KLINIČKA BIOHEMIJA I 2. parcijala 2023/24 PDF

**KLINIČKA BIOHEMIJA I** **2.parcijala -- odgovorene analitike za usmeni ispit** **2023/24** 1. **Analitika Hb** **Dijagnostika hemoglobinopatija** Koriste se razni testovi, za dokazivanje HbS služi test rastvorljivosti, gdje oksihemoglobin u prisustvu natrij sulfita prelazi u deoksihemoglobin...

**KLINIČKA BIOHEMIJA I** **2.parcijala -- odgovorene analitike za usmeni ispit** **2023/24** 1. **Analitika Hb** **Dijagnostika hemoglobinopatija** Koriste se razni testovi, za dokazivanje HbS služi test rastvorljivosti, gdje oksihemoglobin u prisustvu natrij sulfita prelazi u deoksihemoglobin. Test je kvalitativne prirode, poprilično brz i jednostavan, manjkavost mu je što ne detektuje druge vrijednsoti Hb, te se s toga ne koristi za diferencijaciju HbS, D i G. HbF se može odrediti alkalnom denaturacijom, jer su drugi hemoglobini podložniji denaturaciji od HbF na alkalnom pH. Denaturacija se zaustavlja dodavanjem amonij sulfata, a denaturirani hemoglobin se taloži, nakon čega se preostali hemoglobin F odredi spektrofotometrijski. Alkalna denaturacija je loša kod visokih koncentracija, pa se može koristiti jonoizmjenjivačka hromatografija, gdje su hemoglobini razdvojeni prema naboju na specifičnom pH. Koriste se i imunološke metode npr RIA ili ELISA gdje HbF reaguje sa specifičnim antitijelom. Hemoglobin i derivati hemoglobina se mogu određivati spektrometrijski. Oksihemoglobin se mjeri na 540nm i 578nm, deoksihemoglobin na 555nm, methemoglobin na 500nm i 630nm, a karboksihemoglobin na 537nm. Za određivanje hemoglobina u krvi koristi se cijanomethemoglobinska metoda. HbFe(2) + K3\[Fe(3)CN6\] → HbFe(3) + K4\[Fe(2)CN6\] HbFe(3) + KCN → HbFe(3)CN Nastali cijanmethemoglobin se mjeri na 540nm. Koristi se Drabkinov reagens (kalij fericijanid i kalij cijanid). Normalno je niska koncentracija hemoglobina u plazmi. Povisena kod akutne intravaskularne hemolize, a nema znacaja kod hronicnih hemoliznih bolesti. Hemoglobin se moze odredjivati u plazmi sa benzidinom, ili mjerenjem oksihemoglobina (koristi se soretova traka, mjeri se na 415nm, te na 380nm i 450nm za korekciju turbiditeta). Odredjivanje sulfhemoglobina i methemoglobina se vrsi spektrometrijski. Methemoglobin A max 630-635nm. MetHb + CN → cijanmethemoglobin (gubitak A max) Sulfhemoglobin A max 600-620nm. SulfHb + CN → cijansulfhemoglobin (ne utice na A max SulfHb) 2. **Detekcija i analitika porfirina** Porfirini se mogu određivati skrining testovima na urinu: **Watson Schwarzov test** (kvalitativan), nakon direktne reakcije urina sa Erlich reagensom (dimetilaminobenzaldehid) slijedi ekstrakcija sa organskim otapalom. Porfobilinogen + Erlich reagens → crvena boja (interferira urobilinogen) Ako se **izolira PBG** (anionski jonoizmjenjivaci, **urin se propusta kroz jonoizmjenjivac**, ako je **PBG prisutan ostaje na zidovima jonoizmjenjivača**, nakon toga se **ispire sa vodom**, **dodaje se acetatna kiselina** te se **izolira PBG**, a ako ž**elimo izdvojiti i ALA, koristi se natrij acetat te se izlaze temperaturi od 100 stepeni C 10 minuta)**, nakon **crvenog obojenja** može se kvantitativno mjeriti spektrofotometrijski na **553nm**. Takođe se mogu određivati **kvantitativnim testovima za odredjivanje porfirina (URO, PROTO, KOPRO),** kvantitativnim testovima za odredjivanje prekursora porfirina (ALA, PBG), te hromatografski. **Porfirini u bistrim otopinama mogu se mjeriti direktno preko roze fluorescencije kad se izloze UV svjetlu.** **Porfirini se mogu odrediti i u fecesu tako sto se prvo feces tretira sa HCl, sadržaj se miješa, dodaje se dietileter, ponovo se miješa, vrši se ispiranje vodom, zatim se vrši centrifugiranje. U gornjem organskom sloju su pigmenti (hlorofil, karoteni), a u donjem vodenom sloju porfirini.** Može se vršiti i **ekstrakcija protoporfirina iz eritrocita,** tako sto se **miješa uzorak krvi sa vodom, dodaje se etanol, a zatim se vrši centrifugiranje**, nakon čega **u supernatantu imamo porfirine koji fluoresciraju i detektuju se fluorimetrijski.** **Može se određivati i aktivnost porfobilinogen deaminaze.** **Hemolizat eritrocita sa PBG se inkubira na 37 stepeni C 30 minuta, zatim dodatkom TCA (trikarbonskih kiselina) i centrifugiranjem, u supernatantu dobijamo uroporfirinogen-3.** Nakon oksidacije **na zraku prelazi u uroporfirin-3,** koji se određuje fluorimetrijski. Detekcija porfirije variegata se može raditi pomoću eseja protoporfirinogen oksidaze. **Protoporfirin-9 reaguje sa natrij amalgamom i nastaje protoporfirinogen-9, nakon čega izlaganjem nitrogenu na 37 stepeni C imamo neenzimatsku oksidaciju, te zatim fluorimetrijski na HPLC određujemo protoporfirin-9.** **Tečnom hromatografijom, slobodne porfirinske kiseline i izomeri se razdvajaju prema polarnosti na sistemu reverzne faze. Detekcija se vrsi fluorescencijom**. Visoko je specificna, visoke talasne duzine. Preporucena metoda koja omogucava odredjivanje glavnih izomera specificnih porfirina. Relativni udio razlicitih izomera omogucava razlucivanje razlicitih vrsta porfirija. **Odredjivanje koproporfirina u urinu:** **Ekstrakcija se vrsi etilacetatom na pH 4.8, a uzorak urina se moze tretirati i sa slabom otopinom joda. Koncentracija se ocitava se na fluorimetru. Ocitana koncentracija se poredi sa standardom poznate koncentracije.** 3. **Analitika LDH** Odredjivanje se zasniva na primjeni osnovne reakcije koju katalizira LDH. - Rutinske metode koriste **piruvat i laktat kao supstrat. Reakcija može biti laktat u piruvat ili reverzna reakcija piruvat u laktat**, ali se posljednjih godina više koristi reakcija laktat u piruvat kao referentna metoda. Referentna metoda za određivanje ukupne LDH je ova metoda na 37 stepeni celzija. - **Vrši se kompleksiranje sa DNPH (dinitrofenilhidrazin) gdje se stvaraju obojeni produkti sa piruvatom, kada ide od piruvata ka laktatu.** - Može da se **određuje fluorescirajući NADH.** Kada oslobođeni NADH reaguje sa tetrazolijem, nastaje obojeni kompleks. Mjeri se porast apsorbance NADH na 340nm (Warburgov opticki test). Ako se mjeri reakcija piruvat u laktat, odnosno oksidacija NADH onda se mjeri pad apsorbance. - Separacija i kvantifikacija izoenzima LD se moze vrsiti elektroforezom na agaroznom gelu ili celuloza acetatu. Nakon razdvajanja izoenzima LD elektroforezom, reakciona smjesa se preliva preko potpornog medija. Oslobođeni NADH u zonama LD aktivnosti se detektuje fluorescencijom na 365nm, ili redukcijom tetrazolijum soli u plavo obojeni formazan. LD1 i LD2 su poviseni kod akutnog infarkta miokarda, a LD5 kod kongestije srca i hipoksije. Selektivna inhibicija LD2 do LD5 omogućava određivanje samo LD1. Inhibitori su 1,6-heksandiol, natrij perhlorat i gvanidin tiocijanat. Imunoprecipitacija -- antiserum (koziji) se koristi za mjerenje LD1 jer precipitira LD2 do LD5, a u supernatantu ostaje LD1. 4. **Analitika AST i ALT** **Ne mjerimo enzim, mjerimo katalitičku aktivnost, bez čije se aktivnosti reakcija ne može odvijati.**\ **Aspartat, oksoglutarat daju oksoacetat i glutamat kao keto par.** Kolorijsko -- spektrofotometrijske metode, **mjerimo aktivnost enzima** spektrofotometrijski, **ne mjerimo enzim u količini**, nego u njegovoj aktivnosti u i zato se mjeri u internacionalnim jedinicama. **[Određivanje aktivnosti AST]** Sadrži **dva para aminokiselina, supstat aspartat, koenzim** **oksidacijski NAD,** koenzim prelazi iz jednog stanja u drugo, mjerenje na **340nm**, jer **redukovana forma NADH prelazi u NAD.** **[Određivanje aktivnosti ALT]** Sadrži **dva para aminokiselina, supstart alanin, koenzim oksidacijski NAD,** mjerenje na **340nm, NADH prelazi u NAD.** 5. **Analitika nukleotidaze i GDH** **Supstrati** kod određivanja nukleotidaze su : - **adenozin-5\'-monofosfat (AMP)** - **inozin-5\'-monofosfat (IMP).** Supstrati su organski fosfatni esteri i mogu biti hidrolizirani i drugim enzimima, npr nespecifičnom ALP, te zato metode određivanja moraju da koriguju hidrolizu nespecifičnim fosfatazama. Efekat ALP na IMP je inhibiran sa beta-glicerolfosfatom. Ova supstanca je supstrat za ALP ali ne i za NTP (nukleotidazu) i time se smanjuje ALP koja bi hidrolizirala IMP. **Inozin-5\'-monofosfat djelovanjem nukleotidaze prelazi u inozin,** koji **dalje djelovanjem purin nukleozid fosfohidrolaze prelazi u hipoksantin.** **Djelovanjem ksantin oksidaze nastaje mokračna kiselina i H2O2.** **Reakcijom H2O2 i hromogena nastaju voda i obojeni hromogen koji se određuje na 510nm.** Metoda određivanja GLDH je kontinuirana. Reakcija se može određivati u oba smijera (reverzibilna). Ravnoteža forsira stvaranje glutamata. **U reakcionoj smjesi neophodan NADH. Reakcija započinje dodatkom 2-oksoglutarata**. Mjeri se smanjenje apsorbancije na **339nm.** **U reakcionu smjesu može se dodati oksamat jer inhibira aktivnost LD pa se izbjegava korištenje NADH od strane tog LD.** 6. **Analitika lipaze i amilaze** **Određivanje aktivnosti amilaze se može vršiti saharogenim, amiloklasticnim i hromolitickim metodama.** **Supstrat je skrob.** **U saharogenoj metodi djelovanjem amilaze iz skroba nastaju glukoza i maltoza.** **U amiloklasticnoj metodi skrob reaguje sa jodom i nastaje plavi kompleks, a djelovanjem amilaze prelazi u crveni kompleks.** **Brzina nestanka plavog kompleksa proporcionalna je aktivnosti amilaze.** Od novijih metoda imamo **Kaufman-tietz metodu**, gdje djelovanjem amilaze na skrob dobijamo maltotriozu, maltozu i dekstrine. **Maltotrioza i maltoza pod djelovanjem alfa glukozidaze daju glukozu.** **Djelovanjem glukozo oksidaze na glukozu nastaju H2O2 i delta-glukonolakton. U reakciji H2O2 sa hromogenom (4-aminofenazon uz prisustvo pirola, trinder reakcija) nastaje obojeni hromogen.** Kod metode **du pont aca** **djelovanjem amilaze na maltopentozu nastaju maltotrioza i maltoza**, a **djelovanjem alfa glikozidaze glukoza.** **Glukoza sa ATP i djelovanjem heksokinaze daje glukozu-6-fosfat i ADP, a zatim djelovanjem glukozo-6-fosfat dehidrogenaze na G6P i NAD nastaju 6-fosfo glukonolakton i NADH, te se mjeri pad apsorbance na 340nm.** U metodi sa **heksokinazom, amilaza djeluje na maltotetraozu i nastaje maltoza. Maltoza** **sa fosfatom uz djelovanje maltoza fosforilaze daje glukozu i glukoza-1-fosfat. G1P djelovanjem beta-fosfoglukomutaze prelazi u G6P, koji sa NAD uz djelovanje G6P dehidrogenaze daje 6-fosfat glukonolakton i NADH te se odredjuje na 340nm.** Moguca je i **metoda sa supstratom 4-nitrofenil glikozid,** koji **djelovanjem amilaze daje 4-nitrofenil glukozu, koja dalje djelovanjem alfa-glukozidaze daje zuti spoj nitrofenola koji se odredjuje na 405nm.** Osim heparina svi ostali antikoagulansi inhibiraju aktivnost amilaze tako sto vezu kalcij. Aktivnost lipaze se moze odredjivati turbidimetrijskom metodom i titrimetrijskom. Kod **titrimetrijske metode lipaza katalizira hidrolizu masnih kiselina iz emulzije oleinske kiseline. Vrsi se titracija oslobodjenih masnih kiselina sa razblazenim alkalijama, a kolicina upotrebljene alkalije se biljezi u funkciji vremena i sluzi za mjerenje stvorene kolicine masnih kiselina. Lipaza hidrolizira masne kiseline iz emulzije oleinske kiseline sa simultanim snizenjem turbiditeta reakcione smjese. Apsorbanca se mjeri na 340nm.** Promjena apsorbance u minuti je mjera enzimske aktivnosti lipaze. Lipaza se takodje moze mjeriti **spektrofotometrijski sa kompleksom pomocnih indikatorskih enzima gdje produkuje obojeni proizvod koji se mjeri na 550nm**. 1,2-diacilglicerol djelovanjem lipaze daje 2-monoacilglicerol i masne kiseline. 2-monoacilglicerol djelovanjem monoglicerid lipaze se razlazu na glicerol i masne kiseline, a glicerol dalje sa ATP djelovanjem glicerol kinaze daje glicerofosfat i ADP. Glicerofosfat djelovanjem glicerofosfat kinaze daje dihidroksiaceton fosfat i H2O2, te se zatim vrsi trinderova reakcija sa H2O2, odnosno sa 4-aminofenazonom i fenolom (ili TOOS) uz djelovanje peroksidaze nastaje obojen spoj koji se mjeri na 550nm. 7. **Analitika GGT i CK** **Za odredjivanje GGT koristi se gama-glutamil-p-nitroanilid kao supstrat i glicilglicin kao akceptor gama-glutamil ostatka**. **Djelovanjem GGT nastaje gama-glutamil glicilglicin i zuto obojeni p-nitroanilin koji se mjeri na 405nm**. **Za odredjivanje CK koristi se kreatin fosfat kao supstrat koji sa ADP djelovanjem CK daje kreatin i ATP.** **ATP i glukoza djelovanjem heksokinaze daju G6P i ADP, a zatim G6P sa NADP djelovanjem G6PD daje 6-fosfoglukonat i NADPH koji se mjeri na 339nm.** **CK se moze odredjivati i bioluminiscentnim metodama koje imaju vecu osjetljivost od spektrofotometrijskih metoda.** U ovoj metodi, **kreatin fosfat sa ADP djelovanjem CK daje kreatin i ATP, a zatim ATP sa luciferinom djelovanjem luciferaze daje AMP i oksiluciferin. Kao metoda separacije i kvantifikacije izoenzim**a **CK** koristi se **elektroforeza**, gdje se kao **potporni medij koriste agar, agaroza ili celuloza acetat**, a **detekcija izoenzima se vrsi sa NADPH fluorescentnom metodom na 360nm** ili bojenom reakcijom sa tetrazolijum solima pri cemu **nastaje obojeni formazan**. **Odredjivanje izoenzima CK miokarda imunoinhibicijom se odvija u 2 faze, gdje u prvoj fazi imamo imunoinhibiciju sa antitijelom na M podjedinicu, a u drugoj fazi odredjivanje aktivnosti B podjedinice.** Moze se odrediti i masena koncentracija CK miokarda, gdje se koristi sendvic tehnika sa 2 antitijela, jedno za B podjedinicu, drugo za M podjedinicu. Prvo antitijelo je imobilizirano za matrix, a drugo konjugovano sa enzimom kao markerom. Ovdje se mjeri samo CK-MB a ne druge 2 izoforme. Ova metoda je osjetljivija jer mjeri masenu koncentraciju. 8. **Analitika ALP i KP** Kod odredjivanja **ALP supstrat je 4-nitrofenilfosfat koji djelovanjem ALP prelazi u bezbojni 4-nitrofeniloksid, koji dalje u alkalnim uslovima prelazi u zuto obojenu formu i mjeri se na 405nm.** Za separaciju izoenzima ALP koristi se elektroforeza. Nakon elektroforeze ALP zone se boje tako sto se gel inkubira sa 1-naftilfosfatom kojem se dodaje hromogen dijazonijum so. Ako se koristi celuloza acetat, boja se nanosi pomocu agar gela koji sadrzi sistem za bojenje. Jetrena ALP se krece brze prema anodi, kostana ALP daje vise difuznu zonu i ima redukovanu anodnu pokretljivost, intestinalna ALP migrira dosta sporije nego kostana, a placentarna ALP daje usku traku obicno preko kostane. Kao alternativa elektroforetskom razdvajanju kostane od jetrene ALP moze se koristiti i uporedno odredjivanje enzima GGT koji je povecan samo u bolestima jetre. Inkubacija seruma sa neuromidazom preko noci se koristi kao dokaz prisustva intestinalne ALP. Ovaj tretman redukuje anodnu pokretljivost svih formi ALP osim intestinalne. Kod odredjivanja prostaticne ACP tartarat inhibira osjetljivu prostaticnu grupu ACP, a ostala aktivnost se mjeri i oznacava kao neprostaticna ACP, te iz razlike ukupne i neprostaticne ACP dobijamo vrijednost prostaticne ACP. ACP se moze odredjivati i sa 4-nitrofenilfosfatom kao supstratom, koji se razlaze na fosfat i nitrofenol. Reakcija se odvija u kiseloj sredini i prekida se dodatkom alkalije. Mjeri se apsorbanca 4-nitrofenola na 405nm. 9. **Analitika holinesteraze** Supstrati za odredjivanje aktivnosti serumske holinesteraze su soli joda acetiltioholina, propioniltioholina, butiriltioholina, benzoiltioholina i sukciniltioholina. Oslobodjeni tioholin reaguje sa elmansovim reagensom (DNTB) i nastaje 5-MNBA (5-merkapto-2-nitro benzoeva kiselina) i mjeri se na 410nm. 10. **Testovi bilijarne ekskrecije** Slobodni nekonjugirani bilirubin je rastvoriv u mastima i ne prolazi glomerularne filtre pa ga nema u urinu. Konjugirani bilirubin je rastvoriv u vodi i filtrira kroz glomerule, jedan dio se reapsorbuje u tubulima a ostatak tamno oboji urin. Direktni bilirubin se dokazuje test trakom i diazo reagensom u urinu. Ako urin stoji na zraku, boja prelazi u zelenu zbog oksidacije bilirubina u biliverdin. Izolovani porast bilirubina u serumu (bez povisenih enzima) vidja se kod familijarne zutice ili hemolize. Kod nekonjugovane hiperbilirubinemije nema bilirubina u urinu. U slucaju potpune opstrukcije je bijela stolica. Kod hepatitisa moze biti svjetlije boje ali nikada bijela. 11. **Određivanje bilirubina u serumu** Bilirubin se u serumu moze odredjivati spektrofotometrijski. U mikrokivetu debljine 10mm se otpipetira 1ml fosfatnog pufera i 20 mikrolitara seruma. Na spektrofotometru se mjeri apsorpcija probe prema cistom puferu na 454nm i 540nm. Princip ove metode je da je apsorpcija bilirubina u serumu na 454nm razmjerna njegovoj koncentraciji. Da bi se korigovala apsorpcija hemoglobina na toj talasnoj duzini, mjeri se i apsorpcija na 540nm i oduzme od ocitane apsorbance na 454nm, jer je apsorpcija hemoglobina na obe talasne duzine ista, pa ce razlika odgovarati apsorpciji samog bilirubina. Bilirubin se takodje moze odredjivati diazo reakcijom. Ukoliko zelimo odrediti ukupni bilirubin, onda je potrebno dodati akcelerator kafein-benzoat. Reakcijom sa diazotiranom sulfanilnom kiselinom nastaju azobilirubin izomeri koji apsorbuju na 600nm. 12. **Određivanje bilirubina u urinu** Obzirom da se normalno samo konjugirani bilirubin izlucuje u urinu, njegova prisutnost ukazuje na konjugiranu hiperbilirubinemiju. U tom slucaju je urin tamnije boje sa karakteristicnom zutom pjenom. Ako urin dugo stoji na zraku, boja prelazi u zelenu zbog oksidacije bilirubina u biliverdin. Za dokazivanje bilirubina u urinu koristi se testna traka impregnirana diazo reagensom. Lijekovi koji boje urin crveno ili su crveno obojeni u kiselom mediju, kao npr fenazopiridin, mogu dati lazno pozitivnu reakciju. Velike kolicine askorbinske kiseline smanjuju osjetljivost reakcije. U praksi se bilirubin rijetko dokazuje u urinu. 13. **Određivanje urobilinogena u urinu i stolici** Povecana kolicina urobilinogena u urinu nalazi se kad je hepatocelularna funkcija smanjena ili kada postoji visak urobilinogena u gastrointestinalnom traktu koji premasuje kapacitet jetre da ga ponovo izluci. Primjeri su virusni hepatitis, ciroza i hemoliza. Ako je bilijarno izlucivanje bilirubina poremeceno, izlucivanje urobilinogena u urin se smanjuje zbog ogranicenog dotoka u crijevo. Stolica je bijela poput krede kod bolesnika sa holestatskom zuticom kada nema urobilinogena. Danas je dokazivanje urobilinogena od male pomoci u procjeni jetrene bolesti. Za dokazivanje urobilinogena u urinu koristi se testna traka impregnirana diazo reagensom. Koncentracija nitrita veca od 50mg/L ili prisustvo formaldehida dovode do smanjenja boje testne trake. 14. **HPLC bilirubin frakcije** HPLC analiza ukazuje na 4 distinktne forme bilirubina u serumu, a to su alfa bilirubin (nekonjugirani oblik), beta bilirubin (mono-konjugiran sa glukuronskom kiselinom), gama bilirubin (dikonjugiran sa glukuronskom kiselinom) i delta bilirubin (ireverzibilno vezan za protein). Samo beta, gama i delta frakcije su rastvorive u vodi, te zato korespondiraju sa direktnim bilirubinom. Alfa bilirubin se rastvara putem alkohola i prisutan je sa svim drugim podfrakcijama u frakciji indirektnog bilirubina. 15. **Određivanje tumor markera,izazovi, prednosti i nedostatci metoda** Tumorski markeri se odredjuju imunohemijskim metodama s obiljezivacima sto podrazumjeva sve obiljezivace (enzimi, fluorescentne tvari, hemilumiscentne tvari), a moze se odredjivati i metodama molekularne biologije. Postoji nemogucnost standardizacije metoda za odredjivanje tumorskih markera kao i harmonizacije referentnih intervala za ove analite. Jos jedan bitan problem je razlika u specificnosti antitijela koja se primjenjuju u postupku odredjivanja pojedinog tumorskog markera, losa mogucnost kalibracije i razlicitost oblikovanja samog postupka za odredjivanje tumorskog markera. Osim toga, referentna metoda za odredjivanje tumorskih markera ne postoji, kao ni potvrdjeni referentni materijal za veci dio tumorskih markera. Prema tome, referentni intervali za tumorske markere znatno ovise o primjenjenoj metodi. 16. **Analitika ukupnih proteina** Kod kjeldahove metode, u uzorak dodajemo toplu sumpornu kiselinu, te dobijamo amonijak jone koje titriramo sa nesslerovim reagensom (KI/HgCl2/KOH), nakon cega dobijamo koncentraciju protein nitrogena koju pomnozimo sa 6.25 da bi dobili koncentraciju ukupnih proteina. Odredjivanje direktnom fotometrijom se vrsi mjerenjem apsorpcije na 280nm (zbog aminokiselina tirozin i triptofan, jer je to njihov Amax) ili na 200nm (zbog peptidnih veza, jer je to njihov Amax). Kod lowry metode dodaje se fosfotungstat ili fosfomolibdat koji reaguju s aminokiselinama tirozin i triptofan i nakon redukcije nastaje plavo obojenje koje se mjeri na 600nm. Nekada se lowry metoda koristi u kombinaciji sa biuret metodom, a 100 puta je osjetljivija od biureta. Trazi purifikaciju zbog interferenci. Ukupni proteini se najcesce odredjuju biuret metodom. U ovoj reakciji bakarni jon u alkalnoj sredini reagira sa peptidnim vezama proteina u osnovnom rastvoru gradeci plavo obojene komplekse koji pokazuju Amax na 540nm. Kalij natrij tartarat se doda na kompleks i stabilizira bakarne jone. Jodid se dodaje kao antioksidans. 17. **Analitika albumina** Albumin je najzastupljeniji protein u serumu. Albumin je protein anion i reagira sa anionskim bojama. BCG Amax na 628nm i BCP Amax na 603nm (bromkrezol zeleno i ljubicasto). Vezanje za BCG i BCP nije specificno jer i drugi proteini imaju aspartat i glutamin ostatke, ali citanje apsorbance u roku 30 sekundi povecava specificnost. 18. **Osnove elektroforeze i njen značaj u analitici proteina** Elektroforeza se zasniva na kretanju nabijenih molekula u elektricnom polju, V=Eq/f, gdje je V brzina kretanja molekula, E elektricno polje u volt/cm, q ukupan naboj, a f frikcioni koeficijent (ovisi od mase i oblika molekula). Separacija plazma proteina se moze vrsiti na agaru, celuloza acetatu, papiru, skrobu. Nabijene molekule se krecu kroz medij zbog snage koju ispoljava elektricno polje. Faktori koji djeluju na mobilnost makromolekula su naboj i konformacija, jonska atmosfera i potencijal zeta (joni suporotnog naboja koji se koncentrisu oko makromolekula stvaraju dvostruki sloj naboja = jonska atmosfera), zatim efekat relaksacije (iregularno kretanje u skokovima, smanjena mobilnost), te elektroforetski efekat (joni u vodi hidrirani, elektroliti se krecu u suprotnom smjeru i nose rastvarac sa sobom - elektroosmoza). Naboj i mobilnost karakteristika je svakog jona. Ako rastvor sadrzi supstancu ciji pKa je blizu pH otopine, supstanca postoji u nabijenom stanju i u stanju bez naboja. Kada je pH=pKa samo 50% cestica ce imati naboj. Ako je pH za jedinicu ispod, 90% cestica je bez naboja, a ako je pH za jedinicu iznad, 90% cestica ce imati naboj. Efektivni naboj supstance varira sa pH te i mobilnost supstance mora varirati sa pH. Kod proteina, na niskom pH su visoko pozitivni, na specificnoj visoj pH su nula, a na alkalnoj pH negativni. Izoelektricna tacka je pH na kojem molekula nema naboj. Rastvori moraju biti puferovani da se odrzi konstantnost pH, a pH pufera se odabire za postizanje optimalnog net naboja prilikom separacije. Za proteine raspon pH 7 do 9, serumski proteini 8,6. Provodljivost predstavlja sumu koncentracija pomnozenu sa efektivnom mobilnosti svih prisutnih jona. 19. **Optimizacija elektroforeze** Optimalne elektroforetske separacije moraju izbalansirati izmedju brzine i rezolucije. Visoki napon povecava brzinu, a toplota izaziva evaporaciju pufera i moze denaturirati proteine. Pufer visoke jonske jacine povecava provodljivost, ali stimulira efekte endoosmoze. Ako se poveca koncentracija soli, raste provodljivost, treba podesiti napon tj. umanjiti ga. Pad napona uzrokuje redukciju nabijenih cestica, te usporeno kretanje, pa duze treba za separaciju. Zato imamo pad rezolucije zbog povecane difuzije. Povecanjem provodljivosti na fiksiranom naponu raste jacina struje, raste elektricna toplota, dolazi do denaturacije. 20. **Efekat endoosmoze** Endoosmoza ili elektroosmoza je efekat kretanja tecnosti koje se desava pod utjecajem napona. Nosac ne smije ulaziti u interakciju sa molekulama. Npr agaropektin ima veliki broj COOH grupa, a u neutralnom pH se stvara puno kontrajona. Aplikacija napona dovodi do kretanja kontra jona, a COOH grupe se nece kretati, dok se solvent krece u jednom smjeru. Veliki, visoko nabijeni proteini migriraju prema elektrodi sa slicnim nabojem. 21. **Analitika serumskog željeza** Serumsko zeljezo je zeljezo vezano za transferin seruma i ne ukljucuje zeljezo u sklopu slobodnog hemoglobina. Odredjuje se spektrofotometrijski. Prvo se vrsi odvajanje zeljeza od transferina deterdzentima ili kiselinama. Zatim se vrsi redukcija Fe(3) u Fe(2) (npr pomocu hidrazina). Nakon toga se stvara kompleks zeljeza i hromogena, tj. zeljezo reagira sa organskim spojevima koji sadrze reaktivnu feroinsku skupinu i stvara se obojeni produkt. 22. **Određivanje TIBC i UIBC** Rutinski test za ispitivanje statusa zeljeza je transferin testiranje, poznato pod imenom TIBC (ukupni kapacitet vezanja zeljeza). Visok nivo ukazuje na nizak sadrzaj zeljeza u organizmu, a nizak nivo na prepuna skladista. Najbolji serumski marker za pracenje rasta koncentracije zeljeza u organizmu. UIBC i TIBC se odredjuju dodavanjem dovoljno Fe(3) za postizanje saturacije transferina. Visak zeljeza se ukloni apsorpcijom sa magnezij karbonatom. Ponovi se esej i odredjivanje ukupnog kapaciteta se radi po istom principu kao sto se odredjuje zeljezo (odvoji se zeljezo od transferina, pa se reducira i onda se oboji hromogenom i odredi spektrofotometrijski). 23. **Određivanje i klinički značaj feritina** Nizak nivo feritina u serumu je indikator deficita zeljeza (visoka specificnost). Ukoliko je visok nivo u serumu, imamo opterecenje zeljezom. Feritin moze rasti u serumu i u drugim stanjima, kao sto su hepatitis, infekcija i slicno. Niski nivoi uvijek znace deficit zeljeza, ali drugi faktori mogu zamaskirati ovaj deficit. Feritin raste i kod hemohromatoze (defekt u HFE genu, povecana aktivnost feroportina, povecana apsorpcija zeljeza u crijevima). Odredjuje se imunohemijskim metodama s obiljezivacima (npr IRMA). 24. **Analitika bakra** Najveci dio bakra je u serumu vezan za ceruloplazmin i mora se prvo odvojiti da bi mogao reagirati s reagensima. Bakar se oslobadja zakiseljavanjem i deproteinizacijom, a zatim se provodi reakcija s reagensima (npr ditizon). S obzirom da je bakar jako rasiren, treba paziti da ne dodje do kontaminacije uzorka bakrom iz okolisa. Obicno se odredjuje atomskom apsorpcijskom spektroskopijom, ali mogu se koristiti i druge metode poput fotometrijske. 25. **Analitika i klinički značaj određivanja ceruloplazmina** Ceruloplazmin sadrzi bakar (vecina bakra vezanog u plazmi) i sintetise se u jetri. Koncentracija je smanjena u wilsonovoj bolesti, cirozi, hepatitisu. Moze biti povecana i u upali, hemohromatozi i holestazi. Odredjuje se imunonefelometrijom i imunoturbidimetrijom, ili preko aktivnosti oksidaze (superoksid dizmutaza u eritrocitima ili citohrom c oksidaza u trombocitima/leukocitima), pri cemu je aktivnost enzima znacajno reducirana kod deficita bakra. Specificna enzimska aktivnost ceruloplazmina (omjer enzimski aktivnog i imunoreaktivnog) je osjetljiviji pokazatelj statusa bakra u tijelu od odredjivanja koncentracije bakra u serumu.