Viral Tanı Yöntemleri 2024-25 PDF

VİRAL TANI YÖNTEMLERİ 1 VİRAL HASTALIKLARIN LABORATUVAR TANISI Klinik tanının desteklenmesi Ayırıcı tanı Prognoz ve tedavinin takibi Epidemiyolojik veri elde edilmesi 2  Viral Enfeksiyonların Laboratuvar Tanısı : 1. Etken Vir...

VİRAL TANI YÖNTEMLERİ 1 VİRAL HASTALIKLARIN LABORATUVAR TANISI Klinik tanının desteklenmesi Ayırıcı tanı Prognoz ve tedavinin takibi Epidemiyolojik veri elde edilmesi 2  Viral Enfeksiyonların Laboratuvar Tanısı : 1. Etken Virusun Saptanması (direkt yöntemler) a. Virusun izolasyonu - üretilmesi b. Virus partikülünün gösterilmesi c. Viral antijenlerin gösterilmesi-Direkt seroloji d. Viral inklüzyon cisimciğinin gösterilmesi e. Viral nükleik asitlerin gösterilmesi 2. Virusa karşı immün yanıtın gösterilmesi (indirekt yöntemler) 3 Virusun İzolasyonu için kullanılan sistemler : 1. Hücre Kültürleri 2. Embriyonlu Yumurta 3. Deney Hayvanları 4  EMBRİYONLU YUMURTA Bazı virüslerin primer izolasyonu (HSV, İnfluenza) Ag. üretimi ( serolojik testler için) Aşı hazırlanması (Çiçek, influenza) 5 DENEY HAYVANLARI KOBAY(Guinea pig) Viral patogenez çalışmaları TAVŞAN İlaç ve aşı çalışmaları KEME(RAT) BEYAZ FARE 6 HÜCRE KÜLTÜRLERİ Günümüzde kullanılan yöntem 7 HÜCRE KÜLTÜRLERİ İnsan/hayvan kökenli embriyonik/karsinoma dokusu, hayvan dokuları kullanılır. Mekanik/enzimatik yöntemlerle hücreler ayrıştırılır. Üremeyi destekleyecek özel kültür sıvısı eklenir. Hücreler şişe/tüplerde inoküle edilir ve tek tabakalı (“monolayer”) üreme izlenir. Klinik örnek eklenerek, virusun hazırlanan hücrelerde üremesi beklenir. 8  HÜCRE KÜLTÜR TİPLERİ Primer kültür: Bir organizmanın doku veya organlarından elde edilen hücre kültürü (Maymun böbreği, insan amnion zarları) Organ kültürü: Doku veya organın tümü veya bir kısmı Eksplant: Bir organın doku organizasyonunun nispeten bozulmamış küçük parçası Hücre kültürü: Primer kültür ya da eksplanttan filizlenen hücre tabakasının mekanik veya enzimatik olarak ayrıştırılarak yeni bir kültür kabına aktarılması ve tek tabaka veya süspansiyon şeklinde üremesinin sağlanması 9  Diploid hücre kültürleri  Birinci kültürden hazırlanan kültürlerdir. İlk pasajlarında orjinleri ile %75 oranında aynı karyotiplidirler. Pasajlarla karyotiplerinde değişikliğe uğrarlar ve en çok 50 pasajda ölürler.  Primer kültürle elde edilen ilk hücrelerden köken alan sınırlı sayıda pasajı yapılabilen diploid hücre kültürü Sürekli hücre dizisi (continuous cell line):  Bazı neoplazmlardan veya transforme hücrelerden elde edilen sürekli pasajlar (heteroploid hücre kültürü)  Kendiliğinden veya amaçlı olarak transforme edilmiş (primer hücre kanser hücresi ise) sonsuz sayıda pasaj yapılabilen hücre dizisi Hücre suşu (cell strain)/alt dizi (subline):  Bir kültürü oluşturan hücrelerin klonlama veya diğer bir yöntemle seçilerek ayrı kültüre alınması ve takip eden pasajları 10 11 Ortomiksovirüsler, paramiksovirüsler ve enterovirüsleri üretmek için primer maymun böbrek hücre dizisi , CMV başta olmak üzere HSV, VZV, adenovirüs, pikornavirüs gibi çok sayıda virüsü üretmek içinse insan fetal diploid hücre dizisi ideal ortamdır. Hep-2 hücre dizisi ise özellikle RSV, adenovirüs ve HSV izolasyonu için mükemmel bir ortamdır. 12  Hücre kültürlerinin morfolojisi Fibroblastik Epitelyal 13 Hücre kültürü hazırlanmasında kullanılan şişeler..... 14 ….tüpler 15 VİRAL BESİYERLERİ Tüm besiyerlerinin temel bileşeni bikarbonat tampon sistemi içeren dengeli bir tuz solüsyonudur inorganik iyonlar, glikoz ve fenol kırmızısı indikatörlü bir tampon (HEPES) içerir. Kısa dönem canlılığı sürdürme amaçlı olanlar hariç tüm besiyerlerine aa. ve vitaminler (A, B vitamini gibi) eklenmelidir. Antibiyotik ve hormonlar gibi diğer katkı maddeleri temel besiyerine katkıda bulunurlar. 16 BAZI BESİYERLERİ ÖRNEKLERİ: Dengeli tuz solüsyonları Earle’ün ve Hank’ın dengeli tuz solüsyonları en sık kullanılanlarıdır. Eagle kriyoprotektif besiyeri (Eagle/Eagle MEM) Hank’ın dengeli tuz solüsyonu ve %15 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren “Eagle’ın minimal esansiyel besiyer”i, virüslerin korunması için tanımlanmış temel besiyeridir. DMSO kriyoprotektif ajan olarak görev yapar. %10 fetal sığır serumlu (FBS) büyüme besiyeri Serum hücre büyümesini etkileyebilecek inhibitörler, toksinler, enfeksiyöz ajanlar ve antikorlar, fötal sığır serumunda daha az olduğu için fötal sığır serumu tercih edilir. 17 Hücre kültürü hazırlanması Pr me parçalama Enz mat k parçalama 18 Hücrelerin tek tabaka oluşturması 19 Hücre kültürü çalışmaları özel biyogüvenlik kabinlerinde gerçekleştirilmelidir 20  Örneğin ekilmesi İzolasyonu amaçlanan virusun üreyebileceği hücre kültürüne ekilmeli Gerektiğinde ön işlemler yapılmalı  Dekontaminasyon (steril olmayan örnekler için; boğaz, rektal sürüntü, vb)  Konsantrasyon (örn. BOS ve idrar örneklerinin santrifüj edilmesi) 21 HÜCRE KÜLTÜRÜNÜN DEĞERLENDİRİLMESİ I: VİRÜSÜN GÖSTERİLMESİ VE ÖN TİPLENDİRME 1) Sitopatik etkinin değerlendirilmesi 2) Hemaglütinasyon/ Hemadsorpsiyon 3) Viral inklüzyon cisimciklerinin gösterilmesi 4) Elektron mikroskopisi 5) Biyokimyasal tiplendirme: Rhinovirus için; hücre kültürünün seri dilüsyonu yapılır, pH belirli bir süre belirli bir düzeye ayarlanır, infektivitede 2-4 log da 10 azalma virüsün rhinovirus olduğunu gösterir. 6) Hücreye bağlı kalma veya hücreden ayrılarak besiyeri içine dağılma; CMV , VZV hücrede kalır. 7) Viral antijenlerin gösterilmesi 22 35-37oC’de inkübasyon ve sitopatik etki oluşumunun izlenmesi 23  Virusun üreme özelliklerine ve örnekteki konsantrasyonuna bağlı olarak sitopatik etki oluşumu  En erken 2-3 gün  En geç 2-3 hafta  Sitopatik etki süresi önemli Mikroskobik değerlendirme  Sitopatik etki çeşidi  Sitopatik etkinin şiddeti 24 25 Hücre kültürlerinde Virusların sitopatik etkiler... hücre kültürlerinde oluşturdukları sitopatik etkiler 26 27  Piknozis (örn.Enterovirus) Hücrelerin yuvarlaklaşması, sitoplazmanın küçülmesi, çekirdeğin elektrondan yoğun hale gelmesi 28 Piknotik hücreler 29 Agregasyon (örn.HSV) Piknotik hücrelerin biraraya toplanması 30  Sinsitya-Füzyon-Dev hücre (örn.RSV, CMV, Kızamık) Hücreler arasında sitoplazmik köprülerin oluşması; hücrelerin birleşmesi ve çok çekirdekli dev hücrelerin oluşumu 31 Sinsitya oluşumu 32 Çok çekirdekli dev hücre 33 34 35 HÜCRE KÜLTÜRÜNÜN DEĞERLENDİRİLMESİ II: VİRÜSÜN KESİN TANISI VE TİPLENDİRİLMESİ (İMMÜNOLOJİK YÖNTEMLER) 1) Nötralizasyon testi: Bilinen antiserum ile virüsün hücreyi infekte etmesinin engellenmesi 2) Hemaglütinasyon inhibisyon testi 3) Hemadsorpsiyon inhibisyon testi 4) Direkt floresan antikor testi 36  NÖTRALİZASYON DENEYİ  Viral enfeksiyonlar sırasında virüsün enfektivitesini nötrleyen antikorlar gelişir.  Bu antikorlara nötralizasyon antikorları adı verilir.  Hasta serumunda virüs antijenlerini bloke ederek enfektivitelerini önleyen (nötralize eden) antikor varlığının araştırılmasında nötralizasyon deneyi kullanılır.  Duyarlılığı ve özgüllüğü oldukça yüksektir, ancak teknik olarak uygulanması zor ve zaman alıcı olduğundan rutinde yaygın olarak tercih edilmezler.  Canlı hücre sistemleri ( hücre kültürleri, embriyonlu yumurta, deney hayvanları) kullanılır.  Hasta serumu (antikor) sulandırılır ve her sulandırım standart miktarda virüs ile karıştırılarak pleyt çukurlarında hazırlanmış hücre kültürlerine inoküle edilir.  Serumda nötralizan antikor varlığında virus reseptörleri bloke edileceğinden hücre kültürlerinde sitopatik etki (CPE) ortaya çıkmaz. 37 38 Hemaglütinasyon İnhibisyon Deneyi  Virüslerin kendilerine uygun hayvan eritrositlerini hemaglütine etme özellikleri vardır.  Bu özelliklerine karşı organizmada antikor gelişir.  Bu amaçla mikropleyt çukurlarında hasta serumunun seri sulandırımları hazırlanır.  Üzerlerine bilinen virüs antijeni standart miktarda eklenir.  Bu karışım 1 saat bekletilerek özgüllük varsa birleşmenin olması sağlanır.  Sonra tüm çukurlara virüsün aglütine ettiği eritrosit süspansiyonundan standart miktarda eklenir. 39  1 2 3 40 Hemadsorbsiyon İnhibisyon Deneyi  Hemadsorbsiyon, bazı virüslerle enfekte olan hücrelerin yüzeylerine viral antijenler eksprese edildiğinden bazı hayvan eritrositlerinin adsorbe olması (yapışması) olayıdır.  Genelde hemaglütinasyon yapan virüsler hemadsorbsiyon da yaparlar.  Bu olay özgül antikor varlığında önlenir ve bu teste HaÖ adı verilir. HaÖ testi canlı hücre kültürlerinde gerçekleşir. 41  Bu amaçla, hasta serumu standart miktarda bilinen antijenle (virüsle) karıştırılarak hücre kültürüne inoküle edilir.  Virüsün hücrelere penetrasyonu ve replikasyonu için gerekli süre inkübe edilir. Sonra hücre kültürü içine eritrosit süspansiyonu eklenir ve inkübasyona bırakılır.  Hasta serumunda özgül antikor varsa virüsü bloke ederek hücreleri enfekte etmesini ve üremesini önler ve eritrositler hücre yüzeylerine yapışmaz (pozitif sonuç).  Aksi halde yani antikor yokluğunda, virüsler hücreleri enfekte ederek üreyecek ve hc yüzeylerinde antijenlerini eksprese edeceklerdir.  Bu durumda eritrositler hc yüzeylerine yapışmış olarak görülürler (negatif sonuç). 42 Direkt floresan antikor testi 43 b. Virus partikülünün gösterilmesi Elektron mikroskopi (EM) İmmün EM 44 ADENOVİRUS 45 c. Viral antijenlerin gösterilmesi-Direkt seroloji İmmünofloresans 46 d. Viral inklüzyon cisimciğinin gösterilmesi Doku örneklerinde histolojik /sitolojik boyama Rabies Virus CMV 47  VİRAL İNKLÜZYON CİSİMCİKLERİNİN GÖSTERİLMESİ  Virüslerin hücrelerde üremesi sonucu inklüzyon cisimciği adı verilen, ışık mikroskobunda görülebilen bir takım oluşumlar meydana gelir.  Bu cisimcikler viral ürünlerin ya da virüslerin hücrede toplandığı ve küme yaptığı oluşumlardır.  İnklüzyon cisimcikleri sitoplazmada, nükleusta ve hem nükleusta hem de sitoplazmada görülebilmektedir.  İnklüzyon cisimciklerinin gerek yerleşim yerleri, gerek boyanma özellikleri ve gerekse görünümleri virüslere göre farklılıklar gösterir.  Bu yüzden hastalık materyalinden yapılan histolojik preparatlarda hücreler içinde ışık mikroskobu ile inklüzyon cisimciklerinin gösterilmesi tanı yönünden oldukça önemlidir. 48 Viral inklüzyon cisimcikleri Hastalık İsmi Yerleşimi Kuduz Negri İntrastoplazmik CMV Baykuş gözü (owl’s eye) İntranükleer HSV, VZV Cowdry A İntranükleer Poks virüs Guarneri İntrastoplazmik asidofilik İntranükleer bazofilik Adenovirüs _ Perinükleer sitoplazmik Kızamık _ İntrasitoplazmik ve intranükleer 49 BEYİN DOKUSUNDA NEGRİ CİSİMCİĞİ (KUDUZ) 50 İDRARDA CMV (GIEMSA) 51 HSV 52 ADENOVIRUS 53 e. Viral nükleik asitlerin gösterilmesi Tanısal virolojide en hızlı gelişen alan kalitatif ve kantitatif sonuçlar alınmasını sağlayan moleküler amplifikasyon yöntemleridir. Polimeraz zincir reaksiyonu(PCR),Northern Blot, Southern Blot … Thermal cycler Real Time PCR 54  Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR )  Kısaca PCR olarak da bilinen bu yöntem dolaylı bir tanı yöntemidir.  Ortamda az miktarda bulunan nükleik asitlerin çoğaltılmasına yönelik bir yöntemdir.  Bu sayede nükleik asitlerin sayıca artmasıyla, nükleik asit belirleme yöntemleriyle daha kolay bir şekilde ortaya konulur.  Bu yöntemin temeli DNA'nın ortamda DNA polimeraz enzimi ve gerekli nükleotidlerin bulunması durumunda, bol miktarda iplikcik sentez edebilmesi temeline dayanır. 55 PCR/PZR PCR’da virüsün çoğaltılması istenen özgül DNA segmenti hedef alınır. Bu amaçla yaklaşık 20 bazlık özgül nükleotid dizileri (primerler) kullanılır. PCR’da primerlerin viral DNA’ya tutunup karşıt sarmalı sentezleyebilmesi için serbest nükleotidlere ve reaksiyonu katalizleyecek ısıya dirençli taq polimeraz enzimine gereksinim vardır. 56  RNA genomu olan virüslerde PCR işleminden önce revers transkripsiyon ile komplementer DNA(cDNA)’nın elde edilmesi gerekir. Bu tür PCR’a RT-PCR denmektedir. Duyarlılığı artırmak için bazen nested PCR da uygulanabilir. Bu yöntemde PCR işlemi iki kez uygulanır. 57 58 59  Viral Enfeksiyonların Laboratuvar Tanısı : 1. Etken Virusun Saptanması (direkt yöntemler) a. Virusun izolasyonu - üretilmesi b. Virus partikülünün gösterilmesi c. Viral antijenlerin gösterilmesi-Direkt seroloji d. Viral inklüzyon cisimciğinin gösterilmesi e. Viral nükleik asitlerin gösterilmesi 2. Virusa karşı immün yanıtın gösterilmesi (indirekt yöntemler) 60 61 SEROLOJİK YÖNTEMLERLE VİRÜSE ÖZGÜL ANTİKORLARIN ARAŞTIRILMASI  Virüslerin izolasyonu ve identifikasyonu hem zor, hem de pahalı olması nedeniyle her laboratuvarda uygulanamamaktadır.  Bu yüzden hem kolay olması, hem de daha ucuz olması nedeniyle çoğu laboratuvarlarda serolojik deneyler tercih edilmektedir.  Bundan dolayı viral enfeksiyonların laboratuvar tanısında serolojik deneylerin önemi büyüktür. 62  Viral Antikorların Saptanması 1.Nötralizasyon Deneyi A - Deney Hayvanlarında B - Hücre Kültüründe C - Embriyonlu Yumurtada 2. Direkt, İndirekt Hemaglütinasyon Deneyi 3. Kompleman Birleşme Deneyi 4. Hemaglütinasyon İnhibisyon Deneyi 5. Hemadsorbsiyon İnhibisyon Deneyi 6. Floresan Antikor Deneyi Serolojik testler 7. İmmun Diffüzyon Deneyi 8. ELISA Deneyi 9. Paul - Bunnel Deneyi 10.Lateks Aglütinasyon Deneyi 63  Katı-faz immünolojik Testler  Ag veya ab katı bir materyale (polistiren mikrotüplerin kuyucukları, nitroselüloz/naylon membranlar veya plastik boncuklar gibi) bağlanır  Ag aranacaksa katı faza ab bağlanır (Direkt)  Ab aranacaksa, katı faza ag bağlanır (İndirekt)  ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)  RİA (Radioimmune assay) 64  Kuyucuğa hasta serumu eklenir ve inkübe edilir  Ag/ab bağlanması gerçekleşir  Reaksiyon karışımı yıkanır  Bağlanmamış ag/ab ve serum uzaklaştırılır  Agxab kompleksine bağlanarak onu görünür hale getirecek bir İŞARET=ETİKET taşıyan bir antikor eklenir ve inkübe edilir  RİA: Radyoaktif izotoptur (32P, 125I, vb)  ELISA: Enzimdir (alkalen fosfataz, horseradish peroksidaz ile işaretli keçi-antihuman immünglobulini vb)  İşaretli ab, agxab kompleksine bağlanır 65  Yıkama ile bağlanmayan işaretler uzaklaştırılır  ELISA:  Enzimin sübstratı eklenir  Sübstratın parçalanması sonucu ortaya çıkan renk değişimi spektrofotometrede ölçülür  RIA:  Bağlanma sonucu açığa çıkan radyoaktif ışıma sintilasyon sayacında ölçülür 66 67 68  Enzim Avantajları:  Radyasyon maruziyeti yok (GÜVENİLİR)  Reaksiyon esnasında enzim değişmez  Enzime bağlanan antikorlar stabildir, uzun süre saklanabilir  Renkli son ürün gözle/ spektrofotometrik olarak okunabilir 69 Direkt ELISA Antikor kuyucuğa bağlanır  Hasta serumunda ag aranmasında kullanılır Hasta örneği eklenir. Ag varsa, özgül ab ile bağlanır.  Kuyucuklar, aranacak antijene özgül antikor Araştırılan antijene özgül, enzimle işaretli ab eklenir. Ab-ag-işaretli ab sandviçi oluşur. ile kaplanır Enzim sübstratı eklenir. Reaksiyon sonunda gözle görülür renk değişikliği olur. 70  İndirekt ELISA Antijen kuyucuğa bağlanır  Hasta serumunda spesifik bir antijene Hasta örneği eklenir. Özgül ab varsa, ag ile bağlanır. karşı antikor aramada kullanılır Kuyucuk, antikorun Enzimle işaretli anti-human Ig eklenir, ag-ab kompleksine  bağlanır. Ag-ab-anti-human Ig kompleksi oluşur. özgül olarak tanıdığı ag ile kaplanır Enzim sübstratı eklenir. Reaksiyon sonunda gözle görülür renk değişikliği olur. 71  Fluoresan antikor teknikleri Fluoresanlı boyalarla işaretlenmiş ag/ab kullanılır Direkt fluoresan antikor testleri (DFA) İndirekt fluoresan antikor testleri (İFA) Örnekler immünfluoresan mikroskopta incelenerek fluoresans varlığı araştırılır 72 73 Tanısında İFA Kullanılan Enfeksiyonlar VZV, CMV, EBV HSV 1-2 Rubella Ucuz ve hızlı ANCAK deneyim ve özel donanım gerektirir 74  Blot Testleri (WB)  Çok spesifik antikorların aranması gerektiğinde kullanılır  Antikor aranacak etken parçalanıp proteinleri açığa çıkartılır  Proteinler PAGE (poly akrilamid jel elektroforezi) ile ayrılır ve nitroselüloz kağıda aktarılır  Kağıt küçük şeritlere kesilir  Şeritler hasta serumu ile inkübe edilir ve yıkanır Anti-human Ig enzim konjugatı eklenir, konjugat agxab kompleksine bağlanır Enzim sübstratı eklenir, renkli bant oluşumu ile mevcut ab tipi belirlenir 75 76 77 Nerede kullanılır? 78