Presentación UT1 Análisis Bioquímico PDF

LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO ANÁLISIS BIOQUÍMICO UD 1 Técnicas de laboratorio de bioquímica clínica (I) 1 ÍNDICE 1 Introducción a las técnicas de bioquímica clínica 2 Las técnicas espectrométricas CONTENIDOS DIGITALES 3 Espectrometría de ab...

LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO ANÁLISIS BIOQUÍMICO UD 1 Técnicas de laboratorio de bioquímica clínica (I) 1 ÍNDICE 1 Introducción a las técnicas de bioquímica clínica 2 Las técnicas espectrométricas CONTENIDOS DIGITALES 3 Espectrometría de absorción molecular Los contenidos digitales de esta presentación son propiedad de la empresa Acciones Formativas de Calidad SL. y han sido desarrollados por su equipo 4 Espectrometría de docente. absorción atómica Se basan en los contenidos propios elaborados por el profesorado del centro, así como del libro “ Análisis Bioquímico“ de la editorial Altamar, que es el libro guía de 5 Espectrometría de nuestro alumnado para esta asignatura complementando estos contenidos emisión atómica digitales. 6 Espectrometría de Así mismo, pueden contener alguna cita, gráfico, imagen , videos o enlaces luminiscencia obtenidos de contenidos públicos y libres de internet sin restricción para uso manifestada. 7 Espectrometría de dispersión de la radiación 8 Refractometría de líquidos 9 Fotometría de reflectancia. Química seca 2 1 INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS DE BIOQUÍMICA CLÍNICA La bioquímica clínica estudia los procesos metabólicos y moleculares que suceden en nuestro organismo. Estos procesos se estudian en la salud y en la enfermedad. En la bioquímica clínica se utilizan muestras biológicas (sangre, orina, heces, etc) y se aplican métodos químicos y bioquímicos para determinar las magnitudes bioquímicas. Las magnitudes bioquímicas son aquellos signos clínicos, con valores cuantitativos de la química de los procesos metabólicos que nos ayudarán a conocer el estado clínico de un paciente. Si conocemos estas magnitudes bioquímicas podremos saber si hay alteraciones de los valores que se consideran normales, por ej. Glu: 60-120 mg/dl, lo que puede asociarse a procesos patológicos o una variación provocada por un medicamento (actuación terapéutica). Ej. [Glu] > 140 mg/dl en embarazada, indica diabetes gestacional Antes de conocer todos los tipos de determinaciones, deben conocerse los principios básicos, de las técnicas instrumentales que se usan en bioquímica clínica. 3 2 LAS TÉCNICAS ESPECTROMÉTRICAS 2.1 Las radiaciones electromagnéticas. Conceptos básicos 2.2 Interacción radiación-muestra y principales técnicas espectrométricas 2.3 Instrumentación: el espectrofotómetro 4 2 LAS TÉCNICAS ESPECTROMÉTRICAS Técnicas espectrométricas: utilizan la medición de la radiación electromagnética al interaccionar con una muestra. Se pueden usar para obtener información: -Cualitativa (qué analito hay presente en la muestra) -Cuantitativa (qué cantidad de analito hay en la muestra) Las principales radiaciones electromagnéticas que se usan en estas técnicas son: -Luz visible (VIS) -Luz ultravioleta (UV) -Luz infrarroja (IR) 5 2.1 Las radiaciones electromagnéticas. Conceptos básicos -La radiación electromagnética es una de las formas en las cuales se manifiesta la energía. -Las radiaciones se pueden describir como: -Partículas: fotones. -Ondas: son oscilaciones producidas por campos eléctricos y magnéticos que vibran en direcciones perpendiculares entre sí y se propagan a través del espacio. Además se pueden propagar en el vacío, siendo su velocidad c=3.108 m/s. 6  Magnitudes de las ondas electromagnéticas Amplitud (A): Desviación máxima de la onda con relación a su valor medio o posición de equilibrio. Longitud de onda (λ): Distancia que separa dos crestas sucesivas de la onda. Se suele expresar en nm. Frecuencia (ν): Número de oscilaciones o frentes de onda que pasan por segundo. Se suele expresar en Hz o s-1. La λ es inversamente proporcional a la ν. Cuanto menor λ, mayor es la ν. 7  Fórmulas que relacionan conceptos: Frecuencia (ν ): inversa a la longitud de onda (λ ), es decir, una onda que presente una 𝒄 𝝂= distancia entre crestas elevada, tendrá menor frecuencia y viceversa. 𝝀 Energía (E ): se relaciona con la frecuencia a través de h (constante de Planck=6,63.10-34 J.s) 𝒄 E = 𝒉. 𝝂 =h. y también es inversamente proporcional a la longitud de onda, es decir, una onda de elevada 𝝀 λ, tendrá una baja energía. 8  El espectro electromagnético Todas las radiaciones que hay dentro de la naturaleza forman el espectro electromagnético. Podemos ver cómo las ondas con mayor frecuencia (menor λ) son más energéticas (y dañinas) como la radiación gamma y las de menor frecuencia (mayor λ) son menos energéticas (menos dañinas para el ser humano), como las ondas de radio. La luz visible (la que el ojo puede percibir), está situada entre 380-750 nm. 9 2.2 Interacción radiación-muestra y principales técnicas espectrométricas La radiación incide Pérdida de intensidad de la sobre una sustancia radiación al atravesar la sin producirse sustancia. Las moléculas o pérdidas de energía ni partículas absorben radiación cambios de dirección (ganan energía), pasando a un estado excitado. El haz de radiación choca El haz de luz incide sobre contra una partícula en una superficie, se produce un suspensión y cambia de efecto rebote y cambia de dirección sin cambiar su dirección. energía. El haz de luz se desvía al pasar por el extremo de una superficie o al atravesar una rendija 10  Las moléculas o átomos en estado excitado liberan la energía y vuelven a su estado de reposo 11 2.3 La instrumentación: el espectrofotómetro Independientemente del tipo de proceso que se quiera estudiar (absorción, emisión, dispersión, etc), los instrumentos utilizados para estudiar la interacción de la luz con la materia tienen una serie de componentes comunes: Fuente de luz Muestra Detector Elementos ópticos: Tratamiento y Espejos, lentes, rendijas, selector de λ lectura de señales 12 El espectrofotómetro es el instrumento que se utiliza en las técnicas de espectrofotometría. Tiene un diseño muy variable, dependiendo de la técnica, pero hay elementos comunes a todos los espectrofotómetros: -Fuente de radiación. -Monocromador -Cubeta -Detector de la radiación -Sistema de registro y lectura 13  Cada lámpara tiene una vida útil limitada, por lo que se debe vigilar periódicamente. Las subidas y bajadas de tensión de forma brusca afectan a su Fuente de radiación funcionamiento Este componente proporciona la energía radiante de forma continua y estable. Fuente Región de λ (nm) Aplicación Lámpara de arco Xe 250-800 Fluorescencia (xenón) o Hg a alta presión Fuentes continuas Lámpara de H2 y D2 220-360 Absorción molecular UV (proporcionan un espectro (deuterio) contínuo) Lámpara de W 350-2200 Absorción molecular VIS y (wolframio)/Tungsteno el UV próximo, IR Lámpara de W y halógeno 240-2500 Absorción molecular UV- VIS, IR Lámpara de cátodo hueco UV-VIS (depende del Absorción atómica material del cátodo) Fuentes de líneas Lámpara vapor de sodio Depende si es alta presión Absorción atómica (proporcionan un espectro o baja presión de líneas) Lámpara de vapores de Depende del tipo de Absorción atómica Hg lámpara Láser Monocromática, sin ancho Absorción molecular, Fuentes de luz láser de banda fluorescencia, etc 14  El monocromador Monocromador: dispositivo óptico que permite seleccionar y transmitir una radiación monocromática a partir de luz generada por la fuente emisora (produce una amplia gama de λ) Propiamente dicho, el monocromador es el selector de longitud de onda, el cual seleccionará una λ de entre todas las λ que le llegan a través de la rendija de entrada, la que nos interesa y esta será transmitida para llegar a nuestra muestra. 15 La rendija de entrada evita la entrada de luz difusa. Estas rendijas pueden ser lentes colimadoras que colectan los rayos de luz y los enfocan de forma que la luz pasa siendo un rayo organizado de luz paralela. 16 El rayo organizado de luz paralela pasa al selector de longitud de onda, que modifica la longitud de onda de la radiación a la que se haya programado. Los selectores se caracterizan por el ancho de banda que pueden seleccionar. Cuanto más estrecho sea este ancho de banda, más pura será la radiación que incida sobre la muestra y más exactos serán los valores de absorbancia obtenidos. Hay 2 tipos de selectores: -Filtros: compuestos por un material que transmite selectivamente una longitud de onda y absorbe todas las demás. Se suele utilizar en fotómetros. Tipos: -Filtros de absorción: vidrios de colores que absorben todas las λ excepto la de su color. -Filtros de interferencia: solo dejan pasar las ondas que están en fase con un cristal dieléctrico que forma el filtro. Son filtros que eliminan las posibles interferencias de la medida. Son más caros pero más precisos. 17 -Monocromadores: contienen el elemento dispersante que descompone la luz blanca que le llega, en varios colores, se usan en los espectrofotómetros, hay 2 tipos: -Red de difracción: consiste en una placa metálica o un vidrio con un gran número de estrías paralelas, que reflejan la luz en todas las direcciones (el tamaño de estas estría determina la bandas espectral (intervalo de λ) en que se divide la luz. -Prisma de refracción: consiste en un prisma en el que, cuando incide la luz sobre las dos superficies transparentes se produce una doble refracción, descomponiéndose la luz. 18 Desventaja de fotómetros (o colorímetros) respecto a los espectrofotómetros: en estos últimos se puede seleccionar cualquier λ de trabajo con un solo sistema de dispersión, combinado con lentes y rendijas; pero en los fotómetros se necesitan tantos filtros como λ con las que se quiera trabajar. Finalmente, en la rendija de salida, se deja pasar la parte de radiación seleccionada por la red o prisma, y dirige este haz sobre la cubeta que contiene la muestra. A la hora de diseñar un equipo y establecer la anchura de las rendijas se debe llegar a un compromiso entre el intervalos de λ seleccionado y la intensidad de la luz. La rejilla debe ser lo suficientemente estrecha para que cumpla la ley de Lambert Beer, pero también lo suficientemente ancha para que la cantidad de luz que atraviesa la muestra se pueda detectar con suficiente sensibilidad. 19  La cubeta Es el recipiente que contiene la muestra para su medición. Suelen tener un acho de 1 cm y pueden ser de volúmenes variables. Se fabrican en materiales que no absorban la λ deseada. Tipos: -Según el material de fabricación: -Vidrio o plástico: si trabajamos con luz VIS. -Cuarzo: si se trabaja con luz UV. -Según su forma (casi todas son rectangulares), al menos 2 caras deben ser transparentes y estar suficientemente pulidas para evitar los fenómenos de dispersión. -Existen cubetas de flujo continuo, en las que la medida se lleva a cabo mientras la disolución circula a través de ellas. Se suelen usar a la salida de los cromatógrafos para detectar los componentes que se van separando. 20  Detector Los detectores están basados en el efecto fotoeléctrico: los fotones inciden sobre el material y originan la liberación de electrones, produciendo una corriente eléctrica proporcional a los fotones recibidos. Es decir, se basan en la transformación de la señal luminosa en una señal eléctrica. Tipos: Fototubos Fototubos multiplicadores Fotodiodos Detectores de carga acoplada 21  Sistema de registro y lectura Esta señal eléctrica mínima proporcionada por el detector, se amplifica y se transforma en una señal digital, posteriormente, en el sistema de registro. El sistema de lectura (informático) interpreta el resultado que llega del sistema de re gracias a su software, realiza los cálculos necesarios, usando curvas de calibración y obtiene los datos de concentración. 22  Tipos de espectrofotómetros Según la disposición de sus componentes: -Espectrofotómetro de haz simple: es el que hemos estudiado. -Espectrofotómetro de doble haz: a la salida de la lámpara hay un sistema óptico que divide el haz de luz hacia un blanco y hacia la muestra a la vez, de forma que tenemos una medida del blanco por cada medida de la muestra. En el tiempo: tienen un chopper, el cual tiene capacidad reflectante y obliga a la radiación procedente de un monocromador a seguir alternativamente dos direcciones, una que atraviesa la cubeta con el blanco y otra atraviesa la cubeta con la muestra. Después las radicaciones se reorientan para que lleguen al mismo detector, que mide alternativamente las intensidades de ambas. En el espacio: todos los componentes están duplicados menos la lámpara, dos haces de luz pasan al mismo tiempo a través de los componentes separados en el espacio. 23 3 ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR 3.1 La absorción molecular 3.2 La ley de Lambert-Beer 3.3 Instrumentación: espectrofotómetro UV-VIS 3.4 Curvas de calibrado 3.5 Mediciones a punto final, cinéticas y enzimáticas 3.6 Espectrometría de absorción molecular en el infrarrojo 24 3 ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN MOLECULAR Se basa en medir la disminución de la intensidad de un haz de luz debida a la absorción molecular. Las moléculas tienen capacidad para absorber una parte de la radiación que reciben, la radiación que no se absorbe es transmitida. Las λ que cada sustancia absorbe son características de la molécula y se pueden usar para identificarla. Se puede hacer un análisis: Cuantitativo: se usa radiación UV-VIS. Nos da información de las magnitudes bioquímicas comparando la radiación absorbida por una solución que contiene una [ ] desconocida de una molécula con una que contiene una [ ] conocida de la misma molécula. Cualitativo: usa la radiación IR y se suele usar para analizar la composición de cálculos urinarios. 25 3.1 La absorción molecular Cuando los fotones de la luz inciden sobre una muestra, sus electrones (que en condiciones normales están en estado fundamental=E mínima), pasan a un estado de energía más alto (estado excitado), Esto se manifiesta como una disminución de la intensidad de la luz. Cuando la radiación electromagnética interacciona con los átomos, las transiciones energéticas solo se producen entre niveles electrónicos bien definidos, obteniéndose espectros de líneas. Cuando la radiación electromagnética interacciona sobre moléculas, las transiciones electrónicas se producen entre los diferentes niveles vibracionales obteniéndose espectros de bandas. 26  Transmitancia, absorbancia y espectro de absorción Transmitancia (T): es el cociente entre la intensidad de la luz incidente (I0) y la luz transmitida (It) (cuando atraviesa un material, en este caso, una disolución contenida en una cubeta. No tiene unidades: -Si su valor es 0 o (0%): no se transmite la luz, por lo que la absorción será total. -Si su valor es 1 o (100%): se transmite toda la luz, por lo que no hay absorción. Absorbancia (A): es el logaritmo inverso de la transmitancia: Si se expresa en %: A=- (log (%T)/100)= -log (%T)- (-log 100)= 2-log (%T) 27 Los espectrofotómetros miden la transmitancia, pero efectúan el cálculo matemático para obtener los valores de absorbancia. Cuando se estudian las absorbancias para un rango de longitudes de onda, se obtiene el Espectro de absorción, este es el conjunto de bandas (o transiciones electrónicas) que indicarán la cantidad de luz absorbida por una sustancia dependiendo de la λ; este espectro es carácterístico de cada sustancia. 28 3.2 La ley de Lambert-Beer A=ԑ.b.c Nos sirve para medir la concentración de analitos en disolución, A=absorbancia, no tiene unidades ԑ=coeficiente de extinción molar o coeficiente de absorción. Cada compuesto tiene el suyo propio a unas determinadas λ, pH, Tª, solventes, etc. Se mide en l/(mol.cm) b=longitud recorrida por la luz en la cubeta que contiene la disolución con la muestra. Se mide en cm (suele ser 1 cm) c=concentración de la molécula absorbente en la disolución. Se mide en mol/l Existen dos grupos de enlaces que van a determinar el ԑ de cada sustancia: -Grupos cromóforos: enlaces químicos que absorben radiación UV-VIS: son los radicales etileno, carbonilo, tiazólico, imino, azoico, nitroso, nitro y quinona. -Grupos auxocromos: enlaces químicos que no absorben luz pero provocan que se desplace la λ a la que absorbe un grupo cromóforo, son los radicales hidroxilo y amino. 29  Linealidad y desviaciones de la ley de Lambert-Beer La linealidad se cumplirá en un rango de concentraciones entre las cuales existe una relación lineal entre la c y la A. Fuera de los límites de la linealidad las [ ] son falsas. Cuando esto sucede hay que diluir la muestra para que su [ ] quede dentro de los límites de la linealidad. Suele suceder en [ ]>0,01M. Como ԑ es cte y conocido para cada sustancia, si conocemos la Abs (porque la medimos), haciendo una extrapolación podemos conocer la concentración (análisis cuantitativo). Por otro lado, si conocemos la concentración y medimos la absorbancia, podremos saber el ԑ de cada sustancia e identificarla (análisis cualitativo) 30 Alteraciones de la ley de Lambert-Beer: Desviaciones instrumentales debidas a: Alteraciones en la luz incidente, debido a que la luz no sea monocromática, por lo que siempre habrá que usar un sistema selector de λ. Errores en la rendija de salida La cubeta. Es necesario elegir correctamente el material de la cubeta, el grosor, ver que está limpia, sin golpes, etc. El detector. Si le llega luz procedente de lugares diferentes a la fuente de luz, habrá errores. Desviaciones químicas debidas a: pH de la disolución Si la absorbancia del disolvente es > que la del soluto Si hay interferentes que absorben en la misma λ. Si hay fluorescencia Si se producen reacciones químicas entre compuestos que dan lugar a otros cromógenos. 31  3.3 Instrumentación: espectrofotómetro UV-VIS Pueden ser de doble haz o de haz simple VIS UV Red de difracción Suelen trabajar en un intervalo de transmitancia: 10% < (T%)< 80% que corresponde a unas absorbancias de 0,1< A< 1,0 32  Manejo del espectrofotómetro UV-VIS El manejo depende del fabricante, pero por norma general: 1. Puesta en marcha: encender el aparato y esperar unos 20-30 minutos de calentamiento de las lámparas. 2. Selección de la longitud de onda. 3. Selección del modo de medida: absorbancia o transmitancia 4. Selección de la lámpara 5. Ajuste del 0% de transmitancia (corrientes oscuras) 6. Selección de la curva de calibración adecuada a la muestra a medir (incluirá el blanco de reactivos que tiene el 100% T). 7. Medición de la muestra problema. 33  3.4 Curvas de calibrado Debido a que en la ley de Lambert-Beer hay desviaciones, muchas veces no se puede aplicar directamente. Normalmente en una muestra no existe solo la sustancia a analizar, sino que también hay otras que pueden interferir, además el disolvente también presenta su propia absorbancia. Por todo ello, antes de hacer la medición espectrofotométrica debemos hacer otras mediciones: Medición de la absorbancia que se debe a las corrientes oscuras o radiaciones, es decir, luz que no procede de la fuente de radiación. Esto es el 0% de T. Medición de la absorbancia debida a la composición de la cubeta, el disolvente y otros reactivos usados. Esto es el 100% de T. Esto se conoce como blancos, y son el blanco de la cubeta y el blanco de reactivos, lo que nos dará una línea basal de absorbancias, y que nos dejarán la ley de Lambert-Beer como: 34 Es importante conocer los procedimientos de calibración, que serán: Mediante un factor de calibración: Básicamente consiste en obtener una disolución patrón de concentración conocida y mediante una representación gráfica se obtiene una recta cuya pendiente es el factor de calibración K, y la ordenada en el origen es el blanco de los reactivos. Una vez obtenida, en la recta se extrapola el valor de la concentración de la muestra problema a partir de la absorbancia medida con el espectrofotómetro. Siendo: Cm, la concentración de la muestra problema. K, factor de calibración =Cp/Ap (concentración y abs patrón) Am, absorbancia de la muestra Ab, absorbancia del blanco Construyendo una curva de calibrado: Partimos de un patrón inicial, que se va diluyendo y se van determinando los valores de absorbancia correspondientes, como mímino debemos obtener 3 puntos para poder trazar la curva de calibración. Una vez ensayadas las soluciones problema, su concentración se averigua por interpolación en la recta de calibración. 35 3.5 Mediciones a punto final, cinéticas y enzimáticas (Aplicaciones) Si tenemos moléculas poco absorbentes o no absorbentes a las λ UV-VIS, podemos usar métodos indirectos. Estos métodos consisten en que las moléculas que no absorben, reaccionen con otros compuestos para formar derivados que sí absorben. Normalmente se usan reactivos comerciales, que en presencia del analito a determinar, desencadenan unas reacciones que dan lugar a una sustancia cuya absorbancia podemos medir. A= analito B y C=reactivos comerciales D y/o E= sustancias cuya Abs se puede medir Si la sustancia que vamos a medir adquiere color, se habla de. métodos colorimétricos. A veces, los reactivos que se utilizan son enzimas, entonces hablamos de métodos enzimáticos. Teniendo todo esto en cuenta, para el cálculo de las magnitudes bioquímicas se establecen 3 grupos: Cálculo de la concentración en técnicas de punto final. Cálculo de la concentración en técnicas cinéticas. Cálculo de la actividad enzimática. 36  Cálculo de la concentración en técnicas de punto final Punto final significa que la reacción se ha producido por completo por lo que se habrá agotado A, B y/o C y se habrá formado D y/o E. Por ello sueles haber un exceso de reactivos, para asegurar que el analito reacciona totalmente en las condiciones de trabajo (pH, Tª, tiempo, etc.). De esta forma, la concentración del analito es directamente proporcional a la concentración de uno de los productos formados. Si la reacción es de este tipo: Podemos usar un colorímetro y la absorbancia del producto coloreado obtenido es proporcional a la concentración del analito en la muestra. Si la reacción es de tipo enzimático: La sustancia problema es el sustrato de la enzima. Esta enzima transforma la sustancia problema en un producto coloreado que absorbe en el UV-VIS. Y la concentración del producto coloreado es proporcional a la concentración de la sustancia problema. 37 Este es un ejemplo muy común para la determinación de Glucosa por el método de la hexoquinasa. La hexoquinasa es la enzima y la glucosa es el sustrato. El NADPH es coloreado y su concentración será proporcional a la concentración de glucosa. 38  Cálculo de la concentración en técnicas cinéticas En estas técnicas se va a medir la velocidad de la reacción antes de que acabe. Es fundamental mantener las condiciones que nos pide el fabricante del protocolo comercial. En las técnicas cinéticas, la variación de la Abs/tiempo es proporcional a la concentración y/o actividad del analito. Esto se debe a que si el analito está en la muestra dará lugar a la aparición o desaparición de sustancias capaces de absorber radiación. En estos casos, la ley de Lambert-Beer quedará: Siendo ΔA, la variación de la absorbancia. Realmente se mide en minutos, quedando: Como ԑ y b son ctes, se agrupan en un factor numérico F (el cual nos da la casa comercial), quedando: En resumen, como realmente estamos añadiendo una sustancia que desencadena una variación de la absorbancia, y conocemos la concentración de esa sustancia (patrón), nos quedará que: 39 En las mediciones cinéticas en las reacciones enzimáticas, tomamos como ejemplo la técnica Trinder: Se medirá la absorbancia de la quinona en el espectrofotómetro y el incremento de la absorbancia es directamente proporcional a la cantidad de glucosa en la muestra. 40  Cálculo de la actividad enzimática En el suero la concentración de enzimas es muy baja, pero tienen una alta capacidad catalítica, por ello se puede determinar su actividad y suponer que esta sea proporcional a su concentración. Para calcular la actividad enzimática se mide la velocidad de reacción. Recordemos que esto se hace midiendo la cantidad de sustrato que desaparece o la cantidad de producto que se forma en un intervalo de tiempo. Estas reacciones son muy sensibles a las condiciones de reacción , por lo que se debe controlar la Tª, pH y concentración de reactivos. Se puede hacer de 2 formas: Método a punto final: pondremos en contacto el reactivo y la enzima (que es nuestra muestra), tras un tiempo indicado, se para la reacción y se mide la absorbancia final; esto puede hacerse: A un punto: si la enzima no tiene un periodo de incubación. A dos puntos: sí hay periodo de incubación, por lo que se mide tras el periodo de incubación y luego al final de la reacción. Métodos cinéticos: se utilizan cuando las concentraciones de la enzima son grandes y agotan enseguida el sustrato, por lo que baja rápidamente la velocidad de la reacción. En este caso se realizan lecturas cada minuto durante 3-5 minutos para asegurarnos que estamos en la fase lineal de la curva. 41 La actividad enzimática se expresa como U (unidades de actividad enzimática). Es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un μmol de sustrato/minuto. La concentración catalítica se expresa como U/l En el Sistema internacional de unidades (SI), se usa el katal (Kat) para hablar de actividad enzimática. 1 katal nos indica la cantidad de moles de enzima que son necesarios para transformar 1 mol de sustrato en 1 segundo. 1 katal equivale a 60 x 106 unidades de actividad enzimática. Como es una unidad muy grande, se suele utilizar sus submúltiplos microkatal (μkat) y nanokatal (nkat). 42 3.6 Espectrometría de absorción molecular en el infrarrojo Se usa para averiguar la composición química de los cálculos urinarios. Se construye una gráfica que representa el porcentaje de transmitancia frente a la longitud de onda (expresada en cm –1). Dependiendo de la composición del cálculo urinario se obtendrá un tipo de gráfica que se compara con los gráficos patrones. Cálculo urinario con oxalato cálcico monohidrato Cálculo urinario con oxalato cálcico dihidrato 43 4 ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA 4.1 Espectrometría de absorción atómica con llama 4.2 Espectrometría de absorción atómica con atomización electrotérmica 44  4 ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA Se utiliza para cuantificar átomos o iones en una muestra en concentraciones muy bajas (nivel de trazas, ppm o ultratraza, ppb). Se usa para cuantificar tanto elementos esenciales (Cu, Zn, Se, Li, etc.) como tóxicos (Pb, Al, Hg, Cd, As, etc.). Sabemos que los electrones de un elemento químico, cuando se irradian, tienen la capacidad de pasar de su estado basal (capa de valencia) a su estado excitado (de mayor energía). Y esta transición es característica de cada elemento. De esta forma, las λ a las que absorbe un elemento químico, se van a llamar líneas espectrales y tendrán un ancho de banda muy estrecho. 45 Para conseguir la absorción atómica, primero ha de llevarse a cabo la transformación de la muestra a vapor atómico. Esto se hace por el proceso de atomización. Los sistemas actuales de atomización son: -atomización por llama -atomización por electrotermia con horno de grafito. 46  4.1 Espectrometría de absorción atómica con llama Se usa cuando el elemento a medir está en concentraciones de ppm. Instrumentación Se usa un espectrofotómetro de absorción atómica con llama. Es como el de absorción molecular, pero se diferencian en la fuente de radiación y en el tratamiento de la muestra. Fuente de radiación: Lámpara de cátodo hueco (vidrio que tiene un gas inerte en su interior y un electrodo). El cátodo debe ser del mismo material del analito (elemento a analizar en la muestra). Hay lámparas con varios cátodos, para poder medir varios elementos atómicos a la vez. Tratamiento de la muestra: La muestra debe ser atomizada, para ello hay un sistema que produce una llama y consta de: -un nebulizador, que transforma la muestra líquida en un aerosol -una cámara premezcla, donde la muestra nebulizada se mezcla con los gases -y un quemador, donde la mezcla se somete a la llama, transformándose entonces en átomos elementales. Se pueden alcanzar incluso los 3000ºC 47  Interferencias -Químicas: hay moléculas que impiden la atomización de los metales. -De ionización: si los iones emiten a la λ a la que se mide. -De matriz: la absorción aumenta debido al disolvente o porque se forman compuestos que absorben a la λ a la que se mide. The picture shows the flame color from aspirating a sample with high salt content. Sodium turns the flame orange. 48  4.2 Espectrometría de absorción atómica con atomización electrotérmica También se conoce como espectrofotometría de absorción atómica con horno de grafito. Se usa cuando los metales a medir están en ppb. Instrumentación La muestra se coloca en un tubo de grafito que se va calentando debido al paso de la corriente eléctrica (efecto Joule). Se trabaja con rampas de temperatura: -Primero se calienta la muestra para obtener una película sólida sobre el tubo. -A continuación se va aumentando la Tª para destruir la materia orgánica (mineralización de la matriz). -Cuando ya solo quedan analitos inorgánicos, se calienta el tubo de grafito a 3000ºC para producir la atomización. -Por último a Tª máx hay una etapa de lavado donde se eliminan los restos del tubo. Los compuestos volátiles generados se arrastan con Ar (gas inerte), que circula en todo momento por el sistema excepto en el momento de la atomización, momento en que se detiene para que la luz atraviese el vapor atómico y se lleve a cabo la absorción. 49 Al no tener que nebulizar la muestra, presenta unas ventajas respecto a la llama: -Se usa menos volumen de muestra. -La muestra puede ser viscosa o incluso sólida. -Se mejora mucho la sensibilidad (ppb). La principal desventaja de la espectrometría de absorción atómica es que se mide la concentración total del analito en la muestra, independientemente de su estado de oxidación. Esto resulta fundamental, por ejemplo en la detección de tóxicos, ya que en muchos casos el nivel de toxicidad del elemento depende de la forma iónica en la que se encuentra. 50 5 ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN ATÓMICA 5.1 Fotometría de llama 5.2 Espectrometría de emisión atómica por plasma 51 5 ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN ATÓMICA Se estudia la radiación emitida por los átomos excitados en una muestra. Esto es debido a que algunos elementos químicos, al ser excitados aplicándoles calor, vuelven a su estado fundamental, emitiendo la energía sobrante en forma de radiación luminosa. Esta radiación será característica de cada elemento. Se puede utilizar con fines cualitativos y cuantitativos. -Análisis cualitativo: cuando un átomo es excitado por una fuente de energía, se encuentra en un estado inestable. Para desactivarse (y volver a su estado más estable) emite un espectro de líneas característico que permite su identificación comparándolo con patrones. He Kr -Análisis cuantitativo: si suministramos energía a los átomos de una muestra para que pasen a un estado excitado, la intensidad de la radiación que emiten cuando se desactivan es proporcional al número de átomos que teníamos en estado fundamental. Por lo que midiendo esta intensidad de radiación electromagnética del espectro de emisión de un elemento, podemos calcular su concentración. 52  Método de atomización-excitación Temperatura (ºC) Denominación de la técnica Llama 1700-3100 Fotometría de llama (metales alcalinos, Na, Li y K) Chispa eléctrica 40000 Espectroscopía de emisión por chispa Arco eléctrico 4000-5000 Espectroscopía de emisión por arco Plasma 4000-8000 Espectroscopía de plasma 5.1 Fotometría de llama Utiliza el calor aplicado por la llama para producir la atomización y la excitación atómica. Posteriormente se producirá la emisión de luz cuando los átomos vuelven a su estado fundamental. Instrumentación El fotómetro de llama es similar al de atomización, pero aquí no será necesaria la fuente de luz. Se suele usar un estándar interno para controlar la variables como velocidad de aspiración, atomización, viscosidad de la solución, Tª y estabilidad de la llama. Éste es una sustancia que no está en la muestra y emite a una λ alejada de los elementos a medir. Se añade a la muestra y a los calibradores. 53  5.2 Espectrometría de emisión atómica por plasma El plasma presenta mayor reproducibilidad y unos límites de detección más bajos. El plasma es una mezcla gaseosa conductora de la electricidad, constituida por cationes y electrones. El más usado es el de Ar (argón). Ar + E Ar + e- + Ar+ 54 6 ESPECTROMETRÍA DE LUMINISCENCIA 6.1 Fotoluminiscencia 6.2 Quimioluminiscencia 55 6 ESPECTROMETRÍA DE LUMINISCENCIA Cuando una sustancia excitada emite radiación en forma de luz, sin asociarse esta emisión con altas Tª, hablamos de luminiscencia. Dependiendo del origen de la luz tendremos: Fotoluminiscencia. La excitación la provocan los fotones y puede ser: -Fluorescencia -Fosforescencia Quimioluminiscencia. La excitación la provoca una reacción química. Bioluminiscencia. Es un fenómeno de quimioluminiscencia pero que sucede en seres vivos (ej. Luciérnagas) Electroquimioluminiscencia. La excitación se provoca por la aplicación de una corriente eléctrica. 56  6.1 Fotoluminiscencia Para originar emisión fotoluminiscente, primero debe absorberse radiación y un electrón debe pasar a un nivel energético superior. Este electrón, al volver a su estado fundamental emite una radiación de mayor longitud de onda que la recibida, por lo que tendrá una menor energía. Dependiendo del tiempo que dure la emisión hablamos de: Fluorescencia: 10-8 seg. Se usa en inmunoanálisis. Fosforescencia: periodo largo, incluso de horas. 57  Espectrometría de fluorescencia Suele usarse para medir la luz que emiten moléculas aromáticas o que tienen dobles enlaces conjugados. Es una técnica muy sensible, debido al retraso que hay desde la excitación hasta la emisión de la luz fluorescentes. Podrá determinar analitos que estén en muy bajas concentraciones. Instrumentación Se usan fluorímetros que poseen: -Lámparas de arco de Xe o de Hg -2 monocromadores que seleccionan las λ de entrada y de salida -Cubetas de cuarzo (las de plástico dan fluorescencia adicional) con 4 caras transparentes. -Diseñados en ángulo recto para que la luz que procede de la lámpara (excitación) no llegue al monocromador de emisión ni al detector. Las determinaciones se hacen con muestras muy diluidas. 58  Quimioluminiscencia La reacción química genera una molécula excitada electrónicamente, que emite luz al volver a un estado de menor energía. El compuesto orgánico (Luminol) se oxida por peróxido de hidrógeno (u otro oxidante), y la luz es emitida por el producto que se forma en esta reacción. Se puede aplicar en inmunoanálisis para cuantificar sustancias de muy baja concentración (como trazas de sangre en el escenario de un crimen). 59 7 ESPECTROMETRÍA DE DISPERSIÓN DE LA RADIACIÓN 7.1 Turbidimetría 7.2 Nefelometría 60 7 ESPECTROMETRÍA DE DISPERSIÓN DE LA RADIACIÓN En espectrometría de dispersión, la muestra con la que se trabaja es una RECUERDA suspensión, es decir, hay partículas sin disolver en una disolución. Cuando la luz incidente choca contra una partícula en suspensión: -una parte de la luz se dispersa -otra parte se absorbe -otra parte se refleja -y otra parte se transmite. La dispersión de la luz y la intensidad de esta dispersión van a depender de: -longitud de onda de la radiación incidente -tamaño y peso molecular de la partícula El haz de radiación choca -distancia entre la cubeta y el detector contra una partícula en suspensión y cambia de -concentración de partículas en la muestra. dirección sin cambiar su Todos estos factores se relacionan entre sí según la ley de Rayleigh. energía. Las técnicas usadas son la turbidimetría y la nefelometría. Sus aplicaciones son: inmunoquímica, reacciones de precipitación, tiempos de coagulación y cuantificación de microorganismos. 61  7.1 Turbidimetría Es una técnica cuantitativa, que mide la disminución de la intensidad del haz de luz (luz transmitida) que atraviesa la cubeta que contiene la muestra en suspensión. Se usa un espectrofotómetro de absorción molecular UV-VIS. Se cumple la ley de Lambert-Beer, aunque sustituiremos ԑ por k (cte que dependerá del tamaño y forma de las partículas y también de la longitud de onda de la fuente). 62  7.2 Nefelometría Es una técnica cuantitativa, que mide la intensidad de luz dispersada en un ángulo determinado. Los nefelómetros son parecidos a los fluorímetros, pero la longitud de onda que se emite es igual que la que se mide. Los detectores se colocan en ángulos entre 10º y 90º respecto de la cubeta. Es más sensible que la turbidimetría y se utiliza cuando la muestra contiene pocas partículas dispersantes y/o su tamaño es pequeño. 63 8 REFRACTOMETRÍA DE LÍQUIDOS La refracción es el desvío o cambio de dirección que experimenta un haz de luz al atravesar una solución sobre la que incide. Esto es ocasionado por la diferente naturaleza del medio de propagación (aire-solución). La luz incide con un determinado ángulo de incidencia(α1) , pero al desviarse su dirección, este ángulo cambia, y se llama ángulo de refracción (α2). Cada medio posee un índice de refracción (n) característico que mide la velocidad de la luz en el vacío (c) y la velocidad de la luz en dicho medio (v). A través de la Ley de Snell se puede relacionar el índice de refracción de dos materiales con el ángulo que se desvía la radiación al pasar de un material a otro. n1. sen α1 = n2. sen α2 64 El índice de refracción es una característica físico-química que se encuentra tabulada para numerosos elementos químico, por lo que puede utilizarse para confirmar la identidad de un compuesto, determinar su pureza o para medir la concentración de mezclas binarias. Se utilizan los refractómetros clínicos en refractometría de líquidos. La determinación se realizará gracias a la refracción que existe entre el prisma de índice de refracción elevado y la muestra. -Si las muestras tienen una baja concentración, la diferencia entre los índices de refracción será amplia. -Si las muestras tienen una elevada concentración de solutos, la diferencia entre los índices de refracción es baja. En el laboratorio de análisis clínicos se usa para medir la concentración de albúmina en muestras de suero o plasma, para medir el peso específico en orina. Pero actualmente no se usa tanto, ya que hay métodos más sencillos como las tiras reactivas y automatizados (autoanalizadores). 65 9 FOTOMETRÍA DE REFLECTANCIA. QUÍMICA SECA 9.1 Fundamento de la reflectancia 9.2 Instrumentación 9.3 Los reactivos de química seca 66 9 FOTOMETRÍA DE REFLECTANCIA. QUÍMICA SECA La fotometría de reflectancia es una metodología que mide la intensidad de la luz reflejada en una superficie después de producirse la reacción química que se desencadena al aplicar la muestra. La reacción química se produce un fase sólida (tira o soporte) donde estarán deshidratados, estabilizados y fijados todos los reactivos necesarios. De ahí el nombre de química seca. Cuando se añade la muestra (ej. Sangre) esta va a difundir sobre la fase sólida, disolviendo los reactivos sólidos y provocando la reacción, la cual es cuantificada por el espectrofotómetro de reflexión. Test de inmunocromatografía 67  9.1 Fundamento de la reflectancia Hay veces que no toda la radiación incidente es reflejada, una parte puede ser absorbida por la superficie. La reflectancia es el resultado de dividir el flujo de luz reflejada entre el flujo de luz incidente. El haz de luz que incide sobre la superficie tiene una λ que es absorbida por los productos de la reacción que queremos reconocer. El resto de la radiación se reflejará en múltiples direcciones (reflexión difusa). Así podemos relacionar la reflectancia con la concentración del analito que nos interesa. 68  9.2 Instrumentación En fotometría de reflectancia se mide la luz reflejada tras la adición de la muestra sobre el reactivo sólido. Para ello se usa es espectrofotómetro de reflexión, que es muy parecido al espectrofotómetro de absorción: -Fuente de luz: lámparas de haluro de tungsteno (W) o Xe. -Selector de longitud de onda -Sistema óptico: lentes, espejos y filtros para recoger la luz reflejada, y pueden tener una esfera integradora para iluminar la muestra desde todos los ángulos. -Reactivos de fase sólida (química seca). -Detector y procesador de datos. Obtienen el espectro de luz reflejada que se corresponde con la concentración del analito. -Sistema de lectura. -Tiras reactivas: se hace la lectura sobre la superficie -Ractivos multicapa: la lectura se hace sobre el reverso de la superficie. 69  9.3 Los reactivos de química seca Tiras reactivas Son láminas en forma de tira donde están todos reactivos necesarios para hacer el análisis. Cuando entran en contacto con la muestra cambian de color. Están constituidas por: -Soporte de plástico. -Una matriz de celulosa que contiene los reactivos. Algunas tira pueden tener: -Capas que son filtros para evitar que pasen algunas moléculas no deseadas: lípidos, proteínas, etc. -Capas indicadoras: contienen un colorante que forma un complejo coloreado que nos informa de la concentración de un analito. Y puede ser cuantificado por espectrofotometría de reflexión o de manera visual (usando una carta de colores, lo que resulta algo subjetivo). Se utilizan en los análisis POCT (a la cabecera del paciente) para hacer un diagnóstico rápido en una consulta o autodiagnóstico. Los más conocidos son pruebas de orina (nitritos, glucosa, etc.), control de glucemia y pruebas de embarazo. 70  Películas multicapa (slide) La lámina contiene los reactivos que permiten la determinación del analito. Tienen varias capas: -Capa difusora. Es porosa y tiene varias funciones: -Permite que la muestra se distribuya de forma uniforme por toda la lámina. -Actúa como superficie que refleja la luz. -Actúa como filtro de células, cristales, moléculas, etc. (para esto a veces se suelen añadir diferentes capas intermedias) -Capa reactiva. Contiene los reactivos en un o dos capas, en condiciones controladas. -Capa indicadora. En ella se forman los complejos coloridos que se cuantificarán por espectrofotometría de reflexión. -Capa soporte. Es la base sobre la que se depositan las demás capas. Está hecha de plástico transparente puesto que debe dejar pasar la luz para medir la reacción. El espectrofotómetro irradia en la cara inferior del slide y la luz reflejada es recogida por el detector para su cuantificación y lectura. Se utiliza en el laboratorio clínico con analizadores automáticos. La ventaja que presentan frente a los reactivos líquidos es que tienen una mayor estabilidad y se pueden introducir directamente en el equipo sin necesidad de reconstituirlos o agitarlos. 71 72