LEZIONE 7 15-03-2022.docx

**BIOLOGIA CELLULARE** **15/03/2022** **Lezione 7** **COMPARTIMENTI INTRACELLULARI E SMISTAMENTO DELLE PROTEINE** Nella tabella viene esplicato che tutte le cellule eucariotiche hanno lo stesso set di organelli racchiusi da membrana, ma mostra come la composizione possa variare in funzione del t...

**BIOLOGIA CELLULARE** **15/03/2022** **Lezione 7** **COMPARTIMENTI INTRACELLULARI E SMISTAMENTO DELLE PROTEINE** Nella tabella viene esplicato che tutte le cellule eucariotiche hanno lo stesso set di organelli racchiusi da membrana, ma mostra come la composizione possa variare in funzione del tipo cellulare preso in esame; in particolare va a correlare questa nozione con la funzione cellulare. Analizzando la tabella, mostra in epatociti (principale tipo cellulare presente nel fegato) e in cellule del pancreas esocrino l'esempio di composizione in membrane che delimitano organelli o la cellula stessa.\ In primo luogo quindi la tabella ci dice che la membrana plasmatica rappresenta una piccola percentuale in massa di quella che è complessivamente la massa delle membrane cellulari eucariotiche: c'è quindi una bassa percentuale di membrane costituite da membrana plasmatica.\ Mentre una componente importante --più della metà di membrane di questi tipi cellulari---è costituita da membrane del reticolo endoplasmatico.\ Il reticolo endoplasmatico è classificato in: - - Questo spiega perchè nell'epatocita abbiamo un 16% di membrana di RE liscio, che è minore invece dell'1% nelle cellule del pancreas esocrino.\ Le cellule del pancreas esocrino sono cellule deputate alla sintesi e alla secrezione degli enzimi pancreatici coinvolti nella digestione (sono proteine): in queste cellule sarà quindi più espanso il compartimento del RE rugoso, deputato alla sintesi di proteine che verranno secrete, rispetto a quanto è esteso il RE liscio.\ Le funzioni in un certo senso spiegano le differenze di composizione di reticolo endoplasmatico rugoso e liscio tra i due tipi cellulari. La membrana interna mitocondriale è la sede delle reazioni coinvolte nella sintesi di energia a livello mitocondriale (quindi catena di trasporto degli elettroni, fosforilazione ossidativa, ecc,): quest'attività metabolica è particolarmente accentuata negli epatociti. Per questo in questo tipo cellulare è molto sviluppata la membrana mitocondriale interna, sede di queste funzioni cataboliche. Il RE degli epatociti: ha importante funzione per il metabolismo e lo smistamento di lipidi e colesterolo tra diversi tipi cellulari nell'organismo attraverso in particolare la sintesi di proteine VLDL, ma in realtà gli epatociti sono molti importanti anche per la sintesi di una serie di proteine che vengono poi secrete, da cui poi viene sviluppo di RE rugoso.\ Alcuni esempi di proteine secrete degli epatociti sono: albumina (proteina che è principale componente nel siero, sintetizzata dal ferro e rilasciata poi nel circolo ematico dove funge da carrier, trasportatore per legare altre proteine e farmaci) fattori della coagulazione e del complemento (fattori del complemento: sono proteine che legano anticorpi, a loro volta legati ad una cellula bersaglio, e che mediano una reazione citotossica) questo complemento deve essere eliminato dal siero tramite trattamento termico di scomplementazione, ossia inattivazione al calore del fattore di complemento. *Ripetiamo:* Ruolo importante degli epatociti per la sintesi di proteine che vengono poi secrete, e quindi sviluppo delle membrane del RE rugoso. Sono delimitati da membrana tutti gli altri organelli presenti nelle cellule eucariotiche, che rappresentano una piccola percentuale che può sempre variare in funzione del tipo cellulare in esame.\ Gli epatociti sono importanti per le reazioni di catabolismo ed inattivazione di farmaci, reazione di ossidazione, e per questo hanno membrana interna mitocondriale particolarmente sviluppata; ma anche una componente di membrane di perossisomi, ossia organelli deputati allo svolgimento di reazioni ossidative. Quindi in una cellula eucariotica più o meno la metà del volume è costituito dal citosol, il resto del volume è rappresentato da organelli, ciascuno con il proprio volume. **Origini della membrana:** *Come si è sviluppata la compartimentalizzazione di una cellula eucariotica*?\ L'ipotesi più accreditata attualmente è quella che prevede l'origine della prima cellula eucariotica aerobia a partire da un **archea** (e non da batteri). Gli Archea presentano effettivamente alcune analogie con le cellule eucariotiche (non presenti invece tra cellule eucariotiche ed i batteri).\ Ad esempio negli Archea sono presenti geni come l'actina, tubulina, ecc; ossia i geni codificanti per istoni, che non presenti nei batteri. Quindi ci sono evidenze che indicano che il genoma nucleare di una cellula eucariotica si sia prodotto ed evoluto più probabilmente da un archeobatterio piuttosto che da un batterio, proprio per queste analogie tra geni del genoma degli eucarioti e degli Archea.  *Come si è evoluta la cellula eucariotica*? A partire da un Archea che, avendo perso la parete batterica, sarebbe stato più permeabile all'incorporazione di DNA esogeno, definito in slide come *trasferimento genico orizzontale*: ossia un trasferimento di DNA da una cellula ad un'altra che non ne rappresenta la progenie. Quindi la perdita della parete batterica avrebbe favorito il trasferimento genico orizzontatale che sarebbe alla base dell'evoluzione di una prima cellula eucariotica.  *Da cosa deriverebbe la struttura compartimentalizzata della cellula eucariotica*? Dalla formazione di una serie di invaginazioni della membrana, che avrebbero dato luogo a dei compartimenti ---come l'involucro nucleare in slide. Questi compartimenti intra cellulari che deriverebbero quindi da invaginazioni della membrana plasmatica.\ Analogamente, oltre all'involucro nucleare anche il lume del RE deriverebbe da invaginazioni della membrana plasmatica che poi si richiudono su se stesse. Si introduce allora il concetto di **spazio topologicamente equivalente**.\ Sulla base della formazione di queste invaginazioni, si va a creare un involucro nucleare che è definito da una membrana nucleare interna ed una esterna, lo spazio che è interposto tra queste due membrane dell'involucro nucleare è topologicamente equivalente allo spazio extra cellulare; analogamente anche il lume del RE è topologicamente allo spazio extra cellulare. Oltre alla formazione di queste invaginazioni della membrana, che si ripiegano su loro stesse dando una serie di compartimentalizzazioni delimitate da membrane (involucro nucleare, RE, apparato del Golgi, lisosomi, sistemi di vescicole presenti nella cellula,...), l'origine dei mitocondri deriverebbe dall'endosimbiosi di una cellula procariotica aerobia internalizzata (fagocitata) da questa cellula ancestrale, precursore della cellula eucariotica. **Le origini evolutive spiegano le relazioni topologiche degli organali racchiusi da membrana**: Nell'immagine vengono esemplificati e rappresentati con colori diversi, gli spazi che sono topoligicamente equivalenti. Sono spazi che comunicano tra di loro senza la necessità che una molecola attraversi la membrana. *Esempio*: il citosol non è topologicamente equivalente allo spazio extra cellulare, perchè la molecola per passare dal citosol allo spazio extra cellulare deve attraversare la membrana plasmatica; al contrario un lisosoma, o una vescicola di trasporto intra cellulare, o un lume dell'apparato del Golgi o del RE, è topologicamente equivalente allo spazio extra cellulare, perchè è possibile veicolare molecole da questi compartimenti all'esterno della cellula, senza che queste molecole debbano attraversare una membrana.\ *Esempio nel pannello (A):* si ha una vescicola con il suo cargo, cioè ciò che è trasportato. Si ha una vescicola che gemma da questa struttura, questa vescicola contiene una qualsiasi molecola che può passare da questa struttura (che può essere ad esempio l'apparato del Golgi) allo spazio extra cellulare senza attraversare membrane. Il cargo viene caricato da una vescicola che gemma da un compartimento e si fonde con altro compartimento permettendo il rilascio nello spazio extra cellulare del suo contenuto. Quindi la teoria endosimbiontica (che sarebbe all'origine dell'evoluzione della cellula eucariotica a partire da endosimbiosi di cellula procariotica con cellula ancestrale eucariotica di derivazione dagli archea) spiega la relazione tra questi spazi topologicamente equivalenti o non equivalenti; spazi definiti da membrane all'interno della cellula. Allo stesso modo, il nucleo è topologicamente equivalente al citosol, perchè il passaggio di molecole dal nucleo al citosol non implica l'attraversamento di una membrana: ci sono dei pori nell'involucro nucleare che permettono il passaggio di queste molecole. **TRASPORTI** In funzione di questa definizione appena presentata, si possono identificare tre diversi meccanismi di movimento delle proteine tra i compartimenti intra cellulari. - **TRASPORTO REGOLATO**.\ Riguarda il passaggio di molecole, di proteine dal citosol al nucleo e viceversa, quindi tra spazi topologicamente equivalenti. Le proteine possono quindi passare da un compartimento all'altro senza attraversare membrane.\ Questo trasporto NON avviene per diffusione attraverso i pori dell'involucro nucleare non selettivo, bensì è un trasporto regolato e selettivo. Viene mediato da strutture selettive che permettono il passaggio per diffusione solo di molecole piccole (in generale molecole più piccole di 60kD possono passare dall'interno all'esterno del nucleo attraverso i pori dell'involucro nucleare). Mentre il trasporto di molecole più grandi è un trasporto attivo e selettivo in entrata ed uscita dal nucleo. Può riguardare singole proteine o complessi multimerici, macromolecolari.  - **TRASLOCAZIONE PROTEICA.**
\ Riguarda il passaggio di molecole dal citosol ad altri compartimenti delimitati da membrana, che non sono topologicamente equivalenti al citosol. Questo tipo di trasporto è un trasporto che permette il passaggio di proteine dal citosol a compartimenti non topologicamente equivalenti tramite una membrana. Il traporto può avvenire verso RE, mitocondri, cloroplasti e perossisomi.  - **TRASPORTO VESCICOLARE.**
\ Trasporto di proteine attraverso vescicole. Le vescicole sono dei sistemi di veicolazione delimitati da membrana, da un doppio strato fosfolipidico. Il trasporto vescicolare permette il trasporto di proteine, di un cargo, da un compartimento ad un altro topologicamente equivalenti, oppure da un compartimento intra cellulare ad uno spazio extra cellulare che è topolgicamente equivalente. È un trasporto che permette di veicolare il trasporto di proteine dal lume del RE all'esterno della cellula, allo spazio extra cellulare. *Come è possibile che una proteina venga etichettata, destinata ad uno specifico compartimento?* Questo avviene grazie alla presenza di [sequenze segnale,] che funzionano come etichette per indicare il compartimento di destinazione di una specifica proteina.\ Quindi le proteine hanno sequenze segnale, che sono delle sequenze amminoacidiche necessarie per il corretto smistamento di queste proteine al comparto cellulare al quale sono destinate. **SEQUENZE SEGNALE** Nella tabella sono rappresentante alcune sequenze segnale che permettono il corretto smistamento di proteine. Proteine per importazione a livello nucleare: sequenza di 5 amminoacidi carichi positivamente che vengono riconosciute e permettono il trasporto a livello nucleare della proteina che ha tale sequenza 
\ Segnale di esportazione dal nucleo al citosol: amminoacidi in arancione alternati ad altri amminoacidi non conservati.\ Anche l'importazione nel mitocondrio implica la presenza di zone segnale: domini della proteina definiti da amminoacidi alternati ad altri amminoacidi non conservati che vanno a costituire una alfa elica anfipatica, cioè con una porzione ad alfa elica polare, carica positivamente, alternati a amminocidi apolari o polari neutri. Questa ripetizione permette nella struttura secondaria della proteina di formare un'alfa elica anfipatica che rappresenta il segnale di importazione mitocondriale (in questo caso si parla non si sequenza segnale, bensì di zona segnale rappresentante il dominio nella struttura secondaria della proteina).\ Analogamente avviene nell'importazione nei plasmidi: alcuni amminoacidi conservati alternati ad altri non conservati. Queste sequenze segnale possono essere localizzate all'amminoterminale della proteina (come nel caso di importazione dei mitocondri in cloroplasti); oppure possono essere carbossiterminali (come per perossisomi); oppure possono essere sequenze interne alla proteina (come nei casi di esportazione ed importazione dal nucleo). Quando sono all'ammino o al carbossi temrinale, alcune sequenze segnale possono a volte essere eliminate nella proteina matura; quindi non sono più presenti nella proteina matura, dopo il suo smistamento al corretto compartimento intracellulare. Quindi le sequenze segnale possiamo in generale definirle come sequenze amminoacidiche (da 15 a 60 amminoacidi); in alcuni casi le sequenze sono particolarmente brevi, in altre situazioni hanno lunghezze medie; nel caso specifico del peptidil segnale di importazione nel RE si ha una sequenza amminoacidica di una decina di amminoacidi che sono tutti in fila nella sequenza e prendono il nome di **peptide sengale del RE**. **IL TRASPORTO DI MOLECOLE TRA NUCLEO E CITOSOL** È il sistema di trasporto regolato: importazione ed esportazione di proteine dal citosol e nucleo e viceversa. Il nucleo è costituito da un'invaginazione della membrana plasmatica che ha generato un compartimento intra cellulare delimitato da membrana, quindi da un doppio strato fosfolipidico, e nell'involucro nucleare si ha membrana nucleare interna (che si affaccia verso il nucleo), molto diversa da quella nucleare esterna.\ La membrana nucleare esterna è in continuità con il RE.\ *In che senso sono diverse le due membrane nucleari interna ed esterna*? La membrana nucleare esterna è rivestita da ribosomi, come la superficie del RE rugoso; quindi la membrana nucleare esterna è sedi di sintesi di proteine come lo è la membrana del RE rugoso.\ Quindi in questo lume dell'involucro nucleare si troveranno delle proteine di nuova sintesi che sono state traslocate all'interno del lume del RE con il quale presentano continuità.\ La membrana nucleare interna invece è rivisitata da proteine della lamina nucleare, che è un importante sito di ancoraggio del genoma nucleare ad un reticolo proteico che ha la funzione di [supporto] alla lamina nucleare. Lo spazio che si interpone tra la membrana nucleare interna ed esterna è detto spazio perinucleare, che è in continuità con il RE. Questo involucro nucleare presenta dei pori: attraverso di essi si realizza il trasporto regolato. È regolato da complessi proteici molto articolati, costituti anche da 500-1000 molecole proteiche diverse, sono quindi complessi molto articolati e visibili anche in microscopia elettronica. Questi complessi proteici hanno una struttura proteica esposta dal lato citosolico diversa da quella esposta verso il lato nucleare. La struttura proteica rivolta verso il nucleo è una struttura sviluppata, articolata ed ingombrante ed ha una struttura 'a canestro'.\ Queste strutture proteiche formano un complesso del [poro nucleare] che presenta una simmetria ottagonale, in otto spicchi equivalenti in termini di composizione proteica sul lato citosolico e sul lato nucleare.\ *Da quali proteine è composto il compless*o? In rosso e giallo: **nucleoporine**: proteine che formano il complesso del nucleo. Si distinguono in nucleoporine **scaffold** (d'impalcatura) ---le rosse--- e nucleoporine **del canale**---in giallo. Le nucleoporine del canale possiedono anche una porzione proteica non organizzata, che protrude verso il centro del complesso del poro nucleare. Sono porzioni, regioni disordinate con ripetizioni di amminoacidi fenilalanina-glicina, denominate regioni FG. Queste porzioni disorganizzate (in grigio) delle nucleoporine del canale conferiscono una selettività al complesso del poro dell'involucro, quindi costituiscono una sorta di groviglio gelatinoso che non lascia passare molecole di dimensioni inferiori a 60kD Il reticolo gelatinoso funge da filtro selettivo, impedendo il passaggio di proteine più grandi attraverso i pori dell'involucro nucleare.  Oltre allenucleoporine scaffold e di canale, ci sono delle proteine in verde: sono proteine che piegano la membrana. La formazione dell'involucro nucleare implica un ripiegamento di membrane che energicamente non è estremamente stabile. La stabilizzazione di questi complessi, che richiede questo livello di ripiegamento della membrana che costituisce l'involucro nucleare, richiede l'interazione di questi complessi proteici con proteine integrali di membrana che vanno appunto a ripiegare la membrana. E ancorano il complesso del poro nucleare al doppio strato fosfolipidico che costituisce l'involucro nucleare. Anche le nucleoporine di impalcatura hanno una porzione fibrillare, che va a costituire la struttura 'a canestro' che si vede sul foglietto nucleare dell'involucro nucleare. Questa struttura a canestro quindi è definito da porzioni fibrillari delle nucleoporina scaffold. L'importazione di una proteina a livello nucleare dipende da un segnale costituito di 4-5 amminoacidi basici, con carica positiva. Nella slide viene mostrato il fatto che, una proteina che ha localizzazione nucleare definita dalla sequenza amminoacidica di segnale di localizzazione, la modificazione di un solo amminoacido dei 5 della sequenza modifica la localizzazione della proteina stessa da esclusivamente nucleare ad esclusivamente citosolica. La proteina mutata artificialmente per studiare il ruolo della sequenza segnale di importazione nucleare è *large T antigen* di SV40, una proteine di origine virale, derivante dal virus SV40. (Già visto nell'immortalizzazione delle cellule) Un sistema artificiale per indurre l'immortalizzazione delle cellule è quello di veicolare all'interno delle cellule il gene codificante large Tantigen di SV40, come ad esempio *HEK293T* : cellule di rene embrionale umano, immortalizzate. **IMPORTINE ED ESPORTINE** Il segnale di localizzazione nucleare viene riconosciuto da proteine che mediano l'importazione di proteine che devono andare caricate all'interno del nucleo, come ad esempio large T antigen di SV40. Le proteine esemplificate qui sotto hanno dei segnali di localizzazione nucleare, che vengono riconosciuti da dei recettori di importazione nucleare, o **importine.** Le importine sono delle proteine citosoliche solubili in grado di riconoscere le proteine che presentano un segnale di localizzazione nucleare, con le quali interagiscono formando complessi come nella slide.  Un'importina non ha specificità selettiva per una proteina, ma è in grado di interagire con tante proteine che presentano quel segnale di localizzazione nucleare. *Caso pannello (B)*: si ha una proteina cargo, che deve essere importata nel nucleo. Questo cargo presenta un segnale di localizzazione nucleare. La proteina viene riconosciuta da una proteina adattatrice, riconosciuta a sua volta dall'importina: quindi l'interazione tra proteina che presenta il segnale di localizzazione nucleare e l'importina può essere diretta (pannello A) o indiretta (pannello B). Oltre al dominio che permette alle importine di interagire con proteine che presentano un segnale di localizzazione nucleare; le importine possiedono anche un dominio che permette loro l'interazione con sequenze F-G (sequenze disorganizzate che costituiscono una struttura gelatinosa nella parte interna del complesso del poro nucleare) presenti nelle nucleoporine del canale; le importine che interagiscono con queste sequenze FG sono in grado di risolvere localmente queste strutture gelatinose facilitando il passaggio del cargo dall'esterno all'interno della cellula. Per quanto riguarda il pannello B: l'interazione indiretta di una proteina cargo con un'importina, abbiamo visto che può essere mediata da proteina adattatrice.\ La proteina adattatrice ha un segnale di localizzazione nucleare riconosciuto dall'importina; la proteina adattatrice (in verde) solo [dopo] l'interazione con il cargo, espone il suo segnale di localizzazione nucleare.\ **Concetto importante**: una proteina che presenta un segnale di localizzazione nucleare, per essere trasportata a livello nucleare, deve avere una conformazione che renda riconoscibile da parte delle importine, o di altre proteine adattatrici, il loro segnale di localizzazione nucleare. Quindi non tutte le proteine che hanno tale sequenza amminoacidica automaticamente sono esclusivamente adibite alla localizzazione nucleare. Perché se questa sequenza segnale di localizzazione nucleare è mascherata, coperta da altre proteine (quindi non è esposta a importine o proteine adattatrici), la proteina che presenta questa sequenza può essere anche adibiti alla localizzazione citoplasmatica: questo è un importante sistema di regolazione della localizzazione, ad esempio, della funzione di fattori trascrizionali: un fattore trascrizionale svolge la sua funzione a livello nucleare, ma non necessariamente è ad esclusiva localizzazione nucleare, può trovarsi anche nel citosol ed esporre il suo segnale di localizzazione nucleare solo dopo l'interazione con il suo ligando o con altra proteina.\ Quindi la sequenza segnale di localizzazione nucleare è una condizione necessaria, ma non sufficiente per avere la localizzazione della proteina.\ In questo caso la proteina adattatrice ha una sequenza segnale, che viene esposta e riconosciuta solo dopo che la proteina adattatrice ha interagito con un'altra proteina, nel caso in esempio una proteina cargo. Tutto questo discorso relativo alle importine, vale anche per l'esportazione: proteine deputate ad esportazione dal nucleo al citosol sono le **esportine**. Importine ed esportine fanno parte di una grande famiglia di proteine (recettori per il trasporto nucleare), dette **[carioferine]**, che mediano il trasporto da nucleo a citosol e viceversa di altre proteine. **GTPASI RAN** *Da cosa è regolato il trasporto da citosol a nucleo e viceversa delle proteine*? Da una parte è regolato dall'interazione con importine ed esportine.\ Un altro meccanismo fondamentale che conferisce direzionalità ai processi di importazione ed esportazione è definito da una proteina che ha attività GTPasica, cioè è in grado di idrolizzare GTP a GDP.\ È una [GTPasi monomerica]. Le GTPasi monomeriche (le vedremo diverse volte nel corso) condividono questo stesso meccanismo: sono proteine monomeriche ad attività GTPasica: sono in grado di legare GTP ed idrolizzarlo a GDP + fosfato inorganico. In questo modo possono assumere due diverse conformazioni: una legata al GTP e l'altra legata a GDP. *Cosa regola il legame di GTP o GDP*? Intanto queste proteine hanno attività enzimatica intrinseca (ossia capacità di idrolizzare GTP a GDP e fosfato inorganico), quest'attività viene esaltata da proteine che prendono il nome di **GAP** (GTP-ase activating proteine). Sono proteine che interagiscono con la GTPasi monomerica attivandone l'attività GTPasica, quindi promuovono il passaggio da proteina legata a GTP alla conformazione in cui la stessa proteina lega GDP, esaltandone l'attività GTPasica. Le GAP attivano l'attività GTPasica promuovendo l'idrolisi di GTP a GDP + fosfato inorganico.\ Ci sono poi delle altre proteine **GEF** (guanine exchange factor), che sono fattori che promuovono lo scambio nucleotidico, il rilascio di GDP e la sua sostituzione con GTP; quindi promuovono la conformazione della proteina che lega GTP. In generale (non sempre), al legame di GTP o GDP da parte di una GTPasi monomerica corrisponde una conformazione attiva o inattiva della GTPasi monomerica.\ Risulta attiva quando lega GTP e inattiva quando lega GDP.\ In questo senso GAP e GEF sono dei regolatori dell'attività delle GTPasi monomeriche. Per quanto riguarda la direzionalità del trasporto di importazione ed esportazione di proteine da nucleo a citosol e viceversa, la GTPasi specifica che è coinvolta è **Ran**.\ Questa Ran GTPasi non ha conformazioni diverse se attiva o inattiva, legando GTP o GDP. Bensì svolge queste due conformazioni con diverse funzioni, diverse attività. *Quali conformazioni ha la GTPasi Ran nel nucleo o nel citosol?* - Nel citosol prevale l'attività della Ran-GAP, che promuove l'idrolisi del GTP. Quindi favorisce, a livello citosolico, la conformazione della proteina legata a GDP. Quindi a livello citosolico si trova prevalentemente Ran legato a GDP; questo perchè a livello citosolico è particolarmente presente la Ran-GAP. - A livello nucleare, si ha un fattore di scambio del nucleotide guanosinico GEF, specifico per Ran che è localizzato in modo stabile a livello nucleare perchè interagisce con la cromatina. Quindi a livello nucleare questa Ran-GEF favorisce la conformazione di Ran che lega GTP. *Come viene importato a livello nucleare Ran?* Abbiamo visto che le proteine di solito vengono importate a livello nucleare mediante interazione con le importine. Ran interagisce con una proteina che [non] è della famiglia delle carioferine (rappresenta quindi un'eccezione al meccanismo visto precedentemente). *Come regola Ran l'importazione delle proteine da citosol a livello nucelare*?  Si ha la proteina marrone che interagisce con l'importina. L'importina a sua volta, oltre ad avere dominio di attivazione con proteine che presentano il segnale di localizzazione nucleare, è in grado di interagire con le sequenze FG: le importine sono in grado di dissolvere localmente questa regione gelatinosa permettendo il passaggio attraverso il poro nucleare delle proteine.\ Qualora la proteina, con l'importina, riesca ad attraversare la regione delle sequenze FG, a livello nucleare Ran-GTP (che qui prevale) va a legare l'importina liberando la proteina che è arrivata alla sua destinazione nucleare. Il cargo dell'importina viene rilasciato a livello nucleare. Il complesso costituito da importina e Ran-GTP è in grado di diffondere attraverso la regione del foro dell'involucro nucleare e, se arriva a livello citoplasmatico (dove prevale l'attività GTPasica per la presenza di Ran-GAP), andrà in contro ad idrolisi del GTP al GDP. Avremo quindi Ran-GDP che si dissocia dall'importina e un fosfato inorganico. La dissociazione di Ran-GDP dall'importina, rende disponibile l'importina per una nuova importazione: in questo senso il legame di GTP o GDP definisce la direzionalità mediata da Ran-GTPasi. Per l'esportazione di un cargo dal nucleo al citosol, il meccanismo è simile ed è sempre mediato dagli stessi meccanismi.\ Si ha esportina (in marrone) che a livello nucleare si lega con il suo cargo (in verde) che presenta una sequenza segnale di esportazione dal nucleo.\ A livello nucleare, l'esportina lega Ran-GTP e l'interazione con Ran-GTP promuove il legame del cargo.\ Quando l'esportina che lega Ran-GTP ed il suo cargo arrivano a livello citosolico, attraversando il complesso del poro nucleare, andrà a promuovere l'attività di Ran-GAP e quindi di nuovol' idrolisi del GTP a GDP+ fosfato inorganico. A livello citosolico, l'interazione di Ran-GDP con l'esportina è instabile, quindi Ran-GDP si dissocia portando al rilascio il cargo dell'esportina a livello citosolico e l'esportina è libera per un altro legame. 2^a^ PARTE: Slide 13: **[Il trasporto attraverso gli NPC può essere regolato controllando l'accesso al macchinario di trasporto]**  Le proteine possono avere dei segnali di importazione, di esportazione o entrata. Espongono siti di interazioni con importine ed esportine e utilizzano segnali di importazione o esportazione che ne regolano la loro direzione citosolica o nucleare. Esistono quindi anche delle proteine che contengono sia segnali di importazione, sia di esportazione! Tra gli esempi vi sono proteine che fungono da chaperon, quindi da navetta, che mediano il trasporto dentro e fuori dal nucleo di altre molecole. In funzione del fatto che prevalga l'attività di esportazione o di importazione nelle proteine che possiedono entrambi segnali, queste avranno una localizzazione prevalentemente citosolica o prevalentemente nucleare. L'importante meccanismo di regolazione della localizzazione di una proteina è rappresentato, qualora questa contenga un segnale di localizzazione nucleare o un segnale di esportazione, dal nucleo. Un esempio è rappresentato da NF-AT che è un fattore trascrizionale. NF-AT sta per "nuclear factor of activated T cells", quindi "fattore nucleare delle cellule T attivate" e di fatto è un fattore trascrizionale, quindi una proteina che agisce a livello nucleare regolando l'espressione di geni target. Esplica la sua funzione nelle cellule T attivate. Le cellule T o linfociti T sono cellule del sistema immunitario che sono in grado di riconoscere antigeni e attivarsi per dare una risposta volta all'eliminazione delle cellule che presentano questi antigeni. Di fatto, a controllare la funzione di NF-AT che è un fattore trascrizionale; uno dei meccanismi di regolazione dell'attività di NF-AT è rappresentato dalla regolazione della sua localizzazione perché ovviamente a livello citosolico non esplicherà una funzione di modulazione dell'espressione genica, che necessita il trasporto a livello nucleare. *Come viene regolato NF-AT?* NF-AT possiede dei segnali di esportazione dal nucleo che qui nell'immagine nella slide è indicato in verde e una sequenza segnale di importazione nucleare (o segnale di localizzazione nucleare) che è indicata in rosso. Di fatto la localizzazione di NF-AT è regolata proprio dall'esposizione del segnale di esportazione e dal mascheramento del segnale di importazione, oppure viceversa dall'esposizione del segnale di importazione nel nucleo e mascheramento di quello di esportazione. Disegno 1: Quindi NF-AT in questo caso in slide è citosolica perché l'aggiunta di una serie di gruppi fosfato, quindi un meccanismo di fosforilazione di una particolare regione della proteina, maschera di fatto il segnale di importazione nucleare. In questo caso l'unico segnale esposto è il segnale di esportazione per cui la proteina ha una localizzazione citosolica. Disegno 2: In alternativa possiamo avere una conformazione in cui c'è un'altra proteina, calcineurina, che copre, maschera il segnale di esportazione nucleare. Un'interazione non covalente tra proteine maschera il segnale di esportazione dal nucleo al citosol mentre in questa conformazione abbiamo esposto il segnale di importazione nucleare. L'esposizione del segnale di importazione nucleare è il risultato della defosforilazione di questa porzione della proteina. *Quindi cosa accade?* In un linfocita T, in una cellula T che non è attivata, NF-AT è localizzata a livello citosolico e presenta il suo dominio di importazione nel nucleo (o sequenza di importazione nel nucleo) mascherato da questa fosforilazione. In seguito ad attivazione dei linfociti T, la calcineurina viene attivata quindi si ha un aumento del calcio citosolico che determina un'attivazione della proteina calcineurina. La calcineurina quindi è una proteina [attivata] dal calcio. Il linfocita T riconosce un antigene e va incontro ad un'attivazione e questa attivazione implica un aumento dei livelli citosolici di calcio. Abbiamo già detto che nella cellula ci sia uno storaggio di calcio a livello del lume del reticolo endoplasmico oppure calcio presente in alta concentrazione a livello extracellulare, mentre presenta più bassi livelli a livello citosolico. I livelli di calcio citosolico aumentano in risposta a determinati segnali e il segnale può essere l'attivazione del linfocita in conseguenza all'interazione con qualcosa di estraneo, che il linfocita T riconosce come non-self. L'attivazione della calcineurina fa sì che questa proteina, che è una fosfatasi, defosforili NF-AT, quindi vada a rimuovere questi gruppi fosfato che mascheravano il segnale di localizzazione nucleare. Quindi abbiamo: calcineurina; fosfatasi che defosforila NF-AT con esposizione del segnale di importazione nel nucleo (vedi disegno 2). Al contempo la calcineurina, oltre a defosforilare questi residui, è in grado di interagire con la sequenza di esportazione dal nucleo, mascherandola (vedi disegno 2). Grazie a questo duplice effetto della calcineurina attivata dall'aumento del calcio, NF-AT può legare importina ed essere trasportato a livello nucleare. Qui esplica la sua funzione di attivazione dell'espressione genica di una serie di geni target, che medieranno l'effetto biologico di risposta del linfocita T allo stimolo. Disegno 3: Quando rientra il segnale che aveva attivato il linfocita T, calano i livelli citosolici di calcio e questo si traduce in un'inibizione della calcineurina che si dissocia da NF-AT quindi non maschera più il segnale di esportazione dal nucleo. Disegno 4: Al contempo altre protein chinasi potranno fosforilare i residui che erano stati defosforilati dalla calcineurina e fosforilando questi residui queste protein-chinasi andranno a determinare un mascheramento del segnale di localizzazione nucleare, di importazione nel nucleo presente nella proteina NF-AT. Il risultato sarà che in questa conformazione (che vediamo nel disegno 4) NF-AT passi dal nucleo al citosol grazie al suo segnale di esportazione esposto. Questo è un esempio di proteina che presenta sequenze segnale di importazione ed esportazione dal nucleo e la cui distribuzione citosolica nucleare è influenzata da altre proteine che possono determinare un mascheramento o un'esposizione di questi segnali. Slide 14: Un altro meccanismo di regolazione della localizzazione di proteine che agiscono a livello nucleare è quello rappresentato in questa slide. In questo caso abbiamo di nuovo a che fare con un fattore trascrizionale, **SREBP** che sta per "sterol response binding protein". Dove sterol response element sono sequenze di DNA, elementi di risposta agli steroli, che sono presenti nelle regioni promotrici di una serie di geni che come tali rispondono a sterol response element binding protein ovvero SREBP che è questo fattore trascrizionale. [Quindi SREBP lega uno sterol response element], cioè una sequenza specifica di legame di questo fattore trascrizionale, e lo sterol response element è presente nella regione promotrice di diversi geni e questi geni sono prevalentemente codificanti per enzimi coinvolti nella sintesi del colesterolo. SREBP quindi funge da fattore trascrizionale ovviamente solo quando è a livello nucleare ed è qui che è in grado di legare i suoi sterol response element **SRE:** cioè sequenze nucleotidiche specifiche nelle regioni promotrici di una serie di geni, tra cui prevalentemente geni codificanti per enzimi della sintesi del colesterolo ed ha senso che sia attivo quando una cellula ha bisogno di sintetizzare nuovo colesterolo. SREBP nella sua forma attiva a livello nucleare ha questa conformazione, che è il risultato di un clivaggio proteolitico che avviene al di fuori del nucleo, in particolare questo clivaggio proteolitico di SREBP è influenzato dai livelli di colesterolo. Pannello (A): In presenza di alto colesterolo infatti SREBP (rappresentata in verde nell'immagine A), che è una proteina integrale di membrana cioè con dei tratti transmembrana ed è grazie a questi tratti transmembrana che è ancorata al doppio strato fosfolipidico della membrana del reticolo endoplasmatico, è ancorato a questa membrana e interagisce con una proteina, **SCAP** (rappresentata in azzurro), che a sua volta lega il colesterolo (rappresentato dal pallino rosso). Quando il colesterolo citosolico è alto, quindi la cellula ha molto colesterolo a disposizione, il colesterolo lega SCAP, la proteina regolatoria dell'attività di SREBP. Quando c'è molto colesterolo all'interno della cellula, il colesterolo lega SCAP e SCAP interagisce con SREBP mantenendolo a livello della membrana del compartimento che che prende il nome di reticolo endoplasmatico. Pannello (B): Quando c'è poco colesterolo a livello citosolico, con scarse riserve nella cellula, ovviamente il colesterolo non è più legato a SCAP a causa dei suoi bassi livelli citosolici e questo fa sì che il complesso SCAP-SREBP non venga più trattenuto a livello del reticolo endoplasmatico, ma possa migrare mediante gemmazione di vescicole, che vanno dal reticolo endoplasmatico al Golgi, in maniera tale che il complesso vada all'apparato del Golgi. Quindi se c'è poco colesterolo il complesso SCAP-SREBP non è più trattenuto nel reticolo endoplasmatico ma può migrare attraverso il trasporto vescicolare all'apparato del Golgi. A livello dell'apparato del Golgi sono presenti delle *proteasi* che tagliano SREBP: ci sono due proteasi (che sono indicate in rosso) che sono in grado di determinare un clivaggio proteolitico di SREBP e questo clivaggio proteolitico permette il rilascio di una porzione citosolica di SREBP che è la porzione della proteina che funge, dopo essere trasportata a livello nucleare, da fattore trascrizionale attivando l'espressione di geni codificanti per enzimi della sintesi del colesterolo. In questo modo la cellula regola la localizzazione nucleare e conseguentemente l'attività di un fattore trascrizionale che controlla e promuove l'espressione di geni codificanti per enzimi della sintesi del colesterolo solo quando la disponibilità all'interno della cellula è scarsa. Quindi quando nella cellula c'è poco colesterolo la cellula grazie a questo meccanismo è in grado di, attraverso il trasporto nucleare di SREBP rilasciato dal suo ancoraggio alle membrane del reticolo endoplasmatico del golgi, essere trasportato a livello nucleare attraverso meccanismi che abbiamo visto prima dove induce l'espressione di geni importanti per la sintesi endogena di colesterolo. Quindi fino ad ora ci siamo focalizzati sul trasporto regolato di proteine dal citosol ad uno spazio topologicamente equivalente che è il nucleo. Slide 15: **[TRASLOCAZIONE DI PROTEINE DAL CITOSOL A DUE COMPARTIMENTI NON TOPOLIGICAMENTE EQUIVALENTI]** Adesso passiamo ad un altro meccanismo che è quello di traslocazione di proteine dal citosol a due compartimenti che topologicamente non sono equivalenti e in particolare ci focalizzeremo sul solo trasporto di proteine, traslocazione di proteine [dal citosol al mitocondrio]. Per quanto riguarda la traslocazione di proteine a livello di plastidi presentano meccanismi sovrapponibili a quelli che vedremo per il trasporto nei mitocondri e quindi nelle slide non troviamo le parti relative alla traslocazione di proteine a livello dei cloroplasti. Slide 16: **[La traslocazione nei mitocondri dipende da sequenze segnale e proteine traslocatrici]** In questa slide vediamo la morfologia del mitocondri e dei cloroplasti costituiti da una membrana esterna e da una membrana interna in entrambi gli organelli. Per i mitocondri il DNA mitocondriale non codifica per tutte le proteine mitocondriali presenti nel mitocondrio, ma alcuni geni codificanti per proteina a localizzazione mitocondriale sono codificati dal genoma nucleare: quindi dal genoma della cellula a localizzazione nucleare. Queste proteine codificate da questi geni verranno sintetizzate a livello citosolico. Dal citosol dovranno migrare, quindi essere trasportate, all'interno dei mitocondri. In questo caso per le proteine la traduzione avviene a livello citosolico e poi vengono trasportate nei mitocondri con un meccanismo post traduzionale quindi le proteine mitocondriali codificate dal genoma della cellula, dal genoma nucleare, vengono tradotte a livello citosolico e vanno a legarsi subito delle proteine **chaperon**. Le **chaperon** sono delle proteine che interagiscono con altre proteine e le assistono nel ripiegamento quindi sono proteine che assistono, sono proteine o complessi multimerici, complessi proteici che assistono il folding e quindi il ripiegamento di proteine. In questo caso le chaperon servono a impedire il ripiegamento delle proteine mitocondriali. Le proteine chaperon legano queste proteine mitocondriali sintetizzate a livello citosolico e mantenendole in conformazione svolta: impedendo il ripiegamento di queste proteine finché queste proteine non vengono trasferite dal citosol al mitocondrio e quindi solo nel mitocondrio andranno incontro al ripiegamento. Il segnale per l'importazione nel mitocondrio meglio caratterizzato è costituito da un'alfa elica anfipatica in cui questa conformazione anfipatica presenta da un lato dell'alfa elica di amminoacidi carichi positivamente e un lato di aminoacidi apolari. Slide 8: Guardiamo questa tabella: Importazione di mitocondri ---\> c'è un residuo carico positivamente ogni 2-3 aminoacidi e questi residui carichi positivamente vanno a costituire un lato dell'alfa elica anfipatica di cui parlavamo che rappresenta il segnale o la zona di importazione nel mitocondrio. [Quindi sul mitocondrio sono presenti dei recettori di importazione. ] Slide 17: **[LA TRASLOCAZIONE NEI MITOCONDRI DIPENDE DA SEQUENZE SEGNALE E PROTEINE TRASLOCATRICI]{.smallcaps}** Nell'importazione a livello mitocondriale sono coinvolte diverse proteine che prenderemo in esame nelle slide successive e in particolare abbiamo dei complessi proteici di traslocazione nella membrana mitocondriale esterna come **TOM** e **TIM** mitocondriale.  Delle proteine analoghe saranno presenti sulle membrane dei plastidi e medieranno l'importazione di proteine dal citosol al lume del plastide. Quindi **TOM complex** e **TIM,** sono **[TIM 23]** e **[TIM 22,]** e vedremo cosa fanno questi complessi. Nella membrana mitocondriale esterna avevamo già visto che, così come nella membrana esterna dei batteri oppure nella membrana esterna dei plastidi, sono presenti dei complessi proteici costituiti da barili beta che vanno ad assemblarsi in strutture che formano le porine. Le porine sono dei canali non selettivi che lasciano passare passivamente molecole idrosolubili dall'interno all'esterno del mitocondrio o della membrana esterna della cellula batterica... Le porine sono quindi dei [complessi non selettivi] nella membrana esterna di questi organelli e dei batteri e queste strutture a barile beta costituite da numerosi foglietti beta, (da 8 a 22 foglietti beta), possono essere presenti nelle proteine a barile beta, vengono assemblate con l'intervento grazie all'azione di questo SAM complex. **SAM complex** è un complesso e un macchinario di sorting e assemblaggio, di smistamento e assemblaggio che è importante per l'assemblaggio delle proteine con una conformazione a barile beta nella membrana esterna mitocondriale. Slide 18: **[I PRECURSORI DELLE PROTEINE MITOCONDRIALI SONO IMPORTANTI COME CATENE POLIPEPTIDICHE NON RIPIEGATE]{.smallcaps}** I precursori delle proteine mitocondriali vengono importati nel mitocondrio come catene polipeptidiche non ripiegate e sono non ripiegate grazie all'associazione con le proteine chaperon di cui abbiamo parlato prima. Le proteine chaperon che sono in parte identificate dall'acronimo **Hsp** come **Hsp70,** dove '70' sta ad indicare il peso molecolare del complesso proteico e 'Hsp\' proteina per shock da calore. Hsp sono proteine che fungono da chaperon, non sono tutte i chaperon presenti all'interno di una cellula ma sono buona parte di questi chaperon. *Perché prendono questo nome?* Perché proprio in conseguenza all'aumento della temperatura che le proteine nella cellula possono subire una parziale denaturazione, un'alterazione conformazionale per cui è importante che intervengano queste proteine e quelle analoghe che sono state identificate. Quindi le Hsp sono un tipo di chaperon. Quindi la proteina che deve essere importata dato che presenta un segnale di importazione mitocondriale, deve essere importata nel mitocondrio, grazie alla sua sequenza segnale di localizzazione mitocondriale arriva sulla superficie della membrana esterna mitocondriale e qui riconosce TOM ovvero il traslocatore della membrana esterna mitocondriale. Quindi lega TOM e grazie a questa interazione TOM ne permette una traslocazione e in questo caso parliamo di traslocazione perché una proteina passa dal citosol ad un compartimento non equivalente topologicamente attraversando una membrana. Quindi è un meccanismo di traslocazione all'interno del mitocondrio mediato da questo complesso rappresentato in giallo che è TOM. Quindi grazie alla sede di TOM nella membrana esterna e TIM 23 nella membrana interna, che è un altro traslocatore della membrana interna, la proteina che presenta un segnale di localizzazione mitocondriale di importazione del mitocondrio arriva nella matrice mitocondriale e una volta arrivato nella matrice mitocondriale il peptide segnale potrà essere tagliato, potrà essere eliminato e questo avviene non necessariamente sempre e in genere avviene quando il peptide segnale è localizzato ad un'estremità della sequenza polipeptidica, quindi o ammino o carbossi terminale mentre se è all'interno della proteina, è molto improbabile che venga eliminato. Quindi viene clivato il peptide segnale e nella matrice la proteina potrà andare incontro ad un ripiegamento per assumere la sua conformazione funzionalmente attiva. Slide 19: **[L'idrolisi di ATP e un potenziale di membrana sono usati per spingere L'importazione delle proteine nei mitocondri:]** *Come avviene questa traslocazione?* È un meccanismo di trasporto attivo che implica consumo di energia per la cellula e in primo luogo bisogna dire che le Hsp che tengono svolte a livello citosolico le proteine o assistono talvolta al ripiegamento delle proteine, lo fanno idrolizzando ATP e quindi implicano un consumo di energia. Queste Hsp70 fungono da chaperon e si associano alla proteina che deve essere importata a livello mitocondriale e questa proteina lega TOM: poi vengono traslocate attraverso la membrana mediante un meccanismo che implica consumo di ATP, quindi idrolisi di ATP, consumo di energia sottoforma di idrolisi di ATP. [Quindi il primo meccanismo, ovvero la traslocazione attraverso TOM, implica l'idrolisi di ATP. ] La traslocazione attraverso TIM 23, che è l'altro traslocatore presente nella membrana interna, invece sfrutta prevalentemente un gradiente protonico presente sulla membrana mitocondriale interna e generato dalla catena di trasporto degli elettroni. La dissipazione di questo gradiente protonico è comunque una forma di consumo di energia per la cellula. Quindi anche la traslocazione attraverso TIM 23 implica un consumo di energia per la cellula. Inoltre appena la proteina traslocata viene esposta nel lume del mitocondrio, quindi a livello della matrice mitocondriale, una Hsp che fa parte di un complesso più grande ad attività ATPasica lega la proteina e determina modificazioni conformazionali della stessa proteina attraverso consumo di ATP. Quindi vediamo che l'importazione di una proteina codificata a livello citosolico dal citosol alla matrice mitocondriale implica molti step che richiedono energia, quindi collettivamente implica un grande consumo di energia per la cellula. Il vantaggio per la cellula eucariotica di avere geni mitocondriali, geni codificanti per proteine mitocondriali codificati dal genoma nucleare, sta nel fatto che l'ambiente della matrice mitocondriale dove è localizzato il DNA mitocondriale è un ambiente fortemente ossidante e quindi, in quanto ambiente ossidante, è fortemente genotossico cioè in grado di indurre mutazioni nel DNA localizzato in questa sede. Quindi nell'evoluzione il trasferimento di geni codificanti per proteine mitocondriali dal DNA mitocondriale al DNA nucleare ha incitato un vantaggio selettivo perché la localizzazione nucleare implica una maggiore protezione delle sequenze geniche dall'attività mutagena di forme radicali dell'ossigeno di un ambiente ossidante presente nella matrice mitocondriale. Quindi abbiamo: 1. Consumo di energia per l'interazione con le Hsp 70 nel citosol; 2. Consumo di energia da parte di TOM che trascina la proteina nello spazio intermembrana attraverso idrolisi di ATP; 3. Consumo di energia per la traslocazione della proteina da parte di TIM 23 attraverso la membrana mitocondriale interna; 4. Consumo di energia da parte di Hsp 70 nella matrice che trascina la proteina nella matrice stessa del mitocondrio. Infine a livello mitocondriale ci saranno altre proteine chaperon che, sempre idrolizzando ATP, assistono al ripiegamento della proteina che è stata importata nella forma svolta, non ripiegata: quindi il ripiegamento avviene nella matrice ed è catalizzato da altre chaperon, altre Hsp, che svolgono la loro funzione mediante idrolisi di ATP. Slide 20: **[Integrazione di porine nelle membrana esterna mitocondriale (A) e batterica (B)]** A questo punto abbiamo importato a livello della matrice mitocondriale la proteina attraverso TOM e TIM 23 ma questo non è l'unico destino che possono avere le proteine che vanno a livello mitocondriale. Pannello (A): Un destino alternativo è rappresentato dalle proteine che vanno ad assumere una conformazione a barile beta nella membrana mitocondriale esterna come nel caso di questa proteina, di questa porina codificata da un gene nucleare, la proteina polipeptidica viene sintetizzata a livello citosolico e la traslocazione è mediata dal TOM complex. Quando la proteina arriva a livello dello spazio intermembrana non viene ulteriormente traslocata nella matrice da TIM 23 ma rimane a livello dello spazio intermembrana quindi interagisce di nuovo con altre proteine chaperon che la stabilizzano nella conformazione non ripiegata e ne assistono al ripiegamento che è mediato dal complex Sam. Quindi questo complesso SAM ne media il ripiegamento per dare queste strutture a barile beta che vanno a determinare la formazione di un poro non selettivo e permeabile a molecole idrosolubili. Questo in (A) che abbiamo illustrato è per l'[importazione nel mitocondrio]. Pannello (B): Questo si riferisce ad un meccanismo analogo presente nelle cellule batteriche quindi qui vediamo il citosol, lo spazio periplasmatico e la membrana esterna di cellule procariotiche ovvero di cellule batteriche. Slide 21: **[Importazione di proteine mitocondriali dal citosol nella matrice o nello spazio intermembrana]** Altri meccanismi di importazione di proteine citosoliche: Pannello (A): In questo caso (A) abbiamo una proteina integrale di membrana, con un tratto transmembrana, localizzata nella membrana mitocondriale interna e che si affaccia sullo spazio intermembrana. In questo caso l'importazione, la traslocazione della proteina è mediata da TOM e TIM 23 e dopo l'importazione che è parziale per quanto riguarda la traslocazione attraverso la membrana interna, durante la traslocazione ad un certo punto c'è un tratto indicato in azzurro della sequenza amminoacidica che va a costituire il tratto transmembrana della proteina. La traslocazione attraverso TIM 23 viene bloccata in corrispondenza dell'interazione di TIM 23 con il tratto transmembrana. Quindi TIM 23 permette una traslocazione parziale della proteina, quando interagisce con la sequenza che va a costituire il tratto transmembrana, ne permette l'avvolgimento in una struttura secondaria e poi viene rilasciata nella membrana mitocondriale interna. Il risultato sarà una [proteina integrale] nella membrana interna che si affaccia, per buona parte in questo caso, sullo spazio intermembrana ma potrà essere una qualsiasi proteina integrale di membrana della membrana mitocondriale interna. In questo caso vediamo che la sequenza segnale di importazione mitocondriale è ammino terminale e viene tagliata dopo la traslocazione nella membrana mitocondriale interna della proteina sintetizzata a livello citosolico. Pannello (B): Questo in (B) riguarda poche proteine importate dal citosol al mitocondrio e diverse proteine sintetizzate a partire dal DNA mitocondriale quindi questa via riguarda poche proteine importate dal citosol mitocondrio e la maggior parte delle proteine che sono sintetizzate dal DNA mitocondriale. *Che destino condividono queste proteine?* Vengono fatte convergere sul complesso che si chiama OXA complex e in pratica quello che fa questo complesso è permettere l'incorporazione di queste proteine che hanno questo destino nella membrana mitocondriale interna. Nel caso della proteina citosolica avremo di nuovo un segnale di importazione mitocondriale rappresentato in rosso che dopo l'importazione viene tagliato. Queste proteine che derivano dal citosol però hanno un ulteriore segnale che è indicato in azzurro che le targhetta al complesso OXA e, una volta targhettate al complesso OXA, le proteine che vengono dal citosol oppure le proteine mitocondriali assumono la loro conformazione funzionalmente attiva grazie all'azione di questo complesso. Sia nel caso in (A) che in (B) abbiamo a che fare con delle proteine integrali di membrana quindi che prevedono un tratto transmembrana che le ancora saldamente alla membrana mitocondriale interna. Pannello (C): Quello che può accadere è che da una proteasi specifica venga tagliato il tratto transmembrana per dare proteine solubili nello spazio intermembrana come vediamo nel pannello (C). Pannello (E): In questo pannello (E) vediamo il destino di una proteina che legando sempre delle Hsp, delle proteine chaperon, viene importata dal citosol attraverso TOM e viene poi ripiegata per dare una struttura con diversi tratti transmembrana. Viene ripiegata mediante interazione e traslocazione mediata da TIM 22 che è l'altro complex TIM. Abbiamo parlato prima di TIM 23 mentre in questo caso subentra un altro componente TIM che è TIM 22. TIM 22 media l'importazione e il ripiegamento di proteine nel mitocondrio, in particolare il ripiegamento di proteine integrali di membrana che presentino diversi tratti transmembrana e siano ancorati alla membrana mitocondriale interna. Un esempio di queste proteine è quello costituito dalle proteine coinvolte nella fosforilazione ossidativa o nell'importazione di ATP, ADP e fosfato inorganico nel mitocondrio. Pannello (D): Altro aspetto importante che non abbiamo considerato per queste proteine che svolgono la loro funzione a livello mitocondriale è la [formazione dei ponti disolfuro]. L'ambiente citosolico è troppo riducente per permettere la formazione di ponti disolfuro che sono molto importanti per determinare la struttura terziaria ed eventualmente quaternaria di una proteina o di un complesso proteico. Quindi nel citosol non si formano ponti disolfuro tra residui di cisteina ma questi si formano per le altre proteine cellulari nel lume del reticolo endoplasmatico, per le proteine che vanno nel mitocondrio: questi ponti disolfuro si formano grazie all'azione di una proteina ad attività ossidanti che è **Mia40** che si trova nello spazio intermembrana ed è in grado di riconoscere gruppi sulfidrilici nei residui di cisteina, nelle catene laterali dei residui di cisteina, e catalizzare la formazione di ponti disolfuro. Questo è possibile perché l'ambiente mitocondriale è più ossidante di quanto non sia quello citosolico quindi in questo contesto si possono formare i ponti disolfuro che sono importanti per una questione di proteine mitocondriali. Slide 22: **I PEROSSISOMI** Per la funzione dei perossisomi in particolare nelle cellule animali la sintesi di plasmalogeni, è fondamentale che vengano importate delle proteine che hanno un segnale di localizzazione per i perossisomi e le proteine deputate allo svolgimento di questa funzione di importazione di proteine codificate dal genoma nucleare e sintetizzate a livello citosolico che devono essere importate nei perossisomi sono ad esempio **Pex 5** e **Pex 7** che prendono il nome insieme di **[perossine]**. Sono proteine deputate all'importazione di proteine che abbiano sequenze segnale specifiche per la traslocazione nei perossisomi e parliamo di nuovo di traslocazione perché passiamo dal citosol ad uno spazio non topologicamente equivalente che è il lume dei perossisomi. Queste proteine deputate all'importazione di proteine nei perossisomi sono così importanti tanto che mutazioni a carico di questi due geni Pex 5 e 7 causano una malattia autosomica recessiva che determina proprio una grave anomalia nel processo di mielinizzazione quindi grande deficit neurologico e causa delle malattie, che rientrano sotto la categoria di sindrome di Zellweger, caratterizzate proprio dalla morte precoce dopo la nascita a causa di deficit funzionale a livello cerebrale ma non solo.