASI#CICLINO?DIPENDENTI# " Il"progredire"di"una"cellula"in"tutte"queste"fasi"è"controllato,"nelle"cellule"dei"mammiferi,"da"due"famiglie"di" proteine:"le"chinasi# ciclino?dipendenti"(Cdk)"e"le"cicline;"le"Cdk"sono"degli"enzimi"ad"attività"serin?treonin# chinasica,"che"fosforilano"specifici"substrati"se"associati"alla"specifica"ciclina"che"ne"de5 termina" l’attivazione." La" cellula" infatti" regola" la" loro" attività" enzimatica" controllando" la" concentrazione# delle# cicline,"che"oscilla"nelle"varie"fasi"del"ciclo"cellulare:"ogni"fase"ha" una"precisa"coppia"Cdk5ciclina;"in"pratica,"la"prima"ciclina"a"essere"trascritta"è"quella"che" attiva"la"Cdk"che"permette"la"progressione"in"G1"(e"la"sintesi"della"ciclina"successiva),"poi" nella"fase"G1"tardiva"questa"ciclina"viene"degradata"e"aumenta"la"sintesi"della"ciclina"che" consente"di"progredire"in"fase"S,"e"così"via.!" La"concentrazione"delle"cicline,"la"cui"emivita"è"molto" breve," viene" regolata" dai" fattori# di# trascrizione" e" dal" sistema# dell’ubiquitina"(la"loro"degradazione"avviene" infatti"nel"proteasoma)." Le"cicline"più"importanti"sono:" nella"fase#G1,"la"ciclina#D#(nei"mammiferi"ne"esistono"3:"D1,"D2"e"D3),"che"attiva"le"Cdk4"e"Cdk6."La" ciclina#D"è"la"prima"ciclina"a"essere"sintetizzata;"infatti"i"fattori#di#crescita"che"fanno"entrare"nel"ci5 clo"le"cellule"in"G0"determinano,"grazie"alla"trasduzione"del"segnale,"la"sintesi"di"fattori"di"trascrizio5 ne"che"si"portano"sul"promotore"del"gene"della"ciclina"D." In"altre"parole,"aumenta"la"concentrazione"citoplasmatica"della"ciclina"D"a"seguito"di"stimolazione" coi"fattori"di"crescita." Questo"aumento"della"ciclina"D"è"apprezzabile"nella"seguente"figura."In"questo"esperimento,"i"ma5 crofagi,"che"presentano"il"recettore"per"l’M5CSF,"sono"stati"stimolati"con"M5CSF"per"differenti"perio5 di"di"tempo."Le"cellule,"dopo"ogni"trattamento,"sono"quindi"lisate"e"gli"RNAs"cellulari"sono"stati"se5 parati"mediante"elettroforesi."Utilizzando"una"sonda"radioattiva"complementare"all’mRNA"della"so5 la" ciclina" D," è" stato" possibile" mettere" in" evidenza" la" sua" quantità"relativa."Come"si"evince"da"questo"esperimento," la" ciclina" D" comincia" gradualmente" e" progressivamente" ad"aumentare"con"l’aumentare"del"tempo"di"esposizione" al"fattore"di"crescita"(in"questo"caso"M5CSF)." ! 3" !  La" concentrazione" della" ciclina" D" aumenta" fino" al" punto# di# restrizione," dopo" il" quale" non" si" può" più" tornare" indietro;" passato" il" punto" di" restrizione" inizia" a" essere" degradata" e" aumenta"la"sintesi"della"ciclina"E;" nella"fase#G1#tardiva,"la"ciclina#E,"che"attiva"la"Cdk2;" nelle"fasi#S#e#G2,"la"ciclina#A,"che"attiva"prima"la"Cdk2"(quindi" va"a"sostituire"la"ciclina"E)"poi"la"Cdk1#(nell’im5magine"CDC2," così"veniva"chiamata"in"precedenza);" nella"mitosi,"la"ciclina# B,"che"attiva"la"Cdk1"(quindi"va"a"so5 stituire"la"ciclina"A)." I"principali"substrati"fosforilati"dalle"Cdk"sono"gli"istoni,"la"cui"fosforilazione"favorisce"la"compattazione"dei" cromosomi,"le"proteine#della#membrana#nucleare,"con"conseguente"disassemblaggio"dell’involucro"nuclea5 re,"le"proteine#del#citoscheletro,"che"servono"al"macchinario"della"divisione." La"Cdk"è"attivata"solo"parzialmente"dall’associazione"con"la"ciclina"corrispondente;"ci"sono"altri"meccanismi" di"regolazione:" la" piena" attivazione" delle" Cdk" richiede" un’ulteriore" fosforilazione" operata" da" una" CAK" (Cdk"activating"kinase);" l’inibizione" delle" Cdk" è" determinata" da" una" fo5 sforilazione" su" residui" N5terminali" operata" da" una"Cdk?I"(Ckd5Inhibitor),"es."Wee15kinasi;! infat5 ti," all’interno" della" Cdk" ci" sono" siti" di" fosforila5 zione"sia"attivatori"(in"questo"caso"non"viene"in5 dicato"il"nome"dell’AA)"sia"inibitori;" l’attivazione" delle" Cdk" può" essere" infine" deter5 minata" da" fosfatasi" che" rimuovono" i" fosfati" ag5 giunti"dalle"Cdk5I,"es."Cdc255fosfatasi." " I"Cdk?I"possono"essere"divisi"in"due"categorie"differenti:" gli"inibitori"della"famiglia#INK4"(p15,"p16,"p18,"p19),"che"inibiscono"il"complesso"ciclina#D?Cdk4/6," quindi"la"progressione"in"G1"precoce;" altri#inibitori"(p21,#p27,#p57)"che"inibiscono"in"maniera"aspecifica"tutti"gli"altri"complessi.!" " ! 4" ! L’azione# biologica# di" questi" inibitori" è" complessa:" im5 maginiamo" una" cellula" in" fase"G0,"con"elevati"livelli"di" p21"o"p27"che"inibiscono"le" ultime" cicline" o" le" cicline" che"sono"presenti."Giunto"il" fattore# di# crescita," si" verifi5 ca" un" aumento" della" con5 centrazione" della" ciclina# D," che" si" associa" alle" Cdk4" e" Cdk6;" a" questi" complessi" ciclina"D5Cdk4/6"si"lega"p21," che"(pur"essendo"un"inibito5 re"di"tutti"i"complessi"delle"altre"fasi"del"ciclo)"esprime"su"di"essi"una"funzione"attivatoria,"determinando"un" loro"ulteriore"aumento."Così,"progressivamente,"la"p21"si"lega"a"questi"complessi"che"stanno"aumentando"di" numero,"finché"non"inizia"a"essere"rimossa"dai"complessi"sui"quali"stava"esprimendo"una"funzione"inibitoria" (es."ciclina"E5Cdk2),"che"si"attivano." Nel"frattempo"aumenta"la"sintesi"della"ciclica"E,"e"si"amplifica"di"più"il"processo."In"fase"G1"tardiva"la"ciclina" D"svolge"la"sua"funzione"biologica,"ma"la"sua"concentrazione"citoplasmatica"diminuisce"perché"si"sta"sinte5 tizzando"il"suo"inibitore,"INK4." " PUNTO#DI#RESTRIZIONE:#Rb# " Il"punto#di#restrizione"divide"la"fase"G1"in"G1"precoce"e"G1"tardiva."Per"essere"sicuro"che"la"cellula"vada"in"fa5 se"S,"occorre"che"il"fattore"di"crescita"sia"presente"nel"terreno"di"coltura"fino"al"raggiungimento"del"punto"di" restrizione:"infatti"esso"è"il"punto# di# non# ritorno;"se"prima"del"suo"raggiungimento"si"toglie"dal"terreno"di" coltura"il"fattore"di"crescita,"la"cellula"ritorna"in"G0." Da"un"punto"di"vista"molecolare"il"punto"di"restrizione"è"connesso"con"la"funzione"della"proteina# Rb,"fon5 La proteina del retinoblastoma damentale"nel"controllo"del"ciclo"cellulare"(la"sigla"Rb"deriva"da"retinoblastoma,"poiché"è"stata"scoperta"in" questo" contesto).! La" funzione" principale" di" Rb," nonostante" esistano" diverse" isoforme" (p110Rb,"p107Rb"e"p130Rb),"è"proprio"quel5 la" di" controllare" il" passaggio" attraverso" il" punto"di"restrizione." Nella" fase" G0" o" G1" precoce," Rb" segrega" dei" fattori" di" trascrizione," i" fattori# E2F?1/2/3" e# DP?1/2," che" non" possono" svolgere" la" loro" funzione"biologica;"a"seguito"della"fosforila? zione" da" parte" del" complesso" ciclina" D5 Cdk4/6"(serve"che"sia"iperfosforilata),"Rb"li5 bera"i"fattori"di"trascrizione"che"si"portano"ai" promotori" di" geni" codificanti" per" enzimi" e" proteine" necessari" per" l’entrata" in" fase" S," tra"i"quali"quello"della"ciclina"E." ! 5" ! Quindi,"da"un"punto"di"vista"molecolare,"il"punto"di"restrizione"è"rappresen5 tato"dall’iperfosforilazione#di#Rb;"e"vi"deve"essere,"per"tutta"la"fase"G1"pre5 coce,"una"continua"stimolazione"con"il"fattore"di"crescita"perché"questo"pro5 cesso"di"fosforilazione"è"graduale# e# progressivo:"se"viene"tolto"il"fattore"di" crescita"dal"terreno"di"coltura"prima,"Rb"non"sarà"fosforilato"in"maniera"tale" da"poter"espletare"la"sua"funzione"biologica." Come"accennato,"Rb"ipofosforilato"si"associa"a"specifici"fattori"di"trascrizio5 ne,"a"loro"volta"già"associati"ai"relativi"promotori;"per"potenziare"questa"ini5 bizione,"Rb"recluta"altre"proteine,"tra"cui"un’istone?deacelitasi# (HDAC),"che" deacetila"gli"istoni"vicini,"rendendo"la"cromatina"più"compatta."Al"contrario," quando"Rb"è"iperfosforilato,"i"fattori"di"trascrizione"attraggono"altre"moleco5 le"attivatorie,"tra"cui"un’istone?acetilasi,#che"rende"la"cromatina"meno"com5 patta,"favorendo"così"la"trascrizione."" Oltre"a"modulare"la"transizione"attraverso"il"punto"di"restrizione,"Rb"è"anche"coinvolta"nel"differenziamen? to,"perché"trattiene"anche"fattori"di"trascrizione"essenziali"nel"differenziamento"della"cellula"(NF?IL6)." " p53:#IL#GUARDIANO#DEL#GENOMA# " La"proteina"p53"è"un"fattore#di#trascrizione"fondamentale"nel"controllo#dell’integrità#del#genoma,"tanto"da" esser"definita"“il"guardiano"del"genoma”;"essa"ha"una"emivita"molto"breve;"viene"costitutivamente"e"conti5 nuamente"prodotta"e"poi"subito"degradata,"è"quindi"fisiologicamente"assente"in"una"cellula." La"p53"è"un"omotetramero:"è"quindi"attiva"quando"è"formata"da"quattro"subunità"p53,"pesanti"53KDa"l’una." In"ogni"subunità"distinguiamo:" una"dominio# di# tetramerizzazione," situato" all’estremità" C5terminale,"a"livello"del"quale"avviene"il" legame"con"le"altre"subunità;" una"DNA?binding#domain#(dominio"in"grado"di"legare"il"DNA),"essenziale"per"l’espletamento"della" sua"funzione"di"fattore"di"trascrizione;" una"sequenza#di#localizzazione#nuclea? re" (NLS)," di" 556" AA," che" le" consente" di" entrare"nel"nucleo;" un"dominio#di#attivazione#della#trascri? zione,"che"consente"di"far"partire"la"tra5 scrizione"dei"geni"di"cui"è"fattore"di"tra5 scrizione." Contiene" inoltre" residui# serinici# e# treoninici," substrato" di" numerose" protein5chinasi" che" ne" modulano"l’attività"“DNA5binding”." Fisiologicamente,"questa"proteina"viene"prodot5 ta"nel"RE,"indirizzata"al"Golgi"e"infine"al"nucleo," dove"si"associa"a"una"proteina:"Mdm2"(la"prima" M" sta" per" murino," quindi" l’omologo" umano" è" con" la" H);" ciò" determina" la" monoubiquitinazio? ne"di"p53,"che"a"sua"volta"determina"la"sua"usci? ta" dal" nucleo:" nel" citoplasma" viene" infine" po5 liubiquitinata"e"degradata"nel"proteosoma."" ! 6" ! In"caso"di"danno"al"DNA,"la"molecola"ATM,"che"rileva"il"danno,"attiva"una"chinasi"che"a"sua"volta"fosforila" p53."A"questo"punto,"la"p53"fosforilata"si"stacca"da"Mdm2,"non"viene"più"monoubiquitinata"e"permane#nel# nucleo,"dove,"avendo"acquisito"la"sua"attività"“DNA5binding”"e"transattivante,"espleta"la"sua"funzione"di"fat5 tore"di"trascrizione;"essa"si"porta"sui"promotori"del/i"gene/i:" che"bloccano#il#ciclo#cellulare,"per"consentire"la"riparazione"del"DNA,"come"il"gene"che"codifica"per" la"p21,"inibitore"delle"fasi"del"ciclo"successive"a"G1;" che"codificano"per"gli"enzimi#di#riparo#del#DNA;" che"codificano"per"fattori#pro?apoptotici#(bad,"bax,"noxa),"nel"caso"in"cui"il"danno"non"venga"ripara5 to,"in"modo"tale"che"la"cellula"vada"incontro"a"morte"cellulare"programmata"(via"mitocondriale"in5 trinseca);" che"codifica"per"mdm2,"il"suo"stesso"regolatore,"per"far"ripartire"(dopo"aver"espletato"la"sua"funzio5 ne)"la"trascrizione"e"sintesi"di"MDM2,"e"ripristinare"il"turnover"fisiologico."E’"un"meccanismo"a"feed? back#negativo." In"generale,"essa"determina"l’attivazione"di"geni"che"codificano"per"prodotti"che"esercitano"un’azione"nega? tiva"sulla"progressione"del"ciclo"e"la"repressione"di"geni"che"codificano"per"prodotti"che"favoriscono"la"pro5 gressione"del"ciclo." La" p53" interviene" anche" nella" senescenza:" l’esaurimento" dei" telomeri" attiva" infatti" delle" proteine" p535 dipendenti.# # RECETTORI#DEI#FATTORI#DI#CRESCITA#E#TRASDUZIONE#DEL#SEGNALE# # Come"accennato,"per"arrivare"al"punto"di"restrizione"serve"un"fatto5 re"di"crescita;"studiamo"quindi"i"recettori#per#i#fattori#di#crescita.# La"maggior"parte"(98%)"dei"recettori"per"i"fattori"di"crescita"sono"re? cettori# tirosin?chinasici:" presentano" quindi" nella" porzione" intracel5 lulare"un"dominio"(in"rosso"nell’immagine)"ad"attività"enzimatica"di" tipo" tirosin5chinasico;" questa" attività" è" nulla" quando" il" recettore" non"è"stimolato"dal"suo"ligando.!" In"generale,"un"recettore"tirosin5chinasico"ha"un"solo"dominio#tran? smembranario,"ricco"di"aminoacidi"idrofobici,"una"parte#extracellu? lare,"adibita"all’interazione"con"lo"specifico"ligando,"e"una"parte#in? tracellulare,"con"il"dominio"chinasico"e"una"coda"citoplasmatica"ric5 ca"di"tirosine"non"fosforilate"a"riposo." Quando" il" ligando" arriva" e" viene" riconosciuto" dal" recettore," si" ha" oligomerizzazione:" così" il" dominio" chinasico" di" un" recettore" fosforila" le" tirosine"del"recettore"adiacente"(nei"testi"tro5 vate"il"termine"autofosforilazione,"riferito"a"un" recettore"tirosin5chinasico,"ma"è"ovvio"che"un" recettore" non" può" fosforilare" se" stesso;" l’oligomerizzazione" può" essere" chiamata" an5 che" dimerizzazione" ma" è" ovvio" che" sulla" su5 perficie" cellulare" non" ci" sono" solo" due" recet5 tori)." " ! 7" ! La"fosforilazione"di"queste"tirosine"ha"un"duplice"significato"funzionale:" aumenta" drasticamente," partendo" dai" livelli" basali," l’attività# enzimatica# del"recettore"stesso,"anche"se"non"sono"molte"le"tirosine"con"questa"fun5 zione," serve" a" formare" il" sito" di" legame" per" reclutare" trasduttori" intracellulari," nello" specifico" a" reclutare" proteine" intracellulari" con" dominio# SH2# (SRC" Homology"2),"che"interagisce"in"maniera"specifica"con"tirosine"fosforilate;" per"questa"interazione,"sono"importanti"anche"gli"aminoacidi"posti"a"valle," in"posizione"C5terminale."Un"altro"modulo"che"riconosce"tirosine"fosforila5 te"è"PTB"(phospho5tisonine"binding);"ma"per"questa"interazione"sono"im5 portanti"gli"AA"che"si"trovano"in"posizione"N5terminale." Di"ogni"recettore"sono"state"mappate"le"tirosine:"per"ognuna"di"esse"si"conoscono" la"posizione,"il"motivo"che"viene"riconosciuto"(formato"dalla"tirosina"e"dagli"ammi5 noacidi"successivi)"dal"trasduttore,"il"tipo"di"trasduttore." La"famiglia"dei"recettori"tirosin5chinasici"può"essere"suddivisa"in"varie"categorie,"ognuna"con"il"suo"prototi5 po:" c’è" la" famiglia" del" recettore" per" l’EGF," quella" del" recettore" per" l’insulina," quella" del" recettore" per" il" PDGF," etc." I" recettori" di" ogni" famiglia" presentano" una" certa"omologia"di"sequenza." Tre"famiglie,"quelle"dei"recettori"per"il"PDGF,"per"l’FGF"e" per" il" VEGF," hanno" un" dominio" chinasico" diviso" in" due# segmenti;"e"l’unica"vera"grande"eccezione"è"rappresen5 tata" dal" recettore# dell’insulina," che" è" un" dimero:" in" questo" caso" l’arrivo" del" ligando" lo" attiva" non" tanto" per" mezzo" della" dimerizzazione" quanto" del" cambio" confor5 mazionale,"che"determinerà"poi"la"sua"fosforilazione." # Prove#sperimentali# Possiamo" rilevare" l’effetto# dei# fattori# di# crescita# in"una"cellula"con"il"seguente" esperimento"(effettuato"negli"anni"’90):"inseriamo"in"una"coltura"cellulare"i"fat5 tori"di"crescita"per"30"secondi,"rompiamo"le"membrane"con"un"detergente,"divi5 diamo"le"proteine"cellulari"su"gel,"e"sfidiamo"il"gel"con"un"anticorpo#contro#la#fo? sfo?tirosina."E’"utile"poi"confrontare"i"risultati"con"quelli"di"una"coltura"cellulare" in"cui"non"sono"stati"inseriti"i"fattori"di"crescita;"la"differenza"è"lampante:"in"cel5 lule" non" stimolate" non" può" essere" rilevata" nessuna" tirosina" fosforilata;" basta" qualche"secondo"di"GF"e"tutte"le"molecole"sono"fosforilate." Si"può"svolgere"un"esperimento"analogo"con"cellule"che"esprimono"il"recettore" per"l’EGF,"con"un"anticorpo"specifico"contro"questo"recettore:"anche"in"questo" caso,"la"principale"proteina"presente"è"proprio"il"recettore"per"l’EGF,"che"è"stato" fosforilato." Possiamo"poi"utilizzare"la"banda"di"gel"corrispondente"all’EGF,"ottenuta"con"que5 sto" esperimento," e" inserirla" in" un" gel" bidimensionale" per" andare" a" individuare" l’aminoacido" fosforilato" (tirosina," serina" o" treonina):" si" nota" che," anche" senza" EGF,"il"recettore"è"già"molto"fosforilato,"sia"in"serina"sia"in"treonina,"e"che,"in"se5 guito"alla"stimolazione"con"EGF,"aumentano"solo"i"livelli"di"fosfotirosina,"che"ini5 zialmente"era"quasi"nulla." ! 8" ! MODULI#DI#COLLEGAMENTO#DEI#TRASDUTTORI#INTRACELLULARI#(BINDING#DOMAINS)# Oltre"a"SH2"e"PRB,"che"riconoscono"residui"di"tirosina"fosforilati,"altri"due"moduli"di"collegamento"dei"tra5 sduttori"intracellulari"sono"SH3,"che"riconosce"sequenze#ricche#in#prolina,"e"PH"(Pleckstrin"Homology),"che" riconosce"gruppi#fosforilati#dell’inositolo."Facciamo"degli"esempi." Il"dominio#SH2"è"presente"per"esempio"sulla"PLCγ"(fosfolipasi5Cγ);"quest’ultima,"reclutata"da"una"ti5 rosina"fosforilata"del"recettore"per"mezzo"del"suo"dominio"SH2,"si"porta"vicino"al"recettore"e"viene" anch’essa"fosforilata,"quindi"attivata."La"PLCγ"attacca"poi"il"PIP2"e"forma"DAG"(che"resta"in"mem5 brana)"e"IP3"(che"va"nel"RE"determinando"il"rilascio"di"Ca).!" Il"dominio# PH"è"presente"per"esempio"sulla"molecola"AKT."La"trasduzione"è"complessa:"le"tirosine" fosforilate"del"recettore"reclutano"la"fosfaditil?inositolo?3?kinasi"(PI3K),"che"ha"un"dominio"SH2;"il" cambio" conformazionale" conseguente" a" questa"interazione,"più"che"la"fosforilazione" dell’enzima" (che" comunque" avviene," ma" sembra" essere" poco" influente)," determina" l’attivazione" di" questo" enzima," che" agisce" sul" PIP2," aggiungendo" un" fosfato" in" posizio5 ne" 5" dell’inositolo" e" formando" quindi" PIP3." Con" questo" meccanismo" la" PI3K" contribui5 sce" alla" formazione" di" un" substrato" ricono5 scibile" dalle" molecole" con" dominio# PH," co5 me" la" molecola" AKT," che" si" porta" quindi" in" vicinanza"della"membrana"plasmatica,"dove" viene" fosforilata" da" alcune" chinasi" e" quindi" attivata." Il"dominio#SH3"è"presente"per"esempio"sulla" molecola"GRB2"(pr."“grab5due”)."Essa,"con"il" suo" dominio" SH2," riconosce" la" fosfotirosina" sul" recettore" e" si" porta" in" membrana;" poi" con"i"suoi"due"domini"SH3"recluta"SOS,"che" ha" una" regione" ricca" in" prolina" e" agisce" da" GNEF"su"RAS5GDP." Il"dominio"PTB"è"presente"per"esempio"sulla" molecola" SHC" (pr." “scìc”);" è" uno" dei" pochi" substrati"a"identità"completamente"italiana:" è"stato"scoperto"in"Italia"dal"prof."Pelicci."Le" tirosine" fosforilate" di" alcuni" recettori" non" vengono" riconosciute" da" GRB2" per" mezzo" del"suo"dominio"SH2,"ma"da"SHC"per"mezzo" del" suo" dominio" PTB." E’" SHC," a" sua" volta," dopo" essersi" agganciato" ed" esser" stato" fo5 sforilato," ad" agganciare" GRB2," che" recluta" SOS." " " ! 9" ! E’" possibile" dimostrare" la" traslocazione" di" AKT" sotto" la" membrana"unendo"una"proteina#fluorescente"all’AKT"e"ana5 lizzando" a" fluorescenza" le" cellule:" in" assenza" del" fattore" di" crescita," la" proteina" è" diffusa" in" tutto" il" citoplasma" (A);" in" presenza"dell’EGF,"a"seguito"dell’attivazione"della"PI3K,"AKT" viene"reclutato"e"trasloca"in"membrana"(B)." Facendo"lo"stesso"esperimento"con"un"AKT"il"cui"dominio"PH" è" stato" distrutto," notiamo" che" sia" in" presenza" (C)" sia" in" as5 senza" (D)" dell’EGF," AKT" resta" nel" citoplasma," perché" non" è" stato"riconosciuto;"così"è"stato"dimostrato"che"il"dominio#PH" è" responsabile" del" passaggio" della" proteina" dal" citoplasma" verso"la"membrana." # LA#VIA#DELLE#MAP?KINASI# RAS,"una"volta"attivato,"attiva"la"via#delle#MAP?Kinasi:"sono"delle"serin?treonin?chinasi"che"si"attivano"a"ca5 scata"dopo"esser"state"fosforilate."Nella"maggior"parte"delle"cellule"umane"la"MAP5KKK"è"RAF,"la"MAP5KK"è" MEK,"le"MAP5K"sono"Erk1"ed"Erk2."Queste"ultime"svolgono"le"seguenti"funzioni:" fosforilano"proteine#citoplasmatiche,"per"esempio"Mnk1,"con"conseguente"attivazione"di"un#fatto? re#di#elongazione#(elF4E),"che"prepara"la"cellula"alla"sintesi"di"proteine"(perché"la"cellula"si"sta"per" andare"a"dividere);" fosforilano" nel" nucleo" dei" fattori# di# trascrizione" (ets," elk1," Sap1;" per" i" linfociti" è" importante" elk1," ma"il"più"importante"è"ets."Comunque"cambiano"a"seconda"del"recettore"e"del"tipo"cellulare,"in"ogni" cellula"si"attivano"contemporaneamente"molte"vie"di"signalling)." Il"fattore"ets"determina"la"trascrizione"di"FOS;"quest’ultimo,"fosforilato,"forma"assieme"a"JUN"il"fat5 tore"di"trascrizione"AP?1,"uno"dei"principali"fattori"di"trascrizione"della"fase"precoce,"che"determina" la"proliferazione."AP51"infatti"si"porta"anche"sul"promotore"del"gene"che"codifica"per"la"ciclina#D"(un" gene" della" fase" tardiva)," che," a" sua" volta," grazie" all’attivazione" delle" Cdk4/6," determina" l’iperfosforilazione"di"Rb"e"il"passaggio"attraverso"il"punto"di"restrizione;" fosforilano"gli"istoni,"rendendo"il"DNA"meno"compatto"e"più"pronto"alla"trascrizione." # FAMIGLIA#DELL’EGF#RECEPTOR# La" famiglia" dei" recettori" dell’EGF," anche" chia5 mata"dei"recettori"ErbB,"è"formata"da"recetto5 ri" differenti" con" una" sequenza" simile:" sono" ErbB?1/2/3/4"(o"HER1/2/3/4)." Questi"recettori"sono"espressi"sulla"superficie" delle"cellule"epiteliali,"in"maniera"più"o"meno" differente." Le" molecole" che" stimolano" questi" recettori" sono" molteplici;" non" si" conosce" il" ligando" di" ErbB52,"ma"esso"è"costitutivamente"attivo." Durante" la" dimerizzazione," gli" EGF5receptors" formano" sia" omo5" sia" eterodimeri;" quindi" il" comportamento" biologico" della" cellula" dipen5 de"non"solo"da"diversi"tipi"di"ligandi"ma"anche" ! 10" ! dall’espressione"differenziale"di"questi"recettori:"per"esempio,"in"presenza"di"TGF5α,"si"attiva"ErbB51,"che"du5 rante"la"dimerizzazione"può"legarsi"anche"ErbB52."Poiché"recettori"diversi"reclutano"traduttori"diversi,"le"pa5 thway"di"trasduzione"del"segnale"sono"pertanto"molto"eterogenee"e"sinergiche." La"traduzione"del"segnale"attivata"da"questi"recettori"regola"molte"funzioni# biologiche,"quali"l’apoptosi,"la" migrazione"cellulare"e"l’adesione,"la"crescita"e"il"differenziamento." Il"recettore"più"importante"da"un"punto"di"vista"oncologico"è"ErbB?2,"iper5espresso"e"costitutivamente"atti5 vo"nei"carcinomi"della"mammella:"maggiore"è"l’espressione"di"ErbB52,"peggiore"è"la"prognosi"del"carcinoma." Ciò" ha" anche" applicazioni" in" clinica:" attualmente," dopo" l’operazione" del" carcinoma" alla" mammella," l’anatomopatologo" valuta" l’espressione" di" ErbB52," attraverso" la" quale" dà" indicazioni" prognostiche" e" tera5 peutiche" sullo" schema" chemioterapico" da" adottare." Inoltre," ultimamente" è" stato" fabbricato" un" anticorpo# monoclonale# ricombinante" contro" ErbB52," definito" Trastuzumab" (commercializzato" come" Herceptin)," che" fa"endocitare"ErbB52"nella"cellula:"questa"down5regulation"fa"sì"che"l’attività"biologica"della"cellula"regredi5 sca" e" rende" il" tumore" meno" aggressivo;" di" conseguenza," nella" pratica" anatomo5patologica" si" valuta" con" l’Herceptin?test# se" il" tumore" è" ErbB52" positivo" (ovvero" se" presenta" l’amplificazione" del" gene" ErbB52)," in" questo"caso"si"aggiunge"allo"schema"chemioterapico"l’Herceptin."Questa"terapia,"entrata"nella"pratica"clini5 ca"una"decina"di"anni"fa,"ha"fornito"ottimi"risultati"nelle"pazienti,"facendo"aumentare"la"durata"del"periodo" libero"da"malattia"e"della"sopravvivenza." " PROTEINE#DELLA#FAMIGLIA#SRC# # SRC"(pr."“Sarc”)"è"il"prototipo"delle"proteine"dell’omonima"famiglia:"sono"molecole"tirosin?chinasiche"intra5 cellulari"ancorate"al"foglietto"interno"della"membrana."Nella"porzione"intracellulare"presentano"tre"domini:" SH1,#SH2#e#SH3"(SH"sta"per"SRC"homology,"identificati"poi"in"altre"proteine);"sappiamo"che:" SH3"recluta"proteine"intracellulari"ricche"in"prolina," SH2"riconosce"tirosine"fosforilate," SH1"è"il"dominio"ad"attività"chinasica." SRC"quando"è"completamente"disteso"si"trova"nella"conformazione"attiva." Quando" non" c’è" il" fattore" di" crescita," si" forma" un" legame# intramolecolare" in" SRC," perché" la" tirosina# 527# (Y527),"che"si"trova"C5terminalmente"a"SH1,"essendo"fosforilata"da"una"chinasi"intracellulare"che"non"regola" il"ciclo,"si"lega"al"suo"stesso"SH2:"questo"legame"intramolecolare"chiude"il"dominio"chinasico"SH1"e"inattiva" SRC." SRC"si"attiva"quando"la"tirosina"fosforilata"di"un"recettore"tirosin5chinasico"attivo,"adiacente"a"SRC,"esprime" un’affinità"per"l’SH2"di"SRC"maggiore"di"quella"della"tirosina"527:"così"SRC"si"apre"e"si"attiva." " ! 11" !  FATTORE#DI#TRASCIZIONE#Myc# # Un"altro"fattore"di"trascrizione"importan5 te" nella" progressione# del# ciclo# cellulare" fino"al"punto"di"restrizione,"oltre"ad"AP51," è" Myc," considerato" l’esecutore" nucleare" dei" segnali" di" proliferazione" provenienti" dalla"membrana"e"trasdotti"al"nucleo."In5 fatti" è" possibile" rilevare" che" in" presenza" del" fattore# di# crescita" la" concentrazione" citoplasmatica" di" Myc" aumenta" notevol5 mente,"fino"alla"fine"di"G1." Myc" è" attivo" quando" forma" con" il" suo" partner," Max," un" eterodimero:" Myc" e" Max" insieme" danno" segnali" che" portano" la"cellula"alla"proliferazione." La"concentrazione"di"Max"nel"nucleo"è"stabile:"non"cambia"in"maniera"signi5 ficativa"durante"il"ciclo"cellulare,"a"differenza"di"quella"di"Myc;"infatti"in"as5 senza"dei"fattori"di"crescita,"le"concentrazioni"di"Myc"diminuiscono"ed"esso" viene"sostituito"da"Mad."In"questo"caso"l’eterodimero"Mad5Max"è"antiproli? ferativo"e"promuove"la"differenziazione." Quindi"la"permanenza"della"cellula"nel"compartimento#proliferativo"o"il"suo" transito"in"quello"differenziativo"dipendono"dalla"quantità"intracellulare"dei" partner"di"Max:"se"prevale"Myc,"la"coppia"Myc5Max"favorisce"la"proliferazio? ne,"se"prevale"Mad,"la"coppia"Mad5Max"favorisce"la"differenziazione." Questo"è"ben"evidente"nella"cripta"intestinale:"utilizzando"un"marcatore"ca5 ratteristico"delle"cellule"proliferative"(Ki67,"verde)"e"uno"caratteristico"delle" cellule"differenziate"(Creb3L3,"rosso)"è"possibile"distinguere"il"compartimen5 to"delle#cellule#staminali,"situato"nella"base"della"cripta,"e"quello"delle"cellu? le# differenziate," situato" superiormente." Ci" aspettiamo" che" nel" primo" com5 partimento" siano" molto" elevati" i" livelli" intracellulari" di" Myc," nel" secondo" quelli"di"Mad.!" " " " ! 12" !  3.#LA#CELLULA#TUMORALE#E#I#GENI#DEL#CANCRO# # NASCITA#DELL’ONCOLOGIA:#RSV# " La"nostra"storia"ha"inizio"con"un"esperimento"svolto"verso"la"fine"dell’800’"da"un"microbiologo,"il"Dr."Rous:" egli"prelevò"delle"cellule"tumorali"da"un"pollo"con"un"sarcoma"(un"tumore"maligno"delle"cellule"connettiva5 li),"le"spezzettò"e"le"filtrò,"poi"iniettò"il"filtrato"in"un"pollo"sano,"con"l’intento"di"vedere"se"fosse"un"microbo"a" causare"il"tumore."Osservò"così"che"il"pollo"sano"sviluppava"il"sarcoma;"pertanto"pensò"che"la"causa"del"tu5 more"fosse"proprio"un"virus"o"un"microbo."Questo"virus"sarebbe"stato"poi"chiamato"virus# del# sarcoma# di# Rous"o"RSV"(quando"c’è"V"finale"si"parla"di"un"virus),"e"nel"pollo"tale"virus"rappresenta"la"condizione"neces5 saria"e"sufficiente"per"far"sviluppare"questo"tumore." " Fino"ai"primi"anni"’90"del"Novecento"comunque"gli"scienziati"non"sapevano"a"cosa"fossero"dovuti"i"tumori;" fino"agli"anni"’80"erano"state"proposte"tre"differenti"modelli#sulla#patogenesi#dei#tumori:" il# modello# del# differenziamento# o# epigenetico,"secondo"il"quale"il"tumore"non"è"legato"ad"altera5 zioni"di"alcun"gene,"ma"scaturisce"da"un"anomalo"processo"differenziativo"della"cellula;"in"altre"pa5 role,"a"cambiare"non"sono"i"geni"ma"i"programmi"trascrizionali:"è"proprio"l’espressione"di"molecole" differenti"a"determinare"l’allontanamento"dal"percorso"differenziativo"fisiologico"e"la"trasformazio5 ne"della"cellula"sana"in"cellula"tumorale;" il" modello# virale" (sostenuto" dai" microbiologi)," secondo" il" quale" la" causa" del" tumore" è" legata" a" un" microorganismo."I"microbiologi"hanno"dimostrato,"in"effetti,"in"una"serie"di"animali,"di"ruscire"con" un" microorganismo" o" un" virus" a" produrre" il" tumore;" ma" non" sono" riusciti" a" dimostrare" lo" stesso" nell’uomo."E’"emerso"così"che,"a"differenza"dei"modelli"animali,"un(virus(non(è(mai(l’unico(agente( eziologico(di(un(tumore(nell’uomo;"questo"non"significa"però"che"il"virus"non"c’entri"col"tumore:"il"vi5 rus"può"essere"una"concausa,"può"cioè"favorire"l’evoluzione"del"tumore." La"teoria"dei"virologi"cominciava"a"vacillare,"nonostante"il"loro"sforzo"e"contributo"insostituibile:"essi" infatti" hanno" caratterizzato" molti" virus" che" determinano" l’insorgenza" tumori" nei" modelli" animali," mai"nell’uomo;" il"modello#ambientale"(sostenuto"dagli"epidemiologi,"che"studiano"la"distribuzione"delle"malattie)," secondo"il"quale"è"l’ambiente"a"far"sorgere"il"tumore."Si"era"visto"che"spalmando"sulla"cute"rasata" del" topo" sostanze" responsabili" dell’insorgenza" del" tumore," dette" cancerogene," es." del" catrame," si" sviluppava" un" carcinoma;" analogamente" gli" epidemiologi" si" sono" accorti" che" alcune" professioni" e" abitudini"predispongono"allo"sviluppo"dei"tumori."Per"esempio"a"Londra"ci"si"accorse"che"gli"spazza? camini"erano"predisposti"a"sviluppare"tumori"dello"scroto;"poi"si"è"dimostrato"che"le"polveri"che"ri5 manevano"nelle"pliche"dei"testicoli,"a"causa"della"scarsa"igiene,"erano"cancerogene."O"ancora:"si"è" visto"che"chi"abusava#di#tabacco"(all’epoca"si"sniffava)"sviluppava"tumori"al"naso." ! 13" ! Si"fa"strada"quest’ultimo"modello,"e"nel"1970"B.#Ames,"biochimico"e"biologo"molecolare,"fa"un’importante" osservazione:"basandosi"su"studi"di"genetica,"suppone"che"tutti# i# cancerogeni# siano# dei# mutageni# (non"è" vero"il"contrario),"e"che"pertanto"occorre"cercare"all’interno"della"cellula"i"geni#mutati;"ma"all’epoca"la"bio5 logia"molecolare"ancora"non"era"nata,"né"si"era"in"grado"di"sequenziare"il"DNA." Paradossalmente"furono"proprio"i"virologi"che"permisero"di"compiere"dei"passi"in"avanti:"all’epoca"in"Cali5 forna,"Dulbecco,"che"lavorava"con"Temin"e"Baltimore,"mise"a"punto"una"tecnica"per"poter"realizzare"colture" cellulari"e"far"replicare"i"virus"in(vitro"(furono"proprio"questi"tre"ricercatori"negli"anni"successivi"a"ricevere"il" premio"Nobel"per"la"scoperta"della"trascrittasi"inversa)."Negli"anni"della"California,"questi"studiosi"isolarono" il"virus"del"sarcoma"di"Rous,"lo"sequenziarono"e"scoprirono"che"il"genoma"era"a"RNA"(è"quindi"il"genoma"di" un"retrovirus)"e"che"presenta:" le" sequenze# LTR,# situate" alle" estremità," importanti" per" l’inserimento" del" retrovirus" nel" genoma" dell’ospite," GAG,"con"i"geni"per"le"proteine"del"capside," ENV,"con"i"geni"per"le"proteine"dell’envelope," POL,"con"i"geni"per"la"trascrittasi"inversa,"la"polimerasi"e"l’integrasi," V?ONC," una" regione" che" scoprirono" essere" responsabile"del"tumore"nel"pollo:"infatti"la" sua" rimozione" non" determina" l’insorgenza" del"tumore."E’"un"oncogene:"nel"caso"speci5 fico,"questa"regione"è"chiamata"V5SRC,"per5 ché"è"responsabile"del"sarcoma"di"Rous." Il"Nobel"arrivò"nel"1989,"quando"Bishop"e"Varmus"“dimostrano"l’origine"cellulare"dei"protoncogeni"retrovi5 rali”:"essi"si"chiesero"5"visto"che"tutti"i"retrovirus"presentano"di"solito"solo"GAG,"POL"ed"ENV"5"da"dove"venis5 se"il"segmento"V5SRC,"e"ipotizzarono"che"esso"fosse"stato"acquisito"dal"virus"passando"da"un"ospite"all’altro" (nel"caso"del"RSV,"deriva"dal"pollo)."Usando"una"sonda"a"DNA,"specifica"per"questo"segmento"di"SRC,"scopri5 rono"che"lo"stesso"segmento"era"presente"anche"nella"cellula#umana,"e,"con"studi"più"approfonditi,"la"mise5 ro"in"evidenza"in"tutte"le"cellule;"scoprirono"infine"che"questa"sequenza"ha"una"mutazione:"in"altre"parole," la"proteina"presente"fisiologicamente"nella"cellula" umana" differisce" solo" per" un" amminoacido" da" quella"trovata"nel"virus"che"causa"il"tumore."E’"sta5 ta"una"scoperta"sconvolgente:"così"è"stato"identi5 ficato"il"primo#gene#responsabile#del#cancro." Per" nominare" questi" geni" usiamo" un" acronimo" a" tre"lettere,"preceduto"da"un’altra"lettera:"con"la"C" (es." C5SRC)" indichiamo" la" versione" non" mutata," con" la" V" (es." V5SRC)" la" versione" mutata;" la" forma" non" mutata," importante" nella" regolazione" della" proliferazione"della"cellula,"prende"il"nome"di"pro? toncogene," la" forma" mutata" invece" prende" il" no5 me"di"oncogene#(lett."gene"che"causa"il"tumore)." A" questo" punto" i" virologi" ritornarono" in( auge" e" iniziarono"a"trovare"altri"virus"che"determinassero" l’insorgenza"del"tumore"nei"modelli"animali;"e"tut5 te" le" sigle" a" tre" lettere" indicano" protoncogeni" la" cui"mutazione"provoca"il"tumore." ! 14" ! Si" è" arrivati" quindi" a" ipotizzare" che" il" virus," durante"il"ciclo#lisogeno,"quando"si"integra," si"inserisce"vicino"a"un"protoncogene"e"che," quando"va"via,"si"porta"via"un"frammento"di" gene," determinando" la" mutazione." Così" è" iniziato"tutto.!" Oggi" si" è" arrivati" alla" conclusione" che" il" tu5 more" è" una" malattia# genetica," in" quanto" determinata" da" mutazioni" a" geni," e" che," nell’uomo," una" singola" mutazione" a" carico" di"un"oncogene"non"è"condizione"sufficiente"per"determinare"l’insorgenza"un"tumore;"si"è"dimostrato"che"ci" devono"essere,"in(vitro,"almeno"2"mutazioni"affinché"una"cellula"da"normale"diventi"tumorale,"e,"in(vivo,"455" mutazioni." Si"è"poi"scoperto"che"i"protoncogeni"codificano(per(proteine(aventi(nella(cellula(eucariotica(un’azione(stimo; lante(la(divisione(cellulare,"quindi"che"a"determinare"un"aumento"del"ritmo"di"replicazione"è"una"mutazione# con# guadagno# di# funzione"del"protoncogene;"per"esempio,"affinché"aumenti"il"ritmo"proliferativo,"il"gene" che"codifica"per"il"recettore"per"l’EGF,"deve"subire"una"mutazione"tale"che"la"porzione"chinasica"del"recetto5 re"sia"sempre"attiva." Si"è"scoperto"inoltre"che"la"divisione"cellulare"è"anche"regolata"da"proteine"che"controllano"in"maniera"ne5 gativa" il" ciclo" della" cellula," come" p53," i" cui" geni" possono" essere" coinvolti" nella" patogenesi" del" tumore" e" prendono" il" nome" di" oncosoppressori;" in" questo" caso" l’oncosoppressore" deve" subire" una" mutazione# con# perdita#di#funzione." " CARATTERISTICHE#DELLA#CELLULA#TUMORALE# " Per"identificare,"in"una"cellula"di"tumore"umano,"i"geni#mutati" occorre"isolare"il"DNA"della"cellula"e"operare"la"transfezione:" occorre" digerire" il" DNA," frammentarlo," inserire" questi" seg5 menti"in"un"vettore,"e"inserire"il"vettore"dentro"le"cellule"euca5 riotiche" (es." fibroblasti" di" topo)," per" osservare" infine" se" c’è" una"cellula"che"ha"le"caratteristiche"di"una"cellula"tumorale;"in" tal" caso" quella" cellula" ha" un" pezzo" di" gene" che" ha" a" che" fare" con"il"tumore." Il"modello"cellulare"in(vitro"di"trasformazione"neoplastica"è"rappresentato"dalla"linea#cellulare#NIH?3T3,"ri5 cavata" da" fibroblasti" murini;" queste" cellule" vengono" classicamente" utilizzate" per" vedere" se" un" gene" può" comportarsi"da"oncogene." Le"caratteristiche"di"una"cellula"tumorale"sono:" perdita"di"inibizione#da#contatto,"tipica"delle"cellule"normali"che,"in"coltura,"crescono"ma"si"fermano" quando" sono" circondate" da" altre" cellule." La" cellula" tumorale" invece" cresce" su" se" stessa," formando"un"ammasso"di"cellule,"chiamato"fo# cus." Per" esempio," se" infettiamo" fibroblasti" NIH53T3"con"il"virus"del"sarcoma"di"Rous,"la"cel5 lula"si"trasforma"e"si"formano"dei"foci;"possia5 mo" valutare" quindi" la" presenza" di" oncogeni" in" ! 15" !  cellule"di"tumore"umano"con"questa"tecnica,"studiando"le"piastre"dove"si"formano"dei"foci,"con"il"fo# cus'forming'essay"(test"di"formazione"dei"foci);" ancoraggio?indipendenza."Una"cellula"normale,"per"poter"crescere,"deve"aderire"o"alla"matrice"ex5 tracellulare" o" a" un" substrato" (es." piastra" Petri)," non" è" quindi" in" grado" di" crescere" in" sospensione," tanto"che"esiste"una"forma"di"morte"cellulare"che"prende"il"nome"di"Anoikis"(dal"greco"a(n);oìkos," “senza"casa”),"in"cui"le"cellule"che"non"aderiscono"al"substrato"vanno"incontro"a"morte,"con"un"mec5 Ancoraggio-indipendenza canismo" p535indipendente" (invece" l’apoptosi" è" p535dipendente)." La" cellula" tumorale" invece" è" in" grado" di" crescere" in" so5 spensione:" perde" quindi" l’ancoraggio;" questo" può" essere"testato"vedendo"se" la" cellula" forma" delle" co5 lonie"in"soft#agar;!" immortalizzazione." Hayflick" ha" visto" che" le" cellule" umani" normali," messe" in" coltura" con" un" po’" di" fattori"di"crescita,"dopo"253"mesi"smettono"di"dividersi"e"muoiono:"queste"cellule"manifestano"il"fe5 nomeno"della"senescenza# replicativa;"egli"ha"osservato"inoltre"che"ogni"tipo"cellulare"presenta"un" numero"limitato"di"divisioni,"indentificato"con"il"numero#di#Hayflick#(dipende"dalla"specie,"dal"tessu5 to"di"origine"e"dall’età"dell’organismo"donatore)."Tale"numero,"dal"punto"di"vista"molecolare,"corri5 sponde"al"numero"dei"telomeri#dei"cromosomi,"che"diminuisce"a"ogni"duplicazione"cellulare"a"causa" della"presenza"dei"frammenti"di"Okazaki;"in5 fatti"la"DNA"polimerasi"duplica"il"DNA"solo"in" direzione" 5’53’," scorrendo" sul" filamento" ve5 loce," mentre" il" filamento" lento" viene" dupli5 cato" pezzetto" per" pezzetto," e" all’estremità" del"cromosoma"non"c’è"spazio"per"inserire"il" primer"di"innesco." Quindi," dopo" molteplici" duplicazioni," quan5 do"la"cellula"giunge"al"punto"critico"in"cui"le" resta" solo" un" telomero," non" si" divide" più" e" innesca"un"meccanismo"apoptotico." Le"uniche"cellule"del"corpo"con"la"telomera? si"sono"le"cellule"staminali"e"embrionali,"che" quindi"sono"immortali;"ma"si"è"visto,"analo5 gamente,"che"anche"le"cellule"tumorali"han5 no"la"telomerasi"attiva:"ciò"le"rende"immor? tali.!" Quindi," per" dimostrare" che" un" gene" si" comporta" da" oncogene" occorre" fare" il" test" di" formazio5 ne" di" foci," verificare" se" in" so5 spensione" in" soft" agar" si" formi5 no" colonie," e," infine," indurre# in' vivo#il#tumore,"iniettando"le"cel5 lule" del" focus" in" un" topo" e" ve5 dendo"se"sviluppa"il"tumore." ! 16" !  MECCANISMI#DI#ATTIVAZIONE#DEGLI#ONCOGENI#NEI#TUMORI#UMANI# " Studiamo" i" geni" coinvolti" nel" cancro," oncogeni" o" oncosoppressori," ponendo" la" nostra" attenzione" su"come" siano"stati"scoperti"(da"virus,"da"transfezione),"su"quale"sia"la"fonte"del"tumore"e"sul"tipo"di"mutazione"di"cui" sono"oggetto,"con"la"consapevolezza"che"se"cambiano"i"geni,"cambia"la"malattia."Infatti,"nell’ambito"dello" stesso" tumore" (es." carcinoma" epatico)," in" pazienti" diversi" gli" oncogeni" mutati" possono" essere" diversi:" di" conseguenza"il"comportamento"biologico"di"questi"tumori"sarà"differente;"anche"se"attualmente"i"due"pa5 zienti"vengono"trattati"con"un"analogo"schema"di"chemioterapia"(che"si"basa"poco"su"indagini"genetiche)." Studiamo" i" meccanismi# di# attivazione# dei# protoncogeni," quindi" le" mutazioni" che" rendono" i" protoncogeni" degli"oncogeni,"ovvero"dei"geni(che(a(seguito(di(mutazione' con' guadagno' di' funzione(favoriscono(la(tra; sformazione(e(la(progressione(neoplastica"(possono"codificare"per"trasduttori"intracellulari,"fattori"di"cresci5 ta,"recettori"per"fattori"di"crescita"o"qualsiasi"altra"proteina"che"favorisca"la"proliferazione)."Per"acquisire"un" vantaggio"proliferativo"è"sufficiente"che"la"mutazione"sia"in"eterozigosi."" I" meccanismi" di" attivazione" possono" essere" sia" qualitativi" sia" quantitativi." I" meccanismi" qualitativi" sono" rappresentati"da:" mutazioni# puntiformi," ovvero" mutazioni" con" cambio" di" un" singolo" nucleotide" che" determina" nella"proteina"il"cambio"di"un"aminoacido." L’esempio"più"importante"è"dato"dal"protoncoge? ne# RAS," presente" nelle" forme" H5RAS," N5RAS" e" K5 RAS"(è"stato"individuato"da"tre"ricercatori"in"tre"vi5 rus"diversi,"ma"la"proteina"è"sempre"la"stessa)."Ri5 cordiamo"che"RAS"è"attivo"quando"è"legato"al"GTP" (è"regolato"positivamente"da"molecole"GNEF,"che" sostituiscono" il" GDP" con" il" GTP);" è" inattivo" quando" è" legato" al" GDP" (è" regolato" negativamente" da" molecole"GAPs,"che"idrolizzano"il"GTP"a"GDP)."Inoltre"va"sottolineato"che"RAS"è"dotato"di"un’attività# GTPasica#intrinseca." Le"mutazioni"più"frequenti"che"fanno"diventare"RAS"un"oncogene"sono"localizzate"nel"codone# 12:" nel"protoncogene"c’è"una"glicina"che"nell’oncogene"viene"sostituita"da"una"valina"(nei"tumori"uma5 ni"si"trova"anche"una"mutazione"nel"codone"13);"questo"codone"codifica"per"l’amminoacido"critico" nel"legame"tra"RAS"e"le"GAPs"inattivatrici."Di"conseguenza"questa"mutazione"fa"sì"che"RAS"rimanga" sempre"in"forma"attiva,"e"quindi"determini"la"trascrizione"continuativa"di"FOS"e"della"ciclina"D."Così" la"cellula"acquisisce"un"vantaggio"proliferativo." E’"stata"rilevata"anche"una"mutazione"a"livello"del"codone#61,"che"codifica"per"un"aminoacido"loca5 lizzato"nella"porzione"ad"attività"GTPasica"intrinseca"di"RAS,"senza"la"quale"RAS"non"si"autoregole5 rebbe:"così"la"cellula"acquisisce"un"vantaggio"proliferativo." Queste"mutazioni"si"ritrovano"con"una"frequenza"altissima"nei"tumori#del#pancreas,"ma"non"solo;"di" solito"la"mutazione"di"RAS"è"un"evento"precoce"nella"patogenesi"tumorale;" riarrangiamenti#cromosomici,"ovvero"le"traslocazioni#cromosomiche."Normalmente"il"nostro"DNA" può"subire"tagli"(a"seguito"ad"esempio"a"esposizioni"a"radiazioni)"che"vengono"riparati"da"appositi" enzimi."Se"gli"enzimi"del"riparo"commettono"un"errore,"può"accadere"che"un"frammento"contenen5 te"un"protoncogene"venga"saldato"in"un"altro"cromosoma:"si"forma"così"un"gene"chimerico"che"co5 difica"per"una"proteina"chimerica."Troviamo"parecchie"traslocazioni"cromosomiche"soprattutto"nel5 le"leucemie,"la"più"importante"di"tutte"è"quella"del"gene"che"codifica"per"la"proteina#BCR?ABL,"pre5 sente"nelle"leucemie#mieloidi#croniche"(CML)."" ! 17" ! I"meccanismi"quantitativi"invece"sono:" amplificazione#genica,"che"consiste"in"un"aumento"del"numero"di"copie"(maggiore"di"6"per"il"geno5 ma"diploide)"di"una"specifica"regione"subcromosomica,"che"determina"un"incremento"della"sintesi" della"proteina." L’esempio"più"noto"è"l’amplificazione"di"ErbB?2,"appartenente"alla"famiglia"dell’EGFR,"presente"so5 prattutto"nei"carcinomi#della#mammella;"tra"i"membri"di"questa"famiglia,"ErbB52"rappresenta"il"re5 cettore"più"potente"nella"risposta"proliferativa."L’entità"dell’amplificazione"di"ErbB52"viene"valutata" dall’anatomopatologo"con"tecniche"di"immunoistochimica"(usando"cioè"anticorpi"contro"la"proteina" sintetizzata)"ed"è"predittiva"ai"fini"prognostici." Come" già" detto," nei" tumori" ErbB52" positivi," l’anticorpo" monoclonale" Herceptin" fa" internalizzare" e" poi"degradare"a"livello"lisosomiale"ErbB52,"togliendo"il"vantaggio"alla"cellula"tumorale;"per"realizzare" gli"anticorpi"monoclonali"sono"usati"modelli"murini,"ma"occorre,"onde"evitare"che"l’anticorpo"venga" riconosciuto" come" un" antigene" non" self5," umanizzare" l’anticorpo," sostituendo" con" una" tecnica" di" biologia"molecolare,"l’Fc"del"topo"con"quello"umano." In"alcuni"casi,"il"gene"si"può"amplificare"anche"staccandosi"dal"cromosoma"e"diventando"un"extra5 cromosoma" che" continua" a" duplicarsi," che" prende" il" nome" di" Double# Minuts" (questo" accade" per" esempio"con"ErbB52"e"con"Myc);" riarrangiamento#cromosomico,"come"la"traslocazione#cromosomica."E’"il"caso"del"linfoma#di#Bur? kitt,"in"cui,"a"causa"della"traslocazione"cromo5 somica," il" gene" che" codifica" per" Myc" (situato" nel"braccio"lungo"del"cromosoma"8)"viene"tra5 slocato"nel"cromosoma"14,"dove"entra"sotto"il" controllo"del"promotore"del"gene"che"codifica" per"la"catena"pesante"delle"immunoglobuline;" poiché" la" catena" pesante" viene" prodotta" in" grandi"quantità,"Myc"viene"over5espresso"e"la" cellula"acquisisce"un"vantaggio"proliferativo."" " MECCANISMI#DI#INATTIVAZIONE#DEGLI#ONCOSOPPRESSORI#NEI#TUMORI#UMANI# # Studiamo"gli"oncosoppressori"e"i"loro"meccanismi"di"inattivazione." L’oncosoppressore#è"un"gene"che"codifica"per"proteine"che"frenano"la"proliferazione"cellulare;"in"altre"paro5 le"è"un"gene(che(a(seguito(di(mutazione'con'perdita'di'funzione(favorisce(la(trasformazione(e(la(progressio; ne( neoplastica." Molti" autori" dividono" gli" oncosoppressori" in" care5taker" (curatori)" e" gate5keeper" (custodi)," ma"è"più"utile"considerare"i"gate5keeper"i"veri"e"propri"oncosoppressori,"e"i"care5taker"i"geni#del#riparo#del# DNA,"che"si"comportano"biologicamente"come"oncosoppressori."Comunque"tra"i"gate5keeper,"che"rappre5 sentano"i"custodi"permissivi,"ci"sono"tutti"gli"oncosoppressori"che"non"riguardano"il"DNA." In"questo"caso,"affinché"la"cellula"acquisisca"il"vantaggio"proliferativo,"occorre"che"la"mutazione"con"perdita" di"funzione"degli"oncosoppressori"sia,"tranne"dovute"eccezioni,"in"omozigosi,"ovvero"su"entrambi"gli"alleli;" l’eccezione"è"rappresentata"da"proteine#multimeriche,"per"esempio"p53,"la"cui"forma"attiva"è"costituita"da" quattro"subunità:"in"questo"caso"è"sufficiente"una"mutazione"su"un"solo"allele"per"avere"un"tetramero"non" funzionante"(infatti"la"probabilità"che"si"formi"un"tetramero"con"tutte"subunità"wild5tipe"è"bassa)." I"meccanismi#di#silenziamento"degli"oncosoppressori"sono:" mutazioni# puntiformi,"di"un"codone"che"codifica"per"un"aminoacido"essenziale"nell’adempimento" della"funzione"della"proteina;" ! 18" !  delezione"di"segmenti"di"DNA;" metilazione#del#DNA,"in"particolare"delle"isole"CpG"presenti"nel"promotore"del"gene"(è"il"meccani5 smo"però"più"frequente)."Questa"modificazione"epigenetica"riguarda"le"citosine"seguite"da"guanine;" se"le"citosine"del"promotore"sono"ipermetilate,"il" gene" diventa" inaccessibile" agli" enzimi" della" tra5 scrizione."Per"esempio,"si"è"visto,"con"una"tecnica" che" permette" di" valutare" il" grado" di" metilazione" dei" promotori," che" il" promotore" del" gene# RASSF1A"(un"oncosoppressore)"di"una"cellula"pre5 levata" da" un" tessuto" tumorale" è" ipermetilato;" il" grado"di"metilazione"diminuisce"se"le"cellule"sono" prelevate"dal"tessuto"adiacente"a"quello"tumora5 le,"per"poi"diventare"nullo"se"le"cellule"sono"pre5 levate"da"un"soggetto"sano.!" " Perdita#dell’eterozigosi# Poiché"la"frequenza"media"di"mutazione"a"uno"specifico"locus,"ad"esempio"dove"c’è"un"oncosoppressore,"è" di"1056"per"ciclo"cellulare,"la"probabilità"che"compaiano"due"mutazioni"sequenziali"sui"due"alleli"dello"stesso" gene"è"di"10?12,"infinitamente"bassa;"poiché"ciò"avviene"comunque,"si"è"cercato"di"capire"quale"fosse"il"mec5 canismo"che"alzasse"di"molto"questa"probabilità,"chiamato"perdita# dell’eterozigosi"(LOH,"loss(of(heterozy; gosis)." I"meccanismi"che"determinano"la"perdita"dell’eterozigosi"per"un"oncosoppressore"sono:" la"ricombinazione#mitotica,"il"più"frequente."Durante"la"mitosi"può"verificarsi"un"processo"di"ricom5 binazione"mitotica"(analogo"al"crossing?over,"che"non"è"prerogativa"della"sola"meiosi),"e,"di"conse5 guenza,"dopo"la"duplicazione"del"DNA,"un"locus"contenente"il"gene"mutato"può"essere"portato"nel" cromosoma"omologo;"al"momento"della"divisione"dei"cromatidi,"c’è"la"probabilità"del"50%"di"forma5 re"una"cellula"figlia"con"due"geni"mutati;" " la"conversione# genica,"nella"quale"la"DNA"poli5 merasi"durante"la"duplicazione"cambia"filamen5 to,"lasciando"il"suo"filamento"guida,"e"forma"un" ibrido" con" il" filamento" di" DNA" complementare" appartenente" al" cromosoma" omologo." Dopo" aver" percorso" una" certa" distanza" in" questo" fi5 lamento,"essa"ritorna"a"usare"come"stampo"il"fi5 lamento" originale." Così" il" DNA" neosintetizzato" acquisirà" sequenze" di" DNA" di" origine" del" cro5 ! 19" !  mosoma"omologo;"se"il"segmento"del"cromosoma"omologo"trascritto"durante"questa"conversione" contiene"geni"oncosoppressori"mutati,"si"può"avere"la"perdita"dell’eterozigosi;" la"non#disgiunzione#mitotica"(v."trisomia"21"o"sindrome"di"Klinefelter);"durante"la"mitosi"non"si"di5 sgiunge"una"coppia"di"cromatidi,"si"formano"pertanto"una"cellula"con"un"solo"cromosoma"e"una"cel5 lula"con"tre"cromosomi;"in"quest’ultima"uno"degli"extra5cromosomi"va"perso:"se"di"questi"tre"cro5 mosomi"due"sono"mutati"e"uno"no,"e"se"si"perde"quello"non"mutato,"si"ha"la"perdita"dell’eterozigosi." " " " LA#PREDISPOSIZIONE#EREDITARIA#AI#TUMORI# " Come"già"detto,"il"cancro"è"una"malattia#genetica,"ma"non"è"sufficiente"una"mutazione"per"avere"una"neo5 plasia;"inoltre"la"neoplasia"è"un"fenomeno"biologico"in"continua"evoluzione:"dopo"essersi"sviluppata,"posso5 no"continuare"ad"accumularsi"mutazioni,"per"esempio"a"geni"adibiti"al"riparo"del"DNA"o"a"p53,"con"conse5 guente"aumento"della"possibilità"di"acquisire"altre"mutazioni." Secondo" studi" epidemiologici" svolti" in" Europa" e" negli" Stati" Uniti," circa" il" 10?20%" dei" tumori" presenta" una" spiccata"aggregazione#familiare,"che"sembra"suggerire"una"predisposizione#ereditaria"alla"malattia;"ovvia5 mente"occorre"tener"conto"anche"dello"stile"di"vita"che"accomuna"i"membri"della"famiglia." Per"esempio"si"è"visto"che"in"Giappone"la"frequenza"del"tumore#allo#stomaco"era"superiore"rispetto"al"resto" del" mondo;" per" valutare" se" tale" frequenza" incrementata" avesse" una" base" genetica" o" fosse" legata" all’alimentazione,"sono"stati"studiati"i"giapponesi"di"terza"generazione"trasferitisi"in"America"(e"non"quelli"di" prima"generazione,"che"conservano"le"usanze"del"paese"di"origine),"e"si"è"visto"che"la"frequenza"era"identica" a"quella"degli"Americani:"quindi"la"causa"è"stata"imputata"allo"stile#di#vita"piuttosto"che"alla"genetica." Pertanto"occorre"restringere"il"campo:"si"è"visto"che"l’aggregazione"di"questi"tumori,"a"spiccata"aggregazio5 ne"familiare"(10520%),"è"dovuta"solo"in"piccola"parte"(corrispondente"al"5%"circa)"alla"genetica;"il"restante"il" 10515%"è"dovuto"allo"stile"di"vita." Si"parla"quindi"di"tumori#ereditari,"sottolineando"però"che"a"essere"ereditato"non"è"il"tumore"ma"la"predi5 sposizione"allo"sviluppo"del"tumore;"in"particolare"possiamo"parlare"di:" cancro# sporadico," quando" non" c’è" una" predisposizione" genetica." In" questo" caso" tutte" le" cellule" dell’organismo"sono"senza"mutazione"alla"nascita,"e"nella"stessa"cellula"si"verificano"almeno"quattro" mutazioni"per"avere"lo"sviluppo"del"tumore;" cancro#a#substrato#ereditario,"quando"tutte"le"cellule"dell’organismo"sono"portatrici"della"mutazio5 ne:"ciò"aumenta"il"rischio"di"cancro,"perché"le"mutazioni"che"si"devono"verificare"nella"cellula"affin5 ché"si"abbia"la"trasformazione"sono"di"meno;"ma"è"chiaro"che"senza"altre"mutazioni"la"cellula"non"si" trasforma." ! 20" ! Il"rischio#di#sviluppare#un#tumore,"che"può"essere"ereditato,"dipende"anche"dal"tipo"di"mutazione"ereditata;" infatti"parliamo"di:" rischio#specifico,"se"la"mutazione"a"un"gene"determina"un"aumento"del"rischio"di"insorgenza"di"una" determinata"forma"di"tumore,"perché"l’azione"biologica"di"tale"gene"è"più"importante"o"esclusiva"di" alcuni"citotipi."E’"emblematico"il"caso"di"Rb,"il"gene"del"retinoblastoma,"un"oncosoppressore"la"cui" mutazione"germinale"determina"un"aumento"del"rischio"di"insorgenza"del"retinoblastoma"(che"esi5 ste"però"anche"come"tumore"sporadico);"occorre"tener"presente"però"che"una"mutazione"con"per5 dita"di"funzione"di"Rb"può"essere"riscontrata"in"tutti"i"tumori"umani"e"non"solo"nel"retinoblastoma;" rischio# sistemico," se" si" ha" mutazione" a" geni" la" cui" alterazione" riguarda" molti# citotipi" (es." un" gene" house5keeping,"come"p53),"con"conseguente"predisposizione"a"vari"tipi"di"tumore,"o"a"geni"la"cui"al5 terazione"si"riflette"nella"disfunzione"di"meccanismi"preposti"alla"difesa#antineoplastica." Tra"il"tumore"sporadico"e"quello"a"substrato"ereditario"ci"sono"delle"differenze"rilevanti;"in"particolare"nel" tumore"ereditario:" si"ha"l’esordio#a#un’età#più#giovane#rispetto"ai"tumori"sporadici."Occorre"considerare"che"il"proces5 so"di"genesi"del"tumore"avviene"lentamente"(tranne"eccezioni,"come"le"leucemie"fulminanti),"per5 tanto"il"processo"è"già"avviato"in"chi"nasce"con"una"mutazione," ci"sono"casi#multipli"nella"stessa"famiglia," sono"colpite"più#generazioni," c’è"un’associazione"con"specifici"tipi"di"tumore,"ai"quali"la"stessa"mutazione"conferisce"un"vantag5 gio." Se,"partendo"da"queste"caratteristiche,"si"sospetta"che"un"soggetto,"con"storia"familiare"positiva"per"una"de5 terminata" forma" di" tumore," presenti" già" delle" mutazioni" a" un" gene" noto" correlato" con" questo" tumore," è" possibile"sequenziare"tale"gene"e,"se"è"mutato,"inserire"il"paziente"in"un"percorso"di"sorveglianza"stringente" e"di"consulenza#genetica#oncologica;"per"esempio,"questi"screening"possono"essere"svolti"in"soggetti"aventi" storia"familiare"positiva"per"il"tumore"del"colon"retto,"del"seno"(basti"pensare"ad"Angelina"Jolie"che"si"è"tolta" entrambi"i"seni"e"le"ovaie,"perché"ha"ereditato"BRCA1"e"2"mutati,"che"predispongono"al"tumore"del"seno"e" dell’ovaio),"etc." " ORIGINE#MONOCLONALE#DEI#TUMORI# " Come"già"detto,"si"definisce"neoplasia"la"crescita"di"una"popolazione"cellulare"sfuggita"ai"normali"controlli" della"proliferazione;"questa"crescita"è"determinata"da"mutazioni"non"letali"a"geni"adibiti"al"controllo"del"ci5 clo"cellulare"(protooncogeni"e"oncosoppressori),"che"conferiscono"alla"cellula"un"vantaggio#proliferativo"e" che"vengono"trasmesse"alle"cellule"figlie." Le"cellule"di"questa"popolazione"cellulare"in"continua"crescita"ed"espansione"hanno"una"probabilità"sempre" maggiore"di"accumulare# mutazioni"produttive"(che"fanno"acquisire"un"ulteriore"vantaggio"proliferativo)"e" possono"esprimere"un"grado"di"fedeltà"sempre"minore"rispetto"ai"loro"precursori;"da"questa"evidenza"nasce" la" nozione" di" progressione# tumorale," ovvero" di" progressivo" aumento" dell’aggressività" della" malattia," de5 terminata"da"aumentate"capacità"proliferative"e,"successivamente,"invasive." Secondo"evidenze"sperimentali,"la"maggior"parte"dei"tumori"ha"uno"sviluppo#clonale,"ovvero"ha"origine"da" un’unica# cellula# iniziale# mutata# avente" un" vantaggio" proliferativo:" si" parla" infatti" di" origine" monoclonale# dei#tumori." ! 21" ! Tuttavia"sappiamo"che"una"singola#mu? tazione"non"è"sufficiente"a"determinare" l’insorgenza" della" neoplasia:" si" devono" accumulare" all’interno" della" cellula" al5 meno"455"mutazioni;"di"conseguenza,"le" cellule"della"massa"tumorale,"pur"aven5 do" un’origine" monoclonale" (pur" deri5 vando"cioè"da"un’unica"cellula"progeni5 trice)"e"condividendo"pertanto"la"prima" mutazione," sono" eterogenee:" a" ogni" ciclo" cellulare," in" cellule" differenti" pos5 sono" insorgere" mutazioni" produttive" differenti:"si"sviluppano"così,"nel"conte5 sto"della"stessa"massa,"differenti"popo? lazioni#cellulari.!! L’origine"monoclonale"dei"tumori"è"stata"dimostrata"sperimentalmente"con"uno"studio"sui"leiomiomi#uteri? ni"(tumori"della"muscolatura"liscia"dell’utero)"in"donne"eterozigoti"per"una"particolare"proteina,"la"G6PDH" (glucosio565fosfo5deidrogenenasi),"che"presenta"le"isoforme"A"o"B."Il"gene"che"codifica"per"questo"enzima"è" localizzato"sul"cromosoma#X," quindi"in"una"donna"eterozi5 gote" il" 50%" delle" cellule" esprime"l’isoforma"A"e"il"50%" l’isoforma" B," perché" il" cro5 mosoma" X" va" incontro" ad" inattivazione" casuale" in" ogni" cellula."E’"stata"quindi"dimo5 strata" l’origine" monoclonale" del"tumore"perché"non"è"mai" stata" trovata" una" massa" tu5 morale"con"cellule"esprimen5 ti" entrambe" le" isoforme;" ciò" conferma" che" il" tumore" ori5 gina"da"un’unica"cellula.!! Oggi"ci"sono"molte"altre"evidenze"a"conferma"dell’origine"monoclonale"dei"tumori,"basti"pensare"al"mielo? ma#multiplo"(tumore"delle"plasmacellule),"in"cui"viene"prodotto"un"solo"tipo"anticorpale." " EVOLUZIONE#DEI#TUMORI# # Come"accennato,"il"tumore"evolve"da"uno"stato"di"neoplasia"benigna"a"neoplasia"maligna,"perché"continua" ad"accumulare#altre#mutazioni." Basti" pensare" a" una" neoplasia" dell’epitelio," in" cui" si" passa" da" uno" stato# di# iperplasia# (iperproliferazione)," determinato" da" una" prima" mutazione," con" cellule" che" mantengono" ancora" le" caratteristiche" delle" cellule" epiteliali,"a"uno"stato#di#displasia,"in"cui"le"cellule"iniziano"ad"assumere"caratteristiche"morfologiche"diffe5 renti"(a"causa"di"anomalie"nel"differenziamento)"e"comincia"ad"essere"alterata"l’architettura"del"tessuto." ! 22" !  " " Ma" la" neoplasia" è" ancora" confinata" e" isolata" dal" connettivo" sottostante," grazie" alla" membrana" basale:" si" parla"di"carcinoma#in'situ"(non"invasivo);"a"questo"punto"insorgono"problemi"nell’apporto"di"nutrienti"e"os5 sigeno,"soprattutto"per"le"cellule"che"si"trovano"al"centro"della"massa:"se"la"massa"non"riesce"a"costruire"una" rete"vascolare,"il"tumore"difficilmente"progredisce." La"capacità"di"formare# un# vaso"all’interno"della"massa,"passaggio"non"scontato,"prende"il"nome"di"switch# angiogenetico"e"solitamente"si"verifica"contestualmente"alla"rottura"della"membrana"basale"e"all’invasione" del"tessuto"sottostante." Con"un"ulteriore"accumulo"di"mutazioni,"il"tumore"può"disseminarsi"attraverso"il"circolo"sanguigno"e"il"circo5 lo"linfatico,"rimanere"in"questo"stato"quiescente"senza"dividersi"nei"tessuti,"e,"per"motivi"ancora"sconosciuti," riprendere"a"proliferare"in"un"altro"distretto"portando"alla"formazione"di"metastasi;"non"bisogna"quindi"con5 fondere"l’invasione,"il"processo"attraverso"il"quale"una"cellula"tumorale"si"porta"nel"sangue"e"si"dissemina," con"la"metastasi,"la"formazione"di"un"secondo"tumore." " ETEROGENEITA’#DEI#TUMORI# " Nonostante"questo"modello"evolutivo"comune,"e"oltre"alla"caratteristica"comune"della"divisione"incontrolla5 ta,"i"tumori"presentano"una"notevole"eterogeneità"perché"hanno:" una"diversa"origine#cellulare,"possono"derivare"da"una"cellula"epiteliale,"connettivale,"etc," una"differente"localizzazione#topografica,"possono"derivare"dall’epitelio"intestinale"o"epatico," una"differente"morfologia#(v."dopo)," un"differente"comportamento#biologico,"dipendente"dal"tipo"di" mutazioni"accumulate"e"impossibile"da"determinare." In"sintesi,"per"questi"motivi,"ogni"neoplasia"ha"una"propria"individualità." Da"un"punto"di"vista"morfologico,"una"cellula"tumorale"presenta:" aspetto#iperplastico:"osserviamo"molte"figure"mitotiche," alterazione"del"rapporto#nucleo?citoplasma:"osserviamo"un"nu5 cleo"non"più"tondo,"di"forme"differenti"e"più"grande," alterazione"della"forma"e"delle"dimensioni," una"diminuzione"del"volume"del"citoplasma," perdita"di"strutture#cellulari"specializzate." # # ! 23" !  TEST#DIAGNOSTICI# # Di" solito" si" diagnostica" un" tumore" molto" tardi," a" meno" che" non" sia" localizzato" in" una" regione" particolare," come"il"cervello."Dopo"aver"individuato,"per"esempio"con"indagini"radiodiagnostiche,"una"massa"sospetta,"si" effettua"dove"possibile"l’agoaspirato,"che"consiste"in"un"prelievo"di"cellule."Tali"cellule"vengono"analizzate" da" un" citologo," che" ne" valuta" gli" aspetti" morfologici:" se" si" tratta" di" cellule" tumorali" si" può" procedere" con" l’asportazione" chirurgica" della" massa," che," dopo" l’intervento," viene" valutata" dall’anatomopatologo" per" l’analisi"del"tumore."" Oltre"all’agoaspirato,"sono"stati"sviluppati"esami"citologici"differenti"per"valutare"la"presenza"di"cellule"neo5 plastiche:"per"i"tumori#del#cavo#orale"può"essere"valutata"l’eventuale"presenza"di"cellule"neoplastiche"nella" saliva,"per"i"carcinomi#della#cervice#uterina"si"può"ricorrere"al"Pap?test"(test"di"Papanicolau),"che"rappresen5 ta"il"primo"esame"cito5oncologico;"esso"consiste"nel"prelievo"e"nell’analisi"di"un"campione"di"cellule"in"vagi5 na."A"seconda"della"morfologia"di"queste"cellule,"la"neoplasia"intraepiteliale"della"cervice"(CIN,"Cervical(In; traepithelial( Neoplasia)" può" essere" classificata," secondo" un" grado" progressivo" di" trasformazione," in" CIN# I," che"corrisponde"a"un’infezione"lieve"da"Papillomavirus,"CIN#II#e"CIN#III"(queste"ultime"due"forme"sono"le"più" gravi"in"cui"è"necessario"intervenire."Con"il"Pap5test"è"stato"possibile"ridurre"di"molto"l’insorgenza"di"questo" tumore." " Per"alcune"categorie"di"tumori"è"possibile"effettuare,"oltre"alle"indagini"di"istodiagnostica"e"citodiagnostica," indagini#specifiche:" di"(immuno)istochimica,"utilizzate"dall’anatomopatologo"per"esempio"per"valutare"l’espressione"di" HER2"nei"carcinomi"della"mammella," di" citofluorimetria# (FAX)," per" marcare" specifiche" cellule," ad" esempio" i" linfociti" T5helper," che" pos5 siamo"visualizzare"con"un"anticorpo"fluorescente"contro"CD4"e"con"una"macchina"che"legge"la"fluo5 rescenza"e"traduce"l’indice"di"fluorescenza"in"quantità"di"linfociti"T5helper,"" di" biologia# molecolare," come" la" PCR," che" permette" di" valutare" la" presenza" di" virus," mettendo" in" evidenza" particolari" sequenze" di" DNA" per" esempio" del" Papillomavirus," dell’EBV," dell’HBV" o" dell’HPV."La"PCR"consente"solo"di"verificare"la"presenza"o"assenza"di"un"virus"scelto"a"priori." " Fatta" questa" premessa," dopo" aver" studiato" la" nomenclatura" e" la" classificazione" dei" tumori," studiamo" nel" dettaglio"i"proto5oncogeni,"i"geni"oncosoppressori"e"i"geni"del"riparo"del"DNA"coinvolti"nei"tumori"umani." ! 24" !  4.#NOMENCLATURA#E#CLASSIFICAZIONE#DEI#TUMORI# " NOMENCLATURA# " E’"sempre"stato"complesso"indentificare"un"criterio"per"la"nomenclatura"delle"neoplasie,"vista"la"loro"estre5 ma"eterogeneità:"nella"pratica"clinica"il"criterio"che"si"è"affermato,"per"quanto"molto"limitato,"è"quello"isto? prognostico,"che"tiene"conto"contemporaneamente"del:" criterio#isto?genetico,"ovvero"del"tessuto"da"cui"origina"il"tumore," criterio#prognostico,"ovvero"della"previsione"del"comportamento#biologico"del"tumore." " CRITERIO#PROGNOSTICO# Da"un"punto"di"vista"prognostico"si"parla"di:" neoplasia#benigna,"se"la"proliferazione"cellulare"rimane"circoscritta;"per"esempio"in"una"neoplasia" benigna"dell’epitelio"ghiandolare,"le"cellule"di"solito"tendono"a"formare"una"sorta"di"capsula"fibrosa" dentro" la" quale" sono" racchiuse" e" crescono." La" massa" tumorale" quindi" eventualmente" si" espande," comprimendo"i"tessuti"circostanti,"ma"resta"confinata,"e"se"opportunamente"asportata"(ovvero"sen5 za"rompere"la"capsula"e"includendo"anche"le"aree"vicine"peri5tumorali)"non"dà"recidive:"il"soggetto" guarisce"completamente." Nelle" neoplasie" benigne," da" un" punto" di" vista" morfologico," le" cellule" sono" molto" simili" alle" corri5 spettive"normali;"per"esempio"nel"caso"di"una"neoplasia"benigna"di"una"ghiandola"endocrina,"le"cel5 lule"continuano"comunque"a"produrre"l’ormone,"ma"progressivamente"insorgono"i"sintomi"di"uno" squilibrio"ormonale."In"quest’ultimo"caso"la"neoplasia"è"sintomatica,"ma"in"molti"casi"i"tumori"beni5 gni"sono"asintomatici"ed"è"difficile"individuarli"prima"che"diventino"maligni;" neoplasie#maligne,"se"la"proliferazione"cellulare"è"incontrollata,"c’è"un’invasione"del"tessuto"sano" circostante"e"la"possibilità"di"metastatizzare;"per"esempio"nei"tumori"maligni"dell’epitelio"la"massa" ha"disgregato"la"membrana"basale"e"infiltrato"i"tessuti"sottostanti:"ha"quindi"la"possibilità"di"arrivare" al"sangue,"di"invadere"l’intero"organismo"ed"eventualmente"di"dare"luogo"a"un"tumore"secondario"o" metastasi." " CRITERIO#ISTOGENETICO# Il"criterio#istogenetico"tiene"conto"del"tessuto#di#origine." " Tumori#dei#tessuti#epiteliali# La"maggior"parte"dei"tumori"umani"è"di"origine"epiteliale."Per"i"tumori#benigni#dell’epitelio"si"parla"di:" polipo" (a," b," c)," se" si" osserva" un’escrescenza" a" forma"di"clava"che"origina"5"o"ciondola5"da"una"su5 perficie,"attaccata"a"uno"stelo"più"o"meno"svilup5 pato;"possono"essere"più"o"meno"radicati"e"diver5 samente"vascolarizzati;" papilloma"(d),"se"si"osserva"un’escrescenza"su"una" superficie"epiteliale"con"lunghe"e"sottili"digitazioni" o" papille." Il" papilloma" ha" superficie" maggiore" del" polipo"a"parità"di"volume,"quindi"si"replica"in"mo5 do"più"attivo,"più"frequentemente"progredisce;" verruca,"se"osserviamo"un’escrescenza"sulla"cute.!" ! 25" ! Il"tumore#maligno#dell’epitelio"prende"il"nome"di"epitelioma"o"più"comunemente"carcinoma;"esso"viene"di5 stinto"in:" carcinoma# basocellulare" (basalioma)," se" prende" origine" dalle" cellule" più" profonde," dotate" di" un" maggiore"ritmo"proliferativo,"per"esempio"dalle"cellule"dello"strato"basale"dell’epidermide," carcinoma# spinocellu? lare" (a# cellule# squamo? se)," se" prende" origine" dalle" cellule" degli" strati" più"superficiali.!" Per" quanto" riguarda" i" tumori" degli"epiteli"secretori"(es."cellula" caliciforme" mucipara" intestina5 le," cellula" mucosa" gastrica)," si" parla"di"adenomi"se"il"tumore"è" benigno," di" adenocarcinomi" se" è"maligno.!" " Tumori#dei#tessuti#connettivi# In"ordine"di"frequenza,"dopo"i"carcinomi"vi"sono"i"tumori"dei"tessuti"connettivi,"che"prendono"il"nome"di"sar? comi,"e"che"rappresentano"l’1%"di"tutti"i"tumori."A"seconda"del"tipo"cellulare"del"connettivo"interessato"si" parla"di:" lipoma"o"liposarcoma,"per"indicare"rispettivamente"un"tumore"benigno"e"maligno"del"tessuto#adi? poso,"che"origina"da"un"adipocita;" osteoma"o"osteosarcoma,"per"indicare"rispettivamente"un"tumore"benigno"e"maligno"del"tessuto# osseo;" leiomioma"o"leiomiosarcoma,"per"indicare"rispettivamente"un"tumore"benigno"e"maligno"del"tes? suto#muscolare#liscio;# rabdomioma"o"rabdomiosarcoma,"per"indicare"rispettivamente"un"tumore"benigno"e"maligno"del" tessuto#muscolare#striato;" angioma"o"angiosarcoma,"per"indicare"rispettivamente"un"tumore"benigno"e"maligno"delle"cellule# endoteliali;# condroma"o"condrosarcoma,"per"indicare"rispettivamente"un"tumore"benigno"e"maligno"del"tessu? to#cartilagineo;" fibroma#o"fibrosarcoma,"per"indicare"rispettivamente"un"tumore"benigno"e"maligno"dei"fibroblasti." In"ordine"decrescente"di"frequenza,"anche"se"stanno"nettamente"aumentando"negli"ultimi"anni,"troviamo"i" tumori#dei#tessuti#ematopoietici,"classificabili"in:" leucemie," linfoidi" o" mielodi," se" hanno" origine" da" un" precursore" di" una" cellula" ematopoietica," che" però"si"è"già"differenziato"in"senso"linfoide"o"mieloide"(ma"non"in"B"o"T,"per"esempio);" linfomi,"se"hanno"origine"da"un"linfocita"B"o"T,"quindi"da"cellule"già"differenziate"e"residenti"in"tes5 suti"immunocompetenti,"come"le"placche"di"Peyer"a"livello"intestinale,"il"MALT"o"un"linfonodo:"sono" tumori"solidi."Genericamente,"i"linfomi"possono"essere"suddivisi"in"due"grosse"categorie:"il"linfoma# di#Hodgkins,"che"di"solito"ha"un"decorso"migliore,"e"i"linfomi#non#Hodgkins;" eritro?leucemie,"se"originano"dal"precursore"dell’eritrocita;" ! 26" !  mieloma#multiplo,"se"origina"dalle"plasmacellule,"quindi"linfociti"B"già"differenziati"secernenti"anti5 corpi;"in"un"paziente"con"questo"tumore"è"evidenziabile,"all’elettroforesi"delle"proteine"del"siero"un" picco#γ"che"può"addirittura"essere"più"alto"di"quello"dell’albumina"(picco"α)." In"alcune"forme"di"mieloma"multiplo,"l’assemblaggio"delle"immunoglobuline"non"avviene"corretta5 mente"e"vengono"prodotte"delle"particolari"catene"leggere,"che"prendono"il"nome"proteine#di#Ben? ce?Jones:"esse"passano"attraverso"la"barriera"di"filtrazione"e"vengono"riassorbite"solo"in"parte,"si"ri5 trovano"quindi"anche"nelle"urine,"e"se"precipitano"possono"determinare"l’insorgenza"di"alcune"for5 me"di"amiloidosi." In"ordine"decrescente"di"frequenza,"troviamo"poi"i"tumori# del# sistema# melanoforo"ovvero"dei"melanociti:" quelli"benigni"sono"i"classici"nei"o"nevi,"quelli"maligni"prendono"il"nome"di"melanomi." " Tumori#di#origine#embrionale# I"tumori"di"origine"embrionale"originano"da"cellule"fisiologicamente"assenti"nel"soggetto:" se"originano"dal"trofoblasto"si"parla"di"corionepitelioma"e"mola#vescicolare;" se"originano"da"cellule#embrionali#pluripotenti"si"parla"di"teratomi#(dal"greco"tèras,(tèratos,"“mo5 stro”)." I" teratomi" si" possono" sviluppare" in" tutti" i" distretti" (spesso" si" sviluppano" a" livello" ovarico)" e" presentano"una"citoarchitettura"disorganizzata,"con"molte"cellule"indifferenziate"e"cellule"differen5 ziate"molto"diverse"le"une"dalle"altre." " Tumori#del#sistema#nervoso# A"seconda"della"cellula"colpita"si"parla"di:" glioblastoma,# astrocitoma,# meningioma,# Schwannoma,# retinoblastoma,# ependimoma,# oligodendrocitoma.# " Altri"tumori"sono"invece"eponimi,"ovvero"hanno"il"nome"dello"scienziato"che"li"ha"studiati:"è"il"caso"del"lin5 foma"di"Hodgkin,"del"sarcoma"di"Ewing"o"del"tumore"di"Wilms." " Il"criterio"istogenetico"a"volte"è"sopraffatto"da"una"nomenclatura# tradizionale,"difficile"da"sradicare:"basti" pensare"che"nella"pratica"clinica"alcuni"tumori"sono"indicati"col"nome"di"derivazione"dell’organo"e"non"del" tessuto"di"origine,"come"l’epatoma,"il"timoma"o"l’APUDoma"(tumore"delle"cellule"del"sistema"APUD)." " Il"limite"del"criterio"istogenetico"è"che"esso"non"tiene"conto"del"percorso#de?differenziativo,"caratteristico" della"cellula"tumorale,"quindi"del"foglietto"embrionale"da"cui"originano"le"cellule"in"cui"si"sviluppa"il"tumore." " In"alcuni"casi"il"tumore"è"talmente"indifferenziato"che"l’anatomopatologo"non"riesce"a"individuare"il"tessuto" di" origine" e" utilizza" il" termine" generico" di" tumore# anaplastico;" comunque" in" questi" casi" utilizza" marcatori" molecolari"specifici,"per"esempio"anticorpi"contro"la"cheratina,"per"identificare"cellule"di"origine"epidermica," o"contro"la"vimentina"o"la"desmina,"per"identificare"cellule"di"origine"mesenchimale."" " " ! 27" !  CLASSIFICAZIONE# " Il"criterio"prognostico"è"fondamentale"per"la"classificazione#dei#tumori,"che"consiste"nella"loro"stadiazione" e"gradazione." " STADIAZIONE# Per"la"stadiazione#TNM"di"un"tumore"si"utilizza,"nella"pratica"clinica,"un"codice"alfanumerico"con"tre"lettere:" la"lettera#T"indica"l’estensione#del#tumore#primitivo,"ovvero"le"sue"dimensioni"e"la"sua"infiltrazione" del"tessuto"sottostante,"ed"è"seguita"da"un"numero"che"va"da"1"a"4"(un"T1"è"meno"esteso"di"un"T4);" se"è"presente"la"sigla"TX"vuol"dire"che"non"si"sta"studiando"il"tumore"primario"ma"per"esempio"una" metastasi;" la"lettera#N"indica"lo"stato#dei#linfonodi#regionali"e,"per"i"tumori"di"alcune"regioni,"quello"dei"linfo5 nodi"iuxta5regionali;"per"esempio"N6/10"vuol"dire"che"dei"10"linfonodi"asportati"e"analizzati,"6"pre5 sentano"al"loro"interno"cellule"tumorali"infiltrate;" la"lettera#M"indica"l’assenza"o"la"presenza"di"metastasi."Se"per"esempio"leggete"TX"MPol"si"sta"par5 lando"di"una"metastasi"polmonare,"o"TX"MKid"di"una"metastasi"al"rene." Davanti"alla"stadiazione"TNM"può"essere"presente"un’altra"lettera"minuscola"che"indica"chi"ha"eseguito"la" stadiazione:" pTNM,"se"il"tumore"è"stato"stadiato"dall’anatomopatologo," cTNM,"se"il"tumore"è"stato"stadiato"dal"chirurgo"in"sala"operatoria," aTNM,"se"il"tumore"è"stato"stadiato"dal"medico#legale"in"sede"autoptica," yTNM,"se"il"tumore"è"stato"stadiato"dopo"un"trattamento#terapeutico"o"chemioterapico," rTNM," se" il" tumore" che" è" stato" stadiato" è" una"recidiva" (ovvero" un" tumore" che" si" ripresenta" nella" stessa"sede)" mTNM,"se"il"tumore"che"è"stato"stadiato"è"un"tumore#multiplo." "" GRADAZIONE# La"gradazione"indica"il"grado#di#differenziazione#dei#tumori,"ovvero"quanto"la"cellula"tumorale"sia"simile"a" quella"da"cui"il"tumore"ha"preso"origine."La"prognosi"peggiora"se"il"tumore"de5differenzia,"quindi"se"presenta" un"grado"di"differenziazione"sempre"minore."La"classificazione"del"grading"è"la"seguente:" G1,"tumore"con"grado"di"differenziazione"elevato," G2,"tumore"con"grado"di"differenziazione"medio," G3,"tumore"con"grado"di"differenziazione"basso," G4,"tumore"indifferenziato," Gx,"tumore"con"grado"di"differenziazione"non#definibile." " Questi"sono"i"criteri"di"classificazione"di"tutti"i"tumori" utilizzati"nella"pratica"clinica,"con"la"consapevolezza" però"che"ogni"tumore,"in"base"ai"geni"mutati,"è"un’entità"a"sé"stante"con"un"proprio"comportamento"biolo5 gico." " # # ! 28" !  5.#ONCOGENI#NEI#TUMORI#UMANI# " Gli"oncogeni"implicati"in"tumori#ereditari"umani"sono"due:"RET,"la"cui"mutazione"predispone"alla"Neoplasia" Endocrina"Multipla"(MEN)"di"tipo"2,"e"MET,"la"cui"mutazione"predispone"al"carcinoma"papillare"del"rene." " L’ONCOGENE#RET#E#I#TUMORI#UMANI# " Una"mutazione"all’oncogene#RET#predispone"maggiormente"allo"sviluppo"di"tumori"alla"tiroide;"ma"esso"è" presente"nella"forma"mutata"in"molti"altri"tumori." RET"è"stato"scoperto"con"un"esperimento"di"trasfezione:"è"stato"estratto"il"DNA"da"cellule"di"un"linfoma"T,"è" stato"trasfettato"il"DNA"in"fibroblasti"murini,"si"sono"formati"infine"dei"foci"nelle"cui"cellule"è"stato"messo"in" evidenza"questo"gene." La"sigla"RET"sta"per"rearranged(during(transfection,"ovvero"“ricombinato"durante"la"trasfezione”,"perché"si" pensava"che"la"traslocazione"cromosomica,"che"determina"la"sua"mutazione"e"attivazione,"fosse"avvenuta" durante"la"trasfezione." " FUNZIONE#FISIOLOGICA#DI#RET# RET" è" un" recettore# tirosinchinasico" presente" in" 3# isoforme," differenti" solo" per" gli" aminoacidi" C5terminali:" RET9," RET43" e" RET51"(il"numero"corrisponde"agli"AA"presenti"nella"porzione" C5terminale);"le"isoforme"9"e"51"sono"le"più"frequenti." In" queste" porzioni" C5terminali" sono" presenti" le" tirosine" che" vengono"fosforilate,"quindi"RET"9"che"ha"meno"tirosine"ingag5 gia"meno"trasduttori." La"funzione"di"RET"è"stata"messa"in"evidenza"in"topi"knock5out:" ha" un" ruolo" nello" sviluppo# del# Sistema# Nervoso# Enterico" dell’ultimo" tratto" del" colon" e" nello" sviluppo# renale." E" nell’uomo," la" delezione" del" gene" RET" a" livello" germinale" de5 termina" l’insorgenza" del" megacolon# congenito" o" malattia# di# Hirschsprung,"caratterizzata"dall’assenza,"nel"sigma"e"nel"ret5 to," del" plesso" mioenterico" e" del" plesso" sottomucoso," che" so5 stengono" la" peristalsi" intestinale," e," di" conseguenza," la" riten5 zione" del" chilo" nel" tratto" a" monte" rispetto" quello" alterato," le" cui" pareti" si" dilatano" (da" qui" il" nome" della" malattia)." Questa" malattia"è"curabile"e,"se"diagnosticata"in"tempo,"scarsamente" mortale.!" RET"è"un"recettore"tirosinchinasico"che"lega"4"differenti"fattori" di"crescita,"appartenenti"alla"famiglia"dei"fattori#neurotrofici#di#derivazione#gliale"(GDNF)."Il"riconoscimento" del"ligando"da"parte"di"RET"avviene"“a"staffetta”"(come"per"il"TLR4):"il"ligando"non"si"lega"direttamente"al"re5 cettore," ma" a" un" co?recettore" appartenente" alla" famiglia" del" GFR?α" (Growth" Factor" Receptor5alfa)," che" è" ancorato"al"foglietto"esterno"della"membrana"per"mezzo"di"una"molecola"di"GPI"(glicosil5fosfaditil5inositolo);" è"il"co5recettore"che"presenta"il"ligando,"dopo"averlo"riconosciuto,"a"RET,"che"oligomerizza,"si"transfosforila" su"specifici"residui"tirosinici"(alcune"fosforilazioni,"su"Y900"e"Y905,"aumentano"l’attività"enzimatica,"altre"in5 vece"servono"a"reclutare"molecole"con"domini"SH2)"e"attiva"la"trasduzione#del#segnale"intracellulare." " ! 29" ! ALTERAZIONI#DI#RET# Le" alterazioni" del" proto5oncogene" RET" si" riscontrano" in" diverse" patologie" umane," soprattutto" nei" tumori" della"tiroide,"come:" il"carcinoma#midollare#(MTC,"nel"5510%"dei"casi),"che"colpisce"le"cellule"C;"in"questo"caso"la"muta5 zione"predisponente"è"una"mutazione# puntiforme"di"RET,"in"quanto"RET"è"normalmente"espresso" nelle"cellule"C;" i"carcinomi#follicolare"(FTC,"10%)#o#papillare#(PTC,"70580%),"che"colpiscono"i"tireociti;"in"questo"ca5 so"sono"le"traslocazioni#cromosomiche"a"rappresentare"la"mutazione"predisponente,"in"quanto"RET" non" è" espresso"nei" tireociti" e" può" essere" coinvolto" in" un" tumore" di" queste" cellule" solo" se" subisce" una"traslocazione"e"va"sotto"il"controllo"di"un"altro"promotore." " I" carcinomi# midollari" della" tiroide" sono" sporadici" nel" 75%" dei" casi" ed" ereditari" nel" restante" 25%." In" quest’ultimo"caso"è"sufficiente"ereditare"la"mutazione"di"RET"in"eterozigosi"per"avere"la"predisposizione:"oc5 corre" una" mutazione" puntiforme" con" guadagno" di" funzione." La" forma" ereditaria" del" carcinoma" midollare" della"tiroide"prende"il"nome"di"MEN2,"che"sta"per"Neoplasia"Endocrina"Multipla:"è"un"tumore"che"colpisce" contemporaneamente"più"ghiandole"endocrine;"in"generale,"conosciamo"due"tipi"di"MEN:" MEN#di#tipo#1,"correlata"con"un"oncosoppressore,"e"in"cui"sono"colpiti"il"pancreas,"l’adenoipofisi"e" le"paratiroidi"(le"“3P”:"pancreas,"pituitaria,"paratiroidi);" MEN#di#tipo#2,"in"cui"è"coinvolto"il"gene"RET"e"che"colpisce"le"paratiroidi,"le"cellule#C#della#tiroide"e" la"midollare#del#surrene"(il"termine"con"cui"si"indica"il"tumore"della"midollare"del"surrene"è"feocro? mocitoma)." In" questa" patologia" le" alterazioni" a" questi" tre" organi" non" insorgono" contemporanea5 mente,"inizialmente"è"solo"un"organo"a"essere"alterato;"per"questo"motivo,"a"un"paziente"con"can5 cro" alla" midollare" del" surrene" vengono" monitorate" anche" le" altre" due" ghiandole," per" escludere" o" meno"un"MEN"di"tipo"2." A"sua"volta,"la"MEN"di"tipo"2"si"divide"in"3#forme,"accomunate"dalla"presenza"del"carcinoma"midolla5 re"della"tiroide,"esse"sono:" o FMTC"(carcinoma"midollare"della"tiroide"di"tipo"familiare),"in"cui"si"sviluppa"solo"il"tumore"alla" tiroide;"in"questa"forma"RET"viene"spesso"attivato"da"una"mutazione"nella"porzione"extracellu5 lare"del"recettore;" o MEN#2A,"caratterizzata"da"tumore"a"tutti"e"tre"gli"organi;"in"questa"forma"RET"viene"attivato"da" una"mutazione"nella"porzione"extracellulare"del"recettore;" o MEN# 2B," caratterizzata" da" tumore" alla" tiroide," feocromocitoma" e" possibilità" di" formare" dei" ganglioneuromi;" il" paziente" presenta" un" aspetto" marfanoide" (alto," con" gli" arti" più" lunghi" del" normale)."In"questa"forma"RET"viene"attivato"da"una"mutazione"nella"porzione"intracellulare"ad" attività"chinasica"del"recettore." La"mutazione"puntiforme"nella"porzione#ex? tracellulare," caratteristica" di" MEN" 2A" e" di" FMTC,"interessa"le"cisteine."RET,"come"molti" altri"recettori,"ha"nel"dominio"extracellulare" cisteine" che" formano" ponti" disolfuro," im5 portanti"nel"conferire"alla"proteina"la"strut5 tura" terziaria" fondamentale" per" interagire" con" il" ligando;" una" mutazione" missenso" a" carico"di"un"codone"che"codifica"per"una"ci5 steina,"fa"sì"che"l’altra"cisteina"presente"nel" ! 30" ! recettore,"che"avrebbe"dovuto"fare"con"essa"un"ponte"disolfuro"intramolecolare,"formi"un"ponte"disolfuro" intermolecolare"con"una"cisteina"del"recettore"adiacente:"si"forma"così"un"dimero"e,"di"conseguenza,"il"re5 cettore"è"sempre"attivo"e"la"cellula"acquisisce"un"vantaggio"proliferativo."Un’analoga"attivazione"può"essere" causata," ma" meno" frequentemente," da" una" mutazione" che" determina" la" sosti? tuzione" di" un" qualsiasi" amminoacido" con"una"cisteina,"quindi"da"una"cisteina" in" più" (nell’immagine" le" mutazioni" con" guadagno"di"funzione"di"RET;"una"è"sta5 ta"individuata"nel"nostro"laboratorio).!" In" questo" caso" è" stato" quindi" possibile" correlare" il" tumore" con" il" genotipo:" in5 fatti" mutazioni" puntiformi" germinali" di" RET"sono"presenti:" nel"95%"delle"famiglie"in"cui"è"presente"la"MEN#2B,"a"livello"della"porzione"chinasica;"ciò"permette"ai" soggetti"appartenenti"a"queste"famiglie"di"essere"monitorati"con"un"semplice"test"di"biologia"mole5 colare," nel"98%"delle"famiglie"in"cui"è"presente"la"MEN#2A,"a"livello"delle"cisteine"della"porzione"extracellu5 lare,"che"sono"state"mappate;"la"mutazione"che"determina"la"forma"più"grave"è"la"sostituzione"della" cisteina#634"con"la"tirosina," nell’88%"delle"famiglie"in"cui"è"presente"la"FMTC." Mutazioni"in"RET"sono"presenti"nel"60%"di"MTC"sporadici." " Nel"20%"dei"casi"di"carcinoma# papillare"della"tiroide"si"riscontrano"traslocazioni# cromosomiche"che"coin5 volgono"RET;"esse"portano,"in"assenza"di"frame5shift,"alla"formazione"di"un"gene"chimerico"formato"da"un" frammento"proveniente"da"un"cromosoma"contenente"le"informazioni"di"un"gene"qualsiasi"(gene"partner)"e" da"un"frammento"del"cromosoma#10"con"le"informazioni"del"gene"RET."Questo"gene,"che"prende"il"nome"di" RET?PTC,"ha"le"seguenti"caratteristiche:" viene"espresso# nei# tireociti,"dove"RET"non"è"fisiologicamente"espresso,"perché"è"sotto"il"controllo" del"promotore"del"gene"partner,"che"è"invece"espresso;" in" esso" non" è" presente" la" porzione" extracellulare" né"quella"transmembranaria"di"RET"ma"è"presente" quella"chinasica,"la"proteina"chimerica"è"quindi"lo5 calizzata"nel"citosol,"dove"fosforila"molti"substrati" senza"alcun"tipo"di"regolazione;" la"porzione# N?terminale"della"proteina,"codificata" dal"gene"partner,"presenta"un"dominio"Coiled?coil" di"dimerizzazione,"che"garantisce"l’attivazione"del5 la"proteina"all’interno"della"cellula." In"sintesi,"questo"gene"chimerico"codifica"per"una"chinasi" costitutivamente"attiva"che"conferisce"alla"cellula"un"van5 taggio"proliferativo." Le"due"traslocazioni"più"frequenti"sono"quelle"che"portano" alla"formazione"dei"geni"chimerici"RET?PTC1"e"RET?PTC3,"i" cui" geni" partner" sono" rispettivamente" l’istone" H4" e" RFG;" ! 31" ! sapendo"che"ogni"cromosoma,"a"seconda"della"fase"del"ciclo"cellulare"e"del"tipo"cellulare,"occupa"una"posi5 zione"ben"precisa"nel"nucleo,"si"è"visto"che"nei"tireociti"i"geni"partner"PTC1"e"PTC3"si"trovano"molto"vicini"al" cromosoma"10"dove"c’è"RET." Evidenze"sperimentali"indicano"che"i"riarrangiamenti"RET5PTC"rappresentano"un"evento#precoce"nella"car5 cinogenesi"tiroidea:"vi"è"infatti"un"elevata"presenza"di"questi"riarrangiamenti"nei"microcarcinomi;"inoltre"si" è"visto"che"inserendo"in"un"genoma"murino"RET5PTC3"sotto"il"promotore"della"tireoglobulina,"il"topo"svilup5 pa"subito"un"tumore"con"un"quadro"molto"simile"a"quello"dell’uomo." I"riarrangiamenti"cromosomici"di"RET,"soprattutto"di"RET5PTC3,"possono"essere"determinati"da"forti"radia? zioni# ionizzanti:"un"esempio"è"il"disastro# di# Chernobyl,"che"ha"causato"un"aumento"vertiginoso"della"fre5 quenza"di"carcinomi"papillari"della"tiroide"nei"bambini"di"Bielorussia"e"Ucraina;"queste"radiazioni"infatti"col5 piscono"il"nucleo"danneggiando"i"cromosomi"oggetto"di"ricombinazione,"che"sono"vicini"soprattutto"in"inter5 fase:"i"cromosomi"si"rompono"e,"se"i"sistemi"di"riparo"intervengono"in"maniera"sbagliata,"si"ha"il"riarrangia5 mento." " L’ONCOGENE#MET#E#I#TUMORI#UMANI# " MET" è" un" oncogene" che" nella" forma" wild5tipe" codifica" per" il" recettore# del# fattore#di#crescita#epatocitico"(HGF5R);"è"un"recettore"tirosinchinasico.!" L’HGF,"anche"chiamato(scatter(factor((fattore"di"dispersione),"è"sia"mitoge? nico,"perché"stimola"la"proliferazione,"sia"motogenico,"perché"stimola"il"mo5 vimento"chemiotassico:"è"un"movimento"particolare,"che"gli"vale"il"nome"di" scatter(factor,"perché"in"sua"presenza"la"cellula"si"disperde"emettendo"pro5 paggini"(questo"sarà"importante"per"l’invasione)." " " Un’attivazione" di" questo" gene," oltre" a" essere" significativa" nel" processo" di" invasione" (contestualmente" all’espressione"di"metallo5proteasi),"causata"da"mutazioni"germinali"con"guadagno"di"funzione,"può"deter5 minare"un"tumore"a"substrato"ereditario:"il"carcinoma#papillare#ereditario#delle#cellule#renali"(HPRCC);"chi" ha"ereditato"questa"mutazione"è"più"predisposto"a"sviluppare"tumori#multipli#in#entrambi#i#reni." In"alcuni"casi"si"è"visto"che"il"tumore"può"essere"determinato"da"un’amplificazione#genica"(trisomia)"di"MET." " " L’ONCOGENE#KIT#E#I#TUMORI#UMANI# " Un"altro"oncogene"importante"nei"tumori"umani"è"KIT,"identificato"in"un"virus"che"determinava"l’insorgenza" di"un"sarcoma"nei"felini"(il"sarcoma"felino"di"Hardy5Zuckerman)."Successivamente"è"stata"trovata"la"contro5 parte"cellulare"normale,"C5KIT,"che"codifica"per"un"recettore#tirosinchinasico." ! 32" ! Tale"recettore"è"infatti"formato"nel"segmento"extracellu5 lare"da"un"dominio"che"riconosce"il"ligando"e"un"dominio" di" dimerizzazione," e" nel" segmento" intracellulare" dai" do5 mini"chinasici"e"da"un"dominio# regolatorio"(situato"nella" porzione"iuxta5membranaria).!" Il" ligando" di" C5KIT" è" SCF" (fattore" delle" cellule" staminali)," anche" indicato" in" letteratura" come" CD117;" il" complesso" ligando5recettore" svolge" un" ruolo" molto" importante" nel" differenziamento"e"nella"proliferazione"di"vari"tipi"cellula5 ri,"quali"cellule#staminali#ematopoietiche,"mastociti,"me? lanociti,"cellule#pacemaker#intestinali"(che"controllano"la" peristalsi)." Si"è"visto"che"forme"mutate"con"guadagno"di"funzione"di" C5KIT"sono"state"descritte"in"diversi"tipi"di"tumore,"in"par5 ticolare:" nel"90%"dei"mastocitomi," in" più" del" 70%" dei" GIST" (tumori" stromali" gastro5 intestinali)," nel"17%"dei"linfomi#T," nel"9%"dei"seminomi/disgerminomi," nell’1%"delle"leucemie#mieloidi#acute." " FUNZIONE#FISIOLOGICA#DI#KIT# In" assenza" del" ligando," la" porzione# catalitica# di# KIT" (in" viola" nell’immagine)"ha"una"doppia"inibizione:"il"primo"ostacolo"è"rappresen5 tato" dal" dominio# regolatorio" situato" in" posizione" iuxta5membraria" (in" giallo)" che" lo" tiene" praticamente" chiuso," il" secondo" ostacolo" è" rappre5 sentato"da"un"loop#di#attivazione"(in"verde),"in"cui"è"presente"una"tiro? sina"critica"per"l’attività"enzimatica"del"recettore"stesso." In" presenza" del" ligando," C5KIT" subisce" un" cambio" conformazionale," di5 merizza"e"si"verifica"una"trans5fosforilazione# delle"tirosine"del# dominio# iuxta?membranario," prima," e" del" loop# di# attivazione," poi," con" conse5 guente"cessazione"della"loro"attività"inibitoria:"si"smaschera"così"il"domi5 nio"chinasico,"che"è"in"grado"di"transfosforilare"completamente"il"recet5 tore,"che"entra"in"completa"attività." " " " ! 33" ! ALTERAZIONI#DI#KIT# Le"mutazioni"di"KIT"con"guadagno"di"funzione"sono"riscontrabili"nel"dominio#iuxta?membranario"e"nel"do? minio#di#dimerizzazione,"in"particolar"modo"nei"GIST"(v."fig."pag."precedente);"ci"possono"essere"mutazioni" con"guadagno"di"funzione"anche"nel"dominio"chinasico,"che"rendono"il"recettore"sempre"attivo"in