Metodologie Quiz Part 1.1 PDF

‼ Il DNA per essere studiato deve essere purificabile (non ci deve essere RNA / proteine…) e amplificabile (devo avere a disposizione una quantità grande di materiale). Questo si può fare usando batteri in laboratorio clonando il frammento e il DNA viene mantenuto all’interno di un vettore come plas...

‼ Il DNA per essere studiato deve essere purificabile (non ci deve essere RNA / proteine…) e amplificabile (devo avere a disposizione una quantità grande di materiale). Questo si può fare usando batteri in laboratorio clonando il frammento e il DNA viene mantenuto all’interno di un vettore come plasmidi, fagi, cosmidi BAC, YAC… ma i più usati sono i plasmidi (permettono il clonaggio di un frammento non molto lungo a differenza ad esempio del fago, invece per fare libreria si usa BAC / YAC perché frammenti lunghi). VET TORI PLASMIDICI Plasmidi: molecole di DNA circolari ed extracromosomiche che vivono in maniera indipendente all’interno della cellula batterica. Si trovano nei batteri e in alcuni eucarioti unicellulari (es lievito) ma non negli eucarioti superiori. Conferiscono caratteristiche utili al batterio come la capacità di sopravvivere a concentrazioni tossiche di antibiotici. Ci sono plasmidi con all’interno DNA con attività enzimatica in grado di degradare prodotti tossici (es toluene) producendo qualcosa che induce la resistenza. In natura i plasmidi hanno dimensioni variabili da 1 kb fino a più di 250 kb. Il numero di copie rappresenta il numero di molecole di un singolo plasmide che si trovano all’interno di una cellula batterica: low copy number / high copy number (usate per il clonaggio per moltiplicare in fretta il plasmide). pUC19 è un plasmide artificiale usato in laboratorio. Per replicarsi all’interno dei batteri i plasmidi necessitano della sequenza ORI all’antibiotico e c’è una regione che è il lacZ che codifica per la 𝛃- (origine di replicazione). È stato introdotto un gene che induce resistenza galattosidasi. Si può avere il polylinker o MCS (multiple cloning site), regione di ~50-100 bp ricca di siti di restrizione che servono per il clonaggio. 2  TRASFORMAZIONE BAT TERICA In natura, nonostante sia un evento raro, può avvenire che il plasmide entra in una cellula batterica. È necessario in laboratorio selezionare i batteri trasformati dai non trasformati, per questo esiste il gene che codifica per l’antibiotico, chiamato marcatore di selezione, selezionando le cellule trasformate ovvero quelle che contengono il plasmide. Trasformazione: inserire all’interno di una provetta, contenente cellule trattate per aumentare l’efficienza di trasformazione, una soluzione che contiene il plasmide, si piastra in un terreno di coltura ottimale per la crescita del batterio contenente anche l’antibiotico della resistenza. In laboratorio la resistenza ad un antibiotico viene spesso usata come marcatore di selezione per assicurarsi che i batteri di una coltura contengano un particolare plasmide. Affinché il plasmide possa entrare nelle cellule batteriche (trasformazione) queste devono essere trattate, rese permeabili→ si chiamano cellule competenti, più prone ad accogliere il plasmide. Le cellule sono rese competenti con CaCl2 o MgCl2 e freddo, che conferiscono rigidità alla membrana della cellula e permeabilità, permettendo il passaggio del DNA. - Come si inserisce un frammento di DNA di interesse? - 1. Utilizzando gli enzimi di restrizione: spezzano il DNA rompendo il legame tra il gruppo ossidrilico OH al 3’ e fosforico P al 5’. Riconoscono sequenze specifiche di DNA, l’enzima agisce e taglia il DNA. Tanti enzimi di restrizione sono stati isolati dai batteri che li utilizzano per difendersi dai fagi. Le estremità possono essere blunt o sticky. Il vettore circolare viene linearizzato tagliandolo con un enzima (BamH1) che genera estremità sticky e posso inserire un frammento di DNA tagliato con lo stesso enzima (BamH1). Il taglio blunt invece genera estremità piatte del vettore ed è un sistema più versatile perché posso tagliare il frammento ma a differenza di prima posso usare enzimi ≠. I vettori contengono delle sequenze con molti siti di restrizione chiamati polylinker o MCS. Esistono molti vettori ≠ che presentano polylinker ≠ dunque si deve trovare compatibilità per fare il clonaggio del frammento. 3  SISTEMA LACZ Non si deve riconoscere all’interno della cellula solo i trasformati utilizzando l’antibiotico, ma anche i ricombinanti, vettori (plasmidi) che contengono l’inserto (frammento di DNA) che voglio studiare. che produrranno la 𝛃-galattosidasi (blu) da quelle ricombinanti (bianche). Screening bianco-blu: permette di distinguere le cellule trasformate ma non ricombinanti lacZ codifica per una parte dell’enzima 𝛃-galattosidasi, il polylinker è all’interno del gene lacZ e il ricombinanti vengono identificati in base alla loro incapacità di sintetizzare l’enzima 𝛃-galattosidasi. clonaggio di un frammento di DNA inattiva il gene laZ e interrompe la produzione del prodotto→ i Per lo screening si usa un substrato analogo al lattosio chiamato X-gal, aggiungendo al terreno l’antibiotico per selezionare le cellule trasformate e un induttore dell’enzima (IPTG) per selezionare i ricombinanti. Li È un analogo del lattosio che si lega al repressore LACl che lega il promotore sul gene che codifica per la B-galattosidasi. - Se la 𝛃-galattosidasi non è interrotta perché non si è inserito il gene di interesse, X-gal viene degradato Si assicura che se il gene LAcz è presente questo venga espresso. dalla 𝛃-galattosidasi in un prodotto di colore blu→ cellule non ricombinanti. - Solo le cellule bianche sono ricombinanti, dove la 𝛃-galattosidasi non viene prodotta perché il gene lacZ è stato interrotto. CLONAGGIO BLUNT END È più versatile perché non ci sono limitazioni di sequenza, posso tagliare con un enzima e inserire il frammento tagliandolo con un enzima ≠ ma che comunque da sempre un frammento blunt end. Tuttavia è un clonaggio meno efficiente rispetto a sticky end perché le colonie ricombinanti possono avere un orientamento sbagliato, dove il 50% si trova in un senso e il 50% nell’altro. Per vedere se il frammento inserito è nella direzione corretta si fa PCR con un primer disegnato sulla sequenza del frammento e uno disegnato su quella del vettore. Frammento inserito corretto—> l’amplificato è della dimensione prevista su agarosio Frammento inserito non corretto —> su agarosio ottengo una banda assente o di dimensioni minori dei quello che mi aspetto Ulteriore problema è che il vettore può richiudersi, avviene una ricircolarizzazione, dunque a questo punto si fa la defosforilazione al 5’ usando fosfatasi alcaline togliendo il gruppo fosfato al 5’ del vettore per cui non possono più richiudersi visto che il gruppo P non si lega a quello OH. 4 2. Clonaggio di un frammento di PCR: amplifichiamo il frammento che ci interessa e che vogliamo inserire all’interno del plasmide. Disegniamo quindi i primer sulla sequenza (gialli) con dei nucleotidi extra all’estremità 5’ che sono i siti di restrizione compatibili con il vettore che vogliamo usare. ( Si fa amplificazione con PCR e quando il frammento è amplificato può essere digerito con gli enzimi. Il prodotto di PCR va purificato in modo da avere nella provetta solo il DNA. SIFA Whodo che Y Secenza Nell Collata Si abbiano Del SIMI di restrizion Vettori che presentano già una rottura nella struttura e hanno alle estremità della rottura delle Timine non complementate in modo tale da legare nello specifico - una sequenza amplificata da taq polimerasi. " T/A cloning Altro modo di clonare un frammento di PCR è usare il vettore T, nome dovuto alla presenza di una T sporgente al 3’ aggiunta al plasmide linearizzato. Sono compatibili per la ligazione con un frammento PCR con A terminale al 5’ (Taq polimerasi). La taq polimerasi quando crea copie del frammento di interesse aggiunge al 3’ di ogni strand una adenina quindi serve che sia presente al 5’ dei filamenti del vettore una timina in modo che si abbia la ligazione. Si evita la ricircolarizzazione del vettore grazie alle T che difficilmente si richiudono. Vantaggio: clonaggio rapido e non dipende da enzimi di restrizione Svantaggio: non si ha il clonaggio direzionale in quanto finendo con A si può inserire in entrambi i sensi. ‼ Problema: la Taq polimerasi è prona ad errori, e quando amplifico un frammento devo avere la certezza assoluta che sia corretto, quindi si possono usare polimerasi che sono proofreading (Pfx/Pfu) ma anche qui si ha l’inconveniente che non lasciano le A protrudi. Quindi successivamente sul frammento amplificato si usa la Taq per qualche ciclo così da aggiungere le A al terminale: A-tailing. 3. Il TOPO cloning: clonaggio mediato da DNA topoisomerasi: Ci sono 3 ≠ TOPO vettori, il primo che vediamo è il TOPO-TA cloning vector: Si basa sulla capacità di creare nel vettore una “T” che può ligare con una una “A” presente su un differente frammento di DNA da inserire. In questo caso l’inserto di DNA si è creato per PCR: infatti, la Taq polimerasi aggiunge un’extra "A" come nucleotide al terminale 3‘ dell’inserto. Il vettore però presenta una topoisomerasi I con una tirosina terminale che si lega con il P al 3’ della timina; si previene la ricircolarizzazione e permette il legame al frammento di PCR all’-OH al 5’. TESE LECATI 1 FOSFAT 31 e S'nitoso che grenich delle a deltramento si leghino * Su trettand al present Non necessita di ligasi perché la topoisomerasi ha anche attività di ligasi. Il legame A-T è forte dunque la topoisomerasi si distacca e viene rilasciata. Svantaggi: non è un clonaggio direzionale / devo amplificare con la Taq che non è proofreading→ si può ovviare il problema con miscele di Taq+high fidelity. Esistono 3 tipologie di topo cloning : 1.topo cloning BLUNT 2.topo cloning STICKY 3.topo directionale STICKY +BLUNT 5 Altra possibilità è usare come vettore lo Zero blunt TOPO vector, il quale termina con le estremità piatte O (no A) e posso clonare il frammento con PCR proofreading (es Pfx) quindi si avranno meno errori con lo svantaggio però che non c’è direzionalità. La reazione di ligazione impiega 5’ a temperatura ambiente. → A e B non permettono il clonaggio unidirezionale. Ultimo vettore in commercio è il D-topo cloning vector dove D sta per direzionale. Si ha un clonaggio unidirezionale: consente la clonazione del prodotto di PCR blunt-end direttamente in un vettore di espressione utilizzando una reazione di ligazione di 5 minuti, viene amplificato con 1 dei 2 primer con sequenza terminale specifica per il clonaggio nel vettore. I D-TOPO contengono GTGG a singolo filamento sull'estremità 5´ e un'estremità blunt sull'estremità 3´. La sporgenza dei 4 nucleotidi invade il DNA a doppio filamento del prodotto PCR e si appaia alla sequenza CACC. La topoisomerasi I quindi lega il prodotto PCR nel corretto orientamento. Si deve ottenere un frammento target da inserire che abbia una porzione con una sequenza in overhang avente il GTGG questo causerà il GTGG del vettore ad invadere il frammento spostando il GTGG del frammento da inserire in modo che il CACC (complementare ) possa accoppiarsi al GTGG del vettore. Questa è l’estremità sticky. L’altra estremità è blunt sia per vettore sia per sequenza target. Questo permette di avere direzionalità garantita e il tutto è mediato da toposiomerasi che lega i fosfati e catalizza la ligazione. 6  IL SISTEMA GATEWAY È basato sulla presenza di siti di ricombinazione, fornisce un percorso veloce ed efficiente per la clonazione. Si basa sull'uso di versioni modificate delle ricombinasi del fago lambda, che inserisce il suo genoma nel DNA dell'ospite usando questi enzimi. Il sistema di clonazione Gateway li utilizza per ottenere una ricombinazione ad alta efficienza e specifica del sito. La seconda caratteristica di questo sistema sono i suoi siti di riconoscimento per gli enzimi clonasi chiamati siti att, e l'uso di diversi tipi di vettori. " È basato sul processo di ricombinazione tra fago lambda e E. coli: La ricombinazione richiede 2 componenti principali: 1. Le sequenze del DNA ricombinante (siti att) 2. Le proteine necessarie al processo di ricombinazione (Int/IHF/Xis) I segmenti di DNA che fiancheggiano i siti di ricombinazione vengono scambiati, in modo tale che, dopo la ricombinazione, i siti att siano sequenze ibride costituite da sequenze donate da ciascun vettore parentale. Ad esempio, i siti attL sono costituiti da sequenze (mix) sia di siti attP (fago) e attB (coli). ‼ La ricombinazione è conservativa, non si ha perdita o aggiunta di bp e avviene con qualsiasi tipologia di DNA (rilassato/super avvolto/lineare). 7 # Il sistema Gateway: reazioni BP e LR Le reazioni BP e LR sono il modo in cui diversi segmenti di DNA vengono spostati da una posizione all'altra all'interno dei costrutti. - Reazione BP: avviene la ricombinazione tra i siti attB e attP. Ho il gene o frammento di DNA che voglio studiare (giallo), disegno dei primer a cui aggiungo sequenze di 25 bp al primer forward per ottenere attb1 e stessa cosa nel primer reverse per formare attb2. Aggiungo il donor vector, che presenta estremità attP con sequenze fronteggianti dove avverrà la ricombinazione. All’interno del donor c’è ccdB è il gene killer che interferisce con l’attività della DNA girasi causando la morte delle cellule. Avviene la ricombinazione che scambia il DNA tra i filamenti, creando un sito attL e uno attR ottenendo rispettivamente l’entry clone dove all’interno del vettore ho il frammento di interesse + un by-product linearizzato che solitamente non funziona e non entra in coli. Ho così il gene di interesse clonato in un vettore circolare. - Reazione LR: i siti attL e attR sono ricombinati in modo simile, creando siti attB e attP. Facilita la ricombinazione tra un substrato attL dell’entry clone con un substrato attR del vettore di destinazione. Esiste un numero limitato di siti att, che sono annotati con numeri, il che significa che c'è un numero limitato di combinazioni. Ogni sito si ricombina solo all'interno del gruppo: per esempio, i siti attL1 si ricombinano solo con i siti attR1, dando luogo ai siti attB1 e attP1, generando un expression clone + by-product. I siti att di lambda WT sono stati modificati con mutazioni per migliorare l’efficienza di ricombinazione e la specificità delle reazioni BP e LR del sistema GATEWAY. 8 Es. le sequenze attP1 del pDONR 201 variano leggermente da quelle del pDONR 221. " Vettore pDONR 221 Ci sono vettori che contengono geni per la resistenza alla Kanamicina e altri alla Zeocin; Kanamicina e Zeocin servono per selezionare le cellule trasformate. Sono presenti T1 T2 terminatori di trascrizione per evitare che si trascriva altro oltre al gene di interesse. C’è un gene ccdB che conferisce resistenza al CmR cloramfenicolo. Selezionare le cellule con CmR permette di amplificare il plasmide in laboratorio e avere la certezza che il ccdb non ricombini con altro, altrimenti se avvenisse le colonie non sarebbero resistenti al CmR. ‼ Deve essere replicato in un ceppo di E. coli con mutazione nella DNA girasi perché dato che il ccdB uccide le cellule (in quanto interferisce con la DNA girasi) così è resistente agli effetti ccdB e può supportare l’amplificazione di plasmidi contenenti il gene ccdB. All’esterno del sito c’è la sequenza di primer M13 che permettono di amplificare il tutto. Quando il frammento è nell’entry clone ci sono molti vettori di destinazione, che hanno caratteristiche diverse a seconda dello scopo dell’esperimento. 9  Gateway + TOPO cloning Si può fare un vettore che abbia le caratteristiche di entrambe. È un vettore che permette di clonare senza fare i primer con 25 bp. Creazione di un costrutto per RNAi (basato su harpin RNA) tramite tecnologia Gateway: L'RNAi (interferenza dell'RNA) è un fenomeno in cui un piccolo RNA a doppio filamento (denominato piccolo RNA interferente o siRNA) può spegnere l'espressione (knock down) del gene corrispondente. Il doppio filamento viene riconosciuto da Dicer che lo taglia in small RNA e porta uno dei due filamenti nella sequenza complementare del gene che volgiamo silenziare. Il silenziamento comporta un abbassamento del prodotto proteico oltre al 90%. In alto " il donor vector e attraverso ricombinazioni possiamo inserire in senso o in antisenso il gene. Sul gene di interesse devo identificare le sequenze che costituiscono il trigger (regione che scatena RNA interference), che costituiranno il doppio filamento di RNA che dovrà essere tagliato e complementare al gene di interesse per effettuare l’RNA interference. Amplifico con PCR il frammento del gene che voglio silenziare e lo inserisco all’interno di un vettore. Il frammento viene clonato nel vettore pENTRY e da questo passa al destination vector. Si fa la reazione aggiungendo l’enzima e ottengo il vettore, dove un promotore trascrive il tutto in un senso e nell’antisenso con formazione dell’RNA a doppio filamento. SENSO Ansenso DICER : SRCUSObe + Decret Sol Anco - Un FLUEN RISC PER POrEt PEMERE NE Legalte Con tra costretterari Viene suddiviso in 2 filamenti e dopodiché uno dei due viene degradato e quello non degradato viene portato alla sequenza complementare all’interno della cellula, appaiandosi e bloccando la trascrizione. Perché clonare il DNA? 10 - Per studiare la funzione del frammento di DNA clonato (es. promotore, enhancer, silencer, regione codificante) - Per indurre una mutazione nel gene - Per sequenziare una molecola di DNA - Per trascrivere un gene ed ottenere quantità elevate del relativo RNA - Per trascrivere e tradurre un gene e ottenere quantità elevate della relativa proteina - Per costruire una libreria genomica di tutto il DNA allo scopo di isolare un gene o un cDNA - Per preparare sonde di ibridazione - Per analizzare l’interazione tra DNA e proteine Vettori per applicazioni specializzate: - Vettori per il clonaggio di DNA a singolo filamento - Vettori per la preparazione di sonde a RNA - Vettori per l’espressione di proteine: vettori che massimizzano la sintesi proteica vettori che semplificano la purificazione delle proteine ricombinanti vettori che favoriscono la solubilizzazione delle proteine espresse vettori che promuovono l’esportazione delle proteine 11