Microbiologia - Introduzione (PDF)

Lez. 1 Prof. Lembo MICROBIOLOGIA I INTRODUZIONE ALLA MICROBIOLOGIA Cosa studia la microbiologia? La microbiologia studia i microorganismi. Essi sono un gruppo molto esteso di organismi viven: microscopici e unicellulari, nella maggior parte dei casi dota: di vita autonoma. Quest’ul:ma è la principale diﬀerenza tra i microorganismi e i macrorganismi: i macrorganismi sono organismi mul:cellulari forma: da cellule che non sono in grado di vivere autonomamente da sole, ma hanno bisogno di vivere insieme ad altre cellule arrivando a formare tessu:, organi, appara: ed inﬁne l’intero organismo. I microorganismi sono generalmente in grado di condurre autonomamente i loro processi vitali, tra cui le sintesi macromolecolari, la produzione di energia e la replicazione. TIPOLOGIE DI MICROORGANISMI BATTERI: nella microbiologia il termine “baPerio” è generico, comprende due :pologie di microorganismi: i Bacteria e gli Archea. Esempi di baPeri possono essere l’E.Coli, lo Streptoccoco, lo Staﬁloccoco o il vibrione del colera. La tubercolosi, il colera e le polmoni: baPeriche sono degli esempi di malaRe che sono causate da baPeri. FUNGHI: Si traPa di funghi unicellulari. Un esempio è il lievito di birra, che ha diverse applicazioni nelle biotecnologie. PROTOZOI: Esempi di protozoi sono il Plasmodium (l’agente eziologico della malaria), il Trypanosoma o l’Ameba. VIRUS: I virus però non sono organismi viven:. Sono struPure biologiche contenen: un genoma. I microorganismi sono estremamente piccoli e visibili solo al microscopio, non per questo ci si deve dimen:care della loro esistenza: sono mol:ssimi e rappresentano la maggior parte degli organismi viven: presen: nel mondo. Il biotecnologo deve avere ben chiara la loro presenza essendo ques: microrganismi degli allea: nello sviluppo di tecniche biotecnologiche. Per avere un’idea della loro grandezza e quan:tà si può osservare al microscopio la punta di uno spillo. È necessario ingrandire l’immagine per notare un gran numero di microorganismi presen: su questa superﬁcie, già di per sé piccolissima. Le cellule procario:che (10-6 –10-7 metri) sono più piccole delle cellule vegetali e animali (10-4 –10-5 metri). TuPe e tre queste :pologie di cellule possono essere osservate al microscopio oRco ed elePronico. I virus, invece, essendo così piccoli (nell’ordine di 10-7 – 10-8 metri) possono essere visualizza: solo al microscopio elePronico. 1 CHE COSA SONO I MICROORGANISMI? Parlare dei microorganismi è un’oRma opportunità per capire che cosa sia la vita. Se volessimo descrivere le principali caraPeris:che della vita dovremmo par:re ad analizzare la vita nella sua forma più semplice, ovvero una cellula dotata di vita autonoma. Deﬁnire che cosa sia la vita è molto importante, ad esempio, per gli scienzia: che stanno organizzando missioni nel sistema solare per andare a vedere se sono presen: altre forme di vita negli altri piane:. Soltanto dopo aver capito e deﬁnito che cosa sia la vita è possibile cercarla. Deﬁnizioni di “vita”: Un organismo vivente è un organismo dotato di: 1. Un metabolismo 2. Capacità di riprodursi 3. Capacità di diﬀerenziazione: una singola cellula può diﬀerenziare, cioè produrre una cellula nuova, diversa da se stessa. 4. Capacità di comunicare: gli stessi baPeri (le forme più semplici di vita) sono in grado di comunicare ed interagire aPraverso delle molecole che vengono scambiate, per poi essere recepite grazie a dei recePori. 5. Capacità di movimento: movimento inteso come deﬁnito e aRvo (che consuma energia). 6. L’ul:ma caraPeris:ca :pica di un organismo vivente è l’evoluzione: evoluzione che si basa sulla comparsa di mutazioni casuali nei genomi della specie portando ad una selezione naturale di par:colari caraPeris:che. L’evoluzione è l’unica caraPeris:ca dei viven: che è anche propria dei virus → pur non essendo ques: ul:mi organismi viven:, possiedono un genoma e per questo possono essere soggeR a mutazioni e di conseguenza evolvere. Nella microbiologia medica la capacità di evolvere di virus e baPeri ha delle implicazioni: virus e baPeri possono sviluppare delle resistenze a farmaci, oppure i virus, essendo in grado di mutare il loro proﬁlo an:genico superﬁciale, possono dare origine a epidemie inﬂuenzali a cadenza annuale. PERCHÉ È COSÌ IMPORTANTE STUDIARE LA MICROBIOLOGIA? In primo luogo perché la vita sula Terra è iniziata con i microorganismi e ancora adesso dipende dalla loro esistenza. I microorganismi hanno infaR creato la biosfera che ha permesso lo sviluppo degli organismi mul:cellulari. I microorganismi, inoltre, cos:tuiscono il 50% della biomassa presente sulla Terra e sono ovunque, in qualsiasi nicchia ecologica, anche la più os:le. Essi saranno probabilmente gli ul:mi ad es:nguersi proprio per la loro capacità di adaPamento. I primi microorganismi unicellulari sono comparsi nel brodo primordiale, in un ambiente fortemente tossico per qualsiasi altro essere vivente. Come possiamo dire che siano sta= proprio i microorganismi ad essere i primi organismi viven= sulla Terra? Sono presen: dei fossili in struPure rocciose sedimentarie causate dall’aRvità dei primi microorganismi, chiamate stromatoli:. All’interno di queste stromatoli: sono sta: trova: fossili di microorganismi: datando l’età delle stromatoli: ne sono state ritrovate alcune risalen: a 3 miliardi di anni fa. In questa scala si può osservare la storia del nostro pianeta, che si ri:ene avere circa 4,5 miliardi di anni. I primi organismi viven: (microorganismi) si suppone essere comparsi circa 3,7 – 3,8 miliardi di anni fa. Intorno a 3,5 miliardi di anni fa sono comparsi i cianobaPeri, microorganismi capaci di svolgere la fotosintesi cloroﬁlliana e produrre quindi ossigeno. 2 Ossigeno che negli anni successivi si è accumulato ﬁno a formare l’atmosfera del nostro pianeta (circa 1,5 miliardi di anni fa). Solo in questo momento si sono potu: sviluppare altri organismi viven:, in ul:mo i mammiferi. Paragonando il tempo trascorso sul pianeta dei microorganismi rispePo a quello dell’uomo si nota proprio quanto i microorganismi siano più an:chi della specie umana. Senza i microorganismi non esisterebbero gli ecosistemi e la vita sul pianeta. I microorganismi sono infaR in grado di degradare la materia morta e di riciclare gli elemen:, rendendo possibile la comparsa di nuova vita. Ciò che si conosce della vita e del suo funzionamento per la gran parte è dovuto allo studio dei microorganismi. Sono organismi molto semplici che permePono di capire le basi biologiche della vita (come la biochimica e la gene:ca). APualmente sappiamo molto poco della maggior parte dei microorganismi presen: sulla Terra: non si conoscono mol: dei microorganismi presen: nell’oceano e nel suolo, ma si stanno iniziando a scoprire i microorganismi presen: nel nostro intes:no che formano il microbiota (si sa che hanno un ruolo fondamentale per il mantenimento di uno stato di salute). Inoltre, aPraverso lo studio dei microorganismi come E.Coli è stato possibile sia conoscere ad esempio le funzioni della cellula dal punto di vista chimico e le sue capacità codiﬁcan: (trascrizione, traduzione, decodiﬁca del codice gene:co ecc), sia apprendere la capacità di u:lizzarli per la sintesi di enzimi u:li all’uomo. L’IMPATTO DEI MICROORGANISMI SULLA VITA DEL PIANETA [Il professore illustra brevemente questa parte, ma ha consigliato di approfondire lo studio sul libro] I microorganismi hanno un impaPo su: Agricoltura Ambiente / Energia Cibo Industria Salute Quando si parla di microorganismi, in par:colare di baPeri, si tende ad iden:ﬁcarli con i microorganismi patogeni. TuPavia, la maggior parte dei microorganismi presen: sul pianeta ha un eﬀePo beneﬁco sia per l’intero pianeta che per l’uomo. Agricoltura: le principali fon: di proteine per un radici delle leguminose presentano dei noduli radicali, all’interno dei quali sono presen: delle comunità baPeriche in grado di ﬁssare l’azoto ambientale in una forma u:lizzabile dalla pianta per la biosintesi delle proteine. Le leguminose quindi producono legumi ad alto contenuto proteico grazie a ques: microorganismi presen: nelle radici. Anche l’alto contenuto proteico della carne è dovuto ai microorganismi → gli animali, come i bovini, si nutrono di alimen: molto ricchi di cellulosa come erba e ﬁeno e possiedono a livello dell’apparato digerente una struPura chiamata Rumine. Il Rumine con:ene dei consorzi baPerici in grado di digerire la cellulosa, mePendo così a disposizione dell’animale dei nutrien:. Ambiente / Energia : i baPeri possono essere u:lizza: per produrre dei biocarburan: → partendo dall’amido di mais, tramite delle fermentazioni, si può produrre etanolo. Si possono usare dei microorganismi per trasformare sostanze tossiche o contaminan: → i microorganismi sono in grado di u:lizzarle come fonte di energia per poi trasformarle in molecole non più tossiche. (Il biotecnologo in questo ambito dovrà quindi selezionare ceppi speciﬁci per degradare determina: contaminan:). 3 Cibo: l’industria alimentare è un enorme ambito di lavoro per il biotecnologo microbiologo. In primo luogo per lo studio volto a preservare dalla degradazione delle derrate alimentari → questo lo si fa già da tempo u:lizzando il sale o una elevata quan:tà di zuccheri, ma ad oggi si usano anche le radiazioni o dei compos: chimici. Vi è però un altro importante ambito che è quello che si occupa di u:lizzare i microorganismi per produrre cibi e bevande → il lievito di birra è u:lizzato per produrre birra, vino o superalcolici; le aziende casearie u:lizzano i microorganismi per la produzione di formaggi o yogurt; i microorganismi vengono anche u:lizza: per produrre addi:vi alimentari quali il glutammato di sodio (esaltatore di sapore) o l’acido citrico (presente nelle bevande gasate). Salute - Ambito medico: sono prodoR bioformaci, faPori di crescita, ormoni, tramite la via ricombinante grazie ai microorganismi. Si clona, ad esempio, il gene dell’insulina e lo si inserisce come cDNA in E.Coli. Questo microorganismo diventa così in grado di produrre grandi quan:tà di insulina umana che, una volta puriﬁcata, può essere u:lizzata. I microorganismi vengono anche u:lizza: nei primi processi dello sviluppo di an:bio:ci : la pennicillina è stata scoperta e sviluppata a par:re dal fungo Penicillium. APualmente, sono in corso ricerche volte a scoprire nuovi microorgansimi produPori di an:bio:ci. Salute – MalaRe: un biotecnologo microbiologo iden:ﬁca e studia i nuovi agen: infePan: che causano malaRe per scoprirne le caraPeris:che biologiche, capirne i possibili traPamen: e cure, ideare nuovi vaccini e sviluppare modalità diagnos:che. La microbiologia ha contribuito notevolmente a migliorare la qualità della vita nell’ul:mo secolo. Il graﬁco mostra le principali cause di morte negli USA nel 1900, dove tra le prime dieci cause di morte, 5 erano dovute a malaRe infeRve (inﬂuenza e polmonite, tubercolosi, gastroenteri:, malaRe infeRve nei bambini e diuerite). Nel 2000 ci sono solo più due cause di morte dovute a malaRe infeRve: l’AIDS (nuova, non era presente nel 1900) e l’inﬂuenza e la polmonite. Tra il 1900 e il 2000 sono sta: sviluppa: an:bio:ci che hanno permesso di salvare un gran numero di mala: di inﬂuenza / polmonite (N.B. l’inﬂuenza è una malaRa virale che non si cura con an:bio:ci, ma apre la strada a numerose infezioni baPeriche che sono traPate con an:bio:ci). L’altro evento fondamentale che ha avuto luogo tra il 1900 e il 2000 è stato lo sviluppo di vaccini → malaRe come la diuerite non sono più presen: come cause di morte proprio per lo sviluppo di vaccini. I vaccini sono sta: importan:ssimi: si considerano proprio i vaccini e la potabilizzazione delle acque come i due elemen: principali che hanno portato a salvare la vita di un numero enorme di persone. La microbiologia è studiata anche per u:lizzare i microorganismi come arma per infePare le popolazioni nemiche: BIOTERRORISMO. 4 Si sa di mol: paesi che hanno studiato e studiano tuP’ora progeR di sviluppo di microorganismi u:lizzabili come armi. Un caso tra i più eclatan: è stato quello successivo all’aPacco delle Torri Gemelle nel 2001: sono state inviate numerose lePere contenen: spore di Antrace negli Sta: Uni:. Questo ha portato a 22 casi di malaRa (11 nella forma da inalazione e 11 casi di antrace cutaneo) e 5 decessi. Le SPORE sono forme diﬀerenziate estremamente resisten: di baPeri. Il messaggio ﬁnale della lezione è una frase del fondatore della microbiologia Louis Pasteur: “Il ruolo dell’inﬁnitamente piccolo in natura è inﬁnitamente largo – The role of the inﬁnitely small in nature is inﬁnitely large” 5 Lez. 2 Prof. Lembo INTRODUZIONE II LEZIONE In questa lezione verranno traPate la struPura e la funzione dei microrganismi e ci si focalizzerà sul gruppo dei Bacteria e degli Archea. Cominciamo osservando queste due cellule al microscopio elePronico: al di là della loro diﬀerente forma (una è allungata, l’altra è sferoidale), si può notare che la cellula di destra con:ene al suo interno numerose struPure delimitate da membrana (tra cui il nucleo contenente il materiale gene:co e i mitocondri), mentre la cellula di sinistra non presenta nessuna struPura delimitata da membrana. Quest’ul:ma è una cellula procariota, una :pologia di cellula molto semplice caraPerizzata dalla mancanza di organuli racchiusi da membrane → il suo materiale gene:co è immerso nel citoplasma. La cellula a destra è invece una cellula eucariota, la quale possiede organelli interni dota: di membrana, tra cui il nucleo, i mitocondri, il re:colo endoplasma:co e l’apparato del Golgi. I baPeri sono delle cellule procariote, mentre i protozoi e i funghi sono cellule eucariote. Una cellula eucariote ed una cellula procariote hanno una dimensione molto diversa. Nell’immagine a destra si può vedere una rappresentazione in scala di una cellula eucariote e una procariote, a cui viene anche comparata la grandezza di un virus. Le cellule procariote hanno delle dimensioni intono al micron (0.5 – 2 μm), salvo rare eccezioni. Essere piccoli in natura è un vantaggio. Per capire il mo:vo di questo vantaggio si osservano due sfere: una con un raggio di 1 μm, l’altra con un raggio di 2 μm. Calcolando il rapporto Superﬁcie / Volume della prima sfera questo è uguale a 3, quello della seconda è uguale a 1,5. Raddoppiando quindi il raggio, il rapporto si dimezza → si traPa di una caraPeris:ca importante dal punto di vista biologico: più una cellula è piccola, più avrà un rapporto superﬁcie / volume maggiore. Una superﬁcie di questo :po consente maggiori scambi con l’esterno ed un metabolismo più aRvo, che hanno come conseguenza un maggiore tasso di replicazione. 6 Poiché i baPeri sono aploidi (hanno una sola copia di geni) ogni mutazione può essere potenzialmente aRva. Avere un gran numero di individui ed essere aploidi signiﬁca poter scegliere, aPraverso la selezione naturale, tra un gran ventaglio di mutazioni che permePono una notevole capacità di adaPamento a nuove condizioni. Questo ha portato ad avere una enorme biodiversità nell’ambito dei procario:. Come studiamo questa biodiversità e come studiamo i rappor= ﬁlogene=ci? Da qualche decennio è stato sviluppato un metodo che si basa sulla ampliﬁcazione e sequenziamento dei geni ribosomiali. Ques: sono un buon orologio molecolare poiché tuR gli organismi viven: li possiedono. Si possono quindi ampliﬁcare i geni ribosomiali, sequenziarli e allineare le rispeRve sequenze oPenute da organismi diversi. Si u:lizza poi un souware che va ad evidenziare le iden:tà o le divergenze tra le sequenze in modo da generare un albero ﬁlogene:co. L’albero ﬁlogene:co fornirà dunque le informazioni riguardan: la distanza evolu:va tra due o più specie. U:lizzando questa metodologia è stato possibile rappresentare l’ALBERO DELLA VITA → con:ene 3 diversi domini (Bacteria, Archaea, Eukarya). TuR gli organismi viven: convergono verso un’origine: probabilmente è esis:to un organismo originario da cui poi si sono sviluppa: diversi ﬁloni evolu:vi → uno ha formato i Bacteria, mentre l’altro biforcandosi ha formato il dominio degli Archaea e degli Eukarya. Due dei tre domini sono procario: (Bacteria e Archaea). Gli Archaea, pur essendo procario:, sono più vicini da un punto di vista evolu:vo agli Eukarya (eucario:). In ul:mo, nel ramo evolu:vo del dominio dei Bacteria sono presen: i mitocondri. Ques: infaR possiedono il loro RNA ribosomiale ed in seguito alle analisi sono sta: colloca: nel dominio dei Bacteria → si traPa di un’altra prova che avvalora la teoria endosimbion:ca dei mitocondri. LA DIFFERENZA EVOLUTIVA SI RIFLETTE SULLE CAPACITÀ METABOLICHE: Ogni organismo vivente ha bisogno di una fonte di energia e di una fonte di carbonio. § FONTI DI CARBONIO: Sono chiama: autotroﬁ gli organismi che u:lizzano una fonte di carbonio inorganica (l’anidride carbonica), mentre sono chiama: eterotroﬁ quelli che u:lizzano come fonte di carbonio dei compos: organici. § FONTI DI ENERGIA: le fon: di energia che vengono u:lizzate provengono dal Sole o da sostanze chimiche. I microorganismi che u:lizzano sostanze chimiche come fonte di energia vengono chiama: CHEMIOTROFI, che possono essere dis:n: in chemioorganotroﬁ (u:lizzano l’energia derivata dall’ossidazione di compos: organici) e in chemiolitotroﬁ (oPengono energia per ossidazione di compos: inorganici). Entrambi immagazzinano l’energia soPo forma di ATP (nei legami ad alta energia). I Chemiotroﬁ che possono eseguire le loro ossidazioni in presenza di ossigeno sono chiama: aerobi, si traPa quindi di microorganismi in grado di vivere solo in presenza di ossigeno. I chemiotroﬁ che invece sono in grado di eseguire i loro processi di ossidazione in assenza di ossigeno sono chiama: anaerobi. Sono chiama: invece FOTOTROFI quegli organismi fotosinte:ci in grado di captare, aPraverso dei par:colari pigmen:, l’energia solare e di ﬁssarla in molecole di ATP. 7 All’interno dei microorganismi sono quindi presen: notevoli diﬀerenze e potenzialità biochimiche che possono essere sfruPate dai biotecnologi. [Il professore parla di organismi “chemotroﬁ”, ma su internet risulta che in italiano si chiamino organismi “chemiotroﬁ”] STRUTTURA E FUNZIONE DELLA CELLULA PROCARIOTA In questa lezione discuteremo della struPura delle cellule procario:che e della loro funzione. (primo video, struPura e funzione della cellula procario:ca 1:) Questa diaposi:va illustra che una delle principali forme dei microorganismi, in par:colare dei baPeri, è la forma sferica. TuR i baPeri che hanno una forma sferica vengono chiama: cocchi. I cocchi dopo il processo di divisione possono rimanere separa: tra loro oppure possono rimanere adesi a due a due, deR diplococchi, oppure possono anche rimanere associa: a formare delle catene, gli streptococchi, in altri casi possono anche associarsi e formare dei grappoli deR staﬁlococchi. Un'altra forma principale è la forma dePa allungata o cilindrica, i baPeri con questa forma prendono il nome di bacilli o bastoncelli. Se rimangono adesi a due a due si chiamano diplobacilli, si chiamano invece streptobacilli se formano una catena. Il bacillo può anche avere delle curvature. Se ha una sola curvatura è dePo vibrione, che ha una forma a virgola, (esempio :pico è il vibrione del colera). Le curvature possono anche essere più di una, un esempio è lo spirillium che possiede tre curvature. Quando le curvature sono molteplici il baPerio prende il nome di spirochete. Questa immagine a lato illustra le struPure della cellula baPerica. In questo modulo inizieremo dallo studio della parete cellulare (o cell wall). La parete cellulare ha molteplici funzioni: conferire rigidità e forma alla cellula baPerica (la cellula baPerica senza la parete cellulare prende il nome di protoplasto) proteggere la cellula dal danno meccanico proteggere la cellula dalla lisi osmo:ca, perché la cellula con:ene un gran numero di solu: e quindi ha un’alta pressione osmo:ca (di circa 2 atmosfere) che porterebbe alla lisi della cellula prevenuta, appunto, dalla parete rigida. funziona da barriera di permeabilità, regolando gli scambi tra l’interno e l’esterno. 8 è uno dei più importan: bersagli per diverse classi di an:bio:ci , in par:colare le penicilline e le cefalosporine, e partecipa alla patogenesi delle malaRe baPeriche. Successivamente vedremo come alcuni an:bio:ci interferiscano con la biosintesi della parete cellulare. LA COLORAZIONE DI GRAM Per poter descrivere la parete è necessario introdurre la colorazione di Gram. In alto a sinistra vediamo un vetrino su cui è stato posto un campione contenente dei baPeri che non si riescono a dis:nguere al microscopio. Per poterli dis:nguere vengono colora:. La colorazione di Gram prevede una prima colorazione con un colorante dePo cristal violePo che colora tuR i baPeri. Con:nuando viene aggiunto un reagente contenente iodio che è un facilitatore della colorazione (fa precipitare cristalli di colorante). Il passaggio successivo è la decolorazione di alcuni baPeri aggiungendo alcol sopra il vetrino. I baPeri decolora: riprendono il colore aPraverso la seconda colorazione con il colore rosso. Alla ﬁne, si osservano alcuni baPeri colora: in viola e altri colora: in rosso (come si vede nell’immagine b). I baPeri che alla colorazione di Gram risultano colora: di viola si chiamano Gram+ (Gram posi:vi), mentre i baPeri che durante la colorazione di Gram sono sta: decolora: e successivamente colora: di rosso si chiamano Gram- (Gram nega:vi). Come mai alcuni baPeri si colorano di viola e altri di rosso? La risposta si trova nella diversità dell’architePura della parete cellulare dei Gram+ e dei Gram-. LA PARETE CELLULARE DEI BACTERIA Nel Gram posi:vo si osserva uno spesso strato scuro esterno non presente nel Gram nega:vo, dove invece si può vedere una seconda membrana divisa dalla prima da uno spazio chiaro, all’interno del quale si può intravedere un soRle strato scuro. (Questa disposizione viene meglio evidenziata dall’immagine a lato). Questo strato scuro, spesso nel Gram posi:vo e soRle nel Gram nega:vo, è cos:tuito dal pep:doglicano che è una struPura :pica della parete dei baPeri. Osservando al microscopio oRco si può notare come un baPerio Gram+ presen: una parete cellulare più liscia rispePo a quella di un Gram-. IL PEPTIDOGLICANO Questa è l’unita struPurale che compone il pep:doglicano che prende il nome di Glican Tetrapep:de. Questa unità si ripete più volte sia sulla sinistra che sulla destra ﬁno a formare una vera e propria “collana di perle”. 9 In alto ci sono due amminozuccheri, sulla sinistra è presente l’N-ace:l-glucosammina, sulla destra invece c’è l’Acido N-ace:l-muramico. In rosa è evidenziato il gruppo ace:le. Ques: due amminozuccheri sono lega: tra di loro da un legame b 1-4 glicosidico. Questo legame può essere tagliato da una proteina dePa lisozima che cos:tuisce una delle prime barriere an:baPeriche del nostro sistema immunitario (si trova, ad esempio, nelle lacrime o nella saliva). L’acido N-ace:l-muramico è legato a sua volta ad una corta catena di 4 amminoacidi: L-alanina, D-acido glutammico, D-alanina e l’acido meso-diamino-pimelico. L’ acido meso-diamino-pimelico è un amminoacido :pico esclusivamente dei baPeri, assomiglia alla lisina ma al posto dell’Idrogeno H troviamo un gruppo carbossilico COOH. Inoltre, possiamo osservare la presenza di amminoacidi sia in forma L che in forma D, diversamente da ciò che accade negli eucario:. Il pep:doglicano è da immaginare come una collana di perle, le cui perle sono questa unità struPurale che abbiamo descriPo. Questa collana di perle non riesce a cos:tuire di per sé un involucro rigido. Questo involucro rigido è formato dall’aﬃancarsi di molte collane di perle legate l’una con l’altra in modo da formare una rete. Nell’immagine ci sono due esempi, uno con un gram- nega:vo, L’Escherichia Coli, e uno con un gram-posi:vo, lo Staﬁlococco aureo. Nel caso del gram-nega:vo le due corte catene di amminoacidi si legano tra di loro in modo che il terzo amminoacido di una catena leghi il quarto amminoacido dell’altra catena in modo da formare una rete rigida. Nel caso del gram-posi:vo sono sempre lega: il terzo amminoacido di una corta catena con il quarto dell’altra catena, ma non direPamente, in questo caso c’è un ponte pentaglicidico (cos:tuito da 5 glicine) che lega il quarto amminoacido con il terzo delle due catene di pep:doglicani. Il risultato di ques: pon: è mostrato nell’immagine a lato, dove vediamo un pep:doglicano di staﬁlocco aureo. Questo ponte garan:sce la struPura rigida di un Gram+. 10 Questa immagine (sx) mostra, invece, la parete di un Gram- in cui le due catene da quaPro amminoacidi sono legate direPamente tra di loro. Questa immagine rappresenta la parete di un Gram+, lo spesso strato scuro che avevamo osservato nelle immagini al microscopio è dato dalla sovrapposizione di numerose maglie di pep:doglicani. La maggior componente della parete di un Gram+ è lo spesso strato di pep:doglicano. Una componente minoritaria è quella degli acidi lipoteicoci o teicoci che essendo carichi nega:vamente conferiscono una carica nega:va alla parete. Questa immagine invece rappresenta la struPura la parete di un Gram-. In cui possiamo osservare la presenza di uno spazio tra le due membrane (interna ed esterna) dePo periplasma o spazio periplasma:co, all’interno del quale è presente uno strato più soRle di pep:doglicano rispePo ai Gram+. La membrana esterna è un doppio strato lipidico, diverso da quello dalla membrana cellulare perché sul fogliePo esterno della membrana esterna troviamo un componente estremamente importante dePo lipopolisaccaride. Nella membrana esterna sono presen: anche delle proteine, alcune di esse sono proteine canale deputate allo scambio con l’esterno, altre sono delle lipoproteine che hanno la funzione di ancorare la membrana esterna allo strato fosfolipidico. Il lipopolisaccaride è formato da una componente lipidica e una componente oligosaccaridica. La componente lipidica è una componente tossica, ossia è in grado di indurre tossicità nelle specie ospite dei baPeri Gram-. Il lipopolisaccaride è in grado di indurre una serie di eﬀeR ﬁsiopatologici (es: la febbre o disturbi gastrointes:nali, ﬁno a manifestazioni più gravi come una coagulazione travasale disseminata, uno shock emodinamico, o ipotensione ﬁno alla morte dell’individuo). 11 Questo è un quadro sinoRco che riassume le principali caraPeris:che della parete dei Gram-posi:vi e dei gram- nega:vi: Nei Gram+ la parete è più spessa e con:ene più pep:doglicano, mentre nei Gram- la parete è più soRle ed è formata da due stra:: il pep:doglicano e la membrana esterna. Il pep:doglicano è il componente principale della parete dei Gram+ ma non dei Gram- Nei Gram+ sono presen: degli acidi teicoici, assen: nei Gram- Solo nei Gram- è presente il lipopolisaccaride Solo i gram-posi:vi sono direPamente sensibili all’azione del lisozima poiché il pep:doglicano è esposto all’esterno solo in essi. BIOSINTESI DEL PEPTIDOGLICANO L’unità struPurale del pe:doglicano viene sinte:zzata all’interno del citoplasma come glicanpentapep:de (è presente un amminoacido in più). Questa struPura non è in grado di passare direPamente la membrana, per fare questo ha bisogno di un trasportatore dePo bactoprenolo al quale è legato il glicanpentapep:de. Il bactoprenolo, illustrato a lato, è una molecola altamente idrofobica che facilita il passaggio del glicanpentapep:de all’esterno. In questa immagine, sulla destra vediamo due catene di pep:doglicano e in alto a sinistra la zona di formazione. La corta catena amminoacidica di destra deve potersi interlacciare con la catena di sinistra, questa reazione viene catalizzata da alcuni enzimi che si chiamano transpep:dasi, le quali rimuovono il quinto amminoacido e legano il quarto amminoacido con il terzo della catena opposta, questa è chiamata reazione di transpep:dazione. Questo processo è importante perché alcune classi di an:bio:ci estremamente importan: (penicilline e cefalosporine) sono in grado di legare le trans-pep:dasi inibendo la reazione di trans-pep:dazione e di conseguenza la formazione del pep:doglicano, quindi una cellula baPerica che non riesce a costruire il proprio pep:doglicano sarà soggePa a lisi osmo:ca, e di conseguenza all’uccisione della cellula. Questo è il modo in cui un an:bio:co svolge il proprio compito terapeu:co. LA PARETE CELLULARE DEGLI ARCHEA: Ciò che è stato analizzato ﬁno ad adesso è la parete dei Bacteria, anche gli Archea (un altro dominio di procario:) hanno delle pare:. Una parete è cos:tuita da uno pseudopep:doglicano che ha una struPura simile a quella descriPa ﬁnora, ma presenta un amminozucchero diverso, è presente sempre l’N-ace:l-glucosamina ma al posto dell’acido N-ace:l- muramico è presente l’acido N-ace:l -talosaminuronico, i due amminozuccheri sono lega: da un legame ß 1-3. Questo legame, a diﬀerenza del legame ß 1-4, non è sensibile al lisozima. TuPavia, questa unità struPurale ripetuta sia sulla destra sia sulla sinistra è in grado di dare luogo ad una catena di pseudopep:doglicani. Altri archea non hanno questa struPura ma hanno degli involucri paracristallini proteici che avvolgono la cellula baPerica e svolgono lo stesso ruolo di una parete. Qui si cominciano a vedere le prime diﬀerenze tra i Bacteria e gli Archea. 12 (Secondo video, struPura e funzione della cellula procario:ca 2:) LA MEMBRANA CITOPLASMATICA: LA STRUTTURA La membrana citoplasma:ca è formata da un doppio strato lipidico all’interno del quale sono immerse delle proteine dePe proteine di membrana. La parte lipidica è composta essenzialmente da fosfolipidi, molecole composte da una testa polare idroﬁlica e delle code idrofobiche che si aﬀacciano tra di loro. Nelle cellule eucariote c’è una quan:tà signiﬁca:va di colesterolo per conferire rigidità alla membrana, mentre nei procario: non è presente (salvo in alcune eccezioni), questo probabilmente perché c’è una parete che protegge la membrana. Sono state scoperte delle molecole chiamate opanoidi (a sinistra) che possono richiamare la struPura del colesterolo e probabilmente svolgere un ruolo simile anche nelle membrane dei procario:. Osserviamo le diﬀerenze tra le composizioni delle membrane dei Bacteria e quelle degli Archea. Nella membrana dei Bacteria sono presen: dei fosfolipidi, forma: da una molecola di glicerolo che è legata aPraverso un legame estere a delle code idrofobiche formate da acidi grassi (uno dei carboni è condensato con un fosfato formando un :pico fosfolipide). La struPura della membrana degli Archea è simile, cioè c’è sempre una molecola di glicerolo che lega un fosfato, ma le code idrofobiche non sono formate da acidi grassi ma da ripe:zioni di una molecola idrofobica a 4 atomi di carbonio lineare che si chiama isoprene in cui le code chiamate ﬁtanili sono legate al glicerolo con un legame etere :pico degli Archea (e non con un legame estere come nei bacteria). A sinistra si può vedere l’unità cos:tu:va della membrana degli Archea. In alcuni casi si può avere un biﬁtanile legato ad entrambe le estremità mediante un legame etere con il glicerolo. In questo caso la membrana diventa una membrana unitaria, non è più un doppio strato come nel caso di ﬁtanile, ma con il biﬁtanile la membrana ha un unico strato. Questa membrana unitaria è presente nei baPeri deR Ipertermoﬁli, che sono degli Archea capaci a vivere ad al:ssime temperature, perché la membrana ad unico strato impedisce la disgregazione della membrana, se fosse un doppio strato questo si aprirebbe danneggiando la cellula. 13 LE FUNZIONI DELLA MEMBRANA CITOPLASMATICA funziona da ancoraggio per le proteine, proteine che possono avere diverse funzioni (enzima:che, coinvolte nella produzione di energia o coinvolte nelle chemiotassi, ossia proteine recePoriali) conservazione dell’energia: a livello della membrana vi è una separazione di cariche, le cariche posi:ve dello ione idrogeno si trovano all’esterno e le cariche nega:ve OH all’interno. Questo crea una diﬀerenza di potenziale che rende carica la membrana. Questa separazione di cariche è oPenuta pompando aRvamente fuori gli ioni idrogeno con consumo di ATP. Questa forza che viene generata si chiama forza protomotrice. funziona da barriera di permeabilità, quindi regola gli scambi tra esterno e interno. (funzione traPata qui soPo) TRASPORTO DEI NUTRIENTI Sono poche le molecole che possono oltrepassare liberamente la membrana a causa della sua natura idrofobica. L’acqua e piccole molecole riescono ad oltrepassarla, mentre molecole più grosse e nutrien: sono totalmente incapaci di oltrepassare la membrana autonomamente. È necessario quindi che ci siano dei trasportatori e dei metodi di trasporto. L’importanza di ques: trasportatori è confermata dall’analisi del sequenziamento del genoma di Escherichia Coli. Il genoma di Escherichia Coli codiﬁca per 4254 geni e il 10% dei prodoR di ques: geni sono delle proteine trasportatrici. Questo conferma l’importanza di scambiare con l’ambiente in maniera seleRva molecole e nutrien:. Quali sono i modi aIraverso i quali vengono trasportate le diverse sostanze? DIFFUSIONE Può essere una diﬀusione semplice (o passiva), che non richiede la presenza di nessun carrier (una proteina canale). O può essere una diﬀusione facilitata dipendente da carrier proteici. Queste due modalità di diﬀusione condividono due caraPeris:che; entrambe non consumano energia, questo perché lo scambio avviene secondo gradiente (da un ambiente ad alta concentrazione verso un ambiente a bassa concentrazione ﬁno a raggiungere l’equilibrio). (non dice la seconda caraPeris:ca?) 14 TRASPORTO ATTIVO Il trasporto aRvo è un :po di trasporto che consuma energia per consen:re l’ingresso di molecole contro gradiente. Nei procario: abbiamo 3 diversi meccanismi aPraverso i quali può avvenire il trasporto aRvo: il trasporto semplice, la traslocazione di gruppo e il sistema ABC. Il trasporto semplice u:lizza come energia quella oPenuta dalla separazione di carica dovuta al consumo di ATP che pompa all’esterno ioni idrogeno che rilasciano la propria energia permePendo l’ingresso di una molecola contro gradiente. Questa modalità sfruPa la forza protomotrice per fare uscire o per fare entrare dei nutrien:. Se una sostanza entra insieme ad uno ione allora il trasporto sarà deﬁnito simporto (quando le molecole entrano nella stessa direzione), se invece entra uno ione idrogeno per permePere la fuoriuscita di una molecola viene deﬁnito an:porto. Un esempio di simporto è la permeasi del laPosio che permePe al laPosio di entrare contro gradiente u:lizzando l’energia donata dall’ingresso di uno ione idrogeno. Un esempio di an:porto è la pompa del sodio che sfruPa l’ingresso di uno ione idrogeno per far uscire uno ione sodio. La traslocazione di gruppo è una modalità che è usata per esempio per trasportare degli zuccheri (a destra il trasporto del glucosio). Questo trasporto si avvale della presenza di diversi enzimi, in par:colare un enzima 2 con 3 diverse subunità che è speciﬁco per ogni molecola che deve essere trasportata (in questo caso sono speciﬁche per il glucosio) e componen: aspeciﬁci che si associano con ognuno dei componen: speciﬁci. Il donatore di energia è il fosfoenolpiruvato che cede un fosfato e si innesca una catena di fosforilazione e defosforilazione che passa il fosfato ad ogni componente di questa catena ﬁno a quando il fosfato viene legato al glucosio che viene trasportato all’interno soPo forma di glucosio 6 fosfato. Il glucosio 6 fosfato è immediatamente disponibile per essere metabolizzato nelle catene metaboliche. In questo caso non si va contro gradiente perché all’interno è presente il glucosio e non il glucosio 6P. Il sistema ABC è un sistema formato da 3 componen: speciﬁche. Una componente che è una “binding protein”, ossia una proteina che lega ad alta aﬃnità le sostanze (in questo caso il maltosio), che nei gram-nega:vi si trova nello spazio periplasmico. Una volta legata la propria sostanza è in grado di portarla al trasportatore e la molecola può essere portata all’interno contro gradiente perchè c’è una terza componente che lega l’ATP e lo trasforma in ADP cedendo energia aﬃnchè possa avvenire il trasporto. 15 Questo è un quadro sinoRco delle diverse modalità che abbiamo descriPo. 16 Lez. 3 Prof.ssa Donalisio COLTIVAZIONE DEI MICRORGANISMI Col:vare un microrganismo richiede l’u:lizzo di terreni o mezzi di coltura con cui si cerca di riprodurre ar:ﬁcialmente un ambiente capace di soddisfare le esigenze metaboliche di un microrganismo. Pertanto, per poter crescere un microrganismo è necessario conoscere il suo metabolismo e le condizioni oRmali di crescita, quali la temperatura oRmale, il pH e il substrato in cui il microrganismo cresce in natura. Microrganismi diversi hanno esigenze nutrizionali diverse e ognuno richiede una fonte di energia di carbonio, per cui può essere: - Fotoautotrofo se u:lizza come fonte di energia la luce solare e come fonte di carbonio la CO2 - Chemioautotrofo se u:lizza come fonte di energia compos: inorganici e come fonte di carbonio la CO2 - Chemioeterotrofo se u:lizza compos: organici sia come fonte di carbonio che come fonte di energia Le cellule sono composte da acqua e macromolecole e durante la nutrizione la cellula acquisisce dall’ambiente esterno gli elemen: necessari, i cosiddeR nutrien:, per formare i monomeri cos:tuen: delle macromolecole. Vengono deﬁni: macronutrien: gli elemen: richies: in grande quan:tà che cos:tuiscono i microrganismi. Questa tabella elenca i principali macronutrien:, il loro peso secco e la loro fonte. Il fosforo è importante per la sintesi degli acidi nucleici e fosfolipidi. Lo zolfo è importante per amminoacidi come la cisteina e la me:onina e per le vitamine. K, Mg, Ca e Fe sono presen: in quan:tà minori rispePo agli altri e derivano dai rispeRvi sali. In par:colare, il magnesio stabilizza gli acidi nucleici e le membrane cellulari, il calcio stabilizza le pare: cellulari in quanto ha un ruolo fondamentale per le endospore e il ferro è molto importante per la respirazione in quanto è un componente dei citocromi. Le cellule baPeriche producono siderofori, agen: chelan: del ferro a cui esso si lega venendo così solubilizzato e trasportato nella cellula. I terreni di coltura sono substra: che contengono sostanze che permePono la crescita dei microrganismi, quindi per i baPeri i terreni devono sempre includere fon: di carbonio, azoto, fosforo e zolfo mentre ossigeno e idrogeno vengono presi dall’atmosfera e gli elemen: come Mg, Ca, Fe e K sono necessari in quan:tà ridoPe rispePo a quelli sopraelenca: e possono essere addiziona: ai terreni. Si hanno poi i micronutrien:, ovvero elemen: richies: in quan:tà molto minori rispePo ai preceden:, come Cu, Mn, Zn, Co e Ni: possono essere presen: come tracce contaminan: nell’acqua oppure come impurità nei sali, nella vetreria o nelle sostanze u:lizzate per creare i terreni. Altri compos: organici necessari in piccole quan:tà possono essere faPori di crescita e vitamine. I terreni possono essere o liquidi o solidi e sono u:lizza: per diversi scopi: TERRENI LIQUIDI Sono i più semplici da preparare e vengono sopraPuPo u:lizza: (sia in laboratori di ricerca che clinici) per far crescere grandi quan:tà di microrganismi. Ad esempio, per fare delle midiprep o delle miniprep si eseguono delle pre-colture di baPeri in brodo. Lo stesso vale nei laboratori analisi, dove spesso si u:lizzano dei terreni di arricchimento prima di col:vare il campione biologico sul terreno solido. I terreni liquidi però hanno un limite: non possono separare diﬀeren: organismi a meno che non vengano inocula: con una coltura pura, a diﬀerenza dei terreni solidi. 17 Nell’immagine (soPo) si può vedere un esempio di terreno liquido u:lizzato in laboratorio analisi: quando si ha il sospePo di un’infezione sistemica, si preleva un campione di sangue dal paziente e al ﬁne di iden:ﬁcare la presenza di baPeri viene inoculato in ques: due terreni di coltura (uno permePe la crescita di baPeri aerobi mentre l’altro degli anaerobi), dopodiché i terreni vengono inocula: in sistemi automa:zza: (incubatori a 37°C) in cui vengono mantenu: in agitazione. Nel caso in cui venga rilevata una torbidità, che è indice di crescita in terreno liquido, il sistema allerta l’operatore, che preleva il materiale biologico e lo semina su terreni solidi. TERRENI SOLIDI Sono solitamente contenu: in piastre anche dePe capsule di Petri e sono terreni gela:nosi in quanto sono cos:tui: principalmente da agar. L’agar è un estraPo polisaccaridico di un’alga marina. Solitamente per fare dei terreni solidi si u:lizza una percentuale dell’1.5% di agar. La peculiarità dell’agar è che scioglie a 80- 90°C e rimane liquido a ﬁno a 40-42°C, al di soPo dei quali solidiﬁca (è considerato un agente solidiﬁcante), pertanto alle temperature a cui viene solitamente u:lizzato, 37°C e 4°C (temperatura di conservazione dei terreni di coltura), l’agar sarà solido. Sono pochi i microrganismi in grado di degradare l’agar, che quindi non viene metabolizzato (ovvero non viene usato come fonte di carbonio) e non è tossico. Inoltre, non viene alterato dalle temperature di sterilizzazione del terreno. Come si può apprezzare la crescita di microrganismi in un terreno? La crescita su terreno liquido si evidenzia con la torbidità, nell’immagine a destra si può notare come la terza provePa sia in crescita in quanto più torbida rispePo alle altre. La crescita su terreno solido invece si può apprezzare osservando la comparsa di colonie, aggrega: di cellule derivan: da una prima cellula. Una colonia baPerica può contenere da 1 a 10 milioni di baPeri, circa 20 generazioni dalla cellula iniziale, questo perché il terreno solido immobilizza le cellule che discendono da una cellula iniziale e che rimangono così ancorate ad uno stesso punto. Questo aggregato di cellule si chiama colonia: una massa visibile ad occhio nudo formata da cellule derivan: da molteplici divisioni. Per seminare un terreno solido immaginiamo di par:re da un inoculo presente in un terreno liquido, l’ansa (uno strumento che presenta ha un loop terminale che permeIe di prelevare un volume ﬁsso, ci sono anse da 1 o 10 microlitri e possono essere monouso o in metallo) viene sterilizzata a calore e poi faPa raﬀreddare per non bruciare i baPeri, in seguito si preleva dalla sospensione liquida presente in provePa un’ansata di inoculo che poi viene strisciato sul terreno agarizzato. Il metodo più u:lizzato è il piastramento a quaPro quadran:. Per eseguire il piastramento a quaPro quadran: il materiale verrà depositato in un primo quadrante, in seguito con l’ansa verranno esegui: strisci successivi nel quadrante A, la piastra verrà poi ruotata e verranno esegui: strisci successivi nel quadrante B e successivamente anche nel C e nel D. A questo punto la piastra viene coperta, capovolta e inserita nell’incubatore a 37°C e tra le 16 e le 24 ore successive nel primo quadrante si osserverà una crescita conﬂuente ma non si dis:ngueranno le colonie, essendo qui il materiale molto concentrato, invece negli strisci successivi, in par:colare nell’ul:mo quadrante, si potranno apprezzare le colonie separate. 18 Partendo invece da una sospensione composta da una popolazione mista di cellule baPeriche, come spesso accade nei campioni biologici (oltre al patogeno si possono trovare anche dei baPeri commensali), piastrando il materiale si oRene una coltura mista: ci sono diversi :pi di baPeri, pertanto si possono apprezzare diversi :pi di colonie. Il vantaggio del terreno solido rispePo al terreno liquido è che permePe di alles:re colture pure o omogenee, ossia è possibile prelevare una colonia isolata ed eseguire una sub coltura, ovvero si semina la colonia isolata su una nuova piastra oPenendo così una coltura pura formata da un solo :po di microrganismo (questo non sarebbe possibile su un terreno liquido). Microrganismi diversi possono dare origine a colonie diﬀeren:, nell’immagine si può apprezzare la diﬀerenza tra colonie baPeriche (in alto) e colonie fungine (in basso), che sono delle muﬀe ﬁlamentose. Solitamente le colonie di baPeri crescono ﬁno ad una dimensione standard, a diﬀerenza delle muﬀe che crescono indeﬁnitamente. Nell’immagine si possono vedere i principali aspeR che caraPerizzano la morfologia delle colonie baPeriche e per cui queste diﬀeriscono. Sono classiﬁcate in base a diversi parametri: - La forma o Circolare, :pica dei baPeri o Rizoide, :piche dei funghi o Irregolare o Filamentoso - Il bordo o Intero o Ondulato o Lobato o Rizoide o Filamentoso, come per le muﬀe - La sezione o PiaPe o Sollevate o Convesse o Pulvinate o Umbonate - La dimensione - La tessitura o Liscia o Rugosa - L’aspePo o Brillante o Opaco - La pigmentazione (colonie possono essere pigmentate o meno) - Le proprietà oRche (opache, traslucen: o trasparen:) TuPe queste caraPeris:che possono avere valore diagnos:co, pertanto colonie di diverse morfologie: 19 - Appartengono a diversi microrganismi - Appartengono allo stesso microrganismo ma cresciuto su terreni diversi, questo è reso possibile dall’u:lizzo delle proprietà metaboliche dei baPeri. Come già dePo, col:vare i baPeri è una delle tecniche più u:lizzate nei laboratori diagnos:ci clinici. Per diagnosi si intende l’iden:ﬁcazione di un patogeno a par:re da un campione biologico prelevato da un paziente con sospePa malaRa infeRva. Si possono iden:ﬁcare due :pi di diagnosi: Diagnosi direPa: ha lo scopo di rilevare direPamente il microrganismo patogeno o le sue componen: quali, ad esempio, gli an:geni o il genoma. Nell’immagine accanto si può notare sulla sinistra il ﬂusso di even: che caraPerizzano la diagnosi direPa: partendo dal campione biologico prelevato dal paziente con sospePa malaRa infeRva, si eseguono le indagini microbiologiche. Nel caso della diagnosi direPa, il campione biologico può essere uno qualsiasi, ad esempio sangue, feci, urine, sperma tessu: bio:ci o secrezioni vaginali. A par:re da questo campione biologico le tecniche diagnos:che u:lizzate possono basarsi su tecniche convenzionali come, ad esempio, la coltura del microrganismo (descriPa precedentemente): il campione viene strisciato su terreni di coltura e al ﬁne di isolare e iden=ﬁcare il patogeno la coltura deve essere sempre pura. In seguito, il campione viene seminato su una serie di terreni che variano a seconda dell’agente eziologico sospePato e poi, a par:re dalla coltura pura che si esegue mediante subcoltura, si prende una colonia ben isolata si esegue l’iden:ﬁcazione del microrganismo. La coltura pura è fondamentale per iden:ﬁcare il patogeno e per eseguire gli studi di sensibilità agli an:bio:ci, ovvero l’an:biogramma. In parallelo, a par:re dal campione biologico, si possono eseguire tecniche diagnos=che molecolari che si basano sulla ricerca dell’an:gene o del genoma del patogeno. Le tappe fondamentali di una diagnosi baPeriologica convenzionale basata sulla coltura sono: 1. A par:re da un campione biologico, il materiale viene seminato su terreni agarizza:, in alcuni casi e in alcune condizioni è fondamentale l’osservazione microscopica del campione, previa colorazione. Le due principali tecniche sono la colorazione di Gram, per individuare i baPeri Gram+ e Gram -, e la colorazione di Ziehl- Neelsen per i micobaPeri. Molto spesso non viene subito eﬀePuata un’osservazione microscopica direPa dal campione biologico, mentre in altre condizioni è molto importante. La colonia cresciuta viene osservata al microscopio ed è fondamentale che la sospensione della colonia avvenga in una soluzione ﬁsiologica, al ﬁne di poter apprezzare in maniera dis:nta i microrganismi. 2. A par:re dalla col:vazione sui terreni si oPengono delle colonie e da quelle meglio isolate si esegue una subcoltura per oPenere la coltura pura. 3. A par:re dalla coltura pura, viene eseguita l’iden:ﬁcazione del patogeno mediante test biochimici che sfruPano il metabolismo dei baPeri. Ques: test biochimici possono essere presen: su kit miniaturizza: manuali come l’Api o sfruPano sistemi automa:zza:, in entrambi i casi lo scopo è oPenere l’iden:ﬁcazione del baPerio 4. Si esegue l’an:biogramma Quando a par:re da un campione biologica è fondamentale eseguire l’osservazione microscopica? Si possono citare alcuni esempi: 20 1- Tampone vaginale. Se vi è un sospePo di vaginite si eseguono più tamponi: uno verrà strisciato sul vetrino e colorato con colorazione di Gram per l’osservazione microscopica, mentre un altro verrà direPamente strisciato sui terreni. L’osservazione microscopica in questo caso è fondamentale perché in una donna sana fer:le è presente un abbondante microbiota formato da lactobacilli, bacilli Gram+ che, grazie al loro metabolismo, mantengono il pH acido. Se si osserva una ricca popolazione di lactobacilli non è presente la condizione di vaginite. Invece, in presenza di un patogeno, come si vede nella seconda immagine, la popolazione di lactobacilli è molto ridoPa e in questo caso è possibile osservare la presenza di un patogeno che nella maggior parte dei casi è un lievito: la Candida albicans che, essendo un fungo, presenta dimensioni 10 volte maggiori rispePo ai baPeri e alla colorazione di Gram appare blu (terza immagine). La vaginite può anche essere causata da un protozoo ﬂagellato come il Trichomonas vaginalis (quarta immagine) o da altri baPeri patogeni. 2- EspePorato. L’espePorato rappresenta il materiale secreto dalle basse vie respiratorie, ne viene eseguita l’osservazione microscopica per valutarne l’idoneità. Il campione viene strisciato e colorato con la colorazione di Gram, in questo caso si possono apprezzare cellule della mucosa boccale (in viola) su cui sono adesi i baPeri (cocchi nella seconda immagine, bacilli nella terza). Se si osservano cellule epiteliali del cavo orale, l’espePorato è considerato non idoneo poiché la loro presenza implica anche quella dei baPeri della cavità orale che sono considera: contaminan:, siccome nell’espePorato l’obbieRvo è l’iden:ﬁcazione del patogeno che causa l’infezione delle basse vie respiratorie. 3- Campioni sterili. Possono essere ad esempio il sangue o il liquor, ovvero campioni che non presentano una ﬂora, di conseguenza è fondamentale l’osservazione microscopica per deﬁnire la morfologia dei baPeri patogeni. Nell’immagine si possono osservare i diplococchi associa: ai leucoci: e responsabili delle meningi:. In base alla composizione dei terreni si possono iden:ﬁcare diverse categorie: - Terreni sinte:ci o minimi o a composizione chimica deﬁnita: ques: terreni sono semplici e tuPe le loro componen: sono note, ovvero si conosce precisamente la quan:tà di sostanze organiche e inorganiche da aggiungere all’acqua dis:llata per poterlo sinte:zzare. Ques: :pi di terreni vengono usa: in par:colari condizioni sperimentali, come per studiare un metabolismo cellulare o per oPenere un par:colare stato ﬁsiologico di coltura. Sono usa:, ad esempio, per la selezione di un microrganismo capace di oPenere N dall’ azoto atmosferico (baPeri azoto ﬁssatori), in questo caso si preparerà un terreno ricco di C, P e S ma privo di N, in questo modo solo i microrganismi in grado si ﬁssare N2 atmosferico cresceranno, mentre gli altri moriranno. Nella tabella sono elencate le caraPeris:che del terreno sinte:co necessario per la crescita di Bacillus megaterium, si traPa di un terreno a composizione chimica deﬁnita per la crescita di un baPerio eterotrofo: è un terreno liquido contenente saccarosio come fonte di C ed energia, oltre ad una serie di sali usa: come fon: di K, Mg, Fe e Mn. Come si può vedere dalla tabella, le concentrazioni da sciogliere in acqua a pH 7 sono deﬁnite e note. Un altro esempio di terreno a composizione chimica deﬁnita è quello del Thiobacillus thioxidans, un baPerio litoautotrofo. Anche in questo caso è un terreno liquido in cui la fonte di C è la CO2, 21 mentre quella di energia è lo zolfo elementare. In questo caso il baPerio cresce a pH 3. - Terreni complessi: la loro composizione non è del tuPo nota in quanto sono cos:tui: da materiali organici a basso costo, spesso si traPa di sostanze digerite come estraR di carne, ad esempio il triptone e il peptone, prodoR solubili proteici crea: dalla diges:one enzima:ca della carne, sono proteine parzialmente idrolizzate, oppure possono essere estraR di soia o di lievito (ricchi di vitamine), sangue animale o caseina digerita. Nella tabella si vede la composizione di un terreno complesso per la crescita di baPeri esigen: dal punto di vista nutrizionale, come fonte di C ed energia vengono u:lizza: il glucosio e il pectone, gli estraR di carne e lievito sono, invece, fon: di vitamine e altri faPori di crescita. Questo terreno essendo solido presenta l’agar. - Terreni seleRvi: (sono i più u:lizza: nei laboratori analisi e diagnos:ci) sono terreni che favoriscono la crescita di uno o più microrganismi, ma inibiscono quella di altri grazie alla presenza di inibitori. Un esempio è il MacConkey agar, un terreno seleRvo per i baPeri enterici poiché con:ene sali biliari che inibiscono la crescita della maggior parte dei baPeri Gram+ e di alcuni Gram-, ma permePe quella dei baPeri enterici, abitua: a crescere nell’intes:no degli animali. - Terreni diﬀerenziali: permePono la dis:nzione dei baPeri in crescita sfruPando le loro par:colari aRvità metaboliche. Un esempio è di nuovo il MacConkey agar, che con:ene un indicatore cromogeno che permePe di dis:nguere la presenza di acidi prodoR dal metabolismo dei baPeri. BaPeri che fermentano un par:colare zucchero come il glucosio produrranno degli acidi che faranno virare l’indicatore di pH a rosso, il che rivela aRvità metaboliche svolte dal microrganismo in crescita, mentre il viraggio non avviene per quei baPeri che non fermentano quel par:colare zucchero, pertanto le loro colonie rimarranno bianche. È possibile disegnare un terreno sia seleRvo che diﬀerenziale (come il MacConkey agar), ad esempio nell’immagine si può vedere come E. Coli è capace di crescere su diversi terreni diﬀerenziali dando colonie di colore diverso, in quanto ques: terreni sfruPano metabolismi diversi. Nella tabella è riportata la composizione del MACCONKEY AGAR: o come fonte di C ed energia si u:lizzano il peptone ed il laPosio, o i sali biliari e il cristalviolePo inibiscono la crescita di baPeri Gram+ o NaCl come fonte di Na e Cl o L’indicatore di pH è il rosso neutro o L’agar a pH 7 È uno dei terreni più u:lizza: per le colture di baPeri enterici in diagnos:ca. È un terreno seleRvo per i baPeri enterici Gram-, quindi sia Escherichia coli che Salmonella typhimurium vi cresceranno. È un terreno diﬀerenziale per il metabolismo, in quanto permePe di dis:nguere baPeri che fermentano il laPosio come E. coli, che darà colonie rosa poiché farà virare il pH, da baPeri che non lo fermentano come Salmonella typhimurium, che darà, invece, colonie trasparen:. (Oltre a virare il colore delle colonie, virerà anche quello del terreno). 22 Un altro terreno seleRvo e diﬀerenziale molto u:lizzato è il MANNITOL SALT AGAR. È seleRvo per i baPeri del genere Staphylococcus poiché è presente il sale, NaCl al 7.5%, e i baPeri di questo genere sono alotolleran: e riescono quindi a crescere in presenza di elevate percentuali di sale, mentre la maggior parte degli altri baPeri no. È diﬀerenziale per la presenza del mannitolo: si valuta la capacità di metabolizzare il mannitolo. Lo Staphylococcuys aureus cresce come Staphylococcuys epidermidis, ma mentre S. aureus provocherà un viraggio di pH a giallo poiché metabolizza il mannitolo liberando degli acidi che fanno virare l’indicatore di pH rosso fenolo, S. epidermidis non farà virare l’indicatore e le sue colonie rimarranno trasparen:. L’ul:mo terreno che citeremo è il BLOOD AGAR, un terreno di arricchimento per la crescita di baPeri esigen: e diﬀerenziale in quanto permePe di dis:nguere i baPeri produPori delle emolisine. Le emolisine sono delle esotossine prodoPe dal baPerio in grado di provocare la lisi dei globuli rossi. Il grado di emolisi è uno strumento per l’iden:ﬁcazione di mol: cocchi Gram+. Si hanno: BaPeri ß emoli:ci che producono le E emolisine, che lisano completamente i globuli rossi e l’Hb presente nel terreno, per questo genereranno un alone trasparente aPorno alle colonie; BaPeri alpha emoli:ci che producono le D emolisine, che causano una lisi parziale dei globuli rossi, per questo sarà visibile un alone verdastro aPorno alle colonie; BaPeri non emoli:ci (gamma emolisi) che non causano emolisi e quindi non fanno variare l’aspePo del terreno. Nell’immagine si possono vedere le piastre con baPeri ß emoli:ci, come Streptococcus pyogenes, in cui è visibile l’alone trasparente aPorno alle colonie, baPeri alpha emoli:ci come Streptococcus faecadis e baPeri gamma emoli:ci. È importante ricordare che i terreni che vengono usa: nei laboratori di diagnos:ca variano a seconda dei campioni biologici u:lizza:, ad esempio per le urine sono molto usa: l’agar sangue e il MacConkey agar. Per l’espePorato, invece, in cui è molto importante l’osservazione microscopica previa colorazione di Gram, si u:lizza un numero molto elevato di terreni per cercare di iden:ﬁcare il maggior numero possibile di potenziali patogeni delle basse vie respiratorie. Ad esempio, vengono u:lizza:: MacConkey agar, Blood agar, Cromagar (usato per l’iden:ﬁcazione delle diverse specie di candida che daranno diverse colorazioni delle colonie) e agar cioccolato, che con:ene discheR di carta assorbente imbevu: di an:bio:co come la bacitracina o l’optochina, addizionato per iden:ﬁcare il patogeno siccome sono note le sensibilità degli streptococchi (incubato in incubatore a CO2 richiesta per la crescita dei baPeri). 23 La col:vazione dei microrganismi è una delle tecniche più u:lizzate nella diagnosi direPa insieme all’osservazione microscopica alla ricerca di an:geni microbici, sfruPato sopraPuPo in test immunocromatograﬁci. Una delle tecniche più avanzate, al momento, è la rilevazione del genoma mediante real-:me PCR. Oltre alla diagnosi direPa, può essere impiegata la diagnosi indirePa al ﬁne di inden:ﬁcare il patogeno e si basa sulla ricerca di an:corpi contro il sospePo patogeno. In questo caso il campione biologico è il sangue. È molto u:lizzata, bas: pensare allo screening in gravidanza per evidenziare infezioni potenzialmente patogene per il feto (toxoplasmosi, citomegalovirus...) o allo screening della popolazione per HIV. Ques: test diagnos:ci sierologici u:lizzano come tecnologia l’ELISA, un saggio immunoenzima:co in cui viene misurata l’aRvità enzima:ca associata agli immunocomplessi, ossia sfruPa la reazione an:gene-an:corpo: per rilevare l’an:gene si usano an:corpi marchia: con enzimi, in seguito viene addizionato un substrato per rilevare l’aRvità dell’enzima. L’ELISA può essere usato sia per ricercare l’an:gene che per ricercare l’an:corpo. 24 Lez. 4 Prof.ssa Donalisio COLORAZIONI BATTERICHE È necessario colorare i baPeri perché ques: sono incolori, trasparen:, per cui la colorazione permePe di aumentare il contrasto tra i microrganismi e il fondo. La colorazione dei baPeri è quindi ﬁnalizzata all’osservazione microscopica, che permePe di deﬁnire diversi parametri, tra cui: dimensione, forma e disposizione; dis:nzione tra Gram+ e Gram-; iden:ﬁcazione di spore e studiare le loro proprietà chimiche e struPurali. Si traPa, nel complesso, di caraPeris:che u:li in diagnos:ca per l’iden:ﬁcazione baPerica. Nell’immagine che segue si dis:nguono (da sinistra a destra) streptococchi a catenelle, cocchi a grappolo, streptobacilli e bacilli isola:. Procedura per la colorazione baPerica: 1. Alles:re il preparato per la colorazione; 2. Eseguire la colorazione (semplice o diﬀerenziale); 3. Osservazione microscopica. Le principali colorazioni diﬀerenziali usate oggi sono la colorazione di Gram e la colorazione di acido-resistenza per i micobaPeri. Analizzando più in dePaglio gli step, innanzituPo occorre strisciare la coltura su un vetrino, formando uno strato soRle, poi si asciuga all’aria e si passa sulla ﬁamma, sia perché il campione si ﬁssi al vetrino, sia per uccidere i microrganismi. A questo punto, il preparato viene ricoperto con il colorante, risciacquato e nuovamente asciugato, dopodiché si osserva al microscopio: nel caso dei baPeri, l’osservazione avviene mediante l’obieRvo 100x e con l’addizione di una goccia di olio di cedro disposta sul vetrino. Il campione che deve essere strisciato su vetrino può provenire da una cultura liquida oppure da una piastra agarizzata (si prelevano le colonie), mentre il materiale deve comunque essere prelevato con l’uso delle anse (di metallo o monouso di plas:ca). In par:colare, le anse di metallo sono u:lizzate in laboratorio e sterilizzate per incandescenza sulla ﬁamma di un becco Bunsen prima di ogni nuovo u:lizzo, per cui bisognerà farla raﬀreddare prima di prelevare i baPeri. Le anse terminano con un piccolo loop che può assumere dimensioni diverse a seconda che si voglia prelevare un campione di 1 μL o di 10 μL. Così come l’ansa, anche l’apertura della provePa dovrebbe essere sterilizzata, dopodiché si preleva il materiale, si risterilizza l’apertura della provePa e si richiude. A questo punto, il materiale viene posto e steso sul vetrino, cercando di formare uno striscio soRle. 25 Nel caso in cui il materiale sia stato prelevato da un terreno solido, allora è fondamentale risospendere la colonia con soluzione ﬁsiologica o acqua, altrimen: all’osservazione microscopica sarà impossibile dis:nguere i microrganismi isola:, ma si vedrà soltanto un unico aggregato colorato. Una volta completata la stesura su vetrino, lo striscio viene ﬁssato con il calore, facendo passare circa tre volte il vetrino sulla ﬁamma, non troppo per non rischiare di alterare il preparato. Una volta adeso, è possibile osservare la pa:na opaca sul vetrino, solo allora si potrà procedere con la colorazione. Come già an:cipato, le colorazioni possono essere di due :pi: COLORAZIONE SEMPLICE: si avvale di un singolo colorante basico (es. cristal violePo, blu di me:lene, safranina) che, in quanto dotato di carica posi:va, avrà aﬃnità per le struPure acide a carica nega:va, come le superﬁci cellulari, le proteine e gli acidi nucleici. Si traPa di una colorazione direPa, che permePe di colorare le cellule baPeriche basoﬁle ed evidenziarne la dimensione, la forma, la disposizione e l’organizzazione cellulare. Di seguito, esempi di cocchi a grappolo (a sinistra) e streptobacilli a catenella (a destra) blu. Invece, coloran: acidi come l’eosina sono dota: di carica nega:va e hanno aﬃnità per struPure basiche. Si depositano aPorno al microrganismo, pertanto in questo caso viene dePa colorazione indirePa o nega:va. COLORAZIONE DIFFERENZIALE: sono le più u:lizzate nei laboratori, in quanto permePono la diﬀerenziazione dei baPeri sulla base della composizione chimica della loro parete cellulare. Queste colorazioni si avvalgono di due coloran:: colorante primario e colorante secondario (o di contrasto), intervalla: da uno step di decolorazione. A seconda della composizione chimica della parete, i baPeri o traPengono il colorante primario durante la decolorazione o perdono il primario e acquisiranno poi il colorante di contrasto. COLORAZIONE DI GRAM Tra le colorazioni più u:lizzate in laboratorio si ritrova quella di Gram, che prende il nome da Chris:an Gram, il baPeriologo danese che la sviluppò per diﬀerenziare due :pologie di baPeri responsabili entrambi di polmonite, ma che risultavano essere struPuralmente molto diversi: Streptococcus pneumoniae (pneumococco), che sappiamo oggi essere Gram+, e Klebsiella pneumoniae, ad oggi un noto baPerio Gram-. Nonostante sia stata sviluppata nel 1984, oggigiorno è ancora una delle colorazioni più impiegate, in alcuni casi in grado di dare anche un’iden:ﬁcazione presun:va. Il protocollo per la colorazione di Gram di compone delle seguen: tappe: 1) Si aggiunge il colorante primario (cristalviolePo al 2% per 1 minuto); 2) Si addiziona il liquido di Lugol, una soluzione iodurata mordenzante in grado di ﬁssare il colorante in virtù del faPo che forma complessi insolubili iodio-cristalviolePo che precipitano all’interno della cellula; 3) Si lava con acqua il vetrino per togliere il residuo di Lugol; 4) Si addiziona il decolorante (alcol 50% - acetone 50%) e lo step nel complesso deve durare 20 secondi; 5) Si lava via l’eccesso di decolorante; 6) Si aggiunge il colorante secondario (safranina allo 0.25% per 45 secondi/1 minuto); 7) Si lava con acqua; 8) Si asciuga con carta bibula (carta porosa), tamponando delicatamente evitando di danneggiare il preparato. Nel momento in cui si eﬀePua la colorazione primaria, tuPe le cellule, che siano Gram+ o Gram-, si coloreranno di blu/viola, colorazione che permane anche dopo l’aggiunta del liquido di Lugol, che forma cristalli con il colorante primario nella cellula baPerica. Dopo aver risciacquato una prima volta il vetrino, il decolorante condensa per disidratazione la struPura del pep:doglicano, per cui i Gram+ restano viola, mentre i Gram- perdono la colorazione. 26 Il mo:vo per cui i Gram- tornano incolore sta nel faPo che, in ques: baPeri, il decolorante agisce come solvente lipidico, dissolvendo la membrana esterna, e rilascia così il complesso cristalviolePo- liquido di Lugol. Così facendo, nel momento in cui si addiziona la safranina, il colorante secondario lo acquisiranno soltanto i baPeri Gram-. Alla ﬁne dell’esperimento, i baPeri Gram+ risulteranno viola, mentre quelli Gram- risulteranno rosa/rossi. Si asciuga poi il tuPo con carta bibula. La diversa reazione alla colorazione di Gram è quindi dovuta a diﬀerenze struPurali nella parete cellulare: mentre la parete dei Gram+ è caraPerizzata da uno spesso strato di pep:doglicano, aPraversato da acidi teicoici e lipoteicoici, la parete dei Gram- è caraPerizzata da uno strato molto soRle di pep:doglicano, in uno spazio pericitoplasma:co, sovrastato da una membrana esterna. Si traPa quindi di diﬀerenze struPurali che conferiscono una diversa permeabilità, che è maggiore nei Gram- (minor pep:doglicano) e minore nei Gram+ (maggior pep:doglicano). Qui raﬃgurata l’immagine al microscopio di cocchi Gram+ a grappolo: si traPa di Staphylococcus aureus. TuPavia, la sola colorazione di Gram non permePe di dare iden:ﬁcazione deﬁni:va, ma solo presun:va e soltanto nel caso ci sia un sospePo che si traR proprio di ques: baPeri. Lo Staphylococcus aureus è patogeno e anche commensale in diverse zone anatomiche, ma in ogni caso è capace di produrre tossine ed enzimi extracellulari e diventare a tuR gli eﬀeR un importante patogeno per l’uomo, in grado di dare manifestazioni cliniche in diversi distreR corporei. Qui invece è raﬃgurato Escherichia coli, un bacillo Gram- (cellule rosso/rosa) commensale dell’intes:no. Anche in questo caso esistono ceppi patogeni per l’uomo (enteroinvasisi, enteropatogeni, enterotossigeni, enteroemorragici, ecc.). La colorazione di Gram permePe anche di osservare microrganismi presen: in elemen: come, in questo caso, lo yogurt (a sinistra), dove si dis:nguono catenelle di streptococchi, bacilli Gram+ e Gram-, anche se rimane comunque una tecnica molto importante nella diagnosi clinica, dove ad esempio si eﬀePuano osservazioni al microscopio di uno striscio di pus, dove sono visibili i diplococchi associa: a leucoci: (al centro): molto probabilmente si traPa di Neisseria gonorrhoeae, baPerio a trasmissione sessuale Gram-. Inﬁne, osservazione al microscopio della ﬂora del cavo orale umano (a destra) dove, grazie a un semplice tampone orale, è possibile osservare bacilli e cocchi, così come a volte lievi: del :po Saccharomyces cerevisiae che, dal punto di vista morfologico e di colonie, su terreni agarizza:, sono simili a baPeri, solo più grossi e assumono colorazione blu se colora: con colorazione di Gram. L’osservazione microscopica previa colorazione di Gram è estremamente importante, in quanto permePe di studiare l’idoneità del campione da soPoporre a coltura, di eseguire un espePorato, che non deve presentare cellule epiteliali del cavo orale perché presumibilmente contaminan:, e inﬁne per varare diagnosi eziologiche presun:ve, come nel caso di presenza di baPeri in campioni biologici normalmente sterili (sospeR di infezioni come meningite, polmonite, seRcemia) o nel caso del tampone vaginale, dove spesso si constata la massiccia presenza di funghi come Candida albicans o altri baPeri patogeni o protozoi. Inoltre, l’osservazione microscopica previa colorazione di Gram è anche 27 un oRmo ausilio per interpretare l’esame colturale, mentre non ha senso farla su campioni clinici come feci o escreato, dove la ﬂora patogena non può essere diﬀerenziata da quella commensale, e nemmeno se si sospePa tubercolosi (per i mycobaPeri la colorazione è un’altra). COLORAZIONE DI ACIDO RESISTENZA La colorazione di acido-resistenza invece è stata messa a punto da Paul Ehrlich, ﬁsico tedesco, che la sviluppò nel 1882 per colorare il bacillo della tubercolosi (Mycobacterium tuberculosis), anche se in realtà questa colorazione permePe di evidenziare tuR i baPeri del genere Mycobacterium, in quanto possiedono caraPeris:che struPurali di parete comuni. Ad oggi si parla di COLORAZIONE DI ZIEHL-NEELSEN, che sono due scienzia: che hanno modiﬁcato la colorazione originale, anche se quella più impiegata oggigiorno, derivata a sua volta dalla colorazione di Ziehl-Neelsen, è la COLORAZIONE DI KINYOUN, che prevede l’u:lizzo di carbolfucsina a freddo (nel protocollo di Ziehl-Neelsen l’u:lizzo di carbolfucsina era a caldo). Nel complesso, la colorazione di acido-resistenza permePe di dis:nguere i baPeri sulla base del loro contenuto lipidico nella parete cellulare. In par:colare, baPeri che hanno un alto contenuto lipidico mantengono il colorante primario (carbolfucsina addizionata per 5 minu:) quando decolora: con alcol-acido; pertanto ques: baPeri vengono deR alcol-acido resisten: (baPeri del genere Mycobacterium). invece, i baPeri che hanno un basso contenuto lipidico perdono la carbolfucsina quando decolora: con alcol-acido e acquisiscono il colorante secondario di contrasto (blu di me:lene); pertanto ques: vengono deR non acidi resisten: (baPeri Gram+ e Gram-). I micobaPeri acquisiscono la colorazione della carbolfucsina perché loro parete cellulare è ricca di cere e lipidi: osservando nel dePaglio la sua composizione, si nota che sopra la membrana citoplasma:ca c’è uno strato molto soRle di pep:doglicano ricoperto esternamente da una struPura ricca di lipidi e carboidra: (arabilogalaPani lega: ad acidi micolici, acidi grassi a lunga catena a cui sono lega: i glicolipidi fenolici) e aPraversata da molecole glicolipidiche, ancorate alla membrana citoplasma:ca (lipoarabinomannani e mannofosfoinosi:di). Il protocollo dell’alcol-acido resistenza consiste nelle seguen: tappe: 1. Si aggiunge il colorante primario (vecchio protocollo: carbolfucsina per 5 minu: a calore perché la soluzione del colorante doveva emePere vapori visibili; nuovo protocollo: carbolfucsina per 5 minu: a freddo); 2. Si lava con acqua; 3. Si decolora con alcol-acido (3% HCl – etanolo al 95%); 4. Si lava con acqua; 5. Si addiziona il colorante di contrasto (blu di me:lene per 2 minu:); 28 6. Si lava con acqua; 7. Si asciuga con carta bibula. Qui è riportata l’immagine del preparato: i baPeri appartenen: al genere Mycobacterium si colorano di rosa (alcol acido resisten:), mentre gli altri baPeri e i detri: cellulari si colorano di blu. Ad oggi questa è una colorazione molto importante: nei paesi occidentali, dove i casi di tubercolosi si mantengono bassi, benché la colorazione di acido- resistenza non dia diagnosi deﬁni:ve, è fortemente presun:va (esistono anche altri baPeri tubercolari, ad es. baPeri commensali del cavo orale). Qualora questa colorazione dia esito posi:vo, bisognerà procedere con altre tecniche diagnos:che: viene eseguito l’esame colturale (semina del campione biologico su terreni solidi o liquidi in laboratori di biosicurezza 3, siccome il baPerio è altamente patogeno) in parallelo con il test degli acidi nucleici (si rileva il DNA del baPerio). La sola coltura non è suﬃciente perché l’esito colturale ha tempi lunghissimi (1-2 mesi) dal momento che, proprio a causa della parete ricca di lipidi, il baPerio si replica molto lentamente. Per questo mo:vo, ci si avvale anche della real-:me PCR, ampliﬁcando il genoma per il test degli acidi nucleici, dove il risultato arriva nel giro di poche ore. Inoltre, è fondamentale che, oltre all’iden:ﬁcazione del ceppo del baPerio della tubercolosi, si ricerchino anche le mutazioni nel cromosoma che conferiscono resistenza agli an:bio:ci, siccome si traPa di una terapia lunga e pesante che si avvale di quaPro farmaci diversi. Nei paesi in via di sviluppo, invece, dove i numeri i numeri di casi di tubercolosi sono decisamente superiori e le disponibilità economiche sono limitate, già l’osservazione microscopica del preparato colorato può dare diagnosi deﬁni:va, dopodiché in parallelo il campione viene inviato in centri di diagnosi specializza: per procedere con l’iden:ﬁcazione, anche se la probabilità che si traR eﬀeRvamente del baPerio della tubercolosi è molto elevata. COLORAZIONI SPECIALI Esistono poi colorazioni speciali, una di queste è la COLORAZIONE NEGATIVA PER LA CAPSULA BATTERICA, caraPeris:ca di alcuni baPeri e che impedisce la fagocitosi da parte di macrofagi. Siccome non può essere messa in evidenza con colorazione di Gram, si u:lizza l’inchiostro di china, che non penetra la capsula ma la evidenzia con un alone chiaro aPorno al baPerio. Un’altra COLORAZIONE è quella DEI FLAGELLl, che sono appendici locomotorie molto lunghe (10-30 nm di diametro) non visibili al microscopio elePronico. Questa colorazione u:lizza carbolfucsina e acido tannico (mordenzante), che inspessisce la struPura ﬂagellare per renderla visibile all’osservazione microscopica. ESAMINAZIONE AL MICROSCOPIO Il microscopio oRco in campo chiaro è il più u:lizzato per l’osservazione dei baPeri, ed è cos:tuito da degli oculari, un tavolino portaoggePo al di soPo del quale vi è un condensatore (sistema di len: che concentra la luce sul preparato, fornendo il cono di luce che penetra nell’obieRvo), una sorgente di luce, una manopola per la messa a fuoco e una serie di obieRvi. Nello schema viene evidenziato il percorso della luce aPraverso il microscopio: ci sono due len: (dell’oculare e dell’obieRvo) e l’ingrandimento del preparato è dato dal prodoPo degli ingrandimen: dell’oculare (ﬁsso, 10x) e dell’ingrandimento dell’obieRvo (regolabile, 10x, 40x, 100x). Nel caso dei baPeri, u:lizzando un obieRvo 100x ed essendo la lente dell’oculare 10x, si eﬀePua un ingrandimento di 1000 volte. I principali obieRvi u:lizza: in microbiologia: 40x (per visualizzare funghi, protozoi, parassi:); 100x (per visualizzare baPeri) con l’addizione di una goccia d’olio di cedro sul vetrino che deve prendere contaPo con l’obieRvo. 29 Per capire come mai l’addizione della goccia d’olio è così importante bisogna introdurre il concePo di risoluzione (d) di un microscopio, ovvero la distanza minima tra due oggeR che ne permePe il rilevamento come due en:tà separate (nel microscopio oRco, d = 0.2 μm). In par:colare, n·sinθ è l’apertura numerica, una proprietà della caraPeris:ca dell’obieRvo che misura l’abilità di caPurare la luce. La risoluzione dipende quindi dalle caraPeris:che della luce (λ) e dalle caraPeris:che delle len: dell’obieRvo (n·sinθ, dove θ è deﬁnito 1/2 del cono di luce che entra nell’obieRvo, mentre n è l’indice di rifrazione del materiale presente tra la lente e il vetrino). Se non si ponesse niente tra lente e vetrino e quindi fosse presente solo aria, allora naria = 1, se invece si addizionasse la goccia d’olio, allora nolio = 1.56: l’olio dunque aumenta la capacità di raccolta della luce da parte di una lente, confermato dal faPo che, sos:tuendo il valore di n nell’equazione, aumenta il denominatore e diminuisce il valore di d, permePendo così la visione di due baPeri come en:tà separate anche a una distanza minore di 0.2 μm. LE ENDOSPORE Sono forme cellulari specializzate per la sopravvivenza prodoPe da alcune cellule baPeriche in condizioni ambientali avverse, si traPa quindi di forme di resistenza. Vengono dePe endospore perché vengono sempre prodoPe all’interno di una cellula vegeta:va baPerica, mentre il processo viene deﬁnito sporulazione. Non tuR i baPeri sono sporigeni, ma solo alcune specie, come quelle appartenen: al genere Bacillus (Bacillus anthracis, Bacillus cereus) e al genere Clostridium (Clostridium botulinum, Clostridium tetani). In natura il processo avviene in condizioni sfavorevoli per la crescita e rappresenta pertanto un vantaggio seleRvo per un microrganismo del suolo, che può così sopravvivere nell’ambiente. Le spore risultano essere metabolicamente inaRve, si trovano quindi in uno stato di vita latente (criptobiosi), e sono forme altamente resisten: a diversi agen: e traPamen:, come elencato nella tabella, dove viene mostrato il tempo necessario per uccidere una cellula vegeta:va e una spora. Queste ul:me, in par:colare, risultano resisten: alle alte temperature, agli agen: chimici, agli an:bio:ci, a radiazioni UV e ionizzan:, persistendo così a lungo termine nell’ambiente. Sono inoltre impermeabili ai coloran:, per cui se si colorassero cellule baPeriche con colorazione di Gram, si intravedrebbero le spore nel corpo baPerico con una diversa distribuzione intracellulare (terminale o centrale), mentre risultano ancora più rifrangen: se osservate con il microscopio a contrasto di fase, a causa del loro basso contenuto di acqua. Le spore sono state u:lizzate come arma del bioterrorismo: nel 2001, degli uﬃci postali americani ricevePero delle buste contenen: spore di Bacillus anthracis, che vennero inalate dagli operatori. All’interno del corpo umano, dalla spora è possibile la germinazione del baPerio che, replicandosi, può dare origine a patologie respiratorie molto severe che possono provocare la morte. STRUTTURA DELL’ENDOSPORA Analizzando la struPura di una spora al microscopio elePronico, si nota che al centro c’è il protoplasto (core), caraPerizzato dalla presenza di citoplasma in quan:tà ridoPa e delimitato da una membrana derivante dalla membrana citoplasma:ca della cellula madre. Nel citoplasma del protoplasto si ritrovano ribosomi e il genoma completo, questo perché la spora è capace poi di dare origine a una cellula vegeta:va quando si troverà di nuovo in condizioni oRmali di crescita. I citocromi sono assen:, mentre è operante un nuovo sistema di trasporto degli eleProni e come riserva energe:ca u:lizza l’acido fosfoglicerico. Più esternamente alla membrana c’è la cortex, spesso strato cos:tuito da pep:doglicano modiﬁcato, caraPerizzato da laPami dall’acido muramico, che conferiscono una maggior resistenza al lisozima e una maggiore elas:cità. Esternamente alla corteccia, c’è una seconda membrana con polarità opposta alla membrana citoplasma:ca. Esternamente alla seconda membrana è presente un ulteriore rives:mento cos:tuito da tuniche, composte da diversi stra: proteici lamellari e ﬁbrillari, e alcune proteine delle tuniche hanno un ricco contenuto in cisteine, rendendo così possibile la formazione di pon: disolfuro. Inﬁne, esternamente alle tuniche c’è l’esosporio, una struPura esterna presente in alcune spore baPeriche di composizione chimica complessa (proteine, polisaccaridi o lipidi). La spora è così resistente in virtù del faPo che i faPori coinvol: sono diversi: innanzituPo, la presenza delle tuniche e della corteccia rappresentano una barriera per l’ingresso di sostanze esterne, come an:bio:ci e agen: chimici. Inoltre, è molto importante il basso contenuto in acqua a livello citoplasma:co (10-30% del contenuto d’acqua di una 30 cellula vegeta:va, con una consistenza simile a gel), che conferisce alla spora resistenza al calore, in quanto aumenta la stabilità delle macromolecole, insieme alla presenza dell’acido dipicolinico (cos:tuisce dal 5 al 15% del peso secco della spora), assente nelle cellule vegeta:ve ma presente nel citoplasma delle spore soPoforma di sali di calcio, con la funzione di ridurre il contenuto di acqua. Il pH del core citoplasma:co è di circa 1 unità più basso delle cellule vegeta:ve (pH di 5.5-6 contro il pH neutro delle cellule vegeta:ve). Per quanto riguarda invece la resistenza alle radiazioni, questo è possibile grazie a eﬃcien: meccanismi di riparazione dei danni provoca: sul DNA e grazie alla presenza delle SASP (small acid-soluble proteins), piccole proteine a basso peso molecolare acido-solubili presen: nel citoplasma della spora che, interagendo con il DNA, lo proteggono dalle radiazioni e rappresentano inoltre una riserva di amminoacidi ed energia per la germinazione. PROCESSO DI SPORULAZIONE (Cellula vegeta:va → Spora) Può essere dis:nto di 7 stadi: Stadio 0: cellula vegeta:va a ﬁne crescita esponenziale; Stadio 1: cessa la sintesi del DNA e questo si addensa, con formazione di cromosomi in via di replicazione; Stadio 2: formazione di un sePo asimmetrico derivato dall’invaginazione della membrana citoplasma:ca, in questo modo la cellula è come se fosse suddivisa in due compar:men:, uno di dimensioni maggiori (cellula madre) e uno di dimensioni minori (pre-spora). Il tuPo prende il nome di sporangio; Stadio 3: la membrana citoplasma:ca del compar:mento maggiore avvolge la spora, estendendosi, in modo tale che la pre-spora risul: avvolta in due membrane, una interna e una esterna, con polarità inverse; Stadio 4: disidratazione e formazione della corteccia primordiale, con deposizione di pep:doglicano fra le due membrane, iniziando così la formazione dell’esosporio; Stadio 5: incorporazione degli ioni Ca2+, un’ulteriore disidratazione, produzione di SASP e di acido dipicolinico, prosegue la formazione della corteccia, iniziano a formarsi le tuniche e l’eventuale esosporio si completa; Stadio 6: spora a completa maturazione; Stadio 7: liberazione della spora ad opera di enzimi li:ci. La sporulazione avviene mediante una cascata di even: di diﬀerenziamento cellulare e le modiﬁcazioni morfologiche che si osservano sono la conseguenza di diversi processi biochimici per l’aRvazione di geni spora-speciﬁci (es. SPO, SSP che codiﬁcano per le SASP), per cui si assiste alla sintesi di nuovo mRNA codiﬁcante per enzimi richies: per il processo morfogene:co (es. proteasi, nucleasi, amilasi, enzimi idroli:ci, ecc.) che, degradando le macromolecole presen:, ne consentono il riu:lizzo tramite i monomeri libera: per la sintesi di macromolecole speciﬁche per la spora. Inoltre, si è osservato che durante la sporulazione si assiste anche alla secrezione di an:bio:ci da parte di alcuni baPeri. Il processo di sporulazione è reversibile (tramite l’aggiunta di nuovo terreno o nuovi nutrien:) ﬁno a un certo stadio: esiste, quindi, un punto di non ritorno oltre il quale non avviene più la reversione, pertanto si deve procedere con la formazione della spora. La sporulazione avviene dunque aPraverso una serie di even: che si susseguono in una determinata sequenza e richiede un programma ben deﬁnito di espressione di gruppi diversi di geni, per cui alcuni verranno espressi e altri repressi. In par:colare, in Bacillus sub:lis è stato osservato che durante il processo di sporulazione u:lizza diverse RNA polimerasi, ciascuna contenente una diversa subunità σ per l’espressione dei geni richies: nei diversi even:. Da ricordare che il faPore σ è responsabile del riconoscimento di promotori speciﬁci da parte dell’RNA polimerasi. È stato osservato che i geni che codiﬁcano per nuovi faPori σ vengono espressi in una sorta di cascata, permePendo la trascrizione successiva di diversi operoni indispensabili per la formazione della spora. Alcuni faPori σ vengono espressi in maniera speciﬁca nella cellula madre, altri nella pre-spora, determinando così un’espressione diﬀerenziale di ques: geni ed è probabile che avvenga una comunicazione aPraverso il sePo, perché l’espressione genica risulta essere coordinata. Come fa a capire una cellula quando sporulare? In Bacillus sub:lis entrano in gioco diversi faPori, tra cui l’esaurimento di nutrien: e l’aumento della massa della coltura cellulare con secrezioni di pep:di. Si aRva quindi una cascata di even: di trasduzione del segnale, in cui il 31 ruolo chiave è giocato da Spo0k, proteina che viene fosforilata e aRva geni essenziali per la sporulazione, mentre ne reprime i repressori. GERMINAZIONE (Spora → Cellula vegeta:va) Processo inverso che dalla spora dà origine alla cellula vegeta:va, si dis:nguono tre fasi: Prima fase (preparatoria): aRvazione, un processo reversibile che in laboratorio è stato oPenuto tramite riscaldamento con calore sub-letale (70°C per 15 minu:), processo in cui non si hanno cambiamen: morfologici o ﬁsiologici delle spore, ma si traPa comunque di una fase importante dove probabilmente avviene il riarrangiamento delle macromolecole; Seconda fase: germinazione, avviene dopo inoculo in un terreno opportuno durante cui si assiste a cambiamen: morfologici e ﬁsiologici della spora, che in par:colare perde la rifrangenza, diventa di nuovo permeabile ai coloran: e perde la capacità di resistere al calore, alle radiazioni e agli agen: chimici. Può essere deﬁnita una fase catabolica di demolizione dei componen: della spora, graie all’azione di enzimi idroli:ci che degradano il pep:doglicano nella corteccia, con conseguente perdita della corteccia, per cui si ha la secrezione di acido dipicolinico, di ioni Ca2+ e di frammen: di pep:doglicano; Terza fase: esocrescita, rigonﬁamento delle dimensioni della spora per assorbimento di acqua e la cellula emerge dal rives:mento sporale. In questa fase avviene anche la perdita delle tuniche, mentre inizia il metabolismo di :po respiratorio, con una grande aRvità biosinte:ca (sintesi di RNA, di proteine e inﬁne di DNA). Al termine della germinazione si è riformata una cellula vegeta:va, per cui è di nuovo possibile la mol:plicazione e, in condizioni opportune, la formazione di una nuova spora (condizioni ambientali avverse). Di seguito è riportato un ar:colo sull’iden:ﬁcazione di inibitori della germinazione delle spore di Bacillus anthracis, di cui è importante studiarne il processo perché dal punto di vista pra:co hanno dei

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