M03_B1_LAB3_4_Wpływ_czynników_fizykochemicznych_na_drobnoustroje_2024_PDF

M03_B1 LAB 3 / LAB 4. WPŁYW CZYNNIKÓW FIZYKOCHEMICZNYCH NA DROBNOUSTROJE WSTĘP TEORETYCZNY Mikroorganizmy we wszystkich środowiskach naturalnych i sztucznych są narażone na działanie różnych czynników środowiskowych. Efekt działania czynników fizycznych i chemicznych otoczenia...

M03_B1 LAB 3 / LAB 4. WPŁYW CZYNNIKÓW FIZYKOCHEMICZNYCH NA DROBNOUSTROJE WSTĘP TEORETYCZNY Mikroorganizmy we wszystkich środowiskach naturalnych i sztucznych są narażone na działanie różnych czynników środowiskowych. Efekt działania czynników fizycznych i chemicznych otoczenia na mikroorganizmy zależy, z jednej strony, od ich natężenia i czasu działania, z drugiej – od rodzaju, gatunku lub szczepu mikroorganizmu. Wyróżniamy oddziaływanie statyczne, tzn. hamujące namnażanie się mikroorganizmów oraz zabójcze, prowadzące do utraty zdolności wzrostu, namnażania się, a w konsekwencji do ich śmierci. Abiotyczne czynniki środowiskowe mające największy wpływ na rozwój bakterii: temperatura, odczyn, zasolenie, promieniowanie, ciśnienie hydrostatyczne, aktywność wody. 1. Wpływ temperatury Temperatura jest jednym z najważniejszych czynników środowiskowych warunkujących procesy życiowe drobnoustrojów (aktywność enzymów i szybkość reakcji metabolicznych zależy od temperatury). Temperatura wpływa: bezpośrednio na: o szybkość wzrostu. o aktywność enzymów, o skład chemiczny komórek, o wymagania pokarmowe pośrednio na: o regulację rozpuszczalności cząsteczek związków wewnątrzkomórkowych, o transport jonów, o dyfuzję substancji chemicznych, o zmianę właściwości osmotycznych błon komórkowych. Drobnoustroje wykazują zdolność wzrostu w zakresie temperatur od -20ºC do ponad 100ºC. Niektóre archeony rosną nawet w temperaturze 121ºC, czyli w temperaturze zwykle stosowanej w autoklawach. Stosunek drobnoustrojów do temperatury określają trzy jej wartości, tzw. temperatury kardynalne: minimalna (poniżej której drobnoustroje nie są zdolne do wzrostu), optymalna (w której mikroorganizmy rozwijają się najlepiej oraz ich czas podwojenia jest najkrótszy), maksymalna (powyżej której drobnoustroje nie są zdolne do wzrostu i funkcjonowania). Temperatury niższe od minimalnych i wyższe od maksymalnych nie muszą być dla drobnoustrojów zabójcze, zawsze jednak hamują ich rozwój. Chociaż kształt krzywych zależności temperaturowych jest różny, optymalna temperatura jest zawsze bliższa maksymalnej niż minimalnej. Temperatury kardynalne nie są sztywno ustalone. Zalezą one do pewnego stopnia od innych czynników środowiskowych, takich jak pH i dostępne składniki odżywcze. Niektóre gatunki mają wąski zakres temperatur wzrostu (np. 1 Neisseria gonorrhoeae rośnie w zakresie 30–38ºC, optimum 35–36ºC); inne rosną w szerokim zakresie temperatur (np. E. coli rośnie w zakresie od 10 do 45ºC). 1.1. Podział drobnoustrojów ze względu na temperaturę wzrostu ▪ Psychrofile – zimnolubne, zdolne do wzrostu w temperaturze 0ºC, optymalna temperatura 20ºC. Temperatura maksymalna 40 ºC. Gleby i wody w klimacie umiarkowanym, rośliny i zwierzęta żyjące w chłodnym klimacie, mrożona lub chłodzona żywność. Szczepy z rodzaju Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter, Alteromonas, Vibrio, Bacillus, Micrococcus. ▪ Mezofile – zdolne do wzrostu w temperaturze umiarkowanej. Optimum wzrostu 20–40 ºC, minimum wynosi od 10 do 25 ºC, maksimum zaś od 40 do 45 ºC. Gleba, wody, rośliny, zwierzęta, człowiek. Saprofity i drobnoustroje chorobotwórcze. ▪ Termofile – ciepłolubne, temperatura optymalna >45 ºC, minimalna 25–45 ºC, maksymalna 70–80 ºC. Gorące źródła i jeziora kwaśne, komposty i kiszonki, gleba, siano, urządzenia grzewcze, gorąca woda technologiczna. Bakterie fermentacji mlekowej, np. Lactobacillus delbruecki (stosowany w przemysłowej produkcji kwasu mlekowego), Streptococcus thermophilus (wchodzący w skład zakwasów jogurtowych). Szczepy z rodzaju Bacillus, Geobacillus, Clostridium. 2  ▪ Hipertermofile – temperatura optymalna >80ºC, minimalna 55ºC, maksymalna 100–121ºC. Gorące źródła, gejzery, obszary wulkaniczne, solfatary, kominy hydrotermalne na dnie oceanów. Zdecydowana większość to są archeony. Grupa mikroorganizmów Temperatury kardynalne (ºC) przykład gatunku minimalna optymalna maksymalna Psychrofile Polaromonas vakuolata 0 4 15 Psychroflexus torquis –16 12 20 Psychrotolerancyjne Pianococcus halocryophilus –15 25 37 Listeria monocytogenes –1,5 37 45 Mezofile Escherichia coli 10 37 45 Neisseria gonorrhoeae 30 35 38 Termofile Geobacillus stearothermophilus 35 60 75 Thermus aquaticus 40 70 79 Hipertermofile Pyrococcus abyssi (archeon) 67 96 102 Pyrococcus fumarii (archeon) 90 106 113 Mechanizmy adaptacyjne psychrofili: Modyfikacja składu kwasów tłuszczowych w lipidach błonowych: większa zawartość nienasyconych kwasów tłuszczowych (z kilkoma wiązaniami podwójnymi) i krótsze kwasy tłuszczowe w fosfolipidach błonowych umożliwiają utrzymanie stanu półpłynnego błony, co pozwala utrzymać transport różnych substancji na odpowiednim poziomie. Synteza tych enzymów, które są lepiej dostosowane do działania w niskich temperaturach. Zachowanie aktywności katalitycznej białek w niskich temperaturach, z jednoczesną niską stabilnością w zmiennym zakresie temperatur. Zredukowany hydrofobowy rdzeń i mniej naładowana powierzchnia dają białkom większą plastyczność w niskich temperaturach. Więcej struktur typu 𝛼 niż kartki 𝛽, więcej aminokwasów polarnych, a mniej hydrofobowych umożliwia enzymom zachowanie aktywności w niskich temperaturach. Synteza krioprotektantów (glicerol, pewne cukry proste, ektoina, karnityna, trehaloza), zapobiegających powstawaniu kryształów lodu w komórce. Wytwarzanie białek chroniących przez zamarzaniem, zdolnych do wiązania powstających w komórce kryształków lodu i zapobieganiu ich powiększania co mogłoby doprowadzić do zniszczenia komórki. Wytwarzanie białek szoku zimna, które wiążą się z pewnymi mRNA i ułatwiają ich translację oraz umożliwiają określonym białkom utrzymanie odpowiedniej konformacji. Mechanizmy adaptacyjne termofili: Modyfikacja składu lipidów błonowych: duża ilość nasyconych kwasów tłuszczowych. Dodatkowo lipidy w błonach komórkowych są połączone wiązaniem eterowym ze ścianą komórkową. U archeonów termofilnych może występować miejscami jednowarstwowa błona komórkowa, zamiast dwuwarstwowej. Taka budowa znacznie podnosi termooporność komórki. 3  Stabilizacja białek przez wytworzenie w cząsteczkach dodatkowych wiązań i oddziaływań w postaci mostków di-siarczkowych i wiązań wodorowych. Zmniejszona liczba aminokwasów termolabilnych oraz wrażliwych na deaminację i oksydację. Białka są bardziej zwarte i sztywne dzięki zmniejszeniu liczby i wielkości pętli peptydowych na powierzchni cząsteczki, większemu upakowaniu i ograniczeniu wolnych przestrzeni, obniżeniu hydrofilowości, zwiększeniu hydrofobowości rdzenia oraz podwyższeniu punktu izoelektrycznego cząsteczki białka. Wytwarzanie białek szoku cieplnego (HSPs – heat shock proteins), które wiążą denaturowane termicznie białka, zabezpieczając je przed agregacją i przywracając im aktywną fizjologicznie strukturę. Wytwarzanie specyficznych białek zabezpieczających czy umożliwiających transkrypcję w podwyższonej temperaturze. Zwiększenie liczby par guanina-cytozyna w kwasach nukleinowych. Stabilizacja cząsteczek DNA dzięki wyższemu niż w komórkach mezofilowych stężeniu jonów K+. Zabezpieczenie dwuniciowej helisy DNA przed rozpleceniem w wysokiej temperaturze za pomocą różnych białek histonopodobnych. Ukształtowanie dodatniego superskręcenia helisy DNA katalizowanego przez odwrotną gyrazę. Synteza trehalozy i innych substancji ochronnych, takich jak różnego rodzaju rozpuszczone w cytoplazmie związki małocząsteczkowe (np. fosforan diinozytolu, fosforan diglicerolu, mannozyloglicerynian). 1.2. Bakteriostatyczne i bakteriobójcze działanie temperatury Wysoka i niska temperatura wpływają na wzrost mikroorganizmów, w skrajnych przypadkach przejawia się działaniem statycznym lub letalnym. Oddziaływanie zabójcze ciepła zależy od czasu i wartości temperatury. Pod wpływem wysokiej temperatury następuje denaturacja białek (skuteczniejsze jest gorące i wilgotne powietrze niż gorące i suche), uszkodzenie błony cytoplazmatycznej oraz kwasów nukleinowych. Najbardziej oporne na wysoką temperaturę są przetrwalniki bakteryjne, zawierające enzymy ciepłooporne, np. racemazę alaninową. Pod wpływem wysokiej temperatury racemaza L-alaniny przekształca ją w D-alaninę, która hamuje kiełkowanie endospor. Enzymy ciepłooporne związane są z kompleksem cząsteczkowym, który zawiera kwas dipikolinowy. Starsze komórki są bardziej oporne na działanie wysokiej temperatury. Obecność w podłożu cukrów, białek i tłuszczów stwarza barierę ochronną dla drobnoustrojów. Ochronne działanie ma również obojętne pH podłoża (z wyjątkiem bakterii kwasoopornych, które posiadają osłonę woskową). Wrażliwość mikroorganizmów na działanie wysokiej temperatury określają: o Punkt śmierci cieplnej – najniższa temperatura, w której dany organizm ginie w ciągu 10 minut. o Czas śmierci cieplnej – czas potrzebny do zabicia wszystkich drobnoustrojów danego gatunku, w określonych warunkach, w danej temperaturze. Ochładzanie jest niejednakowo znoszone przez różne gatunki, zimno może być czynnikiem statycznym lub zabójczym. Bakterie schładzane do temperatury 0ºC nie giną, występuje jedynie zahamowanie podziałów 4 komórkowych. Obniżenie temperatury poniżej 0ºC działa zabójczo, a przyczyną śmierci w tych warunkach jest mechaniczne uszkodzenie komórek powstającymi w nich kryształkami lodu. Drobnoustroje poddane gwałtownemu ochłodzeniu np. w temperaturze ciekłego azotu (–190ºC) nie giną, po powolnym odmrożeniu odzywają i podejmują wszystkie procesy życiowe. Zostało to wykorzystano do przechowywania szczepów drobnoustrojów. Drobnoustroje można także przechowywać w stanie zliofilizowanym. 2. Wpływ ciśnienia osmotycznego Większość drobnoustrojów bytuje w środowisku, w którym stężenie substancji rozproszonych na zewnątrz jest mniejsze niż wewnątrz bakterii, co ułatwia przechodzenie wody do komórek, a proces ten jest równoważony parciem ściany komórkowej. W warunkach hipertonicznych zachodzi zjawisko plazmolizy, w hipotonicznych – deplazmolizy. Większość bakterii hodujemy na pożywkach zawierających 0,85% NaCl (0,14 M). Halofile – wymagają do życia soli w dużych stężeniach, >0,2 M (mikroorganizmy morskie, np. Aliivibrio fischeri potrzebuje NaCl w stężeniu 2%). Ekstremalne halofile – wymagają do wzrostu NaCl w stężeniu co najmniej 9% (1,5 M), a większość do optymalnego wzrostu potrzebuje NaCl w stężeniu 12–23% (2–4 M). Niektóre rosną nawet w nasyconym roztworze NaCl (32%, 5,5 M). Występują w słonych jeziorach, salinach, słonej glebie, w jedzeniu zawierającym duże stężenie soli. Wiele ekstremalnych halofilów to archeony, np. Halobacterium, ich cechą charakterystyczną jest wytwarzanie czerwonych barwników karotenoidowych, które powodują np. intensywne czerwone zabawienie wód, w których się rozwijają. Halotolerancyjne mikroorganizmy – tolerują podwyższone stężenie NaCl w środowisku, ale nie wymagają obecności soli w takim stężeniu. Bakterie z rodzaju Staphylococcus (np. S. aureus) tolerują NaCl w stężeniu 7,5%. Bakterie osmofilne wykazują zdolność do wzrostu na podłożu zawierającym w dużym stężeniu sacharozę. Mechanizmy adaptacyjne halofili: Aby uniknąć lizy halofile muszą utrzymywać równie wysokie wewnątrzkomórkowe stężenie soli, np. poprzez utrzymywanie wysokiego poziomu K+ i Cl- wewnątrz komórki. Enzymy halofili, ich rybosomy i białka transportowe wymagają wysokiego poziomu potasu dla stabilności i aktywności. Ściany komórkowe są stabilizowane przez wysokie stężenie jonów sodu. Synteza lub pobieranie różnego rodzaju związków o charakterze cząsteczek osmoregulacyjnych (osmolitów), np. KCl, glicerol, sacharoza, ektoina, prolina, glicyna, betaina. Stabilizują one enzymy, nie ingerując w procesy metabolizmu komórkowego. 3. Wpływ pH Każdy mikroorganizm rośnie we właściwym dla niego przedziale pH. Mikroorganizmy występują w zakresie wartości pH od 0 do 13. Na podstawie optymalnych wartości pH wszystkie organizmy można podzielić na trzy grupy: Neutrofile – żyjące w pH bliskim obojętnemu (większość mikroorganozmów). Acydofile – kwasolubne, rosnące lepiej przy niskich wartościach pH (ph 0–5,5). Aklalifile – zasadolubne, rosnące lepiej przy niskich wartościach pH (ph 8–11). 5 Acydofile – zamieszkują środowiska o drastycznie niskim pH i są to zarówno środowiska naturalne, jak i powstałe na skutek określonej działalności człowieka: morskie kominy hydrotermalne, gorące źródła, gejzery, fumarole, solfatary, kwaśne wody odpływowe kopalni różnych minerałów, wody spływające z hałd węgla kamiennego. Należą do nich m.in. archeony z rodzajów Sulfolobus, Termoplasma, Ferroplasma, Picrofilus; bakterie Acidithiobacillus ferroxidans, Thiobacillus prosperus, Sulfobacillus acidophilus. Mechanizmy adaptacyjne acydofili: Mimo wysokiego stężenia jonów H+ na zewnątrz komórki, wewnątrz komórek acydofile utrzymują prawie zawsze pH na poziomie zbliżonym do neutrofili (pH 5–7). Wyjątkiem są gatunki z rodzaju Picrophilus, u których pH wnętrza komórki wynosi ok. 4,6. Ciągłemu napływowi jonów H+ do komórek zapobiega: wysoce nieprzepuszczalna błona komórkowa, zmiana ładunku wewnątrz komórki na silnie dodatni, wzmożona synteza czynników odpowiedzialnych za aktywny transport protonów na zewnątrz. Wzmożona ekspresja genów odpowiedzialnych za syntezę transporterów protonów. Usuwają one protony, które napłynęły do komórki z powrotem na zewnątrz. Zwiększona liczba genów związanych z naprawą uszkodzeń DNA i białek. Alkalifile – jeziora i pustynie sodowe, gleba, jelita owadów, jeziora bogate w Ca 2+, wody odpływające z zakładów produkujących papier, detergenty, odpady z garbarni. Do grupy autotrofów alkalifilnych należą niektóre cyanobakterie, np. z rodzajów Anabaenopsis, Cyanospira, Spirulina. Bakterie z rodzaju Bacillus, Micrococcus, Streptomyces, Clostridium. Alkalifilne archeony: Natronobacterium, Halorubrum, Natrialba, Natronobacterium pharaonis. Duża część organizmów alkalifilnych to haloalkalifilie – wymagają do wzrostu zarówno alkalicznego pH jak i wysokiego stężenia soli. Mechanizmy adaptacyjne alkalifili: Utrzymują pH wnętrza komórki na poziomie zbliżonym do neutralnego. pH we wnętrzu komórek skrajnych alkalifilów wynosi 9,5. Gradient pH jest utrzymywany wskutek aktywnego antyportu Na +/H+, polegającego na stałym usuwaniu jonu Na+ w zamian za pobierany proton. Obecność jonów sodu w środowisku jest konieczna do sprawnego funkcjonowania takiej wymiany. Niektóre alkalifile w ścianie komórkowej posiadają dodatkowe, ujemnie naładowane polimery. Są to np. reszty kwasów: tejchuronowego, czy asparaginowego oraz tejchuronopeptydy. Dzięki ich obecności możliwe jest wiązanie dodatnio naładowanych jonów, zwłaszcza Na +. 6  4. Wpływ promieniowania Promieniowanie słoneczne: 100–400 nm – promienie ultrafioletowe, 400–700 nm – światło widzialne, >700 nm – podczerwień i daleka podczerwień. Poszczególne rodzaje promieniowania mogą być selektywnie pochłaniane przez komórki. Efekt mutagenny obserwujemy przy niższym natężeniu działającego promieniowania, efekt letalny zaś przy dużej jego dawce. Światło widzialne wywiera jedynie słabe działanie bakteriobójcze, które polega na zjawisku fotodynamicznego uczulenia komórek przez niektóre związki chemiczne obecne w środowisku wzrostu lub wewnątrz komórki. Substancje te, w obecności światła, uczulają komórkę zwiększając jej wrażliwość na zabójcze działanie części widzialnej widma słonecznego. Wykazują je barwniki (błękit metylenowy, eozyna, safranina) dodane do środowiska mikroorganizmów. Bakterie fotosyntetyzujące, halofile, a także mikroorganizmy występujące w powietrzu, wytwarzają barwniki z grupy karotenoidów, obecność których chroni pozostałe składniki komórki przez nieodwracalną fotooksydacją. Promieniowanie UV oraz jonizujące nie występuje w środowisku naturalnym w takim natężeniu, aby mogło wpływać w sposób decydujący na rozwój mikroorganizmów. Jego działanie w przyrodzie ma charakter mutagenny wobec mikroorganizmów. Promieniowanie UV o zakresie fal 230–270 nm wykazuje bardzo silne działanie bakteriobójcze lub mutagenne. Jest absorbowane przez zasady purynowe i pirymidynowe DNA oraz aminokwasy aromatyczne białek. Najbardziej wrażliwe są formy wegetatywne bakterii. Przetrwalniki są bardziej oporne. Najbardziej wrażliwe na działanie UV są bakterie w fazie logarytmicznego wzrostu. UV ma mała przenikliwość, działa powierzchniowo. Pod wpływem UV mogą występować zmiany w podłożu, powstają nadtlenek wodoru i wolne rodniki HO, które mają właściwości utleniające, a więc toksyczne dla bakterii (pośrednie działanie UV). Efekt letalny: powstanie dimerów pomiędzy resztami tyminy, w tej samej nici DNA, co prowadzi do zaburzenia jego replikacji. Działanie mutagenne: tworzenie się dimerów cytozyny oraz cytozyny i tyminy. Mechanizmy naprawy uszkodzonego DNA: Reperacja świetlna (fotoreaktywacja): rozszczepienie powstałych dimerów tyminy przy udziale enzymu fotolizazy uaktywnianej światłem widzialnym. Reperacja ciemna: rozpoznanie i wycięcie uszkodzonych odcinków DNA, „wypełnienie” usuniętego fragmentu nowym i połączenie w całość nici DNA. Promieniowanie UV jest stosowane do sterylizacji powietrza, pomieszczeń, do dezynfekcji wody pitnej. 5. Wpływ substancji chemicznych Sterylizacja (jałowienie) – proces prowadzący do zabicia lub usunięcia wszystkich mikroorganizmów wraz z ich formami przetrwalnikowymi. Dezynfekcja (odkażanie) – proces, w wyniku którego ulegają zniszczeniu formy wegetatywne mikroorganizmów, pozostają spory bakteryjne. Sanityzacja – usuwanie widocznych zabrudzeń i zanieczyszczeń a wraz z nimi także większości mikroorganizmów (mycie, odkurzanie). 7 Antyseptyka – dezynfekcja skóry, błon śluzowych, uszkodzonych tkanek z zastosowaniem preparatów nie działających szkodliwie na tkanki ludzkie. Aseptyka – sposób postepowania, którego celem jest zapobieganie zakażeniom tkanek i skażeniom jałowych powierzchni. Czynniki wpływające na skuteczność dezynfekcji: poziom skażenia: im większa liczba drobnoustrojów tym więcej czasu potrzebuje środek dezynfekcyjny do ich zniszczenia przy nie zmieniających się pozostałych warunkach (stężenie, temperatura). oporność drobnoustrojów: spory są bardziej oporne, prątki posiadają woskowatą ścianę komórkową, bakterie gram-ujemne posiadają zewnętrzną błonę. stężenie i siła działania: im bardziej stężony jest środek dezynfekcyjny, tym większa jest skuteczność i krótszy czas potrzebny do uzyskania efektu bójczego (ale są wyjątki). czynniki fizyczne i chemiczne (temperatura, pH, względna wilgotność, twardość wody): aktywność większości środków dezynfekcyjnych rośnie wraz ze wzrostem temperatury, ale są wyjątki. Wzrost pH poprawia aktywność niektórych środków dezynfekcyjnych (np. aldehydu glutarowego, czwartorzędowych związków amoniowych), ale zmniejsza aktywność u innych (np. fenoli, podchlorynów). Względna wilgotność wpływa w znaczący sposób na aktywność gazowych środków dezynfekcyjnych (tlenek etylenu, dwutlenek chloru). obecność substancji organicznych (surowica, krew, ropa, kał, sluz) może ograniczać działanie przeciwdrobnoustrojowe preparatów dezynfekujących np. w wyniku tworzenia z nimi nieaktywnych związków. Związki chemiczne Sposób działania Zastosowanie Alkohol (alkohol - denaturacja białek Aktywność bakteriobójcza i bakteriostatyczna na etylowy, alkohol - rozpuszczenie lipidów wegetatywne formy bakterii, nie niszczą spor bakteryjnych. izopropylowy) Optymalne stężenie: 60–90% wodnego roztworu. Aktywność gwałtownie spada po nadmiernym rozcieńczeniu (