Cours de Microbiologie : Les Mycobactéries PDF

Les Mycobactéries Faculté de médecine Département de pharmacie Cours de Microbiologie Dr S.ZOUAGUI  I- Généralités - Classification Ordre : Actinomycétale Famille : Mycobactériaceae Genre : Mycobacterium Espèces : M. tuberculosis M. bovis M. Africanum M. lepra...

Les Mycobactéries Faculté de médecine Département de pharmacie Cours de Microbiologie Dr S.ZOUAGUI  I- Généralités - Classification Ordre : Actinomycétale Famille : Mycobactériaceae Genre : Mycobacterium Espèces : M. tuberculosis M. bovis M. Africanum M. leprae Ce sont des bacilles capables de conserver la coloration malgré l’action combinée de l’alcool et des acides dilués : ce sont des Bacilles Acido – Alcoolo - Résistants = B.A.A.R Aérobies strictes ou microaérophiles immobiles Non ramifiés, non sporulés, à paroi riche en lipides. II- Mycobacterium tuberculosis : Parasite strict de l’homme. M. tuberculosis: Agent principal de la tuberculose humaine Découvert en 1882 par Robert Koch: Bacille de Koch (BK) La tuberculose humaine peut être due: M. bovis M. Africanum « La symptomatologie clinique est identique » Seule l’identification biochimique précise les différencie 1- Caractères bactériologiques : 1-1- Morphologie : M. tuberculosis est un bacille fin, légèrement incurvé de 2 à 5 µm de long sur 0,2 à 0,3 µm de large à extrémités arrondies. Il est immobile – acapsulé – asporulé.----les trois a Se colore mal par les colorants habituels. Après coloration de Ziehl – Neelsen : coloration par la fushine phéniquée à chaud, le bacille se colore en rose et n’est pas décoloré par l’action combinée des acides dilués et de l’alcool. Il est : Acido Alcoolo Résistant. Coloré à l’auramine phéniquée, il devient fluorescent sous lumière U.V. Dans les produits pathologiques : Il se présente isolé ou en petits amas. Farida Hamdad, Juillet 2007  La paroi des Mycobacteriaceae Au ME, la paroi est épaisse de 10 à 20 nm et apparaît constituée de 4 couches différentes: * PG (peptidoglycane) * 2 couches internes qui contiennent des éléments ayant l’apparence de cordages de + en + enchevêtrés * Couche externe qui est faite d’éléments enrubannées Dr G. PAUL (Faculté de Médecine COCHIN-PORT- ROYAL, Université PARIS V)(28.02.04).  La paroi des Mycobacteriaceae ∙ Le squelette de la paroi est composé de peptidoglycane relié de façon covalente à un hétéroside, l’arabinogalactane, lui-même estérifié par des acides mycoliques, acides gras particuliers à très longue chaîne (76 à 90 atomes de C, α ramifiés) qui rendent la paroi relativement imperméable au colorant d’où l’intérêt d’utiliser des colorants concentrés et on renforce leur action par chauffage et résistent à l’action décolorante des acides et de l’alcool, c’est pourquoi on les appelle des bacilles acido-alcoolo-résistants (B.A.A.R : coloration de ziehl neelsen).  1-2- Caractères culturaux : C’est un germe exigent Croissance lente, se divise toutes les 20H. Aérobie- stricte T°op =35° - 37° PH op= 6,7 Il ne pousse que sur des milieux contenant : sérum, glycérine, pomme de terre glycérinée, œuf ou Albumine bovine. 3 Catégories de milieux : Milieux liquides : Milieu Sauton : employé pour la production du BCG et la préparation de la tuberculine. Milieu de Youmans. Milieu de Dubos. Milieu de Middelbrouk = 7H9  Milieux solides : Milieu de Middelbrouk = 7H10 et 7H11. Milieux solide à l’œuf : Milieu Löwenstein – Jensen (L.J) : contient des sels minéraux, de l’asparagine, de la glycérine, du vert malachite et de l’œuf. Il est solidifié par coagulation à 85°c pendant 50 mn. On y obtient des colonies au bout de 2 à 3 semaines : elles sont petites, transparents et lisses puis elles prennent un aspect sec, variqueux, en chou-fleur de couleur crème beige. Elles sont dites eugoniques. Milieu OGAWA. Pr Emmanuelle Cambau.Laboratoire associé du centre National de Référence des Mycobactéries et résistance des mycobactéries aux antituberculeux Groupe Hospitalier Saint Louis-Lariboisière-Fernand Widal, AP-HP Université Paris Diderot  1-3- Caractères biochimiques : Mycobacterium tuberculosis : a une Catalase thermosensible (+) à 20°C et(-) à 68°C produit sans l’utiliser une quantité importante d’acide nicotinique ou niacine d’où : le Niacine test = Test de konno (1956). L’accumulation de niacine est révélée par l’addition de l’aniline et du bromure de cyanogène sur une culture âgée. possède une Nitrate réductase. est résistant au T.C.H = hydrazide de l’acide thiophène – 2 Carboxylique. est sensible au P.N.B = Acide para-nitro-benzoïque. est sensible au pyrazinamide. 1-4- Action des agents chimiques et physiques : Mycobacterium tuberculosis est : Sensible à la chaleur – à la lumière solaire – aux Rayons X – Rayons δ – Rayons UV – Alcool à 70°. Résistant au froid (+) 4°C (-) 70°C, aux désinfectants chimiques, H2SO4 – NaOH (d’où les procédés de décontamination des prélèvements). 2- Physiopathologie : 2.1. Pouvoir pathogène naturel : La transmission est aérienne. L’agent principal de transmission est le malade tuberculeux avec caverne pulmonaire (cavité située dans le tissu pulmonaire et formée à la suite d'une maladie des poumons (notamment la tuberculose). 1- Tuberculose pulmonaire: * Tuberculose du jeune enfant: Miliaire +++ * Tuberculose de l’enfant: - 3-5 ans: Svt asymptomatique - Rarement, les signes cliniques se limitent à une atteinte modérée de l’état général * Tuberculose de l’adulte: Signes cliniques: Toux + ou – productive, fièvre, asthénie, amaigrissement. L’hémoptysie est rare CAVERNES Dr Nicolas Veziris Laboratoire de Bactériologie-Hygiène CNR des Mycobactéries et de la Résistance des Mycobactéries aux Antituberculeux Pitié-Salpêtrière  2- Physiopathologie : 2.1. Pouvoir pathogène naturel : La tuberculose miliaire est une forme d'infection tuberculeuse pulmonaire qui résulte de la diffusion de l'infection par une veine pulmonaire. Une fois que les bactéries atteignent les cavités gauches du cœur et pénètrent dans la circulation systémique, il peut en résulter un ensemencement de différents organes tels que le foie et la rate. Sinon, les bactéries peuvent pénétrer dans un ou plusieurs ganglions lymphatiques, drainées dans une veine systémique et finalement atteindre les cavités droites du cœur. À partir du cœur droit, les bactéries peuvent ensemencer ou ré-ensemencent dans certains cas les poumons, provoquant la « miliaire » sus mentionnée. 2- Les manifestations extra-pulmonaires: Méningites tuberculeuses: mauvais pronostic !! Tuberculose ostéo-articulaire: Dans 50%, la localisation est vertébrale (mal de pott= atteinte lombaire). Tuberculose uro-génitale: Atteintes des reins et les signes cliniques se résument à une dysurie et hématurie. Tuberculose des séreuses: Pleurésie, Péricardite, Péritonite. * Autres localisations: Adénites périphériques (cervicale ou claviculaire) 2-2- Physiopathologie : Le pouvoir pathogène de Mycobacterium tuberculosis est fonction de sa seule virulence (capacité du bacille à survivre à l’intérieur des macrophages et de s’y multiplier.). Epidémiologie (1) OMS: La tuberculose est l’une des 10 premières causes de mortalité dans le monde. En 2016: 10,4 millions de personnes ont contracté cette maladie 1,7 million en sont mortes (dont 0,4 million ayant aussi le VIH). Plus de 95% des décès dus à la tuberculose surviennent dans les pays à revenu faible ou intermédiaire. Sept pays totalisent 64% des cas, l’Inde en tête, l’Indonésie, la Chine, les Philippines, Nigéria, Pakistan et l’Afrique du Sud. 1 million d’enfants ont développé la tuberculose et 250 000 en sont morts (à l’exclusion de ceux ayant le VIH). La tuberculose est le premier facteur de mortalité chez personnes VIH-positives: en 2016, 40% des décès de séropositifs ont été dus à la tuberculose. Epidémiologie (2) La tuberculose multirésistante demeure une crise de santé publique et une menace pour la sécurité sanitaire. L’OMS estime à 600 000 le nombre de nouveaux cas présentant une résistance à la rifampicine dont 490 000 sont des cas de tuberculose multirésistante. À l’échelle mondiale, l’incidence de la tuberculose baisse d’environ 2% par an. On estime que le diagnostic et le traitement de la tuberculose ont permis de sauver 53 millions de vies entre 2000 et 2016. Mettre un terme à l’épidémie de tuberculose d’ici à 2030 fait partie des cibles pour la santé indiquées dans les objectifs de développement durable adoptés en 2015. Facteurs de risque ▪ Dénutrition ▪ Alcoolisme ▪ Immunodépression (maladie (SIDA), traitement,) ▪ Contact répétés avec un tuberculeux ▪ Séjours en forte zone d’endémie 3-Diagnostic : 3-1- Prélèvement : - d’origine pulmonaire : Crachats Tubage gastrique. Aspiration ou lavage bronchique. - d’origine extra-pulmonaire : ✔Contaminés : 1ères urines du matin Pus d’abcès fistulisés ✔Non contaminés : L.C.R liquide pleural liquide péritonéal Biopsie épanchement articulaire.  3-2- Examen microscopique : Réalisation du frottis : Le frottis est réalisé à partir des parties muco-purulentes du prélèvement sur une lame dégraissée affectée du N° d’ordre correspondant au nom du malade. 2cm ∙ Sécher ∙ Fixer à la flamme 1cm  Réalisation de la coloration de Ziehl – Neelsen : Coloration avec de la Fushine phéniquée à chaud : 3mn 3mn 3mn Rincer Décoloration avec H2 SO4 à 25% pendant 3mn et alcool 90° pendant 5mn Rincer Contre coloration avec du bleu de méthylène pendant 30 sec Rincer sécher Observer au microscope à l’immersion (objectif x 100) : L’examen microscopique révèle la présence de B.A.A.R (bacilles roses sur fond bleu). La lecture est codifiée et standardisée : lire en créneau : L’ union internationale contre la tuberculose et les maladies respiratoires (IUATLD) recommande le système de classification des lames (compte de BAAR): PAS DE BAAR Absence de BAAR 1 à 9 BAAR / 100 champs Noter le nombre exact 10 à 99 BAAR/ 100 champs 1+ 1 à 10 BAAR/ champs 2+ > 10 BAAR/ champs 3+  3-3- Mise en culture : Les prélèvements non contaminés sont ensemencés directement sur L.J. Les prélèvements contaminés subissent une décontamination : Plusieurs méthodes : Méthode de Petroff : soude (NaOH) seule à 4%. Méthode de Tacquet et Tison : Lauryl – sulfate et soude à 1%. Méthode de Kubica : N acétyle – L – cystéine + soude. Méthode de Hohn – Löwenstein : H2 SO4 à 4 ou 6% (urines- Pus divers). Après décontamination, centrifuger ; le culot est ensemencé sur milieux L.J (2 à 6 tubes) et incubés horizontalement à 37°C pendant 28 jours. Lecture au : 4éme jour pour déceler les souillures ou les Mycobactéries atypiques à Croissance rapide 28éme jour : Si colonies eugoniques en chou-fleur 🡲 identifier. Si culture Θ🡲 réincuber jusqu’au 42éme jour : Si colonies eugoniques en chou-fleur 🡲 identifier. Si culture Θ🡲 réincuber jusqu’au 72éme jour : Si colonies eugoniques en chou-fleur 🡲 identifier. Si culture Θ🡲 Rendre : Culture négative (-) Les résultats de la culture doivent être qualitatifs et quantitatifs. Si : Nombre de colonies < 100 🡲 + Nombre > 100 et < 200 🡲 + + Nombre > 200 🡲 + + + Si nappe 🡲 culture confluente. 3-4- Identification biochimique : Coloration de Z.N 🡲 BAAR. Catalase (+) à 22°C (-) à 68°C NR+ Niacine test +. Identification par les méthodes de Biologie Moléculaire ❖Hybridation avec une sonde nucléique complémentaire de l’ARN 16S du Complexe tuberculosis, couplée à un ester d’acridinium(Accuprobe®, GenProbe) ❖Inno-LiPA Mycobacteria (Innogenectics): Les produits d’amplification obtenus par PCR de la région codant l’espace intergénique 16-23S sont hybridés à des sondes d’ADN complémentaires, immobilisés sur une membrane de nitrocellulose. Ces amorces sont spécifiques de M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG, et certaines espèces de mycobacéries atypiques ❖Genotype MTBC, Hain, Biocentric basé sur la technologie DNA-Strip qui permet la différentiation génétique au moyen du polymorphisme du gène gyr ß des espèces du Complexe tuberculosis. Farida Hamdad, Juillet 2007 3-5- Antibiogramme : Tester les antituberculeux : Isoniazide – Streptomycine – Rifampicine – Pyrazinamide – Ethambutol – TCH – PNB. ATB de 1ere intention Les quatre premiers possèdent, à des degrés Isoniazide ( INH ) divers, trois propriétés principales : ils sont Rifampicine bactéricides, stérilisants et capables de prévenir Ethambutol l’émergence de bacilles Streptomycine résistants lorsqu’ils sont associés. Pyrazinamide Si multirésistance détectée: ATB de 2eme Intention Ethionamide Dr G. PAUL (Faculté de Médecine COCHIN-PORT- ROYAL, Université PARIS V)(28.02.04). Amikacine Ofloxacine Levofloxacine Moxifloxacine 4- Traitement : Le traitement ATB doit répondre à 2 exigences : Eviter la sélection de mutants résistants aux ATB. Stériliser définitivement les lésions. Molécules : Isoniazide (hépatotoxique) Rifampicine (risque hépatique) Pyrazinamide (risque hépatique) Ethambutol (risque de névrite optique) Les régimes standardisés de première ligne sont au nombre de deux qui ne diffèrent que par le nombre de médicaments associés durant la phase initiale. Le régime 2 EHRZ / 4 HR : nouveaux malades jamais traités auparavant qui ont des formes de tuberculose pulmonaire hautement contagieuses ou potentiellement contagieuses, ou encore des formes de tuberculose extrapulmonaire entraînant un pronostic vital ou fonctionnel sévère Le régime 2 HZ / 4 HR: Il s’applique aux malades tuberculeux porteurs de lésions pauci-bacillaires, non contagieux, ne risquant pas de développer de résistance bactérienne: - Les cas de primo-infection avec adénopathie hilaire ou médiastinale, sans lésion pulmonaire visible. - Les cas de tuberculose extra-pulmonaire courants et simples : tuberculose pleurale, ganglionnaire périphérique, péritonéale à forme ascitique, osseuse et ostéo-articulaire des membres, hépatique, génitale ou cutanéo-muqueuse. Le régime standardisé de deuxième ligne: 2SHRZE/1HRZE/5HRE 5- Prophylaxie : Vaccination par le BCG : Appliquée depuis 1921. Le vaccin est un bacille bovin vivant atténué par 230 repiquages successifs sur pomme de terre biliée glycérinée. Vaccin : le BCG souche vivante de M. bovis dont la virulence est atténuée (bacille de Calmette et Guerin) âge : dès la naissance dans un groupe à risque dès l’entrée dans une collectivité (crèche) ou à 6 ans injection intradermique au sujet IDR négative !! 🡲 lésion qui persiste 1 à 3 mois efficacité du vaccin : Très bonne protection contre les tuberculoses graves Bonne protection contre les tuberculoses pulmonaires  M. tub M. Afri M. bovis B.C.G Aspect des col : eugoniques dysgoniques dysgoniques eugonique en chou-fleur rugueuses lisses rugueuse crème-beige plates ,mates blanches choux fleur rugueuses crème beige Type respiratoire A.S microaérophiles microaérophiles A.S Incubation 3S 3S 4S 2à4S Niacine 🡲 – – – N.R 🡲 – – – Catalase 22° 🡲 🡲 🡲 🡲 🡲 🡲 68° – – – – TCH R S S S Pyrazinamide S S R R Cyclosérine S S S R III – Mycobactéries atypiques: III -1- Classification: Mycobactéries atypiques = Mycobactéries non tuberculeuses = bacilles tuberculeux aviaires et bacilles para tuberculeux présentes dans l’environnement et chez les animaux. Peuvent donner chez l’homme des : Infections d’allure tuberculeuse = Mycobactérioses. Infections hospitalières. Bactéries ubiquitaires, présentes dans l’eau, le sol et les végétaux Ne sont pas des parasites stricts de l’Homme et des animaux Peuvent se développer à l’état commensal, contaminant les prélèvements biologiques ++ espèces ne sont pas pathogènes et d’autres se comportent en opportunistes, pouvant être à l’origine d’infection chez le sujet immunodéprimé 1959, E. Runyon propose une classification en 4 groupes basée sur la: - Rapidité de la Croissance - Pigmentation des colonies. Groupe I = Mycobactéries Photochromogènes : Colonies non pigmentées à l’obscurité, se pigmentant en jaune après exposition à la lumière. Groupe II = Mycobactéries Scotochromogènes : Colonies à croissance lente, pigmentées en jaune orangée à l’obscurité et plus intensément à la lumière. Groupe III = Mycobactéries non chromogènes : Colonies à croissance lente, non pigmentées à l’obscurité se pigmentant parfois à la lumière et avec l’âge en jaune ou en rose Groupe IV = Mycobactéries à croissance rapide : Colonies apparaissent en moins d’une semaine et dont la pigmentation est variable suivant les espèces.  IV- Mycobacterium leprae = Bacille de Hansen Découvert en Norvège en 1873. Habitat : Myc. leprae est un parasite stricte de l’homme. 1975 : découverte : Infection naturelle chez le Tatou et le singe de Mangabey). B) Caractères bactériologiques : 1- Morphologie : B.A.A.R immobile groupés en amas plus ou moins arrondis = globi. 2- Culture : Pas de culture sur milieu artificiel (LJ) Culture sur Rat – Tatou – Singe.