KLINISCHE CHEMIE 1 PDF

Klinische chemie I Academiejaar 2024-2025 Duran, K. Klinische chemie I © 2023, Duran, K. Odisee Alle rechten voorbehouden. Niets uit deze digitale uitgave mag worden verveelvoudigd, opgeslagen in een geautomatiseerd gegevensbestand, en/of openbaar gemaakt in enige vorm of op enige...

Klinische chemie I Academiejaar 2024-2025 Duran, K. Klinische chemie I © 2023, Duran, K. Odisee Alle rechten voorbehouden. Niets uit deze digitale uitgave mag worden verveelvoudigd, opgeslagen in een geautomatiseerd gegevensbestand, en/of openbaar gemaakt in enige vorm of op enige wijze, hetzij elektronisch, mechanisch, door printouts, kopieën, of op welke andere manier dan ook, zonder voorafgaande schriftelijke toestemming van de auteur en/of uitgever. Op deze regel bestaat slechts één uitzondering: elke student die ingeschreven is voor het vak waarin deze tekst wordt gebruikt, mag voor persoonlijk gebruik twee exemplaren laten uitprinten of zelf uitprinten. www.odisee.be  1 Inhoud HOOFDSTUK 1: KLINISCH LABORATORIUM INLEIDING 1 Doel van het nemen van een biologisch staal.......................................................................1 2 Verloop van het analyseproces.............................................................................................1 2.1 PRE-ANALYTISCHE FASE................................................................................. 1 2.1.1 Toestand van de patiënt i.f.v. de staalname en analyse............................................1 2.1.2 Soort monsterafname i.f.v. de analyse.....................................................................2 2.1.3 Afname en transport van het staal............................................................................2 2.1.4 Aankomst van de stalen in het labo..........................................................................3 2.2 ANALYTISCHE FASE.......................................................................................... 3 2.3 POST-ANALYTISCHE FASE.............................................................................. 3 3 Veiligheid bij de manipulatie van een staal..........................................................................3 HOOFDSTUK 2: EXCRETERENDE FUNCTIE VAN DE NIER 1 Inleiding................................................................................................................................5 2 Bouw en werking van de nier om urine te vormen..............................................................6 2.1 ULTRAFILTRATIE............................................................................................... 8 2.2 REABSORPTIE..................................................................................................... 9 2.3 SECRETIE.............................................................................................................. 9 2.4 EXCRETIE............................................................................................................. 9 2.5 BESLUIT.............................................................................................................. 10 3 Samenstelling van de urine.................................................................................................10 3.1 ANORGANISCHE BESTANDDELEN: DE ELEKTROLYTEN...................... 10 3.2 ORGANISCHE BESTANDDELEN.................................................................... 10 3.3 ABNORMALE BESTANDDELEN.................................................................... 10 4 Biologische evaluatie van de nierfunctie............................................................................11 5 onderzoek van DE urine.....................................................................................................12  II 5.1 IDENTIFICATIE VAN URINE........................................................................... 12 5.2 HOEVEELHEID URINE..................................................................................... 12 5.3 HELDERHEID VAN DE URINE........................................................................ 13 5.4 KLEUR VAN DE URINE.................................................................................... 13 5.4.1 Normale kleur.........................................................................................................13 5.4.2 Abnormale kleur: donkergeel, rood, bruin tot zwart (zie labo)..............................14 5.5 GEUR................................................................................................................... 15 5.6 CHEMISCH URINE ONDERZOEK................................................................... 15 5.6.1 Staalname en bewaring...........................................................................................15 5.6.2 Chemische screening met teststroken of (dip)sticks...............................................16 5.7 MICROSCOPISCH EN FLOWCYTOMETRISCH URINESEDIMENT........... 23 5.8 MICROBIOLOGISCH ONDERZOEK................................................................ 25 5.9 BEPALING OSMOLALITEIT OF OSMOLARITEIT........................................ 26 6 Renale Klaringstesten en plasmaflow.................................................................................29 6.1 RENALE KLARINGSTESTEN.......................................................................... 29 6.1.1 Berekening GFR.....................................................................................................30 6.1.2 Tubulaire reabsorptiecapaciteit...............................................................................35 6.1.3 Berekening tubulaire secretie................................................................................37 6.1.4 Besluit.....................................................................................................................37 6.2 RENALE PLASMA FLOW (RPF)...................................................................... 38 7 Bepaling van stikstofhoudende metabolieten....................................................................39 7.1 BEPALING VAN UREUM................................................................................. 40 7.1.1 Inleiding..................................................................................................................40 7.1.2 Klinisch belang.......................................................................................................40 7.1.3 Staalname................................................................................................................41 7.1.4 Principe...................................................................................................................42 7.1.5 Referentiewaarden..................................................................................................53 7.2 BEPALING VAN CREATININE........................................................................ 56  III 7.2.1 Inleiding..................................................................................................................56 7.2.2 Klinisch belang.......................................................................................................57 7.2.3 Staalname en bewaring...........................................................................................60 7.2.4 Principe...................................................................................................................60 7.2.5 Referentiewaarden..................................................................................................61 7.3 BEPALING VAN URINEZUUR......................................................................... 62 7.3.1 Inleiding..................................................................................................................62 7.3.2 Klinisch belang.......................................................................................................64 7.3.3 Staalname................................................................................................................64 7.3.4 Principe...................................................................................................................65 7.3.5 Referentiewaarden..................................................................................................65 7.3.6 Urinezuurkristallen.................................................................................................65 7.4 ADDENDUM: BEPALING VAN CREATINE................................................... 66 7.4.1 Inleiding..................................................................................................................66 7.4.2 Klinisch belang.......................................................................................................66 7.4.3 Principe...................................................................................................................66 8 Proteinurie...........................................................................................................................66 HOOFDSTUK 3: PROTEÏNURIE EN BEPALING PROTEÏNEN 1 Inleiding..............................................................................................................................68 2 Klinische betekenis.............................................................................................................69 2.1 PROTEÏNURIE IN FUNCTIE VAN HET NIVEAU.......................................... 69 2.1.1 Glomerulaire proteïnurie........................................................................................69 2.1.2 Tubulaire proteïnurie..............................................................................................70 2.1.3 Overflowproteïnurie (pre-renaal)............................................................................71 2.1.4 (Post)-renaal............................................................................................................71 2.2 PROTEÏNURIE IN FUNCTIE VAN DE GRAAD.............................................. 72 2.2.1 Persisterende proteïnurie (blijvende)......................................................................72  IV 2.2.2 Intermitterende proteïnurie (met tussenpauzen).....................................................72 3 Bepalingen voor proteïnen in de urine................................................................................73 3.1 KWALITATIEVE BEPALINGEN VOOR PROTEÏNURIE.............................. 73 3.1.1 Klinische relevantie................................................................................................73 3.1.2 Staalname................................................................................................................74 3.1.3 Principe van de teststrook voor detectie van proteïnurie........................................74 3.1.4 Verder opvolging bij proteïnurie............................................................................75 3.2 KWANTITATIEVE TOTAAL BEPALING PROTEÏNEN URINE EN SERUM76 3.2.1 Klinische relevantie................................................................................................76 3.2.2 Staalname................................................................................................................76 3.2.3 Principe van de totaal bepalingen van proteïnen....................................................77 3.3 ELEKTROFORESE VAN PROTEÏNEN IN URINE OF SERUM..................... 81 3.3.1 Inleiding..................................................................................................................81 3.3.2 Klinische betekenis van elektroforese van urinaire eiwitten..................................81 3.3.3 Klinische betekenis van elektroforese van serumproteïnen....................................82 3.3.4 Staalname................................................................................................................82 3.3.5 Principe elektroforese.............................................................................................82 3.4 BEPALING VAN SPECIFIEKE PROTEÏNEN IN SERUM EN URINE.......... 84 3.4.1 Kwantitatieve bepaling van albuminurie................................................................84 3.4.2 Kwantitatieve bepaling van albuminemie..............................................................84 3.4.3 Kwantitatieve bepaling van microalbuminurie.......................................................84 3.4.4 Bepaling voor onderscheid tussen glomerulaire en tubulaire proteïnurie..............85 3.4.5 Bepaling van β2-microglobulinen in serum en urine.............................................86 3.4.6 Klaringstesten om de graad van glomerulaire selectiviteit te meten......................87 3.4.7 Paraproteïnen in het serum en vrije lichte ketens in de urine.................................87 3.4.8 Kwantitatieve dosering van urinaire mucoproteïnen..............................................91 3.4.9 Kwantitatieve dosering serumeiwitten zonder verband met proteïnurie................91 3.4.10 Specifieke dosering van ieder eiwit via chromatografie.....................................91  V HOOFDSTUK 4: AMINOACIDOPATHIE 1 Inleiding..............................................................................................................................93 1.1 HET OVERFLOW TYPE.................................................................................... 94 1.2 HET RENAAL TYPE.......................................................................................... 94 2 Klinische relevantie............................................................................................................95 3 Staalname voor aminoacidopathieën..................................................................................96 4 Bepalingsmethoden voor aminoacidopathieën...................................................................97 4.1 KWALITATIEF................................................................................................... 97 4.1.1 Dunne laag chromatografie.....................................................................................97 4.1.2 Kleurreactie van een bepaald aminozuur................................................................98 4.2 KWANTITATIEF................................................................................................ 98 4.2.1 Chromatografische scheiding gevolgd door ninhydrine reactie.............................98 4.2.2 Liquid chromatografie en tandem massa spectrometrie (LC-MS-MS)..................98 5 Enkele voorbeelden van aminoacidopathieEN...................................................................99 5.1 CYSTINURIA...................................................................................................... 99 5.1.1 Inleiding..................................................................................................................99 5.1.2 Klinisch belang.......................................................................................................99 5.1.3 Bepalingsmethoden.................................................................................................99 5.2 FENYLKETONURIE (PKU)............................................................................. 101 5.2.1 Inleiding................................................................................................................101 5.2.2 Klinisch belang.....................................................................................................102 5.2.3 Bepalingsmethoden...............................................................................................102 5.3 HYPERHOMOCYSTEINEMIE........................................................................ 103 5.3.1 Inleiding................................................................................................................103 5.3.2 Klinisch belang.....................................................................................................104 5.3.3 Staalname en bepalingsmethoden.........................................................................104 5.3.4 Aangepast dieet.....................................................................................................104 5.4 HYDROXYPROLINE IN URINE..................................................................... 105 5.4.1 Inleiding................................................................................................................105  VI 5.4.2 Klinische relevantie..............................................................................................105 5.4.3 Staalname..............................................................................................................105 5.5 ANDERE AMINOZUREN................................................................................ 105 HOOFDSTUK 5: ZUUR-BASE EVENWICHT 1 Inleiding............................................................................................................................108 2 buffers in bloed en andere lichaamsvochten.....................................................................108 3 Respiratoire correctie voor behoud zuur-base evenwicht................................................109 4 rol van nier in behoud van zuur-base evenwicht..............................................................110 5 Besluit...............................................................................................................................113 6 Pathologieën ivm zuur base evenwicht.............................................................................114 6.1 INLEIDING........................................................................................................ 114 6.2 RESPIRATOIRE ACIDOSE.............................................................................. 115 6.2.1 Oorzaken...............................................................................................................115 6.2.2 Compensatiemechanismen...................................................................................115 6.3 RESPIRATOIRE ALKALOSE.......................................................................... 117 6.3.1 Oorzaken...............................................................................................................117 6.3.2 Compensatiemechanismen...................................................................................117 6.4 METABOLE ACIDOSE.................................................................................... 119 6.4.1 Oorzaken...............................................................................................................119 6.4.2 Compensatiemechanismen...................................................................................119 6.4.3 Anion gap..............................................................................................................121 6.5 METABOLE ALKALOSE................................................................................ 122 6.5.1 Oorzaken...............................................................................................................122 6.5.2 Compensatiemechanismen...................................................................................122 6.6 ALGEMEEN BESLUIT..................................................................................... 124 7 Bepaling partiële dampspanning bloedgassen p O2 en p CO2................125 7.1 PCO2................................................................................................................... 125 7.1.1 Inleiding................................................................................................................125  VII 7.1.2 Klinische betekenis...............................................................................................125 7.1.3 Staal......................................................................................................................126 7.1.4 Bepalingsmethoden...............................................................................................126 7.2 PO2...................................................................................................................... 127 7.2.1 Inleiding................................................................................................................127 7.2.2 Klinische betekenis...............................................................................................128 7.2.3 Staal......................................................................................................................129 7.2.4 Bepaling................................................................................................................129  1 HOOFDSTUK 1: KLINISCH LABORATORIUM: INLEIDING 1 DOEL VAN HET NEMEN VAN EEN BIOLOGISCH STAAL Een biologisch staal wordt van de mens afgenomen voor het meten van bepaalde parameters of analyts, vb. glucose, eiwitten: - als hulpmiddel om een diagnose te ondersteunen, vb. bij vermoeden van een ziekte, - als hulpmiddel om een behandeling op te volgen, vb. bij chemotherapie, - als test om eventuele aanwezigheid van ziekten te screenen, ook bij schijnbaar gezonde mensen, vb. voor opsporen van HIV, - als middel om de plasmaspiegels van geneesmiddelen op te volgen, vb. van digoxine. 2 VERLOOP VAN HET ANALYSEPROCES 2.1 PRE-ANALYTISCHE FASE Alle handelingen met betrekking tot het staal vόόr de eigenlijke analyse; de toestand van de patiënt, de monstername, het transport en bewaring. 2.1.1 Toestand van de patiënt i.f.v. de staalname en analyse In de meeste gevallen zijn er geen speciale voorzorgen vereist maar: - soms moet de patiënt nuchter zijn bij staalname (12 uur niet gegeten), - meestal zit de patiënt in een zetel, soms wordt de patiënt verplicht om te liggen, - soms moet de patiënt zich voorbereiden op de staalname vb. een dieet volgen, bepaalde handelingen controleren zoals vb. niet intensief sporten.  2 2.1.2 Soort monsterafname i.f.v. de analyse Bloed: - meestal veneus bloed: geprikt t.h.v. de vene in de vouw van de elleboog. Deze is breed en ligt dichtbij de oppervlakte en is interessant om veneus bloed te nemen. Men kan: - bloed opvangen in buis zonder anticoagulans en centrifugeren: zo ontstaat serum - bloed opvangen in buis met anticoagulans en centrifugeren: zo ontstaat plasma - bloed opvangen in buis met anticoagulans en niet centrifugeren: zo ontstaat volbloed - soms capillair bloed: door een prik in de vingertop met anticoagulans opgevangen in een capillairtje of buisje - uitzonderlijk arterieel bloed: door een arterie aan te prikken, opgevangen in een spuit met anticoagulans; door arts uitgevoerd - bij baby’s hielprik: bloed opgevangen op een speciaal papiertje of buisje met anticoagulans. Urine: 24 uur urine of ochtendurine of willekeurige fractie (zoals bij schoolonderzoek) Andere biologische vochten zoals lumbaal vocht, pleuravocht, synovia vocht, maagsap, ascites vocht… Faeces: 24 uur faeces of fractie 2.1.3 Afname en transport van het staal In veel laboratoria worden de stalen afgenomen in een aparte afnamekamer voorzien van zetel, bed, toilet en lavabo. MLT’s of verpleegkundigen nemen stalen af in ziekenhuizen en rust- en verzorgingstehuizen (RVT) op de kamer van de patiënt. Artsen nemen ook stalen af in hun kabinet. De stalen moeten met de grootste voorzorg getransporteerd worden naar het labo tussen 2 en 8 °C, behoudens uitzonderingen. Identificatie is enorm belangrijk.  3 2.1.4 Aankomst van de stalen in het labo Alle administratieve gegevens (naam van de patiënt, mutualiteit gegevens, aanvragende arts, analyses) worden in de computer gebracht. Indien nodig moeten de stalen zo snel mogelijk gecentrifugeerd worden. De stalen worden, indien nodig, verdeeld in verschillende buisjes in functie van de testen die erop moeten gebeuren. De originele buis die bij de patiënt was wordt de moederbuis genoemd. Bewaring van de verschillende buisjes gebeurt bij kamertemperatuur of bij 2 - 8 °C (koelkast) of bij –20 °C (diepvries) in functie van de te bepalen analyt. 2.2 ANALYTISCHE FASE De eigenlijke bepalingen van de parameters in het monster gebeuren zo snel als mogelijk. De controles en resultaten worden analytisch gevalideerd (zie IKZ). Alarmwaarden worden onmiddellijk gesignaleerd en eventueel hernomen. Er wordt in het labo afgesproken vanaf wanneer een waarde als alarmwaarde wordt beschouwd, vb wanneer die waarde onder of boven een bepaalde grens ligt. Wanneer de waarden analytisch gevalideerd zijn worden ze online in het patiëntenrapport gebracht. 2.3 POST-ANALYTISCHE FASE De resultaten worden gekoppeld aan de naam van de patiënt en klinisch gevalideerd door de klinisch bioloog. De resultaten worden zo snel als mogelijk onder vorm van een rapport met referentiewaarden en eventueel commentaar doorgestuurd aan de aanvragende arts. 3 VEILIGHEID BIJ DE MANIPULATIE VAN EEN STAAL Elk staal en bepaalde reagentia moeten als potentieel pathogeen worden beschouwd: zie labo.  4 Referenties: - Vera Geeraerts over preanalytische fase in ISO 15189: 2007, Focus Diagnostica, 2008, 16, 1 - X. Bossuyt, J.-M. Boeynaems, Wegwijzer in laboratoriumdiagnose Garant, Leuven- Apeldoorn 2001 (zoeken via http://books.google.be) - Interpretatie van medisch laboratoriumonderzoek, tweede herziene druk, JJ Hoffmann, FP Peters, PM Schneeberger en GH Slabbers Bohn Stafleu Van Loghum, Houtem 2012  5 HOOFDSTUK 2: EXCRETERENDE FUNCTIE VAN DE NIER 1 INLEIDING De nier oefent een excreterende, homeostatische en endocriene functie uit. De excreterende functie betekent: o.a. de eliminatie van eindproducten van het metabolisme en eliminatie van het teveel aan substanties (water, natrium- en kaliumionen en andere) van alimentaire oorsprong. Dit houdt ook verband met de homeostatische functie. Homeostase: het houden van concentraties in lichaamsvloeistoffen binnen bepaalde grenzen De homeostatische functie van de nier houdt in dat de samenstelling en de hoeveelheid van de urine voortdurend veranderen omdat de nieren tot taak hebben het inwendig milieu van het organisme constant te houden door stoffen in wisselende hoeveelheden te excreteren in de urine. De endocriene functie betekent dat nieren hormonen produceren. Daarover gaan we het hier verder niet hebben. Om een idee te krijgen van de excreterende en homeostatische functie van de nier moeten een aantal parameters (analyts) onderzocht worden in urine en plasma of serum. Plasma en serum worden bereid uit bloed door het te centrifugeren. Voor het bereiden van plasma moet eerst een anticoagulans gemengd worden met bloed. (zie labo klinische chemie) Urine is een biologisch vocht dat gevormd wordt in de nier en via de ureter of urineleider naar de blaas loopt. Wanneer de blaas samentrekt wordt de urine via de urethra of urinebuis uit het organisme verwijderd. Het klinisch belang van bepaling van analyts in de urine beperkt zich niet alleen tot het kennen van de excreterende en homeostatische functie. Bij een goede renale functie (excretie, homeostase) kan de samenstelling van de urine verder informatie leveren omtrent eventuele bepaalde pathologische toestanden, elders in het lichaam. Daarom kan het klinisch belang van urineanalyses als volgt worden ingedeeld: - van de stoffen die normaal in de urine voorkomen kan worden onderzocht of ze binnen de referentiewaarden aanwezig zijn, vb. gehalte aan creatinine, amylase; - de aanwezigheid en wisselende concentratie van bepaalde hormonen kan informatie leveren in verband met zwangerschap (zwangerschapshormoon) of in verband met het tijdstip in de menstruele cyclus (geslachtshormonen); - stoffen die alleen in abnormale omstandigheden via de nier geëxcreteerd worden kunnen in de  6 urine bepaald worden hetgeen de diagnose van talrijke ziektetoestanden toelaat, vb. glucose in geval van diabetes mellitus; - ingenomen giftige stoffen en geneesmiddelen die via de urine uitgescheiden worden, kunnen opgespoord worden, vb. lood in hogere concentraties dan normaal, illegale drugs. Opmerking: het klinisch belang van bepaling van analyts in plasma of serum is veel uitgebreider dan in urine en wordt in de 4 delen van de cursus klinische chemie besproken, verspreid over 2 en 3 MLT. 2 BOUW EN WERKING VAN DE NIER OM URINE TE VORMEN Voor de anatomische en microscopische bouw van de nier: zie cursussen anatomie en histologie. Hier beperken we ons tot het essentiële teneinde de vorming van de urine te kunnen begrijpen. Zie ook figuur van het nefron. Normaal heeft elke mens 2 nieren. Elke nier bestaat uit ongeveer 1,2 miljoen functionele eenheden, nl de nefronen. Elk nefron bestaat uit een glomerulair en tubulair gedeelte. De glomerulus bestaat uit een netwerk van capillairen waardoor arterieel bloed vloeit en is bedekt met het "kapsel van Bowman". Het tubulair gedeelte bestaat uit de proximale tubulus, de lis van Henle en de distale tubulus. Vele distale tubuli komen samen in één van de vele verzamelbuisjes. Deze monden uit in één van de vele nierpapillen van waaruit de urine verder vloeit in één van de nierkelken en vandaar naar het nierbekken, vervolgens door de ureter naar de blaas. Een volwassene urineert gemiddeld 1,2 l (vrouw) tot 1,5 l (man) per 24 uur. De urine bevat 95 % water en 5 % droogrest (zowel organische als anorganische producten). De productie van de urine omvat 3 belangrijke processen: - ultrafiltratie van het bloedplasma, - reabsorptie van water en 'nuttige' opgeloste stoffen, - secretie van bepaalde stoffen. (let op: secretie is verschillend van excretie!)  7 Figuur 1: Voorstelling van een nefron. Hierbij is: Bowmans’s capsule: kapsel van Bowman; proximal convoluted tubule: proximale tubulus; distal convoluted tubule: distale tubulus; loop of Henle: lis van Henle; collecting duct : verzamelbuisje; de afferente arteriolen samen: 1100 tot 1200 ml bloed/min 600 tot 700 ml plasma/min Figuur 2: Schematische voorstelling van een nefron  8 2.1 ULTRAFILTRATIE Deze gebeurt ter hoogte van de glomerulus van de talrijke nefronen. Het arterieel bloed, komend van de aorta, bereikt de glomerulus via de arteria renalis (de nierslagader). Deze nierslagader vertakt in zeer kleine slagadertjes (de afferente arteriolen) die elk een niernefron binnentreden en zich hier verder vertakken in een netwerk van glomerulus capillairen. Het bloed ondergaat een ultrafiltratie in de glomerulus door poriën. Deze ultrafiltratie gebeurt t.g.v. een drukverschil tussen het bloed en het ultrafiltraat. Door deze poriën kunnen moleculen met een moleculaire massa (Mr) < 65 000 gefiltreerd worden indien ook lading en vorm van de molecule dit toelaten. Moleculen als albumine (Mr = + 65 000) kunnen normaal niet gefiltreerd worden. Ook andere serumproteïnen met Mr > 65 000 en de bloedcellen gaan normaal niet door de poriën en stromen in de bloedbaan (de efferente arteriolen) verder, samen met een groot deel van het plasma. Bloedbestanddelen met een Mr < 65 000 kunnen terechtkomen in het ultrafiltraat. De scheiding is echter niet zéér strikt. Ook een kleine hoeveelheid albumine komt bij een gezonde nier in de glomerulus terecht. Het bloeddebiet ter hoogte van de afferente arteriolen is ongeveer 1200 ml/min (25 % van het hartdebiet). Ermee rekening houdend dat het deel plasma t.o.v. totaal bloed ongeveer 58 % is, betekent dit een plasmadebiet van 700 ml/min. Hiervan zal ongeveer 1/5 glomerulair gefil- treerd worden en 4/5 van het plasma stroomt verder door de efferente arteriolen. De hoeveelheid ultrafiltraat dat normaal gevormd wordt is gemiddeld 120 ml/min. Dit is de glomerulaire filtratiesnelheid of ‘glomerular filtration rate’ (GFR). Dit betekent dat gemiddeld per minuut 120 ml plasma in de nier kan gezuiverd worden van afvalstoffen. Dit ultrafiltraat of primaire urine bevat: - afvalstoffen: ureum, creatinine, urinezuur - 'nuttige' bestanddelen voor het lichaam: eiwitten met laag Mr, aminozuren, glucose, water, elektrolyten..... De pH van het ultrafiltraat is ongeveer 7,4.  9 2.2 REABSORPTIE Reabsorptie gaat van de tubuli en verzamelbuisjes naar het bloed. Reabsorptie gebeurt voor water, aminozuren, glucose, ureum en elektrolyten (Na+, K+, Ca2+, Cl-, HCO3-, SO42- en fosfaten), urinezuur…. Sommige stoffen zoals glucose en aminozuren worden actief gereabsorbeerd: dus met verbruik van energie die geleverd wordt door adenosinetrifosfaat (ATP). Wanneer er te weinig ATP is worden glucose en aminozuren niet optimaal gereabsorbeerd. Daarnaast is er ook passieve reabsorptie van heel veel stoffen, o.a. H2O, elektrolyten-, ureum… Dit transport verbruikt geen energie. Door de reabsorptie van water wordt de primaire urine sterk aangeconcentreerd want bij het einde van de tubuli is 99 % van het water gereabsorbeerd. De tubulaire reabsorptie van water wordt hormonaal geregeld door het antidiuretisch hormoon (ADH) en aldosteron. Het ADH wordt geproduceerd door de hypothalamus en opgeslagen in de achterkwab van de hypofyse. Wanneer het individu veel water heeft ingenomen zal de concentratie van ADH in plasma laag zijn en de diurese (de urineproductie) groot. Wanneer er weinig water werd ingenomen of in geval van vocht- verlies (ernstig braken, diarree..) zal de ADH concentratie in plasma hoog zijn en de diurese laag. Het aldosteron is een mineralocorticoïd dat geproduceerd wordt door de bijniercortex en een belangrijke rol speelt in de elektro- lyten- en waterhuishouding van het lichaam. 2.3 SECRETIE Secretie gebeurt vanuit de capillairen naar de tubuli. Er is secretie van H+ om het zuur-base evenwicht in het lichaam te behouden. Er is secretie van K+, urinezuur, exogene stoffen (bv. para-amino-hippuurzuur) en soms van creatinine (alleen bij stijging van de creatinineconcentratie in het plasma). De secretie gebeurt hoofdzakelijk tegen een concentratiegradiënt in en is dus een actief proces. 2.4 EXCRETIE Excretie betekent uitscheiding uit het lichaam van niet meer bruikbare stoffen. Hier betekent dit: excretie via de urine van niet meer bruikbare stoffen. Uiteindelijk wordt per minuut ongeveer 1 ml urine gevormd met een pH van ongeveer 6.  10 2.5 BESLUIT Het arterieel bloed dat de nierslagader binnenkwam en zich over de vele nefronen had verdeeld is geleidelijk aan veneus geworden en verlaat uiteindelijk de nier als veneus bloed (armer aan zuurstof) via de vena renalis. Ongeveer één vijfde van dit bloed is bij passage door de nieren gezuiverd van afvalstoffen. Dit proces gaat voortdurend door. 3 SAMENSTELLING VAN DE URINE 3.1 ANORGANISCHE BESTANDDELEN: DE ELEKTROLYTEN. gemiddelde/24 uur: - Cl- : 10 g - Na+ : 4 g - fosfaten onder vorm van H2PO41- en HPO42- : 2 g - K+ : 2 g - SO42- : 2 g en andere. 3.2 ORGANISCHE BESTANDDELEN gemiddelde/24 uur: - Ureum : 25 - 30 g - Creatinine : 1,4 g - Urinezuur : 0,6 g - NH4+ : 0,7 g - NO3- - Aminozuren, kleine hoeveelheden proteïnen, vitamine C en andere. 3.3 ABNORMALE BESTANDDELEN komen voor bij - bepaalde ziekten, vb. glucose bij diabetes mellitus, - bij geneesmiddeleninname - bij intoxicaties - ….  11 4 BIOLOGISCHE EVALUATIE VAN DE NIERFUNCTIE Het biologisch onderzoek van de nierfunctie omvat: - onderzoek van de urine: kwalitatief onderzoek met teststrookjes; - microscopisch en microbiologisch onderzoek van het urinesediment; - meting van het concentratievermogen van de nier: de densiteit en de osmolaliteit van de urine; - meting van de eliminatiecapaciteit van zuren, urinaire pH; - kwantitatieve evaluatie van de glomerulaire filtratie: de creatinineklaring; - meting van de serumconcentratie van stikstofhoudende metabolieten die via de nier worden geëlimineerd: ureum, creatinine, urinezuur; - kwantitatieve en kwalitatieve bepaling van proteïnurie. proteïnurie: aanwezigheid van proteïnen in de urine Al deze verschillende onderzoeken zullen verder in dit hoofdstuk worden toegelicht, behalve proteïnurie: hieraan zal een apart hoofdstuk worden gewijd. Opmerking: je ziet dat het biologisch onderzoek van de nierfunctie zowel analyses op urine als op serum (of plasma) omvat.  12 5 ONDERZOEK VAN DE URINE 5.1 IDENTIFICATIE VAN URINE Indien er twijfel bestaat of een binnengekomen staal urine is kan men de concentratie aan ureum of creatinine bepalen of de geleidbaarheid meten omdat deze parameters sterk verschillen voor urine en andere biologische vloeistoffen. 5.2 HOEVEELHEID URINE De urine-excretie of "diurese" bedraagt per 24 uur gemiddeld: 1 500 ml bij de volwassen man, 1 200 ml bij de volwassen vrouw, 1/4 van deze hoeveelheid bij kinderen van 1 tot 6 jaar, 1/2 van deze hoeveelheid bij kinderen van 6 tot 12 jaar. Een minimum van 500 ml is nodig, bij de volwassene, om de afvalstoffen van 24 uur te verwijderen. De diurese varieert met de hoeveelheid ingenomen vocht en de aard van de gebruikte dranken en spijzen. Ze verhoogt met de inname van grotere hoeveelheden vocht, de inname van koffie, thee, alcohol, proteïnen. Ze verlaagt bij vochtverlies langs andere wegen: braken, zweten, diarree en bij geringe waterinname. De diurese wordt geregeld door de samenstelling van het bloed en de concentratie aan anti- diuretisch hormoon (ADH) en aldosteron. De bloeddruk en de hoeveelheid bloed hebben alleen een invloed op de diurese in geval ze extreme waarden hebben (vb. extreem hoge of lage bloeddruk). Pathologisch onderscheidt men : polyurie: abnormaal hoge diurese, over het algemeen > 2 liter/24 uur. De hoeveelheid urine kan variëren tussen: - 2 tot 5 liter bij diabetes mellitus want glucose werkt diuretisch, - 6 tot 20 liter bij diabetes insipidus wegens gebrek aan ADH, - 6 tot 12 liter bij de ziekte van Addison door gebrek aan aldosteron.  13 Oligurie (woord afkomstig van oligo en urie): abnormaal lage diurese, o.a. bij koorts, diarree, zeer veel braken, bij sommige hartziekten of sommige acute nieraandoeningen, door vorming van oedeemvocht of ascitesvocht; hoeveelheid urine < 500 ml/24 uur. Anurie: extreem lage diurese, o.a. bij ernstige nieraandoeningen, bilaterale nierstenen, incompatibele transfusie, shocktoestand, enz. Urineretentie: de gevormde urine wordt in de blaas weerhouden, o.a. bij prostaathyperplasie. 5.3 HELDERHEID VAN DE URINE Bij excretie is urine normaal helder maar kan bij staan troebel worden door neerslag zonder pathologische oorzaak. Indien er troebeling is in verse urine kan dit wel een klinische betekenis hebben: het kan veroorzaakt zijn door de aanwezigheid van etter, bloed, bacteriën of andere. 5.4 KLEUR VAN DE URINE 5.4.1 Normale kleur De normale kleur van urine is min of meer geel. Dat komt door de aanwezigheid van bilirubine-diglucuronide. (zie Klinische chemie II) Geconcentreerde urine zoals ochtendurine kan donkerder gekleurd zijn. Bij blootstelling aan de lucht kleurt urine donkerder door oxidatie van het kleurloze urobilinogeen tot het geelbruine urobiline (zie Klinische chemie II). Urobilinogeen: woord is afkomstig van urobiline en genese; betekent aan de oorsprong liggen van urobiline.  14 5.4.2 Abnormale kleur: donkergeel, rood, bruin tot zwart (zie labo) Donkergeel tot geelbruin: Door verhoogde aanwezigheid van de galkleurstoffen bilirubine-diglucuronide en eventueel urobiline (ontstaan door oxidatie van urobilinogeen). Deze stoffen kunnen verhoogd aanwezig zijn bij verschillende vormen van geelzucht (zie cursus Klinische chemie II). Rood: kan voorkomen bij: - hematurie: aanwezigheid van rode bloed cellen (RBC) in de urine t.g.v. bloedingen in nier of urinewegen. Na centrifugatie komen deze RBC terecht in het sediment (pellet) en is het supernatans niet meer rood. - hemoglobinurie: aanwezigheid van Hb in de urine. Na centrifugatie is het supernatans nog steeds rood. Hemoglobinurie in de aanwezigheid van hematurie is te verklaren doordat een deel van de RBC lyseren in hypotone urine waardoor de Hb vrijkomt in de urine. H2O → O H2O → O H O 2 Hemoglobinurie zonder hematurie kan wijzen op ernstige intravasculaire hemolyse (zie cursus hematologie) waarbij hemoglobine glomerulair gefiltreerd wordt. - porfyrinopathie - bij contaminatie van staalname door menstruatie - na eten van rode bieten Bruin tot zwart: kan voorkomen door: - melanine (huidpigment) dat kleurloos is bij vers uitgescheiden urine maar progressief donker wordt. Melanine komt voor in de urine bij een patiënt met een melanoom met metastasen. - alcapton; dat de urine een bruine kleur geeft. De aanwezigheid van alcapton is het gevolg van een enzymatische deficiëntie waardoor het homogentisinezuur niet meer verder gemetaboliseerd wordt en in de urine wordt uitgescheiden. Homogentisinezuur is zelf een metabolisatieproduct van tyrosine. Homogentisine- zuur polymeriseert tot alcapton en dit gebeurt sneller in alkalisch milieu. Urine bewaard bij kamertemperatuur wordt alkalisch door de vorming van ammoniak (zie volgende blz) Heel wat geneesmiddelen en voedingsstoffen kunnen ook een abnormale verkleuring geven aan de urine.  15 5.5 GEUR Verse urine ruikt normaal niet onaangenaam. Ammoniakale geur ontstaat wanneer urine een tijd blijft staan bij kamertemperatuur. Dit komt omdat commensale bacteriën die het urinestaal contamineren bij de urinelozing sneller vermenigvuldigen bij bewaring van urine bij kamertemperatuur. Meerdere soorten bacteriën bevatten urease dat de aanwezige ureum afbreekt tot ammoniak. H2N C=O + H2O → 2 NH3 + CO2 H2N urease ureum Indien verse urine reeds ammoniakaal riekt kan dit wijzen op een urineweginfectie waarbij de bacteriën reeds in de urinewegen de ureum afbreken tot ammoniak. Fruitachtige geur wordt veroorzaakt door acetoacetaat en aceton (behoren tot de keton- lichamen), in de urine geëxcreteerd bij ontregelde diabetes mellitus en bij vastenketonurie. (zie verder) Fecale geur komt voor bij blaas-colon fistel; dit is een open verbinding tussen blaas en colon. 5.6 CHEMISCH URINE ONDERZOEK Na het evalueren van helderheid, kleur en geur start elk urineonderzoek met een chemische screening met teststroken (dipsticks) en een onderzoek van het urinesediment. Indien hierbij abnormaliteiten ontdekt worden is verder onderzoek aangewezen. (de bepalingen zelf: zie labo) Screening: onderzoek met een test op een grote groep van de bevolking, niet gebaseerd op klinisch aanwijzingen: vb. bij schoolonderzoek wordt elke urine met dipstick onderzocht. 5.6.1 Staalname en bewaring Het urinestaal is bij voorkeur ochtendurine ‘midstream’ en bij gebrek hieraan een willekeurig urinestaal. Exacte afnametijd vermelden. Urine moet vers zijn bij bepaling. Dit betekent: urine wordt kort na staalname geanalyseerd of indien dit onmogelijk is moet de urine in de koelkast (2-8 °C) geplaatst worden om bacterie- groei te vermijden. Bacteriegroei veroorzaakt wijziging van meerdere parameters. Dit kan een verkeerd beeld geven bij aflezen.  16 5.6.2 Chemische screening met teststroken of (dip)sticks Op teststroken zijn één of meerdere reagenszones, elk van ongeveer 0,5 cm2 aanwezig voor semi-kwantitatieve bepaling. Elke reagenszones bevat alle reagentia nodig om 1 parameter te bepalen. Er bestaan verschillende soorten teststroken met telkens 1 reagenszone voor semi- kwantitatieve detectie van 1 parameter zoals: - hemoglobine en/of RBC, vb. Hemastix ® - albumine, vb. Albustix ® - glucose, vb. Clinistix ® - ketonen, vb. Ketostix ® enz. Er bestaan ook teststroken waarop meerdere reagenszones aangebracht zijn voor meting van respectievelijk: soortelijk gewicht (densiteit of relatieve dichtheid), pH, semi-kwantitatieve detectie van albumine, glucose, hemoglobine en/of RBC, leucocyten, bilirubine, urobilinogeen, ketonen en nitrieten. Soms brengt men ook een reagenszone aan voor vitamine C, niet om vitamine C als dusdanig te detecteren maar omdat vitamine C kan interfereren in de bepaling van glucose.(zie verder). Andere firma’s vermijden dat vitamine C interfereert in hun glucosebepalingen door een reagens toe te voegen dat vitamine C metaboliseert. De teststroken worden in de urine gedompeld gedurende 1 sec en de gevormde kleuren ter hoogte van de reagenszones worden vergeleken met referentiekleuren. 5.6.2.1 pH De pH van de urine reflecteert de mogelijkheid van de nier om de pH van de extracellulaire vloeistof (ECF) binnen nauwe grenzen te houden. Door de metabole activiteit van het lichaam worden niet vluchtige zuren (fosforzuur, zwavelzuur, azijnzuur, melkzuur, β-OH-boterzuur, urinezuur..) en vluchtige zuren (CO2) geproduceerd. Deze zuren kunnen het zuur-base evenwicht in het lichaam verstoren zodat wijzigingen in pH zouden optreden. Het is echter zeer belangrijk dat de pH in het ECF en intra- cellulair ongeveer constant blijft zodat de lichaamsfuncties (bv. enzymatische omzettingen) optimaal kunnen verlopen. Hiertoe beschikt het organisme over verschillende buffersystemen in het bloed (proteïnen, hemoglobine, fosfaten, bicarbonaat) en werken nieren en longen mee aan het behoud van het zuur-base evenwicht (zie later). De pH van verse urine kan schommelen tussen 4,5 en 8 maar ligt meestal tussen 5 en 6. De pH moet gemeten worden op verse urine want anders zal de pH wijzigen door uitwisseling van opgeloste CO2 met CO2 uit de lucht en doordat NH3 gevormd wordt bij bewaren van urine.  17 Indien de pH waarde < 5 of > 9 is, dan is meting van sommige andere parameters niet meer betrouwbaar. 5.6.2.2 Proteïnen (albumine) Proteïnen mogen normaal slechts in kleine concentraties in de urine voorkomen. Verschillende pathologische toestanden geven aanleiding tot proteïnurie (zie aldaar). De teststrook is echter vooral gevoelig voor albumine en veel minder voor de andere proteïnen. Nochtans wordt deze test in het labo (verkeerdelijk) altijd bepaling van proteïnen genoemd. De proteïnen moeten gemeten worden op verse urine met pH tussen 5 en 9. Indien proteïnen met de teststrook gedetecteerd worden bij een screening (vb. schoolonderzoek of personeelsonderzoek) zal dit doorgegeven worden aan de huisarts die verder onderzoek kan aanvragen. Indien de arts een proteïnen onderzoek in urine vraagt aan het klinisch laboratorium zal de semi-kwantitatieve bepaling van proteïnen uitgevoerd worden met de teststrook en indien: - positief: een kwantitatieve bepaling van totaal proteïnen volgen (zie later), - negatief: een kwantitatieve bepaling van micro-albuminurie volgen indien de arts daarom verzoekt. Micro-albuminurie: aanwezigheid van lagere concentratie albumine (vanaf 30 mg/l) dan met de teststrook kan gedetecteerd worden (vanaf 200 mg/l) maar zie ook p 18. Micro-albuminurie: is reversibel in tegenstelling tot macro-albuminurie: (>300 mg/l) 5.6.2.3 Glucose Mag normaal niet voorkomen in urine daar de glucose normaal volledig gereabsorbeerd wordt in de tubuli. Oorzaken waardoor er toch glucose in de urine komt (zie hfdst sachariden p 6): 1) Wanneer de glucoseconcentratie in het bloed te hoog is wordt zoveel glucose gefiltreerd ter hoogte van de glomerulus dat de reabsorptiecapaciteit van de tubuli overschreden wordt (zie ook later bij diabetes mellitus). Hierdoor komt glucose in de urine terecht. 2) Wanneer de tubulaire reabsorptie gestoord is kan een normale hoeveelheid glucose in het glomerulair filtraat onvolledig wordt gereabsorbeerd, vb. door tekort aan ATP. Ook dan treedt glucosurie op. Glucose wordt gemeten op verse urine want bacteriën verbruiken glucose. Indien de teststrook glucose detecteert wordt deze kwantitatief bepaald (zie verder).  18 5.6.2.4 Ketonen Bij vastenketonurie (zie verder) en diabetes mellitus komen verschillende ketonen (ook ketonbodies of ketonlichamen genoemd) in de urine voor, nl. acetoacetaat, aceton, β-OH- butyraat (zie ook hfdst sachariden p 17). De naam ketonen of ketonlichamen is misleidend want alleen aceton en acetoacetaat hebben een ketonfunctie in hun formule. Alleen acetoacetaat wordt gedetecteerd met de stick. Aceton is te weinig gevoelig en β-OH- butyraat heeft geen ketonfunctie. 5.6.2.5 Hemoglobine en RBC Elke vorm van bloedverlies ter hoogte van de nier of urinewegen geeft aanleiding tot de aanwezigheid van bloed in de urine. (zie 5.4.2) Bij menstruatie kan bloed in de urine voorkomen door contaminatie bij staalname. Indien bloed macroscopisch zichtbaar is zijn er > 2500 RBC/µl aanwezig. Ook bloedconcentraties die niet met het blote oog zichtbaar zijn kan men met de teststrook detecteren vanaf > 10 RBC/µl. Zoals we reeds vroeger zagen kan er ook hemoglobine (Hb) in de urine voorkomen zonder aanwezigheid van RBC. Het is de peroxidase activiteit in Hb die verantwoordelijk is voor de kleurverandering op de teststrook. Indien de reagenszone op de stick egale verkleuring vertoont wijst dit op de aanwezigheid van vrije Hb in de urine maar deze verkleuring treedt ook op indien vrije myoglobine in de urine aanwezig is. Myoglobine kan ten gevolge van een spierletsel of spiernecrose in de urine terechtkomen. Hemoglobine kan vrij voorkomen ten gevolge van hemolyse van RBC: - in hypotone urine (zie p 10) of - in de bloedvaten en door glomerulaire filtratie in de urine terechtkomen (zie 5.4.2). Indien de reagenszone op de stick stippen vertoont wijst dit op de aanwezigheid van RBC in de urine. De RBC lyseren op het ogenblik dat ze in contact komen met de reagenszone en de vrijgekomen Hb kleurt de reagenszone plaatselijk.  19 5.6.2.6 Nitrieten De meeste verwekkers van urineweginfecties reduceren het in de urine aanwezige nitraat tot nitriet. Het is belangrijk nitrieten te bepalen op verse urine want bij staan kunnen zich ook nitrieten vormen onder enzymatische inwerking van commensale bacteriën op nitraat. 5.6.2.7 Leukocyten (WBC) Het zijn vooral neutrofiele granulocyten die in de urine kunnen voorkomen t.g.v: een acute of chronische ontsteking van nieren of urinewegen (vb. nierbekken, blaas, urethra, prostaat ….). De esterase-activiteit van de leukocyten wordt gedetecteerd. 5.6.2.8 Bilirubine De meeste teststroken spreken van bilirubine maar het is de wateroplosbare vorm van bilirubine, meer bepaald het bilirubinediglucuronide dat hier wordt opgespoord. Deze vorm komt in verhoogde concentraties voor in de urine bij bepaalde vormen van geelzucht (zie Klinische chemie II). 5.6.2.9 Urobilinogeen De meeste teststroken bepalen ook urobilinogeen. Nochtans zijn veel clinici van mening dat urobilinogeen weinig bijkomende informatie biedt op bilirubinediglucuronide. Ook urobilinogeen is in de urine verhoogd bij verschillende vormen van geelzucht. 5.6.2.10 Densiteit of relatieve dichtheid De densiteit van de urine is een onbenoemd getal en wordt het meest exact berekend uit: massa van 1 l urine / massa van 1 l water. De densiteit is in functie van de massa opgeloste stof per volume-eenheid. Opgeloste moleculen met een groter Mr dragen meer bij aan de densiteit dan opgeloste moleculen met een kleiner Mr.  20 De dichtheid geeft vlug een beeld van de concentrering- en dilutiemogelijkheden van de renale tubuli. Deze vermogens zijn snel verstoord bij een beschadiging. De densiteit van een afzonderlijk urinespecimen is zeer veranderlijk. Bij overmatig drinken kan ze dalen tot 1,001 en bij overvloedig zweten kan ze stijgen tot 1,040. De densiteit is normaal omgekeerd evenredig met de hoeveelheid uitgescheiden urine. Hieruit blijkt trouwens de tweevoudige capaciteit die de nier bezit: dilueren en concentreren. (cf. met de densiteit van serum: 1,010 tot 1,012). De densiteit van de normale 24 uur urine ligt voor volwassenen gemiddeld rond 1,020. Bij pasgeborenen en zuigelingen ligt de densiteit van de urine lager (ongeveer 1,010). Bij diabetes mellitus (DM) vindt men hoge urinedebieten gepaard gaande met een hoge densiteit (wegens de aanwezige glucose). Bij diabetes insipidus (DI) vindt men hoge urinedebieten met zeer lage densiteit: 1,001-1,005. urine sterk gedilueerd urine sterk geconcentreerd   1,001 1,020 1,040 __________________________________________________________________   serum: 1,010 - 1,012 Normaal is de nachturine, die 's morgens gecollecteerd wordt, meer geconcentreerd dan de dagurine door het nalaten van drinken tijdens de nacht. Ook het volume is relatief kleiner. Bij bepaalde nierziekten verdwijnt dit verschil tussen nacht- en dagurine, waarbij een urine van constante densiteit uitgescheiden wordt, wat een aanduiding is van het verminderde concentreringsvermogen van de nier. De bepaling van de densiteit kan tijdens het chemisch urineonderzoek verricht worden. Daarnaast vindt deze bepaling toepassing in sommige speciaal verrichte nierfunctieproeven waarvan we hier alleen de concentratietest beschrijven.  21 Concentratietest: principe De gezonde nier weet zich aan te passen aan een zich eventueel voordoend watertekort. Al is er weinig water voorhanden, toch zal de nier de te verwijderen stoffen proberen wegwerken, zich hierbij behelpend met een minimum aan water; de nier zal dan een geringere hoeveelheid urine, die echter meer geconcentreerd is, afscheiden. Men moet er echter wel op bedacht zijn dat de minimum hoeveelheid urine die een volwassene per 24 uur moet produceren om alle afvalstoffen uit te scheiden ongeveer 500 ml is. De eenvoudigste test om het concentrerend vermogen van de nieren te onderzoeken is deze: de patiënt gebruikt een proteïnerijk (diurese vergroot o.i.v. proteïnen) avondmaal rond 18 uur, samen met hoogstens 200 ml drank en drinkt daarna niet meer. Hij urineert wanneer nodig. De urine van de volgende ochtend wordt nog weggegoten. De urinestalen van 10 uur en 11 uur worden onderzocht. De densiteit hiervan moet minstens 1,022 bedragen. Ligt de densiteit beneden 1,018 dan is het concentreringsvermogen van de nier onvoldoende (hyposthenurie). Dit is te wijten aan een relatief in werking ten achter blijven van de aanconcentrerende tubuli tegenover de filtrerende glomeruli. Bij patiënten met oedeem levert deze test weinig informatie op daar oedeemvocht wordt gemobiliseerd om het watertekort te compenseren; het teveel aan interstitieel vocht, aanwezig bij oedeem, zal overgaan naar de bloedvaten. De densiteit vertoont: - vals verhoogde waarden wanneer de urine eiwitten of ketonen bevat, - vals verlaagde waarden wanneer de urine pH > 7 heeft. Daarom wordt de densiteit mathematisch verhoogd met 0,005 indien de pH >7. OPDRACHT: IS HET BELANGRIJK DAT URINE VERS IS VOOR BEPALING DENSITEIT? Opmerking (zie ook labo) De densiteit kan eveneens bepaald worden met de refractometer. Een druppel urine wordt op de refractometer gebracht. Zichtbaar licht valt op de refractometer en wordt m.b.v. een dubbel prisma gebroken. Alleen de Natrium D-lijn (+ 589 nm) gaat door de urinedruppel en wordt gebroken. De refractometer meet de brekingsindex die afhankelijk is van het massa opgeloste stof per volume-eenheid. Uit de brekingsindex wordt de dichtheid afgeleid. De refractometer kan gebruikt worden op voorwaarde dat er geen eiwitten of glucose in de urine aanwezig zijn. De dichtheid kan eveneens bepaald worden met de pycknometer. Dit is de meest juiste maar ook de meest arbeidsintensieve meetmethode die de definitie van densiteit of relatieve dichtheid nog eens duidelijk maakt. De pycknometer is een klein glazen vaatje dat volledig kan gevuld worden dank zij een rechtopstaand capillair dat moet overlopen. Stel: M0 is gewicht van de pycknometer, volledig droog; M1 is gewicht van de pycknometer, volledig gevuld met urine; M2 is gewicht van de pycknometer, volledig gevuld met water; dan is de dichtheid = (M1 - M0) / (M2 - M0).  22 5.6.2.11 Besluit De chemische screening met teststroken wordt uitgevoerd op verse urine. In de meeste labo’s gebeurt de analyse met teststroken automatisch met behulp van bv. de Miditron of analoog toestel. Dit toestel dompelt de teststroken in de urine en leest de kleuren af met reflectometrie (variant van fotometrie, zie verder). In kleinere labo’s gebeurt de analyse met teststroken semi-automatisch. Hierbij brengt de MLT de teststrook in de urine en wordt deze afgelezen met een toestel. De analyse met teststroken bij school- of personeelsonderzoeken gebeurt nog manueel. Tabel 1: Parameters Miditron Parameter wijze van rapporteren Eiwit 0=-; 0,25 = + ; 0,75 = + ; 1,5 = + Glucose 0=-; 3=+; 6=+; 17 = + ; 56 = + Hemoglobine 0 cellen/µl = - ; 10 cellen/µl = + ; 25 cellen/µl = ++ ; 50 cellen/µl = +++ ; 250 cellen/µl = ++++ Leukocyten 0 cellen/µl = - ; 25 cellen/µl = + ; 100 cellen/µl = ++ ; 500 cellen/µl = +++ Nitriet 0=-; 1=+ Acetoacetaat 0=-; 0,5 = + ; 1,5 = ++ ; 15 = +++ Bilirubine Numerieke waarde (µmol/l) Urobilinogeen Numerieke waarde (µmol/l) PH Numerieke waarde Soortelijk gewicht Numerieke waarde OPDRACHT: ZOEK DE EENHEDEN VOOR EIWITTEN, GLUCOSE, NITRIET EN ACETOACETAAT PASSEND BIJ DE GETALLEN VERMELD IN BOVENSTAANDE TABEL. GEBRUIK HIERTOE BOEKJE: COMPENDIUM URINALYSIS WITH TEST STRIPS VAN ROCHE EN DE BIJSLUITER VAN DE COMBUR TEST GEBRUIKT IN HET LABO.  23 5.7 MICROSCOPISCH EN FLOWCYTOMETRISCH URINESEDIMENT Hiertoe wordt bij voorkeur verse ochtendurine genomen. Deze wordt gedurende 5 minuten gecentrifugeerd bij 1000 à 2000 toeren per minuut. Van het sediment wordt een hoeveelheid op een voorwerpglaasje gebracht. Microscopisch wordt de aanwezigheid nagegaan van elementen die normaal niet tot de urine behoren en een aanduiding kunnen zijn voor een pathologie; RBC, WBC, meerdere soorten epitheelcellen in grotere hoeveelheden dan normaal, pathologische cilinders, meestal gevormd in de distale niertubuli of in de urine-verzamelbuisjes, kristallen, tumorcellen, gisten… Onderzoek op micro-organismen maakt deel uit van het microbiologisch onderzoek. Het microscopisch onderzoek van het urinesediment kan geautomatiseerd worden met behulp van flowcytometrie en gebeurt meestal in de Sysmex UF 50 of UF 100 of analoog toestel. Dit onderzoek wordt in de meeste laboratoria gecombineerd met geautomatiseerde dipstickanalyse en de resultaten worden vergeleken. Hier volgen een aantal voorbeelden: - de concentratie nitrieten vertoont een correlatie met het aantal bacteriën. - de activiteit van leukocyten-esterase vertoont een correlatie met het aantal WBC. - de hematurie vertoont een correlatie met het aantal RBC. Wanneer resultaten van Miditron en Sysmex UF 50 of 100 voor eenzelfde staal niet kloppen wordt nagegaan waarom één van de toestellen afwijkende resultaten gaf. Bij het geautomatiseerd onderzoek van het urinesediment worden een aantal elementen niet duidelijk herkend. Het toestel geeft dit aan en dan gebeurt dikwijls een aanvullend microscopisch onderzoek door de MLT. Bij abnormale reacties bij de chemische screening met teststroken in combinatie met het microscopisch onderzoek van het urinesediment moet de aanwezigheid van abnormale stoffen of metabolieten of verhoogde concentraties ervan verder onderzocht worden, ook in serum of plasma. Ze kunnen wijzen op één of andere storing in het organisme, die door verschillende abnormaliteiten kan veroorzaakt worden.  24 Een aantal abnormale metabolieten kunnen wijzen op de aanwezigheid van een "inborn error", een aangeboren genetische afwijking. Indien deze niet snel gedetecteerd wordt kunnen sommige ervan mentale en lichamelijke achterstand veroorzaken en soms dodelijk zijn. Daarom wordt chemische screening van urine steeds uitgevoerd bij zieke pasgeborenen en baby’s. Tabel 2: Parameters UF-100 (bepaald met flowcytometrie) Component wijze van rapporteren Opmerkingen Erytrocyten Numeriek resultaat (/µl) Indien zéér hoog aantal RBC wordt dit Aantal RBC/µl wordt berekend vertaald naar >1400 RBC/µl Leukocyten Numeriek resultaat (/µl) Indien zéér hoog aantal WBC wordt dit Aantal WBC /µl wordt berekend vertaald naar >1400 WBC/µl Plaveiselepitheel 100/µl → +++ Urethraalepitheel Indien >3/µl → + Geen microscopische bevestiging nodig Kristallen Indien >20/µl → het type kristallen Microscopisch bevestigen manueel antwoorden Pathologische Indien >1/µl → het type cilinders manueel Microscopisch bevestigen cilinders antwoorden Hyaliene Indien >3/µl → het type cilinders manueel Microscopisch bevestigen cilinders antwoorden Spermatozoïden Indien > 0/µl → + Microscopisch bevestigen Gisten Indien > 10/µl → +/- Microscopisch bevestigen  25 Voorbeeld van urineonderzoek bij vrouw 48 jaar met Miditron en Sysmex UF 100 Ontvangstdatum urine: 22/04/04 Staal: ochtendurine Screening met teststrook referentiewaarden pH 6,0 5-8 Soortelijk gewicht 1,015 1,010 – 1,030 Eiwit neg < 0,2 g/l Glucose neg < 0,05 g/l Hemoglobine neg neg Leucocyten neg neg Nitriet neg neg Aceto-acetaat neg neg Urobilinogeen 0 µmol/l neg Bilirubine 0 µmol/l neg Sediment: Erythrocyten 1 /µl < 10 Erythrocyten 0 /veld werkelijke GFR.  33 2) Vanaf 50 jaar daalt de GFR ongeveer met 10 % per 10 jaar. Bij oudere mensen daalt ook de creatinineproductie en daardoor daalt de creatinineconcentratie in het serum. Dus is de berekende GFR via de formule voor creatinineklaring bij oudere mensen niet zo sterk gedaald als in werkelijkheid het geval is. Besluit: ondanks de bovenvermelde problemen is de meting van GFR volgens de endogene creatinineklaring een goede schatting voor de werkelijke waarde. OPDRACHT: BEREKEN DE CREATININEKLARING ALS MAAT VOOR DE GFR MET FORMULE (3). referentiewaarden Geloosde urine 1750 ml Tijdspanne 24 uur of 1440 min Creatininemie 0,73 mg/dl Creatininurie 44,90 mg/dl Creatinineklaring. ? ml/min 90 -150 Legende: creatininurie: creatinineconcentratie in urine creatininemie: creatinineconcentratie in plasma of serum 6.1.1.3 Berekenen GFR uit creatinineklaring en correctie voor lichaamsoppervlakte Ondanks het feit dat meerdere laboratoria nog formule (3) gebruiken voor berekening van de creatinineklaring of creatinine clearance is het juister om in deze formule een correctie aan te brengen voor de oppervlakte van de patiënt: Hierbij is 1,73 m2 de gemiddelde oppervlakte van een man en moet de oppervlakte van de patiënt in m2 afgeleid worden door zijn lengte en gewicht met elkaar te verbinden op een nomogram voor lichaamsoppervlakten.  34 OPDRACHT: BEREKEN DE GENORMALISEERDE CREATININEKLARING ALS MAAT VOOR DE GFR BIJ DE BOVENSTAANDE PATIËNT DOOR CORRECTIE VOOR LICHAAMSOPPERVLAKTE. LENGTE PATIËNT: 162 CM EN GEWICHT 56 KG.  35 6.1.1.4 Berekenen GFR uit creatininemie met formule Cockroft en Gault De creatininurie gebruikt voor de creatinineklaring wordt meestal gemeten in 24 uur urine. Omdat de afname van 24 uur urine voor veel patiënten problemen stelt en dikwijls niet exact gebeurt geven een aantal dokters de voorkeur aan een alternatieve formule voor de creatinineklaring meer bepaald de formule van Cockroft en Gault: voor man: (140 - leeftijd) x gewicht / P x 72 voor vrouw: dezelfde formule x 0,85 hierbij is P de creatininemie in mg/dl en is de leeftijd in jaren en het gewicht in kg. OPDRACHT: BEREKEN DE CREATININEKLARING ALS MAAT VOOR DE GFR BIJ DE BOVENSTAANDE PATIENT MET DE FOMULE VAN COCKROFT EN GAULT. PATIËNT IS EEN VROUW VAN 33 JAAR. 6.1.1.5 Schatting GFR (eGFR) via MDRD Veel laboratoria zijn intussen overgeschakeld op modification of diet in renal disease (MDRD) voor de schatting van GFR (estimated GFR) via serumcreatinine, geslacht, leeftijd en ras. MDRD in ml/min /1,73 m2 = 175 x (serumcreatinine) -1,154 x (leeftijd in jaren)–0,203 (x 0,742 indien vrouw) De berekening is genormaliseerd voor gemiddelde lichaamsoppervlakte van 1,73 m2. Serumcreatinine wordt uitgedrukt in mg/dl. Op basis van dit resultaat wordt het stadium voor een chronische nierziekte bepaald zoals gedefinieerd in de kidney disease outcome quality initiatieve (K/DOQI)-richtlijnen. Zie onderstaande tabel. Tabel 3 Stadia van chronische nierziekte zoals gedefinieerd in de K/DOQI-richtlijnen Stadium Omschrijving GFR (ml/min) 1 Nierschade met normale of verhoogde GFR ≥ 90 2 Nierschade met mild verlaagde GFR 60-89 3 Matig verlaagde GFR 30-59 4 Ernstig verlaagde GFR 15-29 5 Nierfalen < 15 of dialyse Nierschade is gedefinieerd als microalbuminurie of proteïnurie. Heel belangrijk is dat voor het berekenen van MDRD de serumcreatinine bepaald wordt volgens een internationale geharmoniseerde en gekalibreerde bepaling en daartoe moeten nog verder inspanningen geleverd worden. (Ned Tijdschr Klin Chem Labgeneesk 2006; 31: 306-311) http://www.bcfi.be/Folia/index.cfm?FoliaWelk=A2010 August and December 2010 OPDRACHT: SCHAT DE GFR BIJ DE BOVENSTAANDE PATIENT MBV MDRD EN GENORMALISEERD VOOR LICHAAMSOPPERVLAKTE VAN 1,73 m2 6.1.2 Tubulaire reabsorptiecapaciteit Tubulaire reabsorptiecapaciteit kan berekend worden via stoffen die glomerulair gefiltreerd worden en ter hoogte van de tubulus, ten dele gereabsorbeerd worden. Alhoewel meerdere stoffen tubulair gereabsorbeerd worden (o.a. ureum, aminozuren, glucose) wordt de tubulaire reabsorptiecapaciteit meestal niet meer berekend.  36 De renale plasmaklaring van stoffen die tubulair gereabsorbeerd worden zal dus minder bedra- gen dan 120 ml/minuut. RK = GFR - TR. In het geval van ureum zal er van de hoeveelheid die glomerulaire filtratie onderging nog ongeveer 2/5 terug in het bloed gereabsorbeerd worden, ter hoogte van de tubuli, zodat de ureumklaring ongeveer 60 % is van de inuline- of endogene creatinineklaring. De ureumklaring is ongeveer 75 ml/min bij de volwassen man. Glucose wordt normalerwijze volledig gereabsorbeerd door de tubuli. Men heeft, de symbolen van vergelijking (1) van 6.1.1.1 gebruikend: C x P - TRG = V x U met TRG : de tubulaire reabsorptiecapaciteit van glucose. P: de glycemie, dit is de concentratie van glucose in plasma. U : de glucoseconcentratie in de uitgescheiden urine: is normaal = 0, dus is ook U x V = O. Hieruit volgt: C x P = TRG Dit betekent dat C x P of de hoeveelheid glucose die per minuut door de glomerulus gefiltreerd wordt, gelijk is aan TRG of de hoeveelheid die in dezelfde tijd terug door de tubuli gereab- sorbeerd wordt. De glucose-klaring is normaal 0 ml/min. Echter, de tubulaire reabsorptie vertoont een bovengrens, voorgesteld, in het geval van glucose, door TRG max. In geval er veel meer dan normale hoeveelheden glucose aanwezig zijn in het bloed zoals bij diabetes mellitus zal er ook veel glucose in het ultrafiltraat aanwezig zijn. Deze kan niet allemaal meer t.h.v. de tubuli gereabsorbeerd worden en er verschijnt glucose in de urine. Anderzijds zal bij tubulusfalen een normale hoeveelheid glucose in het ultrafiltraat niet volledig gereabsorbeerd worden en verschijnt er eveneens glucose in de urine. Als maat voor de tubulaire reabsorptie en de glomerulaire filtratiecapaciteit kan men ook een bepaling uitvoeren van β2 - microglobuline (Mr = 11 800) of van cystatine C (Mr = 13 000) in plasma en urine. Deze kleine eiwitten ondergaan GF en TR maar bij passage door de nier- tubulicellen wordt ze afgebroken. In plasma zijn de concentraties van deze eiwitten: - gestegen bij een gedaalde GFR vanaf 80 ml/min; dit is een indirecte bepaling van het GFR - normaal bij tubulaire dysfunctie. In urine zijn de waarden van deze eiwitten gestegen bij een tubulaire dysfunctie doordat de tubulaire reabsorptie gedaald is.  37 6.1.3 Berekening tubulaire secretie Stoffen die glomerulair gefiltreerd worden en ter hoogte van de tubulus nog een supplemen- taire secretie ondergaan hebben een renale klaring hoger dan 120 ml/min. De RK = GFR + TS (-TR). Stoffen die tubulaire secretie ondergaan zijn: - Exogeen (toegediend) creatinine: de renale klaring van creatinine (endogeen aangevuld met exogeen) bedraagt ongeveer 180 ml/min aangezien, bovenop de glomerulaire filtratie, alle exogeen en het eventueel verhoogde endogeen creatinine worden gesecreteerd, teneinde de plasma creatinineconcentratie opnieuw te normaliseren. - Para-amino-hippuurzuur (PAH) en Diodrast (contrastmiddel): de renale klaring van deze stoffen bedraagt 600 ml/min. In eerste instantie worden deze stoffen maximaal glomerulair gefiltreerd uit + 20 % van het plasma dat de glomerulus passeert. Er is nog + 80 % van het plasma in de efferente arteriolen niet van deze stof ontdaan. Het PAH en Diodrast worden echter ter hoogte van de tubulus bijna volledig gesecreteerd zodat het bloed bij één passage door de nier bijna volledig van deze stof ontdaan wordt. Exogeen creatinine en PAH worden bij de mens niet toegepast voor meting en berekening van de TS maar ze worden wel soms toegepast in het kader van onderzoek bij proefdieren. 6.1.4 Besluit Van alle hierboven vermelde renale klaringstesten wordt bij de mens de GFR het meest uitgevoerd.  38 6.2 RENALE PLASMA FLOW (RPF) RPF wordt gedefinieerd als de hoeveelheid plasma dat per minuut door de nier stroomt. Door het meten van de RPF (waaruit men de renale doorbloeding kan berekenen via de hematocriet) kan men nagaan of er eventueel een vernauwing is ter hoogte van de bloedvaten die de nier voorzien van bloed. Bij hartfalen is het renale bloeddebiet eveneens verminderd. De renale doorbloeding is auto-gereguleerd en daardoor niet afhankelijk van de bloeddruk binnen bepaalde grenzen. Een verminderde renale doorbloeding heeft een verminderde nierwerking tot gevolg. De renale plasma flow kan gemeten worden door aan de patiënt een stof toe te dienen zoals het para-amino-hippuurzuur (PAH) of Diodrast. Slechts een geringe hoeveelheid van deze stof wordt in het bloed van de vena renalis teruggevonden want ter hoogte van de nier ontdoet het bloed zich bijna volledig van deze stof door glomerulaire filtratie en secretie (zie boven). De renale plasmaklaring van PAH en Diodrast bedraagt 600 ml/min wat het normale plasmadebiet van ongeveer 700 ml/min benadert. Voorwaarde voor een juiste meting van de renale plasma flow is dat de GFR en de tubulaire secretie niet gestoord zijn of dat een licht storing van de GFR nog kan gecompenseerd worden door meer tubulaire secretie. Overzicht van de renale klaringstesten: Component GF TR TS toepass. -------------------------------------------------------------------------------------------- inuline + - - GFR mannitol + - - GFR -------------------------------------------------------------------------------------------- creatinine + - +(soms) GFR -------------------------------------------------------------------------------------------- PAH + - + TS en RPF diodrast + - + TS en RPF ---------------------------------------------------------------------------------------------- ß2 – microglobuline + + - GFR en TR cystatine C + + - GFR en TR  39 7 BEPALING VAN STIKSTOFHOUDENDE METABOLIETEN Voor de evaluatie van de nierfunctie worden stikstofhoudende metabolieten, die via de nier worden geëxcreteerd, gemeten in serum en soms in urine. Het zijn ureum en creatinine en in mindere mate urinezuur. Andere stikstofhoudende metabolieten zijn creatine en ammonium-zouten (ammoniak). Ammoniak wordt gemeten als leverfunctietest. Creatine wordt gemeten in het kader van onderzoek i.v.m. skeletspieren Ammoniumzouten en ureum resulteren uit het katabolisme (afbraak) van eiwitten. De eiwitten ondergaan proteolyse tot aminozuren (AZ). Bij de degradatie van AZ wordt gewoonlijk als eerste stap de aminofunctie afgesplitst. Elk levend en dus metaboliserend weefsel produceert ammoniak. Ammoniak, dat toxisch is voor het lichaam, wordt omgezet in het veel minder toxische ureum in de ureumcyclus. Dit is de belangrijkste weg in het organisme om de concentratie aan ammoniak in het lichaam beneden de toxische drempel te houden. (normale ammonemie is < 70 μg/dl ). Ammoniumzouten (ammoniak) en ureum komen uiteindelijk in de urine terecht. Creatine en creatinefosfaat zijn aanwezig in de spieren. Het afbraakproduct van creatinefosfaat is creatinine. Urinezuur is afkomstig van het katabolisme van purinebasen en wordt gemeten om de diagnose te ondersteunen bij vermoeden van jicht. Wanneer de patiënt nierfalen heeft zullen de stoffen die normaal door een gezonde nier verwijderd worden zich nu opstapelen in het bloed. Men zegt dan dat de patiënt uremisch is. De stoffen in verhoogde concentratie in het bloed worden ook uremische retentiestoffen genoemd. Het totaal klinisch beeld dat hier uit volgt is het uremisch syndroom.  40 7.1 BEPALING VAN UREUM 7.1.1 Inleiding Ureum wordt gevormd uit NH3. Uremie: ureumconcentratie in serum. Ururie: ureumconcentratie in urine. 7.1.2 Klinisch belang Men vindt verhoogde concentraties in serum in geval van: - prerenale oorzaken: - verhoogd katabolisme van proteïnen o.a. bij verhoogde proteïne-inname of bij verhoogde spierafbraak (vb. bij immobiliteit) - gedaalde wateropname of veelvuldig braken of ernstige diarree  diurese daalt - hartdecompensatie  doorbloeding v.d. nier daalt. - renale oorzaken: allerlei nierziekten die leiden tot een nierfunctiedaling ter hoogte van de glomerulus  filtratie  - postrenale oorzaken: alle types van urinewegobstructies, vb. stenen, gezwollen prostaat, tumoren.. Deze doen de druk in de nieren   diurese  Aangezien een verhoogde ureumconcentratie in serum (of plasma) zowel kan veroorzaakt worden door renale als niet-renale (pre- en postrenale) factoren hebben we niet veel aan een serum ureumbepaling op zich. Wel wordt het nuttiger indien ze gecombineerd wordt met een serum creatininebepaling. Men vindt verlaagde concentratie in serum in geval van: - prerenale oorzaken: verlaagd proteïne katabolisme (o.a. bij verlaagde proteïne inname) - renale oorzaken: tubulaire problemen  reabsorptie   41 7.1.3 Staalname Ureum kan direct bepaald worden in serum, (plasma) of urine maar wordt meestal bepaald in serum. Stalen worden tussen 2 en 8 C bewaard en de bepaling gebeurt zo vlug mogelijk. In geval ureum op urine bepaald wordt moet het staal zeker vers zijn. O.i.v. bacteriën kan het ureumgehalte dalen want veel bacteriën bevatten het enzym urease dat ureum → NH3. Addendum: Algemene opmerking in verband met staalname: Waar men de mogelijkheid heeft zal men de voorkeur geven aan serum boven plasma voor analyse van de gewenste parameters. Nadeel van serum: de staalname van serum duurt langer dan deze van plasma. Wanneer men gebruik maakt van speciale buizen, met stollingsactivatoren en met een gellaag in de buis is staalname van serum slechts + 10 minuten langer dan deze van plasma. Door centrifugatie komen bloedcellen terecht onder de gellaag en het serum boven de gellaag. Alleen voor een paar analyses waarbij het staal zeer snel in de diepvries moet komen in afwachting van de analyse kan geen serum gebruikt worden omdat die extra 10 minuten te lang zijn. Nadeel van plasma Bij het bereiden kan er een vergissing mogelijk zijn door gebruik van een verkeerd anticoagu- lans. OPDRACHT: ZOEK IN DE LABOCURSUS KLINISCHE CHEMIE DE ANTICOAGULANTIA OP VOOR BEREIDEN VAN PLASMA Opmerking patiënten: - onder heparinetherapie bij het op punt stellen van anticoagulantiatherapie (o.a. bij een stollingsprobleem) hebben steeds heparine in hun bloed; - met onderhuids poortje voor gemakkelijke toegang van baxters (vb. bij chemotherapie) en voor gemakkelijke afname van bloed hebben in het poortje een heparineoplossing om het stollen in het poortje te beletten. Om te beletten dat heparine in hun bloedstaal zit moet eerst een beetje bloed in een ander buisje opgevangen worden dan het buisje voor serumbereiding.  42 7.1.4 Principe 7.1.4.1 Directe methode De diacetyl methode steunt op de reactie van ureum met diacetyl met vorming van het geel gekleurde diazine dat fotometrisch gemeten wordt bij λ = 540 nm. De absorbantie A van diazine is in evenredigheid met de hoeveelheid ureum in het staal. Diacetyl zelf is onstabiel en wordt ex tempore uit het diacetylmonoxime gemaakt. CH3 CH3  H+  C=O + H2O → C=O + HONH2   C = NOH C=O   CH3 CH3 diacetyl monoxime diacetyl hydroxylamine CH3 CH3 H2N   C=O + C=O H+ C=N H2N  →  C = O + 2 H2O C=O t C=N   CH3 CH3 ureum diacetyl diazine, λ = 540 nm Deze reactie kan manueel worden uitgevoerd of geautomatiseerd. Aangezien het diacetyl direct met ureum reageert en niet met ammoniak zal de aanwezigheid van ammoniak in serum of urine geen interferentie veroorzaken in de bepaling van ureum.  43 Addendum: Algemene informatie i.v.m. fotometrische bepaling (zelfstudie). In de hierboven vermelde bepalingsmethode voor ureum moet er uiteindelijk een meting gebeuren van de absorbantie A van diazine, aanwezig in het reactiemengsel. De absorbantie A wordt gemeten in een fotometrisch bepaling. Deze absorbantie A (gecorrigeerd voor de blanco) is evenredig met de onbekende concentratie van ureum (= de onbekende). Om de concentratie van de onbekende te kennen worden samen met de onbekende ook standaardoplossingen van ureum met gekende concentraties meebepaald. Uit de gevonden absorbanties van de standaarden worden de concentraties van de onbekende afgeleid. Fotometrie Stel een gekleurd product: het absorbeert een deel van het zichtbare licht en laat het niet- geabsorbeerde licht door, dit is de kleur die wij waarnemen. Vb. een stof is rood gekleurd omdat ze het complementaire kleur aan rood (dit is groen) absorbeert en rood doorlaat of reflecteert. Ditzelfde kunnen we stellen voor alle gekleurde stoffen en voor alle gekleurde oplossingen. Waarom gaan moleculen in oplossing een deel van het licht absorberen? Omdat dit licht energie levert om elektronen e van deze molecule in aangeslagen energietoestand te brengen (e → e*). δ-elektronen zijn niet in aangeslagen energietoestand te brengen. -elektronen zijn wel in aangeslagen energietoestand te brengen op voorwaarde dat ze in conjugatie (zoals bv. in benzeen) zijn met andere -elektronen. Deze elektronen in conjugatie vereisen namelijk minder energie om naar een aangeslagen energietoestand te komen. - elektronen bevinden zich in dubbele bindingen en in vrije elektronenparen zoals in stikstof (niet in de stikstof van quaternair ammonium!). Het aantal geconjugeerde dubbele bindingen in een molecule en het soort binding zal bepalend zijn voor de vereiste lichtenergie om e → e*, vb. bij C=C is meer energie vereist dan bij C=O. Voor een gegeven soort binding geldt dat hoe groter het geconjugeerd systeem van dubbele bindingen is, hoe minder energie er nodig is om de elektronen in aangeslagen toestand te brengen.  44 Gekleurde moleculen in oplossing beschikken over een (uitgebreid) systeem van geconjugeerde dubbele bindingen. Met behulp van licht uit het zichtbaar gebied kunnen elektronen van deze moleculen in aangeslagen energietoestand gebracht worden; e -> e* Kleurloze moleculen in oplossing kunnen eventueel over een beperkt aantal geconjugeerde dubbele bindingen beschikken. Hierin kunnen de elektronen m.b.v. UV licht naar een aange- slagen energietoestand gaan (vb. benzeen). Deze eigenschappen om licht te absorberen waardoor e -> e* worden toegepast in de fotometrische bepalingsmethode. UV zichtbaar IR --------------l------------------l------------- λ + 400 nm + 660 nm Opdat een stof fotometrisch zou kunnen bepaald worden moet ze in staat zijn om monochromatisch licht (= licht van één bepaalde λ ) te absorberen. In een fotometrische bepaling maakt men gebruik van een fotometer. Deze zendt mono- chromatisch licht uit van een welbepaalde golflengte. Deze golflengte kan behoren tot het UV gebied of tot het zichtbare gebied. Wanneer de stof die we fotometrisch wensen te bepalen kleurloos is, is monochromatisch licht uit het UV gebied nodig. Wanneer de stof die we wensen te bepalen gekleurd is, is monochromatisch licht uit het zichtbare gebied nodig, complementair aan de kleur van de stof die wij waarnemen. Wanneer monochromatisch licht van geschikte golflengte door een oplossing van de fotometrisch te bepalen stof gestuurd wordt zullen  elektronen het monochromatische licht absorberen en daardoor in aangeslagen energietoestand komen. Doordat een deel van het monochromatisch licht geabsorbeerd wordt vermindert de lichtintensiteit. Stel Io is de intensiteit van het licht dat door de oplossing gestuurd wordt en I is de intensiteit van het uittredend (= niet geabsorbeerde) licht, dan is: de absorbantie A = log (Io/I). Soms is het toestel zo gebouwd dat I wordt gereflecteerd en daarna gedetecteerd : noemt reflectometrie. Dus reflectometrie is bijna hetzelfde als fotometrie. (wordt later verder uitgewerkt) Dit betekent: hoe hoger de concentratie van een welbepaalde stof in oplossing, hoe meer licht geabsorbeerd wordt, hoe kleiner I, hoe groter A. De concentratie van de stof in oplossing is recht evenredig met de A.  45 Kwantifiseren We meten de A van de onbekende ureum concentratie en tegelijk van standaardoplossingen met gekende ureum concentraties. Aangezien de absorbantie recht evenredig is met de concentratie kunnen we een kalibratielijn (standaardcurve) opstellen zoals voorgesteld in onderstaande figuur. De concentraties van de ureumstandaarden komen in de x-as. De absorbanties van de respectievelijke standaarden in de y-as. De best passende rechte wordt getrokken. Standaarden(st) st 1 st 2 st 3 st 4 st 5 concentratie 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 mg/dl absorbantie 0,140 0,310 0,462 0,591 0,763 0,136 0,458 0,759 0,146 0,769 De nulstandaard wordt meestal niet opgenomen in de kalibratielijn omdat de nulstandaard < DL (LOD) of bepaalbaarheidsgrens (zie IKZ). De kalibratielijn gaat dus niet door punt (0,0). A│  │ │ │ │ 0└────────────────────── [ureum] in mg/dl Figuur 3: Dit is een typische kalibratielijn voor een fotometrische bepaling. Uit de bekomen kalibratielijn kan m.b.v. de gemeten A van de analyt, de [analyt] worden afgeleid. Kiezen van de maximale λ voor de fotometrische bepaling Bij het zoeken naar de maximale λ wordt monochromatisch licht van oplopende λ door de oplossing gestuurd. Die verschillende λ van het licht worden achtereenvolgens door de opge- loste moleculen geabsorbeerd. De ene λ wordt meer geabsorbeerd dan de andere. Zo wordt gezocht naar de λ die het sterkst geabsorbeerd wordt. Dit is dan λmax. Het bepalen van de λmax gebeurt aan de hand van een absorptiespectrum.  46 Bestudeer deze figuren. U zal ook voorbeelden zien in het labo klinische chemie Figuur 4: Absorptiespectrum van een stof in oplossing met λmax bij 210 nm en 290 nm Figuur 5: Absorptiespectrum van een gekleurde oplossing met 2 λmax In sommige gevallen is men verplicht te meten bij een andere λ dan de λmax omdat er interferentie is van andere stoffen bij λmax (zie verder bij absorptiespectrum van NADH)  47 7.1.4.2 Indirecte methode Ureum wordt gehydrolyseerd onder invloed van het enzym urease. De ammoniak die reeds aanwezig was in het staal kan interfereren in deze bepaling. Daarom moet de ammoniak afzonderlijk bepaald worden in een blanco bepaling. (zie werkwijze in het addendum rond enzymatische bepalingen). H2N urease C = O + H2 O → 2 NH3 + CO2 H2N  H2O 2 NH4+ + CO32- O " HOOC - (CH2)2 - C - COO- + NH4+ + NAD(P)H + H+ 2-oxoglutaraat   Glutamaatdehydrogenase; pH = 7,4 + NH3  HOOC - (CH2)2 - C - COO- + NAD(P)+ + H2O  glutamaat H de NAD(P)H  wordt gevolgd bij λopt = 340 nm. De gemeten absorbantie  [NAD(P)H]  1/[NH4+]  1/[ureum] NAD(P)+ het nicotinamide adenine dinucleotide (fosfaat) NAD(P)H idem maar in gehydrogeneerde of gereduceerde vorm: de dihydro(pyridine) component van NAD(P)+ Interferentie kan in bovenstaande enzymatische bepaling optreden bij gehemolyseerde stalen omdat NAD(P)+ en NAD(P)H kunnen vrijgesteld worden uit de RBC. Dergelijke interferentie treedt dus ook op bij alle andere enzymatische bepalingen met co- enzym NAD(P)+ en NAD(P)H.  48 Figuur 6: Links: NAD+ Rechts: NADH + H+ NAD(P)H is het co-enzym van vele enzymsystemen. Het is noodzakelijk om de NAD(P)H te volgen en niet NAD(P)+ omdat: - de λmax van NAD(P)H = λmax van NAD(P)+ = 260 nm; bij deze λ meten we dus beide vormen samen - NAD(P)H ook nog sterk absorbeert bij λ = 340 nm. Men moet in deze fotometrische bepalingsmethode bij λ = 340 nm meten omdat men dan in staat is om slechts één van beide vormen te meten nl. (NAD(P)H) zonder storing van de andere vorm. De λ van 340 nm is hier niet de λmax maar de λopt. Elke enzymatische reactie waarbij NAD(P)H het co-enzym is kan op deze manier gevolgd worden en gekwantifiseerd Figuur 7: Absorptiespectra van NAD(P)+ en NAD(P)H. ‘Extinction’ is absorbantie  49 Addendum: algemene informatie in verband met een enzymatische bepaling om een bepaalde stof te meten die fungeert als substraat. stel: Substraat 1 = onbekende enzym 1 Substraat 1 ↔ Reactieproduct 1 In een volgende stap wordt Reactieproduct 1 = Substraat 2 enzym 2 Substraat 2 ↔ Reactieproduct 2 Op deze manier koppelt men een aantal enzymatische reacties aan elkaar waarbij het reactieproduct of één van de reactieproducten van één reactie telkens het substraat wordt voor de volgende reactie. Veel enzymatische reacties zijn reversibel en de richting hangt meestal af van de pH van het milieu. Men moet een gebufferd milieu hebben met een welbepaalde pH waarbij alle reacties in de gewenste richting kunnen doorgaan. De temperatuur waarbij de reactie doorgaat is meebepalend voor de snelheid van de reactie. Uiteindelijk wordt één reactieproduct, waarvan de concentratie evenredig is met de oorspron- kelijke concentratie aan onbekende (= substraat 1), fotometrisch bepaald. Bij een enzymatische reactie moet men goed weten welke substanties in het incubatiemilieu moeten aanwezig zijn: enzym(en), co-factor(en), co-enzym(en), substra(a)t(en)..., bij welke pH, ionenconcentratie en temperatuur moet gewerkt worden. De aanwezigheid van co-enzymen (vb. NADH) of co-factoren (vb. Mg2+) kan noodzakelijk zijn.  50 Addendum: Enzymatische bepaling voor meten van substraat met eindpuntmeting Blancometing methode 1 Bepaalde substanties (vb. reactieproduct 1, hier NH3) kunnen reeds in een bepaalde concentratie aanwezig zijn in een serumstaal waarin men de onbekende (= substraat 1) moet meten. Deze substanties kunnen reeds een bijdrage leveren tot de uiteindelijk te meten absorbantie. Aangezien deze bijdrage niet afkomstig is van de onbekende, is dit een interferentie en dus niet gewenst. Daarom ook een voorafgaande bepaling uitvoeren, nog voor de eigenlijke bepaling, om deze interferentie uit te sluiten. Dit is een blanco bepaling. Men brengt in de respectievelijke incubatiebuizen de reagentia, buffer, kalibratoren of het staal (serum of plasma of urine) maar men voegt enzym 1 (hier urease) niet toe. De eerste enzymati- sche reactie kan nog niet doorgaan. De daaropvolgende reacties kunnen wel doorgaan: hier: de ammoniak, die reeds aanwezig was, zal reageren met 2-oxoglutaraat en een deel van NAD(P)H omzetten tot NAD(P)+. Men meet de absorbantie van de blanco → A1 (= absorbantie 1) Daarna voegt men ook enzym 1 (hier urease) toe. Substraat 1 (hier ureum) krijgt nu pas de kans om te worden omgezet onder katalytische werking van enzym 1 en verder alle reacties te doorlopen (de ammoniak die nu gevormd wordt uit ureum zal op- nieuw NAD(P)H doen dalen door omzetting tot NAD(P)+) Men meet na een welbepaalde tijd, als de reactie is afgelopen, de absorbantie → A2. ∆A = A1 - A2 : De absolute waarde van het verschil tussen beide absorbanties, ∆A, is veroorzaakt door substraat 1 (ureum in de onbekende of standaarden). ∆A is recht evenredig met de concentratie van substraat 1. Bij deze werkwijze wordt elk staal 2x gemeten want de blanco wordt voor elk staal afzonderlijk bepaald. Blancometing methode 2 I.p.v. de blanco voor elk afzonderlijk staal te bepalen kan ook een blancoserum voor ureum (dit is een serumstaal zonder ureum) worden bepaald. Dit blancoserum moet dan ook de interfererende stoffen bevatten in een concentratie die je in serum verwacht. Dit blancoserum wordt zoals de standaarden en onbekenden onderworpen aan de bepalingsmethode. De A van dit blancomonster (A0) hangt dus af van de aanwezige interfererende stoffen en moet in principe ongeveer dezelfde waarde hebben als de A1 van elke blanco. De absorbanties van de standaarden en sera (onbekenden) na afloop van de reactie of een welbepaalde tijd noemen we Ai (individuele absorbantie) noemen. Praktisch probleem is dat een serumstaal zonder ureum niet bestaat. Men moet iets artificieel maken.  51 Besluit eindpuntmeting: wanneer de onbekende in een staal de rol krijgt van substraat 1, zoals in het bovenstaande voorbeeld, kan men dus ofwel 1 - starten met het toevoegen van alle reactiebestanddelen, behalve enzym 1, aan de buizen voor kalibratoren en stalen; meet A1 (blanco). - vervolgen met toevoegen van enzym 1 aan elke buis en na een welbepaalde tijd tot alle substraat is omgezet (vb.