Isolamento del DNA: cromatografia vs. solventi

Ecco gli appunti di studio dettagliati del testo fornito:

Metodi per l'analisi del DNA e dei genomi

• Il DNA è una molecola a doppio filamento lunga e soggetta a rotture durante la manipolazione.
• I nucleotidi sono l'unità ripetitiva di base del DNA, formati da tre gruppi diversi.

Tipi di DNA da purificare

• DNA cellulare totale: include DNA genomico e qualsiasi altro DNA presente nella cellula.
• DNA plasmidico: solo DNA plasmidico, senza DNA genomico.
• DNA fagico: solo DNA virale da particelle virali o cellule batteriche infette con virus (ad esempio, M13).

Isolamento del DNA cellulare totale

• Presenti 4 passaggi fondamentali: il primo dipende dalla matrice di partenza, gli ultimi tre sono comuni.
• Esempio di estrazione da cellule batteriche:
  • Coltura batterica fatta crescere e raccolta per centrifugazione.
  • Le cellule vengono prelevate e lisate per generare un estratto cellulare.
  • Purificazione per rimuovere ciò che non è DNA (zuccheri, proteine).
  • Concentrazione del DNA per una maggiore concentrazione in soluzione.

Ottenere la coltura

• Richiede l'inoculo dei batteri in brodo di coltura (LB), un mezzo con le sostanze necessarie per crescere.
• I mezzi di coltura possono essere definiti (quantificazione precisa degli elementi) o complessi (composizione non specifica, elementi variabili).
• Il pH viene aggiustato a 7.5 con NaOH, la soluzione viene autoclavata per la sterilità, e la coltura viene cresciuta overnight a 37° a 150-250 rpm per esponenziale crescita.
• L'analisi della densità ottica (OD600) stima il nnumero di batteri; L'OD aumenta con la concentrazione cellulare.
• Si procede con centrifugazione di una volta che le cellule sono cresciute per poter estrarre il DNA.
• 1 unità di densità ottica corrisponde a 0,8 x 10º cell/ml per specifica di E.coli

Produzione dell'estratto cellulare

• Attivazione di un processo di lisi per rompere gli involucri e rilasciare il contenuto cellulare.
• La lisi può avvenire tramite:
  • Metodi fisici: rottura della parete per pressione (sonicazione, macinazione in azoto liquido).
  • Metodi chimici ed enzimatici: lisozima + EDTA (degradazione parete E.coli), detergenti (solubilizzano le membrane).
• I passaggi possono essere combinati (pre-trattamento enzimatico seguito da metodi chimici/fisici).
• Si ottiene un estratto con frazioni di membrana e parete che, essendo pesanti, separabili tramite centrifugazione.
• Le cellule batteriche vengono solubilizzate in un buffer di lisi per agevolare la degradazione e la rimozione(inattivatori, rnasi, betamercaptoetanol).

Matrici

• Diversificate classificate come semplici( colture batteriche) o complesse (componenti cellulari diversi)
• Il buffer di lisi varia in base alla matrice ed è un passaggio che deve essere ottimizzato incluso quello della rottura della parete.

Estrazione da cellule vegetali

• Parete che comporta un passaggio di rottura meccanica (congelamento in azoto e pestatura).
• La bassa temperatura è importante per inibire le nucleasi.
• I mulini possono causare la rottura causando la rotazione delle biglie di silice con il campione mantenuto al freddo.

Estrazione da cellule animali

• Non richiede la rottura meccanica in azoto liquido, ma l'uso di detergenti, manca la parete cellulare

Estrazione da matrici complesse

• Bisogna fare un'ottimizzazione e comprendere le sostanze chimiche presenti all'interno

Purificazione del DNA

• Separazione dei componenti dal DNA, come proteine e RNA.

Liberazione del DNA da proteine e/o zuccheri e altri contaminanti

• Due opzioni:
  • Digestione enzimatica delle proteine con proteinasi K.
  • Separazione fisica del DNA rispetto ad altri contaminanti (non li distrugge).

Uso di solventi organici

• Aggiunta di miscela di fenolo all'estratto cellulare.
• Le proteine passano nella parte con il solvente.
• Centrifugazione per separare fase acquosa (DNA) e solvente organico (proteine).
• Interfaccia tra solvente organico e fase acquosa dove si depositano le le proteine coagulate.
• Recuperare lo strato acquoso attentamente
• Si può ripetere il passaggio, ma si può rompere parte del DNA
• Si precede talvolta il passaggio usando la proteina K per tagliare proteine complesse

Metodo cromatografico

• Si basa sull'utilizzo di particelle cariche positivamente per effettuare una cromatografia a scambio ionico.
• Viene caricato l'estratto sulla colonna cromatografica.
• Il DNA si lega alle particelle per questioni elettriche e si aumenta la concentrazione di sale Il DNA è rilasciato quando il sale maschera le cariche elettriche
• L'alternativa è usare particelle di silice che in presenza di guanidio tiocianato fanno legare specifico DNA, con successiva sostituzione e effettaazione per la rimozione dell'RNA si usa RNasi

Magnetic beads based DNA extraction

• Si usano microsfere magnetiche con silice
• Il buffer di lisi viene mescolato con silice che cattura il DNA

Vantaggi e svantaggi dei metodi cromatografici

• Vantaggi: elimina inibitori a differenza del solvente, è veloce, sicuro e scalabile.
• Svantaggi: produce DNA di taglia minore e minor resa poiché la resina si satura, è meglio usare i solventi per DNA intatto

Concentrazione del DNA

• Riduzione del contenuto di acqua dopo soluzione acquosa e concentrazione di DNA

Precipitazione

• Precipitazione con etanolo (X2) o isopropanolo (0,6X), a freddo e con sali per far precipitare il DNA.
• Inserimento di bacchetta di vetro per attaccare le maglie di DNA.
• Centrifugazione per raccogliere il DNA sul fondo.

Osservazioni sui vari reagenti

• CTAB(estrazione cell vegetali): detergente per DNA vegetale con polisaccaridi (0,7 M sale)
• EDTA: chela e blocca (buffer TRIS-EDTA -> conservazione 4°C)
• Betamercaptoetanolo (tossico, buffer) rompe i ponti disolfuro
• Guanidinio tiocianato: agente cautropico che favorisce il legame
• Non usare vortex o puntali stretti si può rompere
• Purificazione dei nuclei se si elimina mitocontri

Kit commerciali:

• Sono la soluzione migliore e si basano spesso su resine di silice o altre matrici cromatografiche.

Isolamento del DNA plasmidico

• Passaggi analoghi all'isolamento del DNA cellulare totale, separazione del DNA plasmidico e del DNA genomico in base alle loro differenze chimico-fisiche (dimensione,conformazione)
• Sferoblasti con triton , rottura enz (parete) e detergente (membrana). Con centrifugazione rimozione dna genomico

Sfruttando la diversa dimensione

• Saccarosi al 25% porta a situazione di tonicità che non si rompa.
• Triton per rottura mebrana plasmatica

Sfruttando la diversa conformazione

• DNA superavvolto o lineallizato e in base a questo cambia a livello di denaturazione

Denaturazione alcalina

• Se a ph tra 12 e 12 si ha singolo filamento a differenza del superavvolto, poi trattato a ph 7 si aggroviglia e precipita
• Maggiore efficienza del precedente

Isolamento del DNA fagico

• Nella coltura extracellulare sono rilasciati fagi e DNA è recuperato dal mezzo
• con la deproteinizzazione rimozione capside virale e Cromatografia a scambio ionico
• Va controllato un titolo di produzione di particelle virali

Valutazione della qualità e quantità de DNA:

• Tramite CORSA ELETTROFORETICA, si ottiene una, se sono integro, altrimenti strisciata, e valutazione della purezza

Corsa elettroforetica matrice, TAE, TBE

• Gli acidi nucleici sono caricati e possono essere separati in un campo elettrico in presenza di una matrice pore e di un tampone
• Agarosio crea matrice con pori dimensione variabile.
• Acrilammide ha risoluzione e frammenti molto simili
• Molti gradi con campo pulsato con elettrodi posti a 45
• Utilizzato etidio bromuro(cangerogeno)
• Si usano DNA genomico e fago ad esempio e si confronta con un marcartore

Southern Blotting:

• Serve per identificare in che punto del DNA è presente un gene di interesse, utilizza DNA genomico trasferito su di una membrana ed analizzato con delle sonde.
• Enzima digestione(10mg digerito) e si separano tramite gel, in vaschetta vi è wick per permettere lo spostamento dei frammenti con forza capillare.
• Trasferimento con HCI e soluzione neutralizzate
• Nel wick con buffer vi è la membrana di nitrocellulosa/nylon
• Tolgo la membrana tramite UV/80
• Metto a incubare con con il probe specifico.

Membrane utilizzate:

• Nitrocellulosa:specie frammenti piccoli DNA
• Nylon lega il legame covalenteDNA
• diverse tipologie,o cariche positivamente

Condizioni di ibridazione:

• Ibridazione poi tubi/vaschetta a 65°C-42°C in base al buffer

Oligonucleotidi:

• Maggiore lughezza maggiore specificità

Metodi di marcatura :

• Marcetura di posizione terminale 5': bassa sensibilita