LEZIONE 3 PARTE 1 (04-03-2022).docx

**BIOLOGIA CELLULARE** **[04/03/2022]** *Riprendendo concetto della lezione precedente: cellule congelate in azoto liquido ed in vapori di azoto. In termini di sicurezza per l'operatore è più sicuro un contenitore con vapori di azoto. Perché al contrario in caso di azoto liquido, quando si vanno a...

**BIOLOGIA CELLULARE** **[04/03/2022]** *Riprendendo concetto della lezione precedente: cellule congelate in azoto liquido ed in vapori di azoto. In termini di sicurezza per l'operatore è più sicuro un contenitore con vapori di azoto. Perché al contrario in caso di azoto liquido, quando si vanno ad estrarre i rack, parte dell'azoto liquido si riversa vicino all'operatore e quindi comporta un maggiore rischio di ustioni o danni al materiale circostanze.\ Altra differenza è che: mentre in azoto liquido si ha una temperatura di -196°C, nei vapori di azoto abbiamo la stessa sostanza in un'altra fase quindi la temperatura a cui vengono mantenute le cellule in vapori di azoto varia tra valori di -190°C e -130°C.\ Inoltre si può formare all'interno del recipiente di stoccaggio dell'azoto un gradiente, tra la parte più in basso vicina all'azoto liquido e la parte più alta, più vicina all'uscita del recipiente: questo significa che per storaggio a lungo termine (di decine di anni), l'azoto liquido garantisce un mantenimento della temperatura più uniforme.\ Nei vapori di azoto, la temperatura non è necessariamente la stessa, anzi forse è superiore.* *A prescindere, al di sotto dei -130°C l'attività metabolica delle cellule è completamente bloccata.* *Detto ciò, si ricorda che i due sistemi sono ancora entrambi in uso.* **TECNICHE PER IL MANTENIMENTO DELLA STERILITÀ** Queste sono una serie di tecniche che si mettono in atto quando si lavora con culture cellulari, volte a preservare la sterilità della nostra coltura cellulare, perchè uno dei principali problemi in coltura cellulare è rappresentato (come visto in lezione precedente) dal rischio di contaminazione di diversa natura, da parte di microrganismi che vivono molto bene nelle condizioni utilizzate nelle colture (terreni ricchi di nutrienti, temperatura a 37°C). Una contaminazione può rendere necessaria l'eliminazione delle nostre colture: tutto ciò che si aveva in coltura per gli esperimenti deve essere eliminato e non è detto che sia poi di nuovo riproducibile: quando si ha una coltura generata da una biopsia di un paziente, se questa si contamina la si deve buttare e molto probabilmente non si potrà avere la stessa coltura dallo stesso paziente. **TIPI DI CONTAMINAZIONE** Uno dei maggiori problemi nel mantenimento di una coltura cellulare è la contaminazione da microorganismi, quali: 1. 2. 🡨Funghi 3. **SORGENTI DI CONTAMINAZIONE** - - - - - - - - - - - - - - **DIAGNOSI DI INFEZIONE DA BATTERI** Esistono diverse tipologie di contaminazione, trattiamo innanzitutto le *infezioni batteriche.* Contaminazioni batteriche che possono apparire al microscopio, quando conclamate, come nell'immagine vista in precedenza. I batteri appaiono molto più piccoli delle nostre cellule --dimensioni di pochi micron---, non sono rifrangenti e quindi appaiono molto scuri, possono essere o meno dotati di motilità, organizzati in catenelle o grappoli, possono avere forma tondeggiante o allungata. È importante ricordare che quello che permette di distinguere una contaminazione batterica (o in generale una contaminazione) da una sofferenza cellulare che provoca l'accumulo di detriti cellulari è il fatto che i contaminanti se presenti sono più omogenei e uniformi tra loro rispetto ai detriti cellulari. L'osservazione al microscopio è una delle principali tecniche che permette di diagnosticare una contaminazione batterica (punto 3 dell'elenco sotto). *Infezioni batteriche:* 1. Improvvisa diminuzione del ph del terreno 2. Torbidi del terreno 3. Presenta di granularità intercellulari eventualmente mobili al microscopio invertito 4. Identificazione della morfologia del batterio mediante preparazione di un vetrino ed osservazione al microscopio. È possibile appunto fare dei preparati dedicati da colorare per capire bene qual forma di contaminazione batterica abbiamo. 5. Isolamento ed identificazione mediante piastratura di un'aliquota della coltura in un terreno solido dedicato per batteri. Oltre all'aspetto microscopico rappresentato dalla granularità, ci sono dettagli percepibili anche macroscopicamente che si possono osservare nel recipiente di coltura. Quindi guardando macroscopicamente un recipiente di coltura estratto dall'incubatore, ci si può accorgere di qualche segnale di potenziale contaminazione batterica: - - **DIAGNOSI DI INFEZIONE DA FUNGHI E LIEVITI** Contaminazioni da funghi e lieviti determinano: a. Riferendosi alle immagini viste in precedenza di funghi e lieviti: b. c. **DIAGNOSI DI INFEZIONE DA VIRUS** I virus sono molto piccoli (nell'ordine di nanometri, sotto al micron in quasi la totalità di casi), quindi non sono rilevabili al microscopio ottico ossia quello a disposizione in laboratori di colture cellulari. Si devono quindi utilizzare delle tecniche di diagnosi delle infezioni da virus diverse, ed in particolare si deve essere in grado di riconoscere due effetti che possono verificarsi in caso di infezione da virus, ossia [effetto citopatico] ed [emoadsorbimento]. 1. 2. Quindi non si vedono le particelle virali, ma si devono utilizzare dei sistemi indiretti come i due appena visti per diagnosticare l'infezione virale. **DIAGNOSI DI INFEZIONE DA MICOPLASMA** I micoplasmi sono cellule batteriche molto piccole, come i virus non sono rilevabili al microscopio ottico. Sono cellule batteriche procariotiche particolari, hanno dimensioni tra 125 e 250 nm (dimensioni simili a virus).\ Sono inoltre particolari perché non possiedono una parete batterica come quella che si ha negli altri batteri. Non possedendo parete batterica di peptidoglicani questi contaminanti non saranno sensibili ad antibiotici che vanno ad interferire con la sintesi della parete batterica. Per le contaminazioni da micoplasma si devono quindi utilizzare antibiotici particolari che agiscono medianti altri meccanismi comuni ad altri batteri e micoplasma. Si può diagnosticare una contaminazione da micoplasma attraverso una serie di alterazioni indirette della coltura, come: a. b. c. Quindi una serie di sintomi indiretti del fatto che qualcosa è cambiato in coltura. Se si ha il sospetto della coltura non si può escludere che ci sia un'infezione da micoplasma a definire quest'alterazione del comportamento delle nostre cellule. Per l'identificazione della contaminazione da micoplasma esistono diverse tecniche: - - - - Immagine seguente: esempio di un kit commerciale utilizzato per la diagnosi di contaminazione da micoplasma.\ Si ha una coltura di cui si sospetta contaminazione da micoplasma, si recupera una piccola aliquota di terreno di coltura che si sottopone ad un ciclo di ebollizione (che serve a lisare le cellule di micoplasma) in modo che venga rilasciato nel terreno il DNA del micoplasma. Il DNA del micoplasma viene poi utilizzato come templato per la PCR utilizzando primers specifici. Alla fine dell'amplificazione di PCR si corre su gel di elettroforesi.  - - - - - - - Tabella che sintetizza alcune delle tecniche viste. (non ci si è soffermata) **ELIMINAZIONE DELLE CONTAMINAZIONI MICROBICHE** Quando è possibile la soluzione migliore è sempre eliminare la coltura. Se si ha una coltura contaminata da batteri in modo eclatante, ovviamente la situazione non è reversibile. Se invece c'è una lieve contaminazione da batteri è possibile trattare la coltura con antibiotici e trattamenti specifici esistono non solo per batteri, ma anche per muffe e lieviti (esistono antibiotici anche per micoplasmi). Ma la regola generale rimane eliminare la coltura infetta e i reagenti usati, disinfettare cappa incubatore e superficie di lavoro. Tabella: per cercare di revertire delle contaminazioni quando ancora non sono eclatanti: Ovviamente per la scelta dell'antibiotico è utile avvalersi di tecniche colturali per identificare il tipo di batterio responsabile della contaminazione, per poter scegliere tramite antibiogramma l'antibiotico più efficace per risolvere la contaminazione della coltura.  [Regole generali per evitare e controllare le contaminazioni da microrganismi:] 1. 2. 3. 4. 5. **NORME DI SICUREZZA NEL LABORATORIO DI COLTURE CELLULARI** **2° parte lezione 4/03/2022** **[NORME PER IL MANTENIMENTO DELLA STERILITÀ]** In queste slide sono riassunte la serie di norme per il mantenimento della sterilità appena dette. Immagine che contiene testo Descrizione generata automaticamente  In particolare: 5. 6. a. b. c. d. e. Guardare i video dei link per un esempio concreto di ciò che ha spiegato in questa lezione. **[NORME GENERALI DI SICUREZZA]** Il laboratorio di colture cellulari espone l'operatore agli stessi rischi di un altro laboratorio di chimica o di biologia molecolare e in aggiunta espone l'operatore a un rischio biologico. Questo perché quando lavoriamo con colture cellulari che sono di derivazione animale o biopsie di derivazione da paziente o da animali abbiamo un rischio biologico determinato dalla potenziale contaminazione di questi campioni (colture cellulari, biopsie, espianti) da parte di virus, batteri e altri patogeni che mettono a rischio e possono essere pericoli per l'operatore (da cui il concetto di rischio biologico). Oltre alle colture e ai campioni con i quali allestiamo le nostre colture, un'altra importante fonte di rischio biologico è rappresentata da alcuni emoderivati che si usano per le colture cellulari, come ad esempio il siero di solito di origine bovina (in generale di origine umana o animale). 1. a. b. c. d. 2. 3. a. b. 4. 5.  Questi sono i simboli di pericolo chimico che si possono incontrare in un qualsiasi laboratorio, anche di biologia cellulare. Fate sempre attenzione a questi pittogrammi che possono essere presenti sui reagenti che utilizzate. Oltre a questi pittogrammi nei reagenti che utilizzate in qualsiasi laboratorio saranno presenti delle frasi di rischio Hazard statements (indicati con la H seguiti da un numero) che ci dicono a quale o a quali rischi è esposto l'operatore. Secondo un sistema globale armonizzato, ora le sostanze chimiche vengono etichettati con una serie di: *codici H* (*Hazard statements o Hazard codes*), che ci dicono il rischio a cui l'operatore è esposto; e *codici P* (*Precautionary statements o Precautionary codes*), cioè le frasi di precauzioni che ci dicono quali accortezze adottare nel manipolare una determinata sostanza in funzione del rischio a cui quella sostanza ci espone. Tra le varie frasi H una molto importante è H350, che etichetta le sostanze cancerogene (esistono altri codici varianti di sostanze cancerogene). Bisogna verificare sempre prima di manipolare una sostanza se si è nelle condizioni di manipolarla in laboratorio. 6. 7. - - - **[CAPPE BIOHAZARD]** Prima di parlare delle cappe Biohazard, che sono delle particolari cappe a flusso laminare volte a proteggere l\'operatore da un rischio biologico, vi mostro una tipologia di cappa a flusso laminare che non protegge l\'operatore del rischio biologico e che si potrebbe trovare nei laboratori. Attenzione quindi a distinguere cappe a flusso laminare e cappe biohazard perché solo le seconde proteggono l'operatore dal rischio biologico. Queste sono cappe a flusso laminare che proteggono il solo prodotto che manipoliamo, ma non l\'operatore e l\'ambiente. Sono cappe quindi che generano un flusso laminare uniforme che ci permette di manipolare il prodotto (la nostra cultura, la nostra biopsia) e proteggere il prodotto, ma non l\'operatore. Possono avere un flusso laminare verticale (come nell'immagine) oppure orizzontale: le cappe con flusso orizzontale sono veramente una variante obsoleta difficile da trovare nei laboratori, mentre sono molto più diffuse le cappe a flusso laminare verticale. Sono sempre a flusso laminare verticale le cappe Biohazard. La cappa Biohazard quindi protegge l\'operatore e l\'ambiente da rischio biologico. Quindi agenti patogeni che implicano un rischio biologico possono essere manipolati in una cappa Biohazard (Biological Safety Cabinets = BSCs) e non in una cappa a flusso laminare. [Cos'è che ci permette di contenere il rischio biologico in una cappa Biohazard?] - - - ***[Classificazione cappe Biohazard]*** In base alla tipologia di cappa Biohazard avremo una diversa percentuale di aria ricircolata all'interno della cappa per mantenere il flusso laminare e una diversa percentuale di aria espulsa all'esterno. All\'aumentare della percentuale di aria che viene espulsa verso l\'esterno aumenta la protezione per l'operatore e l'ambiente. Meno aria viene quindi ricircolata e più è alto il livello di sicurezza della cappa. Normalmente il 20% dell'aria viene espulsa, mentre l'80% viene utilizzata per il ricircolo tramite filtraggio HEPA. Il tipo quindi di cappa e il livello di sicurezza che ci garantisce la cappa Biohazard che utilizziamo impatta su ciò che possiamo manipolare in una cappa. - - 1. 2. 3. 4. - Questa è una tabella riassuntiva per cercare di sintetizzare i concetti e le differenze tra cappe Biohazard di classe 1,2,3 con la classe 2 che prevede diversi sottotipi diversificati in funzione della velocità del flusso dell'aria, del flusso laminare e della percentuale di aria ricircolata. Immagine che contiene testo Descrizione generata automaticamente ***[Classificazione dei gruppi di rischio dei microrganismi infettivi]*** La scelta della cappa Biohazard dipende dal rischio biologico al quale viene posto l'operatore. Il rischio biologico prevede una classificazione in 4 Biosafety Levels dei patogeni. La classificazione viene fatta in funzione del rischio al quale un determinato agente biologico espone l'operatore e la comunità. [Quindi, a quale rischio va incontro l'operatore? Di prendere una malattia mortale? Questa malattia mortale è facilmente trasmissibile alla comunità?] Se lo è abbiamo un **Biosafety Level di livello 4**, alto rischio per l'individuo e per la comunità; in alternativa, se l'agente biologico che manipoliamo implica un alto rischio per l'operatore ma non per la comunità (come, ad esempio, HIV) è un **Biosafety Level di livello 3**. Stessa cosa per le altre categorie: quindi, gli agenti biologici praticamente innocui per l'individuo e per la comunità rientrano nei **Biosafety Level di categoria 1**; mentre, è presente un **Biosafety Level di categoria 2**, di rischio intermedio per l'operatore ma basso per la comunità.  Alcuni esempi di questi agenti biologici, non necessariamente patogeni: - - - - Immagine che contiene testo Descrizione generata automaticamente  Queste sono altre 2 tabelle che riportano le stesse classi di rischio dei microrganismi infettivi.