Uji Katalase, Koagulase, DNase, dan Hemolisa - Kelompok 1

UJI KATALASE, KOAGULASE, DNASE DAN HEMOLISA KELOMPOK 1 D-4 TLM -BAKTERIOLOGI II-  ANGGOTA KELOMPOK Luvi Dwi Utami Togi Angel Rahmanuela P3.73.34.2.23.029 P3.73.34.2.23.046 Naila Fauqi Rosyada P3.73.34.2.23.034 Nab...

UJI KATALASE, KOAGULASE, DNASE DAN HEMOLISA KELOMPOK 1 D-4 TLM -BAKTERIOLOGI II-  ANGGOTA KELOMPOK Luvi Dwi Utami Togi Angel Rahmanuela P3.73.34.2.23.029 P3.73.34.2.23.046 Naila Fauqi Rosyada P3.73.34.2.23.034 Nabilla Valinka Turnip P3.73.34.2.23.034 P3.73.34.2.23.047 PENGERTIAN UJI KATALASE Uji Katalase merupakan uji yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri yang menghasilkan enzim katalase. Enzim katalase pada bakteri merupakan enzim yang berfungsi mengurai hidrogen peroksida (H2O2) yang terbentuk dari proses respirasi aerob terhadap bakteri, menjadi air (H2O) dan oksigen (O2). Bakteri yang bersifat aerob memiliki enzim katalase untuk mendegradasi hidrogen peroksida yang bersifat toksik bagi bakteri. TUJUAN & PRINSIP KATALASE TUJUAN UJI KATALASE PRINSIP UJI KATALASE Uji katalase berguna untuk Setiap bakteri mempunyai suatu enzim membedakan genus yang tergolong flavoprotein yang dapat Staphylococcus sp. dan bereaksi dengan oksigen membentuk Streptococcus sp senyawa-senyawa beracun yaitu hidrogen Uji katalase digunakan untuk peroksida (H2O2) dan suatu radikal bebas mengetahui aktivitas katalase yaitu superoksida (O2 -). Bakteri dapat pada bakteri yang di uji memproduksi enzim katalase yang dapat memecah H2O2 menjadi H2O dan O2.  PROSEDUR UJI KATALASE METODE ALAT UJI TUBE/TABUNG ALAT CARA KERJA /PROSEDUR Objek glass Pipet reaksi Tabung tetes Tambahkan 2 ml larutan 3% H2O2 ke dalam Ose Pipet tabung reaksi. Ose/tusuk Bunsen gigi Ambil 1 ose penuh koloni bakteri. Jangan Bunsen menggunakan jarum ose berbahan platinum BAHAN karena dapat menyebabkan positif palsu. BAHAN Alternatif lain dapat menggunakan tusuk gigi Koloni Koloni Bakteri atau tusuk sate steril. Bakteri H2O2 3% Celupkan koloni bakteri ke dalam larutan 3% H2O2 3% H2O2 dalam tabung reaksi. Amati gelembung gas yang terbentuk. PROSEDUR UJI KATALASE METODE UJI SLIDE ALAT ALAT CARA KERJA /PROSEDUR Objek glass Pipet tetes Objek glass Panaskan ose diatas bunsen hingga membara Ose Pipet tetes lalu dinginkan Ose Bunsen Pastikan gelas objek telah dibersihkan dengan Bunsen baik sebelum digunakan BAHAN Ambil koloni bakteri lalu letakkan pada objek BAHAN glass Koloni Koloni bakteri kemudian ditetesi 1-2 tetes H2O2 3% pada H2O2 3% Bakteri obyek glass yang terdapat koloni bakteri H2O2 3% dan langsung diamati terjadi penguraian hidrogen peroksida INTERPRETASI HASIL KATALASE HASIL UJI KATALASE HASIL UJI KATALASE METODE TABUNG METODE SLIDE Katalase positif uji: ditunjukkan Staphylococcus aureus untuk dengan munculnya gelembung tes positif Katalase. secara langsung Katalase negatif uji: ditunjukkan Streptococcus pyogenes untuk dengan tidak adanya gelembung uji Katalase-negatif. atau beberapa gelembung setelah 20 detik  PENGERTIAN KOAGULASE Koagulase adalah protein enzimatik yang berfungsi mengubah fibrinogen menjadi fibrin, yang menyebabkan pembekuan atau penggumpalan dan merupakan suatu pemeriksaan bakteri untuk diferensiasi Staphylococcus aureus dari spesies Staphylococcus lainnya. Uji koagulase merupakan uji yang digunakan untuk mengetahui ada tidaknya enzim koagulase yang dihasilkan oleh Staphylococcus sp.  TUJUAN & PRINSIP KOAGULASE TUJUAN UJI KOAGULASE PRINSIP UJI KOAGULASE Pemeriksaan ini dilakukan untuk Uji koagulase berdasarkan prinsipnya mendeteksi adanya pembentukan adalah untuk mendeteksi adanya enzim enzim koagulase yang terikat ke koagulase pada bakteri yang diuji. dinding sel bakteri. Uji koagulase Prinsip uji koagulase adalah untuk menggunakan 2 metode yang mengetahui bakteri tersebut patogen bertujuan untuk: atau tidak. Uji slide atau clumping factor Pada Staphylococcus aureus, terdapat digunakan untuk mengetahui dua bentuk koagulase yang adanya ikatan koagulase berbeda, yaitu koagulase bebas (free Uji tabung digunakan untuk coagulase) dan koagulase terikat mengetahui adanya koagulase (bound coagulase). bebas PROSEDUR UJI KOAGULASE METODE SLIDE/CLUMPING FAKTOR ALAT CARA KERJA /PROSEDUR Ose Ambil objek glass fiksasi diatas nyala api Object Glass teteskan 1 tetes plasma sitrat diatas objek Bunsen glass Pipet Tetes Panaskan ose diatas api bunsen dinginkan Mikroskop Ambil koloni bakteri yang diuji menggunakan ose yg sudah dipanaskan letakkan diatas object glass Ratakan koloni bakteri dan plasma sitrat BAHAN dengan ose homogenkan lalu tututp dengan cover glass Koloni Bakteri Amati dibawah mikroskop Plasma Sitrat  Interpretasi Hasil Positif (+) terbentuk Gumpalan Halus Negatif (-) tidak terbentuk nya Gumpalan Halus Secara Mikroskopis menunjukkan bahwa bentuk gumpalan hasil uji koagulase secara mikroskopis berbentuk bulat tidak teratur. PROSEDUR UJI KOAGULASE METODE UJI TABUNG ALAT CARA KERJA /PROSEDUR Ose 4 tetes atau 200µl plasma darah Tabung Reaksi dimasukkan secara aseptis ke dalam Bunsen tabung reaksi steril Pipet Tetes Tambah 3-4 koloni atau 1 tetes biakan Inkubator Staphylococcus sp. Campur dengan hati hati lalu tabung dimasukkan dalam inkubator BAHAN pada suhu 37°C selama 1-4 jam. pengamatan akan dilakukan pada 4 jam Koloni Bakteri pertama dan sesudah 18-24 jam Plasma sitrat perhatikan kepadatan dari media Positif (+) terjadi Pembekuan Interpretasi Hasil 1 + Positif : Jika Koagulan Tidak Terkumpul dan sedikit 2 + Positif : Jika Koagulan Terkumpul dibagian atas sedikit 3 + Positif : Jika Koagulan dibagian bawah dan banyak 4 + Positif : Jika Koagulan Yang terbentuj secara padat/solid dan tidak jatuh apabila tabung dibalik dan dinyatakan sebagai S.Aureus (Staphylococcus aureus) Negatif (-) Cair Koagulan tidak terbentuk  UJI DNASE Uji Deoksiribonuklease (DNase) adalah uji biokimia yang dilakukan untuk membedakan organisme berdasarkan kemampuannya menghasilkan enzim DNase. DNAse adalah enzim ekstraseluler yang dapat memotong DNA menjadi nukleotida yang dapat larut dalam asam sedangkan DNA tidak larut dalam asam. Uji DNase merupakan uji penting untuk identifikasi dugaan Staphylococcus aureus dan membedakannya dari spesies Stafilokokus lainnya. TU JU A N UJI DNASE Untuk mendeterminasi kemampuan mikroorganisme yang dapat memecah DNA dengan enzim deoksiribonuklease ( Dnase). Untuk mengidentifikasi bakteri Staphylococcus yang berpotensi patogen. DNASE AGAR TANPA INDIKATOR ◈ Prinsip : Hidrolisis DNA diamati dengan PRINSIP pembersihan agar setelah penambahan HCl (oligonukleotida larut dalam asam, tetapi garam UJI DNASE DNA tidak larut). DNASE AGAR DENGAN METIL HIJAU ◈ Prinsip : Pewarna hijau metil mampu mengikat DNA yang terpolimerisasi untuk membentuk kompleks hijau yang stabil pada pH 7,3. Tindakan DNase mendepolimerisasi struktur DNA dengan melepaskan hijau metil, hijau metil bebas mengalami dekolorisasi spontan pada pH 7,3 yang menghasilkan lingkaran tak berwarna di sekitar koloni positif DNase. DNASE AGAR DENGAN TOLUIDINE BIRU O ◈ Prinsip : Ketika toluidine blue O (TBO) ditambahkan, kompleks terbentuk dengan DNA, yang mengubah strukturnya ketika DNA dihidrolisis, menghasilkan warna merah muda cerah  METODE DAN PROSEDUR UJI DNASE 01. METODE UJI DNASE Prosedur pada agar tanpa indikator: Pelat agar diinokulasi dengan organisme uji dari kultur 18 jam menggunakan jarum atau loop inokulasi steril. Pelat diinkubasi pada suhu 35-37°C selama 24 jam. Pelat agar yang diinkubasi dibanjiri dengan larutan HCl 1N, dan kelebihan asam dibuang. Beberapa waktu dibiarkan agar reagen terserap ke dalam pelat. Pelat diamati untuk menemukan zona bening di sekitar koloni dalam waktu 5 menit. Prosedur pada agar dengan indikator: Pelat agar dengan indikator diinokulasi dengan organisme uji dari kultur 18 jam menggunakan jarum atau loop inokulasi steril. Pelat diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35-37°C. Pelat tersebut kemudian diamati untuk mengetahui perubahan warna indikatornya. METODE DAN PROSEDUR UJI DNASE 02. METODE TERMONUKLEASE Pilih beberapa koloni staphylococcus yang terisolasi dengan baik menggunakan jarum steril dan inokulasikan ke dalam BHI. Inkubasi pada suhu 35-37°C selama 18-24 jam. Letakkan kaldu dalam balok panas mendidih selama 15 menit. Dinginkan hingga suhu ruangan. Buat lubang pada agar Toluidine Blue O (TBO) dengan pipet kaca Pasteur. Isi sumur dengan 2 tetes kultur kaldu yang didinginkan. Inkubasi pada suhu 35-37°C selama 3 jam. Amati perubahan warnanya.  INTERPRETASI HASIL Agar DNase (tanpa indikator) Positif: Terbentuknya halo bening di sekitar koloni. Negatif: Tidak ada zona bening di media Agar DNase Metil Green (dengan indikator) Uji positif: terbentuknya halo bening di sekitar koloni atau sumur pada agar Uji negatif: tidak ada zona bening dalam media atau sekitar sumur di agar dan agar tetap hijau. TBO Agar Uji positif: terbentuknya halo merah muda atau merah di sekitar koloni atau sumur di agar. Uji negatif: tidak ada perubahan pada warna biru royal pada media  UJI HEMOLISA Hemolisis adalah pelepasan hemoglobin dan komponen intraseluler lainnya sebagai akibat dari kerusakan sel darah merah (Red Blood Cell). Hemolisis dapat terjadi secara in vitro dan in vivo. Dalam dunia mikrobiologi hemolisis digunakan untuk mengklasifikasikan mikroorganisme tertentu, dengan cara mengamati kemampuan koloni bakteri untuk menginduksi hemolisis bila ditanam pada agar darah (blood agar). Uji Hemolisa adalah pengujian yang dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri melisiskan darah,  TUJUAN & PRINSIP UJI HEMOLISA Tujuan : Prinsip : untuk mengidentifikasi bakteri patogen untuk mengevaluasi kemampuan suatu agen terutama streptococcus (seperti bahan kimia, obat, atau toksin) dalam untuk memeriksa apakah terjadi menyebabkan lisis atau penghancuran sel darah hemolisis pada darah setelah transfusi, merah (eritrosit). yang bisa menunjukkan reaksi transfusi yang tidak diinginkan untuk membantu dalam diagnosis berbagai penyakit darah atau gangguan terkait yang melibatkan pemecahan sel darah merah METODE DAN PROSEDUR UJI HEMOLISA 1. Media Blood Agar : 1. ambil suspensi bakteri menggunakan ose 2. kemudian goreskan pada blood agar dengan bentuk 4 kuadran 3. lalu inkubasi pada suhu 30°C selama 24 jam 4. baca reaksi hemolitik dengan mengangkat petridis ke sumber cahaya dan amati dari belakang METODE DAN PROSEDUR UJI HEMOLISA 2. Prosedur metode BHI-B (Brain Heart Infusion Broth) 1. Ambil koloni bakteri yang akan diuji, biasanya dari hasil kultur sebelumnya, dengan menggunakan loop ose steril. 2. Inokulasikan (tanamkan) bakteri ke dalam media BHI- B yang sudah disiapkan. 3. Inkubasi media yang telah diinokulasi pada suhu 37°C selama 18-24 jam dalam kondisi aerob.  INTERPRETASI HASIL metode blood agar beta hemolisis (β) alpha hemolisis (α) Gamma hemolisis (γ) disebut hemolisis sebagian, disebut non hemolisis, karena lisis seluruh sel darah penurunan hemoglobin sel darah menunjukkan kurangnya merah. Sebuah zona yang merah untuk metemoglobin dalam hemolisis yang seharusnya tidak jelas, mendekati warna dan media sekitar koloni hal ini ada reaksi dalam media transparansi media dasar, menyebabkan perubahan warna sekitarnya. mengelilingi koloni. hijau atau coklat dalam media  INTERPRETASI HASIL metode BHI-B beta hemolisis (β) alpha hemolisis (α) Gamma hemolisis (γ) disebut hemolisis sebagian disebut non hemolisis, karena lisis seluruh sel darah menunjukkan kurangnya merah. hemolisis yang seharusnya tidak ada reaksi dalam media sekitarnya. PERTANYAAN DAN JAWABAN 1. Apakah yg menjadi perbedaan dari koagulase bebas dan terikat dalam patogenitas/virulensi Staphylococcus aureus? (Kayla) Jawaban: Secara keseluruhan, perbedaan utama antara koagulase bebas dan terikat terletak pada cara kerja mereka dalam proses pembekuan darah dan perlindungan bakteri. Keduanya berkontribusi pada kemampuan Staphylococcus aureus untuk menyebabkan infeksi dan bertahan dalam lingkungan tubuh inang. 2. Apakah ada pertimbangan uji katalase dalam memilih metode uji tabung dan uji slide? Jika ada, apa saja? (Afifah) Jawaban: Pelaksanaan metode slide lebih cepat dibandingkan dengan metode tabung, yaitu berkisar antara 1-2 menit sedangkan metode tabung perlu diinkubasi selama 4 sampai 24 jam terlebih dahulu untuk melihat hasil koagulase. Metode tabung digunakan untuk konfirmasi jika hasil metode slide negatif. 3. Mengapa Staphylococcous aureus memiliki dua bentuk koagulase yang berbeda? (Silfi) Jawaban: Staphylococcus aureus memiliki dua bentuk koagulase yang berbeda karena peran yang berbeda dalam proses infeksi. Koagulase bebas (free coagulase) dapat mengubah fibrinogen menjadi fibrin secara langsung dan digunakan dalam tes koagulase tabung. Koagulase terikat (bound coagulase) tidak membutuhkan faktor plasma untuk mengubah fibrinogen menjadi fibrin dan digunakan dalam tes koagulase slide. Kedua bentuk koagulase ini berperan penting dalam melindungi bakteri dari fagositosis dan memfasilitasi infeksi TER IMA KASIH