Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA PDF

```markdown ## 4. Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA Από το 1953, που οι Watson και Crick πρότειναν το μοντέλο της τρισδιάστατης δομής του DNA, μέχρι σήμερα, η πρόοδος της επιστήμης της Βιολογίας ήταν αλματώδης. Η απομόνωση και χρήση πολυάριθμων ενζύμων έδωσαν στους ερευνητές τη δυνατότητα «αναπαρα...

```markdown ## 4. Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA Από το 1953, που οι Watson και Crick πρότειναν το μοντέλο της τρισδιάστατης δομής του DNA, μέχρι σήμερα, η πρόοδος της επιστήμης της Βιολογίας ήταν αλματώδης. Η απομόνωση και χρήση πολυάριθμων ενζύμων έδωσαν στους ερευνητές τη δυνατότητα «αναπαραγωγής» των διαδικασιών της αντιγραφής, αντίστροφης μεταγραφής, μεταγραφής και μετάφρασης in vitro. Ειδικότερα η απομόνωση των περιοριστικών ενδονουκλεασών, ενζύμων που κόβουν το DNA σε κομμάτια με συγκεκριμένη αλληλουχία βάσεων, καθώς και ειδικών φορέων που μεταφέρουν DNA από κύτταρο σε κύτταρο, επέτρεψε την ανάπτυξη της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA και έδωσε στον άνθρωπο την ικανότητα όχι μόνο να ερευνά, αλλά να επεμβαίνει και να τροποποιεί το γενετικό υλικό των οργανισμών. Η τεχνολογία αυτή βρίσκει εφαρμογή στην παραγωγή σειράς προϊόντων και τη δημιουργία φυτών και ζώων με «βελτιωμένες» ιδιότητες, όπως θα παρουσιαστεί σε επόμενα κεφάλαια. Με την ανάπτυξη της υψηλής αυτής τεχνολογίας, το γενετικό υλικό, το DNA, που ήταν τόσο δύσκολο να μελετηθεί, έγινε «παιχνίδι» στα ανθρώπινα χέρια. Σήμερα μπορούμε να κατασκευάζουμε στο δοκιμαστικό σωλήνα ένα «ανασυνδυασμένο» μόριο DNA, δηλαδή ένα τεχνητό μόριο DNA, που περιέχει γονίδια από δύο ή και περισσότερους οργανισμούς. Το DNA αυτό μπορεί να μπει σε ένα βακτήριο ή σε ένα ευκαρυωτικό κύτταρο. Τα γενετικά τροποποιημένα βακτήρια ή ευκαρυωτικά κύτταρα είναι ικανά να ζουν και να αναπαράγονται μεταφέροντας στους απογόνους τους τις καινούργιες ιδιότητες. Οι τεχνικές με τις οποίες ο άνθρωπος επεμβαίνει στο γενετικό υλικό αποτελούν τη Γενετική Μηχανική. Η Γενετική Μηχανική άνοιξε το δρόμο για νέες, εξαιρετικά ενδιαφέρουσες ερευνητικές και παραγωγικές δυνατότητες, αλλά και για την επίτευξη δύο θεμελιωδών στόχων του ανθρώπου: * α. την κατανόηση των μυστηρίων της ζωής και της εξέλιξης πάνω στη Γη και, * β. τη βελτίωση της υγείας και του τρόπου διαβίωσής του. Η βελτίωση αυτή επιτυγχάνεται με τις εφαρμογές της Γενετικής Μηχανικής τόσο στην Ιατρική όσο και στη γεωργία και την κτηνοτροφία. Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA περιλαμβάνει όλες τις τεχνικές που οδηγούν σε μεταφορά του γενετικού υλικού από τον ένα οργανισμό στον άλλο. Τα στάδια της διαδικασίας αυτής είναι (Εικόνα 4.1): * Η κατασκευή του ανασυνδυασμένου DNA. Για το σκοπό αυτό το ολικό DNA από έναν οργανισμό δότη απομονώνεται, κόβεται ενζυματικά με ειδικά ένζυμα, τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες, και ενώνεται με ένα φορέα κλωνοποίησης. Ο φορέας κλωνοποίησης είναι ένα μόριο * DNA, π.χ. πλασμίδιο ή DNA φάγων, το οποίο μπορεί να αυτοδιπλασιάζεται ανεξάρτητα μέσα σε ένα κύτταρο-ξενιστή όπως ένα βακτήριο. Το DNA που δημιουργείται είναι ανασυνδυασμένο. * Η μεταφορά του ανασυνδυασμένου μορίου DNA σε ένα κύτταρο-ξενιστή. Η εισαγωγή του DNA σε βακτηριακό κύτταρο-ξενιστή ονομάζεται μετασχηματισμός. * Η επιλογή και απομόνωση των κυττάρων-ξενιστών. Στο στάδιο αυτό τα κύτταρα-ξενιστές που έχουν προσλάβει το ανασυνδυασμένο DNA επιλέγονται από εκείνα που δεν το έχουν προσλάβει. Κάθε βακτήριο που προσλαμβάνει ένα μόνο μόριο ανασυνδυασμένου DNA πολλαπλασιάζεται και παράγει μια αποικία που αποτελεί ένα βακτηριακό κλώνο. Είναι φανερό ότι με την παραπάνω διαδικασία παράγονται χιλιάδες κλώνοι, που ο καθένας περιέχει ένα ανασυνδυασμένο μόριο DNA διαφορετικό από τους υπόλοιπους κλώνους. * Η επιλογή ενός βακτηριακού κλώνου που περιέχει το επιθυμητό τμήμα DNA. Αυτή πραγματοποιείται με τη βοήθεια ειδικών μορίων ανιχνευτών, όπως θα αναλυθεί στη συνέχεια. Ο όρος κλώνος αναφέρεται σε μια ομάδα πανομοιότυπων μορίων, κυττάρων ή οργανισμών. Ο όρος κλωνοποίηση αναφέρεται στην κατασκευή, κατά προτίμηση μεγάλου αριθμού, πανομοιότυπων μορίων, κυττάρων ή οργανισμών. ### Μία γονιδιωματική βιβλιοθήκη περιέχει όλο το γονιδίωμα ενός οργανισμού Η ανακάλυψη των περιοριστικών ενδονουκλεασών έθεσε το θεμέλιο για τη δημιουργία των γονιδιωματικών βιβλιοθηκών. Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες παράγονται από βακτήρια και ο φυσιολογικός τους ρόλος είναι να τα προστατεύουν από την εισβολή «ξένου» DNA. Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες αναγνωρίζουν ειδικές αλληλουχίες 4-8 νουκλεοτιδίων στο δίκλωνο DNA. Μία από τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες που χρησιμοποιείται ευρέως είναι η EcoRI που απομονώθηκε από το βακτήριο Escherichia coli (Εικόνα 4.2). Το ένζυμο αυτό όποτε συναντά την αλληλουχία: $5'-GAATTC-3'$ $3'-CΤΤΑ AG-5'$ στο γονιδίωμα, κόβει κάθε αλυσίδα μεταξύ του G και του A (με κατεύθυνση 5'-3') αφήνοντας μονόκλωνα άκρα από αζευγάρωτες βάσεις στα κομμένα άκρα. Τα άκρα αυτά μπορούν να σχηματίσουν δεσμούς υδρογόνου με τις συμπληρωματικές βάσεις άλλων κομματιών DNA που έχουν κοπεί με το ίδιο ένζυμο. **Εικόνα 4.1:** Στάδια παραγωγής ανασυνδυασμένου μορίου DNA και κλωνοποίησή του. * Απεικονίζεται ένα βακτήριο E. coli, το οποίο περιέχει ένα πλασμίδιο με ένα γονίδιο ανθεκτικότητας στην αμπικιλίνη. * Το πλασμίδιο έχει μια θέση όπου κόβει η περιοριστική ενδονουκλεάση. * Απεικονίζεται ένα κύτταρο ευκαρυωτικού οργανισμού το οποίο έχει DNA. * Το DNA κόβεται με την ίδια περιοριστική ενδονουκλεάση. * Δημιουργούνται μονόκλωνα άκρα. * Αναμιγνύονται τα ένζυμα που δημιουργούν μόρια ανασυνδυασμένου DNA. * Το βακτηριακό πλασμίδιο και το DNA ενώνονται μερικώς. * Το ανασυνδυασμένο DNA εισέρχεται σε βακτηριακό κλώνο, ο οποίος περιέχει αντίγραφα ευκαρυωτικού γονιδίου. * Πραγματοποιείται καλλιέργεια βακτηρίων σε θρεπτικό υλικό που περιέχει αμπικιλίνη. * Πραγματοποιείται προσδιορισμός και απομόνωση αποικιών βακτηρίων που περιέχουν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο λόγω της ικανότητας τους να αναπτύσσονται σε θρεπτικό υλικό που περιέχει αμπικιλίνη. Η αλληλουχία GAATTC υπάρχει διάσπαρτη στα γονιδιώματα των οργανισμών. Έτσι το γονιδίωμα ενός ανώτερου ευκαρυωτικού οργανισμού μπορεί να κοπεί σε χιλιάδες κομμάτια με την περιοριστική αυτή ενδονουκλεάση. Στη συνέχεια τα κομμάτια αυτά ενσωματώνονται σε ειδικούς φορείς. Οι πιο χαρακτηριστικοί τύποι φορέων είναι τα πλασμίδια και το DNA φάγων. Τα πλασμίδια που χρησιμοποιούνται ως φορείς κλωνοποίησης έχουν τη συγκεκριμένη αλληλουχία μία μόνο φορά. Έτσι τα πλασμίδια κόβονται από την EcoRI σε αυτή τη θέση και δημιουργείται ένα γραμμικό μόριο DNA με μονόκλωνα άκρα. Τα δύο είδη DNA, του πλασμιδίου και του οργανισμού, αναμιγνύονται και, επειδή έχουν συμπληρωματικά άκρα, ενώνονται μεταξύ τους με τη μεσολάβηση ενός ενζύμου, της DNA δεσμάσης. Όπως θυμάστε η DNA δεσμάση φυσιολογικά είναι ένα από τα **Εικόνα 4.2** * Απεικονίζεται η περιοριστική ενδονουκλεάση EcoRI αναγνωρίζει την αλληλουχία GAATTC στη δίκλωνη αλυσίδα του DNA και την κόβει. ένζυμα της αντιγραφής που συνδέει κομμάτια του DNA. Έτσι δημιουργούνται ανασυνδυασμένα πλασμίδια (Εικόνα 4.3). Μερικά πλασμίδια ξαναγίνονται κυκλικά, χωρίς να προσλάβουν DNA του οργανισμού. Βακτήρια - ξενιστές δέχονται σε μικρό ποσοστό πλασμίδια, μερικά από τα οποία είναι ανασυνδυασμένα. Συνήθως χρησιμοποιούνται ως ξενιστές, βακτήρια που δεν έχουν πλασμίδια και επομένως είναι ευαίσθητα σε αντιβιοτικά (βλ. σελ. 18). **Εικόνα 4.3:** Κατασκευή ανασυνδυασμένου μορίου DNA. 1. Το DNA ενός οργανισμού κόβεται με μια περιοριστική ενδονουκλέαση 2. Το πλασμίδιο-φορέας κόβεται με το ίδιο ένζυμο 3. Τα δύο είδη DNA συνδέονται μεταξύ τους. * Απεικονίζεται ένα δίκλωνο μόριο DNA αμφιβίου, το οποίο περιέχει το γονίδιο rRNA. * Το DNA αμφιβίου κόβεται με την περιοριστική ενδονουκλεάση EcoRI. * Το πλασμίδιο κόβεται με το ένζυμο EcoRI. * Το πλασμίδιο συνδέεται με το τμήμα DNA του αμφιβίου και σχηματίζεται ανασυνδυασμένο πλασμίδιο. Για να μπει ένα πλασμίδιο μέσα στο βακτήριο, τα τοιχώματα του βακτηρίου γίνονται παροδικά διαπερατά σε μακρομόρια, μετά από κατάλληλη κατεργασία (μετασχηματισμός). Η επιλογή των βακτηρίων που δέχτηκαν ανασυνδυασμένο πλασμίδιο στηρίζεται στην ικανότητα ανάπτυξής τους παρουσία αντιβιοτικού, επειδή το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο περιέχει ένα γονίδιο που τους προσδίδει ανθεκτικότητα στο συγκεκριμένο αντιβιοτικό. Κάθε βακτήριο που προσέλαβε ένα ανασυνδυασμένο πλασμίδιο πολλαπλασιάζεται και δίνει έναν κλώνο. Η διαδικασία δημιουργίας κλώνων βακτηρίων ονομάζεται κλωνοποίηση. Το σύνολο των βακτηριακών κλώνων περιέχει το συνολικό DNA του οργανισμού δότη και αποτελεί μία γονιδιωματική βιβλιοθήκη (Εικόνα 4.1). Για να γίνει επιλογή ενός κλώνου που έχει ένα επιθυμητό γονίδιο χρησιμοποιούνται ειδικοί ανιχνευτές, με μια διαδικασία που θα αναλυθεί παρακάτω. Η κλωνοποίηση σε πλασμίδια είναι σχετικά απλή και γι' αυτό τα πλασμίδια αποτελούν το συνηθέστερο φορέα κλωνοποίησης για οργανισμούς με μικρό γονιδίωμα. Ένας άλλος φορέας που χρησιμοποιείται ευρύτατα γιατί μπορεί να ενσωματώσει **Εικόνα 4.4:** Κατασκευή γονιδιωματικής βιβλιοθήκης. * Απεικονίζονται βακτηριοφάγοι (φάγοι) και απομόνωση πυρηνικού DNA. * Το DNA που απομονώθηκε από τους φάγους κόβεται περιοριστική ενδονουκλέαση. * Πραγματοποιείται ανάμιξη. * Με την προσθήκη πρωτεϊνών του φάγου το ανασυνδυασμένο DNA πακετάτε σε αυτές, σχηματίζοντας καινούργιους φάγους. * Πραγματοποιείται προσθήκη φάγων σε καλλιέργεια βακτηρίων. * Απεικονίζεται ένας φάγος ο οποίος προσκολλάται στο βακτήριο και το DNA τους εισέρχεται στο κύτταρο. ```