Storia della Microbiologia PDF

Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Storia della Microbiologia  Maria Luisa Savo Sardaro INTRODUZIONE ALLA MICROBIOLOGIA Storia e scopo...

Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Storia della Microbiologia  Maria Luisa Savo Sardaro INTRODUZIONE ALLA MICROBIOLOGIA Storia e scopo della Microbiologia Storia della Microbiologia 2 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro Definizione § La Microbiologia è la scienza che studia i microrganismi e la loro attività. § Ha per oggetto la forma, la struttura, la riproduzione, la fisiologia, il metabolismo e l’identificazione dei microrganismi. Storia della Microbiologia 3 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro Comprende lo studio della loro distribuzione in natura le relazioni tra loro e con gli altri esseri viventi gli effetti benefici e dannosi che hanno sugli esseri umani le modificazioni fisiche e chimiche che provocano nel loro ambiente Storia della Microbiologia 4 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro La microbiologia n studia quegli organismi che sono talmente piccoli da non poter essere osservati ad occhio nudo, ma tramite l’utilizzo di un microscopio. n si avvale di tecniche di sterilizzazione e di mezzi di coltura utili per l’isolamento e la crescita dei microrganismi. Storia della Microbiologia 5 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro Il ruolo dell’infinitamente piccolo è infinitamente grande! Louis Pasteur Storia della Microbiologia 6 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro Storia della Microbiologia 7 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro L’importanza dei microrganismi I microbi possono essere: n causa di malattie che colpiscono il regno vegetale ed animale n causa di degradazione degli alimenti n essenziali per la vita n necessari per i cicli geochimici e la fertilizzazione del suolo; n importanti per la conservazione degli alimenti mediante fermentazioni degli alimenti n utilizzati come produttori di farmaci e molecole per uso industriale Storia della Microbiologia 8 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro Generazione spontanea o Biogenesi Aristotele (384-322 a.C.) pensava che gli animali potessero originarsi spontaneamente dalle piante e dal terreno. Secondo il grande pensatore dell’antichità gli organismi viventi si originavano, in genere, da altri organismi a loro simili, però a volte possono anche scaturire dalla materia inerte. Esisterebbe infatti, in tutte le cose, un "principio passivo“ rappresentato dalla materia e un "principio attivo" rappresentato dalla forma. Storia della Microbiologia 9 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro Generazione Spontanea o Biogenesi Fino al XVII secolo si pensava che gli organismi viventi potevano generarsi spontaneamente dalla materia in decomposizione. Storia della Microbiologia 10 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro Il medico e poeta toscano Francesco Redi (1626-1697) confutò la teoria della Generazione spontanea, conducendo esperimenti sulla carne in putrefazione. Nel 1668 Redi condusse una serie di esperimenti i quali avrebbero dovuto dimostrare che la generazione spontanea non esiste. Storia della Microbiologia 11 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro Egli mise della carne di vitello e del pesce in alcuni recipienti che sigillò ermeticamente, lasciandone aperti degli altri. Dopo un po' di tempo poté notare la presenza di vermi (in realtà si trattava di larve di insetti) sulle carni in putrefazione all'interno dei recipienti aperti nei quali entravano e uscivano liberamente mosche e altri insetti, mentre non vi era traccia di organismi viventi all'interno dei recipienti chiusi. Storia della Microbiologia 12 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro All’obiezione degli scienziati aristotelici che dicevano che nei recipienti chiusi ermeticamente mancava l’aria e per questo il principio attivo non si era manifestato, Redi rispose ripetendo l’esperimento chiudendo i recipienti solo con un lembo di stoffa sottile e fine in modo che non potesse né entrare né uscire nulla tranne l’aria. Ugualmente non vi fu traccia di organismi viventi all’interno di questi recipienti. Quindi Redi dimostrò che i vermi comparivano solo se le mosche potevano entrare a deporre le uova sulla carne: quindi la teoria della generazione spontanea era smentita. Storia della Microbiologia 13 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro Generazione Spontanea o Biogenesi Invenzione del Microscopio: 1595 un olandese Zacaria Jannsen e il 1624 Galileo Galilei Antony van Leeuwenhoek (1632-1723) nel 1676 scopre gli “animalcules” grazie al suo microscopio. John Needham (1713-1781) nel 1748 rese noti i risultati dei suoi esperimenti, condotti sul brodo di montone, a favore della teoria della Generazione spontanea. Storia della Microbiologia 14 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro Più o meno nello stesso tempo in cui Redi compiva i suoi esperimenti un naturalista olandese, di nome Anton Van Leeuwenhoek (1632–1723), osservò, per la prima volta, la presenza di microrganismi attraverso un rudimentale microscopio da lui stesso costruito. Le osservazioni al microscopio ben presto si moltiplicarono e la presenza di un numero tanto abbondante di microrganismi all'interno di tutte le sostanze esaminate fece risorgere l'idea della generazione spontanea, che gli esperimenti di Redi sembravano avere allontanato. Le osservazioni di Leeuwenhoek stimolarono nuove ricerche in quella direzione e la disputa fra teoria della biogenesi (la vita deriva dalla vita) e teoria della abiogenesi o generazione spontanea (la vita si origina da sostanze non viventi) si spostò dal mondo macroscopico dei vermi e delle mosche a quello microscopico dei protozoi e dei batteri. Storia della Microbiologia 15 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro Antony van Leeuwenhoek Tra i primi scienziati ad utilizzare, diffondere e migliorare l'uso del microscopio, a partire dal XVII secolo Storia della Microbiologia 16 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro Nel 1745 il naturalista inglese John Needham condusse una serie di esperimenti che dettero nuovo vigore alla tesi dell’abiogenesi. Egli scaldò vari liquidi nutritivi come il brodo di pollo o gli infusi d'erbe coi quali riempì alcune provette che poi tappò con della garza. Ebbene, nonostante tutti gli accorgimenti adottati affinché non entrasse nulla nelle provette che contenevano le soluzioni nutritive scaldate dal calore, dopo alcuni giorni si poteva notare che queste pullulavano di organismi viventi. I risultati dei suoi esperimenti lo convinsero che la generazione spontanea era effettivamente possibile. Storia della Microbiologia 17 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro Spallanzani (1729-1799) introduce la pratica della sterilizzazione dei terreni e nel 1799 attacca la teoria della abiogenesi, perfezionando l’esperimento di Needham. Alcuni anni più tardi infatti, rifece gli stessi esperimenti di Needham ma riscaldando il liquido nutritivo molto più a lungo e a temperature molto più alte, fino a farlo bollire per alcuni minuti. Ebbene il risultato fu che anche dopo molti giorni i liquidi contenuti nelle provette, questa volta ermeticamente tappate, rimanevano limpidi e non mostravano la presenza di microrganismi al loro interno. Storia della Microbiologia 18 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro La controversia continuò ancora per molti anni e si concluse definitivamente verso la metà del XIX secolo quando il biologo francese Louis Pasteur ideò un esperimento che avrebbe messo la parola fine a una questione che sembrava irrisolvibile. L'esperimento venne condotto all'interno di un apparato molto semplice, ma geniale, costruito in modo tale da non poter più dar adito a dubbi. Pasteur inventò dei contenitori di vetro con un lungo collo ricurvo ad S (detti, per la loro forma, "palloni a collo di cigno"), che gli permisero di fare l’esperimento in presenza di aria in questo modo: Storia della Microbiologia 19 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro Storia della Microbiologia 20 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro A. all'interno di normali palloni a collo corto Pasteur riponeva la soluzione nutritiva (brodo di coltura); B. il collo corto dei palloni veniva poi assottigliato ed allungato a collo di cigno; C. i palloni venivano messi a bollire per più di un'ora lasciando che il vapore uscisse liberamente dall'orifizio terminale del collo ricurvo. D. Spenta la fiamma, il liquido contenuto nel recipiente cominciava a raffreddarsi lentamente dopo aver richiamato aria dall'esterno, a causa della depressione conseguente al riscaldamento. E. Un gruppo di palloni veniva lasciato così a temperatura ambiente per qualche giorno; F. Ad un secondo gruppo di palloni Pasteur rompeva la parte ad S del collo lasciandoli nello stesso ambiente e per lo stesso tempo degli altri. Storia della Microbiologia 21 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro RISULTATI: All’osservazione nel brodo contenuto nei palloni con il collo ad S non c’era traccia di contaminazione di microrganismi, mentre nei palloni con il collo rotto il brodo di coltura era intorbidito e ricco di microrganismi. Quindi Pasteur concluse che i microrganismi arrivavano sul brodo di coltura, dove si riproducevano in gran quantità, con il pulviscolo contenuto nell’aria. SINTESI FINALE DI PASTEUR: Nelle condizioni ambientali oggi esistenti sul pianeta Terra la generazione spontanea non è possibile e quindi ogni organismo, anche unicellulare, può derivare solo da uno simile preesistente. Storia della Microbiologia 22 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro Generazione spontanea o Biogenesi § Louis Pasteur (1822-1895) introduce l’uso dei recipienti con collo di cigno. § John Tyndall (1820-1893) nel 1877 dimostra che la polvere può trasportare i germi. § Fernand Cohn nel 1877 scopre le endospore termoresistenti. § Robert Koch nel 1876 introduce il concetto di eziologia. Storia della Microbiologia 23 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro Louis Pasteur e Robert Koch Storia della Microbiologia 24 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro Microbi e malattie Molte malattie sono causate da infezioni virali, batteriche, fungine e protozoarie. 1876 I postulati di Koch vengono utilizzati per determinare il legame che esiste tra una malattia ed il microrganismo che si sospetta ne sia la causa. Storia della Microbiologia 25 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro Postulati di Koch 1. L’agente causale deve essere presente in tutti i casi della malattia di cui è ritenuto responsabile e deve essere invece assente negli individui sani. 2. L’agente causale deve essere isolato dall’individuo affetto e, posto in coltura, deve dare origine ad una popolazione cellulare omogenea (una sola specie). Storia della Microbiologia 26 di 27  Maria Luisa Savo Sardaro Postulati di Koch 3. L’inoculo di una coltura pura dell’agente causale in individui sani deve dare luogo alla comparsa della malattia di cui si ritiene responsabile. 4. L’agente causale deve essere re-isolato dall’individuo infettato sperimentalmente. Storia della Microbiologia 27 di 27 Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Tassonomia o Sistematica dei batteri  Maria Luisa Savo Sardaro Classificazione degli esseri viventi Il dominio Bacteria – i batteri rappresentano un gruppo di procarioti molto diversificato e abbondante. Essi si trovano praticamente ovunque sulla Terra; il dominio Archaea – anche gli archei sono procarioti, ma dal punto di vista biochimico sono più affini agli eucarioti che ai batteri. Essi vivono in ambienti estremi; il dominio Eukarya – gli eucarioti comprendono sia forme unicellulari sia organismi pluricellulari, tutte con cellule dotate di un nucleo racchiuso da una membrana. La riproduzione degli eucarioti è sessuata e si osservano diversi tipi di ciclo vitale. Tassonomia o Sistematica dei batteri 2 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Il sistema di classificazione a tre domini Sylvia S. Mader Immagini e concetti della biologia © Zanichelli editore, 2012 Tassonomia o Sistematica dei batteri 3 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Classificazione dei Microrganismi Tassonomia Studia la classificazione dei microrganismi in un sistema gerarchico. Raggruppando i microrganismi, che presentano caratteri morfologici biochimici e genetici simili, in gruppi o taxa Tassonomia o Sistematica dei batteri 4 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Phylum Firmicutes Classe Bacilli (III) Clostridia ……… Ordine Bacillales (I) Lactobacillales Famiglia Bacillaceae (I) Listeriaceae Staphylococcaceae ……. Genere Bacillus (I) …………………….. Specie B. anthracis B. cereus B. thuringiensis B. subtilis …… Tassonomia o Sistematica dei batteri 5 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro CLASSIFICAZIONE dei BATTERI unità tassonomica = specie: insieme di ceppi batterici che mostrano molte caratteristiche fenotipiche comuni che ne permettono la distinzione da altre specie. ceppo o clone = insieme di cellule geneticamente identiche, derivate da subcoltura di una singola colonia isolata in purezza. – ceppo tipo (type strain): coltura da cui è stata descritta originariamente la specie; depositata presso collezioni di colture batteriche (ATCC...); esempio permanente della specie. – ceppo di referenza: coltura usata in studi di malattie infettive e per diverse applicazioni di laboratorio; depositata presso collezioni (≠ ceppi per ≠ usi). Tassonomia o Sistematica dei batteri 6 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro CLASSIFICAZIONE dei BATTERI a seconda del tipo di differenze tra ceppi di una stessa specie: Biotipi o Biovars: ceppi caratterizzati da differenze biochimiche o fisiologiche Sierotipi o Serovars: ceppi caratterizzati da differenze antigeniche Fagotipi o Phagovars: ceppi caratterizzati da differenze di sensibilità a diversi batteriofagi Resistotipi: ceppi caratterizzati da differenze nella resistenza agli antibiotici Tassonomia o Sistematica dei batteri 7 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Classificazione degli Esseri Viventi Linneo e la nomenclatura binomia Nel Settecento il botanico svedese Carl von Linné o Linneo (1707−1778) propose un nuovo modo scientifico per catalogare gli organismi. La classificazione sistematica ideata da Linneo dà «un nome e un cognome» alle specie viventi attraverso la nomenclatura binomia. Tassonomia o Sistematica dei batteri 8 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Classificazione Dei Batteri nomenclatura binomiale nome di specie costituito da 2 parole latine (in corsivo o sottolineato) 1a = genere (iniziale maiuscola) 2a = specie (iniziale minuscola) classificazione descritta nel “Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology” aggiornamenti tassonomici sono riportati in alcuni siti internet ad es.: http://www.bacterio.cict.fr/ Tassonomia o Sistematica dei batteri 9 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Quali metodi possono essere adottati per identificare e classificare un batterio? 1) Metodi microbiologici tradizionali basati sulle osservazione delle caratteristiche fenotipiche del ceppo isolato 2) Metodi microbiologici avanzati basati sullo studio delle sequenze genetiche quindi del carattere genetico legato al DNA specifico del ceppo isolato. Tassonomia o Sistematica dei batteri 10 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro 1) La colorazione di Gram (dal nome del patologo danese che la mise a punto alla fine dell’800) è un metodo che classifica i batteri in base a differenze nella loro parete cellulare. I batteri vengono dapprima trattati con cristal-violetto e poi con una soluzione iodo-iodurata (liquido di Lugol); quindi decolorati con alcool etilico o acetone e ricolorati con un colorante diverso dal primo (fucsina). Quelli che cedono il primo colore sono detti Gram-negativi (Gram -), quelli che lo trattengono Gram-positivi (Gram +). Batteri Gram + Batteri Gram - Tassonomia o Sistematica dei batteri 11 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro 2) Tassonomia o Sistematica dei batteri 12 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Tassonomia o Sistematica dei batteri 13 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Tassonomia o Sistematica dei batteri 14 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Tassonomia o Sistematica dei batteri 15 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Tassonomia o Sistematica dei batteri 16 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Tassonomia o Sistematica dei batteri 17 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Tassonomia o Sistematica dei batteri 18 di 18 Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Monitoraggio microbiologico ambientale  Maria Luisa Savo Sardaro Metodi di campionamentoe monitoraggio degli ambienti Monitoraggio Microbiologico Ambientale (MAM) La contaminazione microbica è dovuta principalmente a due fattori: la contaminazione diretta da parte di presidi non sterili e la contaminazione indiretta da parte di agenti microbici aerodispersi. La sorgente di contaminazione è rappresentata soprattutto dall’uomo e dai sistemi di ventilazione. Per garantire condizioni di sicurezza è quindi necessario effettuare controlli sistematici su aria e superfici di un ambiente a rischio. Sulla base di tali considerazioni si è andato sviluppando nel tempo il concetto di MAM (Monitoraggio Microbiologico Ambientale), un sistema che si prefigge di quantificare la carica microbica in un ambiente confinato. Monitoraggio microbiologico ambientale 2 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro Il Monitoraggio Microbiologico Ambientale –MAM – è una metodica che si compone di due momenti: il controllo dell’aria il controllo delle superfici L’aria è il veicolo tramite il quale gli agenti microbici (legati a particelle inerti di almeno 10 mµ di diametro) si muovono nell’ambiente, raggiungono le superfici e vi si depositano. Il monitoraggio delle superfici è essenziale per conoscere il fall out microbico, cioè quella parte di bioaerosol e di microrganismi in esso presenti che si deposita sulle superfici costituendo un potenziale veicolo di infezione. Monitoraggio microbiologico ambientale 3 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro Fattori che influenzano la sopravvivenza dei microrganismi nell’aria a) resistenza propria del microrganismo b) umidità relativa dell’aria c) temperatura dell’aria e luce solare d) composizione dell’aerosol e) modalità di campionamento dell’aerosol Monitoraggio microbiologico ambientale 4 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro ARIA L’aria può essere veicolo di contaminazione di semilavorati e del prodotto finito. Per questo motivo molte aree nelle aziende sono dotate di sistemi di filtrazione dell’aria a vari livelli di efficienza che minimizzano la presenza di microrganismi. E’ dunque necessario un controllo costante di tali aree per valutare l’efficacia dei sistemi di filtrazione. Occorre validare il sistema di filtrazione dell’aria e garantirne il buon funzionamento con il monitoraggio Monitoraggio microbiologico ambientale 5 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro ARIA Validazione: Consiste nell’effettuare per 3 mesi consecutivi in zone critiche prefissate, campionamenti d’aria settimanale per ottenere un dato statisticamente significativo che rispetti i limiti previsti dalle Norme di Buona Fabbricazione. Il monitoraggio ambientale prevede controlli mensili Monitoraggio microbiologico ambientale 6 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro PARAMETRI MICROBIOLOGICI Carica Batterica Totale a 36°C (batterii mesofili) temperatura ottimale di sviluppo fra 25 e 40 °C batteri patogeni convenzionali o opportunusti e tutti i batteri che costituiscono la flora normale dell’uomo. Carica Batterica Totale a 20°C (batterii psicrofili) temperatura di 15 – 30 °C tutti i microrganismi saprofiti che sono in grado di compiere il proprio ciclo vitale a spese di sostanze organiche in decomposizione, per cui sono in grado di colonizzare il suolo e gli ambienti umidi. Carica muffe e lieviti totale La determinazione di questo parametro è necessaria poiché la loro presenza è spesso correlata alla presenza di polvere e può essere considerevole in presenza di elevata umidità Staphylococcus spp.: sono cocchi Gram positivi e sono numericamente i più rappresentati nella popolazione microbica normale della cute e dell’orofaringe dell’uomo. Monitoraggio microbiologico ambientale 7 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro I batteri più comuni degli ambienti confinati sono: Bacillus, Pseudomonas, Staphylococcus, Micrococcus, Methylobac terium, Flavobacterium. Tali germi fanno parte della normale flora microbica degli ambienti confinati e la loro presenza in generale non deve creare allarmismo. Dei batteri riscontrati maggiormente, Staphylococcus spp. è un indicatore di buone pratiche di pulizia e potenziale patogeno. Monitoraggio microbiologico ambientale 8 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro I controlli ambientali: le superfici Le superfici degli impianti destinati alla produzione ed al confezionamento dei prodotti devono essere mantenute in perfette condizioni igieniche al fine di evitare lo sviluppo di microrganismi che potrebbero determinare una contaminazione dei semilavorati e dei prodotti finiti. Il campionamento si effettua con la: Tecnica Swab: effettuato il lavaggio delle attrezzature con l’impiego del detergente del sanitizzante idoneo, si sfrega un tampone su una superficie ben definita da campionare. Tecnica delle membrane di nitrocellulosa (per 30’’ e incubati alle T° idonee e su diversi terreni di coltura) INDICI DAVALUTARE: AM: accumulo microbico AMO: accumulo microbico orario Monitoraggio microbiologico ambientale 9 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro Metodi di campionamento e monitoraggio dell’aria I metodi adottati per il c ontrollo mic robiologic o dell’aria ambientale si basano sui seguenti campionamenti: CAMPIONAMENTO PASSIVO CAMPIONAMENTO ATTIVO Monitoraggio microbiologico ambientale 10 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro CAMPIONAMENTO PASSIVO Impiego di piastre Petri di sedimentazione. Viene tolto il coperchio della capsula Petri contenente il terreno di coltura agarizzato sterile, in modo che la superficie dell’agar rimanga esposta all’aria per un tempo definito. Al termine si richiude la piastra e si procede all’incubazione a 37°C per 48 ore e a 25° C per altre 24 ore. Si conta il numero di colonie cresciute I risultati vengono espressi nell’ unità di misura: UFC (=Unità Formante Colonia)/m2/ora Monitoraggio microbiologico ambientale 11 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro CAMPIONAMENTO PASSIVO Standard da seguire: Piastra: 1 m da terra Durata esposizione: 1 ora Terreno di coltura: PCA Agar T° e durata incubazione: 37°C per 48 ore IMA: indice contaminazione dell’aria Indice IMA= n° di UFC Monitoraggio microbiologico ambientale 12 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro Classi IMA GRUPPO A ESEMPIODI CLASSE INDICE IGIENE RISCHIO UTILIZZO IMA IMA ARIA 1 0- 5 OTTIMA MOLTO -ULTRACLEANROOM ALTO -IMPIANTIETRAPIANTI -OPERAZIONI ASETTICHE 2 6 - 25 BUONA ALTO -REPARTO INTENSIVO -PICCOLA CHIRURGIA 3 26 - 50 MEDIOCRE MEDIO - AMBIENTI CON PARTICOLARE RILEVANZA D’ IGIENEAMBIENTALE - AMBIENTI SENZA PARTICOLARE 4 51 - 75 CATTIVA BASSO RILEVANZA D’ IGIENEAMBIENTALE 5 ›Nu7o66votesto PESSIMA NULLO - ALTRIAMBIENTI Monitoraggio microbiologico ambientale 13 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro CAMPIONAMENTO ATTIVO attraverso l’uso di una apparecchiatura “SAS Surface Air System” portatile una quantità misurata di aria è aspirata in un coperchio sotto il quale è collocata una capsula petri contenente terreno agarizzato. Le piastre Petri vengono incubate a 37°C per 48 ore e a 25° C per altre 24 ore Le colonie cresciute sulla superficie dell’agar vengono contate e i risultati espressi in UFC/m3 in rapporto al volume d’aria aspirato ed analizzato. Monitoraggio microbiologico ambientale 14 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro CAMPIONAMENTO ATTIVO La conta totale delle colonie batteriche delle piastre di TSA (Triptic Soy Agar), di MSA (Mannitol Salt Agar) e di SAB (Sabouraud Agar) effettuata dopo incubazione è stata espressa in CFU/m3 ed è stata calcolata nel seguente modo: il numero totale (N) delle colonie cresciute è stato diviso per il volume d’aria campionato (V, espresso in litri), e il risultato moltiplicato per 1000 (1 m3 =1000 l). CFU/m3 = (N / V) x 1000 Le piastre di TSA sono incubate a 22°C e a 36°C per 48h. Le piastre di MSA sono state incubate a 36°C per 48h. I risultati delle letture sono stati espressi in CFU/m3 Monitoraggio microbiologico ambientale 15 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro Monitoraggio microbiologico ambientale 16 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL’ARIA CAMPIONAMENTO ATTIVO PASSIVO S.A.S. I.M.A. Monitoraggio microbiologico ambientale 17 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL’ARIA CAMPIONAMENTO I.M.A. – Indice Microbico Aria Esposizione all’aria di Piastre Petri PASSIVO contenenti agar, tempo di 1 ora a 1 m di altezza I.M.A. a 1 m da ogni ostacolo Particelle > 10 µm Monitoraggio microbiologico ambientale 18 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL’ARIA CAMPIONAMENTO PASSIVO I.M.A. Monitoraggio microbiologico ambientale 19 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL’ARIA Monitoraggio microbiologico ambientale 20 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL’ARIA CAMPIONAMENTO Surface Air System: ATTIVO Campionatore ad impatto convoglia l’aria aspirata direttamente su agar. S.A.S. Flusso 180 L/min 1,5 m di altezza Monitoraggio microbiologico ambientale 21 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL’ARIA CAMPIONAMENTO ATTIVO S.A.S. Monitoraggio microbiologico ambientale 22 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL’ARIA Monitoraggio microbiologico ambientale 23 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL’ARIA parametri di valutazione I.M.A. S.A.S. (Pitzurra, 1997) (Orpianesi et al., 1983) GIUDIZIO I.M.A. (ufc/ dm2 /h) ufc/m 3 ottimo 0÷ 9 buono 10 ÷ 39 0 ÷ 125 mediocre 40 ÷ 84 126 ÷ 250 cattivo 85 ÷ 124 251 ÷ 375 pessimo > 124 > 375 Monitoraggio microbiologico ambientale 24 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro H2O Monitoraggio microbiologico ambientale 25 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro L’acqua potabilizzata può contenere una flora microbica “autoctona” e ”alloctona”, capace di resistere ai trattamenti di potabilizzazione. Alcuni di questi microrganismi possono trovare condizioni favorevoli al loro mantenimento in rete. Monitoraggio microbiologico ambientale 26 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro BIOFILM Comunità batterica, altamente stratificata, adesa ad una superficie,, circondata da una matrice extracellulare di natura organica e inorganica dove i microrganismi sono organizzati in una comunità funzionale. Monitoraggio microbiologico ambientale 27 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro Formazione di un biofilm costituito da più specie microbiche Batteri: (cariche positive) cariche -- (cariche +) Monitoraggio microbiologico ambientale 28 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro Protocollo disconnessione della rete idrica e applicazione di un sistema di alimentazione indipendente. modifiche tecniche al circuito per renderlo compatibile con i trattamenti. trattamento dei circuiti. ricollegamento alla rete idrica. Monitoraggio microbiologico ambientale 29 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro 1. Dalla difficoltà di utilizzare di routine tecniche finalizzate alla ricerca di tutti i possibili microrganismi patogeni, é sorta la necessità di ricercare, per la definizione della qualità di un'acqua, microrganismi indicatori di contaminazione, la cui presenza può essere indice della presenza di patogeni. 2. Un efficace indicatore microbiologico di contaminazione deve: a)poter sopravvivere sufficientemente a lungo nell'ambiente per consentire la sua evidenziazione b)deve poter essere identificato con metodologie poco complesse e sufficientemente rapide. Monitoraggio microbiologico ambientale 30 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro Sistema delle membrane filtranti: quantitativo e qualitativo Volume prestabilito di acqua da saggiare Risultato UFC/ml di H2Ofiltrata Monitoraggio microbiologico ambientale 31 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro Microbiologia: metodo delle membrane filtranti Metodo delle membrane filtranti N Colonie/100 ml = (N colonie contate/ volume campione filtrato) *100 Monitoraggio microbiologico ambientale 32 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro - Conta dei coliformi totali (UFC/ml) Microbiologia: analisi delleacque - Conta dei coliformi fecali (UFC/ ml) - Conta delgi Streptococchi fecali TERRENODI T° INC. TEMPO INC. COLTURA CONTA PCA 22°C 72h BATTERICA (Plate Agar 36°C 48h TOTALE Count) COLIFORMI Membrane endo agar 36°C 24h TOTALI less COLIFORMI Membrane 44°C 24h FECALI faecal coliform STREPTOCOCCHI KF streptococcus 36°C 48h FECALI Monitoraggio microbiologico ambientale 33 di 34  Maria Luisa Savo Sardaro Monitoraggio microbiologico ambientale 34 di 34 Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Procarioti e Eucarioti  Maria Luisa Savo Sardaro Quali sono i microrganismi? Questa categoria comprende: virus, batteri, funghi, protozoi ed alcuni tipi di alghe. Esistono due tipi fondamentalmente differenti di cellule microbiche: Procariotiche Eucariotiche Procarioti e Eucarioti 2 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro PROCARIOTI n Organismi con struttura cellulare semplice ed un nucleo primitivo non separato, da una membrana, dal citoplasma. n Le cellule maggiormente rappresentative del gruppo dei Procarioti sono quelle batteriche. Procarioti e Eucarioti 3 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro EUCARIOTI n Questi organismi sono caratterizzati da una cellula avente un nucleo delimitato da una membrana che lo separa dal citoplasma, organelli interni (mitocondri, cloroplasti..), complessi di membrane. n Appartengono al gruppo degli Eucarioti: le alghe, i funghi, i protozoi, le piante superiori e gli animali. Procarioti e Eucarioti 4 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro E’ sempre un problema di dimensioni!!! Procarioti e Eucarioti 5 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Organizzazioni cellulari Cellula procariotica (Procarioti) Archeobatteri, Eubatteri Cellula eucariotica (Eucarioti) Protisti, Funghi, Piante, Animali Nucleo, Sistema di membrane interne, Compartimentazione citoplasma Procarioti e Eucarioti 6 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro La cellula dei procarioti Apparentemente semplice.................... Flagelli I batteri possono essere statici o muoversi nell’ambiente circostante per mezzo di particolari Pili appendici distribuite sulla superficie cellulare. Per conferire forma e rigidità alla cellula i batteri Parete possiedono un rivestimento (parete batterica) che ricopre la membrana plasmatica Procarioti e Eucarioti 7 di 18. Maria Luisa Savo Sardaro Membrana Barriera selettiva, semipermeabile, simile a plasmatica quella delle cellule animali e vegetali Citoplasma Il citoplasma ha caratteristiche analoghe a quello degli altri organismi viventi e lo stesso vale per le reazioni biochimiche. Sprovvisti di un nucleo separato dal citoplasma Nucleoide per mezzo di membrana, e mancano anche di cromosomi morfologicamente identificabili: il cromosoma batterico è infatti un'unica molecola di DNA Procarioti e Eucarioti 8 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro La cellula dei procarioti Citoplasma Nucleoide Ribosomi Parete cellulare Pili Procarioti e Eucarioti 9 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro La membrana plasmatica La membrana cellulare si trova tra la parete e il citoplasma. È costituita da un doppio strato di molecole lipidiche, che rappresenta la struttura portante, tra la quali sono inserite delle molecole proteiche, responsabili delle diverse funzioni della membrana; sono infatti enzimi catalizzatori, recettori di stimoli e ancora sono proteine di trasporto di sostanze attraverso la membrana. La sua funzione non è solo quella di selezionare la direzione e l’entità degli scambi con l’esterno, ma è legata anche alla divisione cellulare. Nei batteri che producono ATP tramite la respirazione, è sede degli enzimi, dei vettori di idrogeno dei processi di fosforilazione ossidativa che nelle cellule eucariotiche si trovano nei mitocondri Procarioti e Eucarioti 10 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Citoplasma Composizione: - Cytosol - Particelle insolubili in sospensione Cytosol:- solvente acquoso - soluti vari: ioni, micro e macromolecole Procarioti e Eucarioti 11 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Rivestimenti esterni Capsula Membrana Esterna Caratterizzano i batteri Parete cellulare Membrana plasmatica Procarioti e Eucarioti 12 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Funzioni della parete cellulare Involucro rigido al di sopra della membrana citoplasmatica Anti lisi osmotica Forma (Bastoncini, cocchi, a virgola, a spirale) Caratteristiche tintoriali (Gram+ e Gram -) Virulenza e patogenicità Costituisce il bersaglio di molti antibiotici Procarioti e Eucarioti 13 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Le diverse forme della cellula batterica Sferica Bastoncelli Spiralati Procarioti e Eucarioti 14 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Cocchi Str. thermophilus Staphylococcus epidermidis St. thermophilus Procarioti e Eucarioti 15 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Bacilli Bacillus anthracis Lb. bulgaricus Lb. casei Procarioti e Eucarioti 16 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Spirilli - Spirocheta Spiranthes Rich. Gli spirilli hanno una cellula con una forma a spirale per la presenza di una o più curvature. Es. Campylobacter, enterite acuta; Helicobacter pilori gastrite acuta Procarioti e Eucarioti 17 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Vibrioni Vibrio cholerae L’agente del colera negli esseri umani Procarioti e Eucarioti 18 di 18 Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento La parete cellulare e caratteristiche dei procarioti  Maria Luisa Savo Sardaro Costituzione della parete batterica Componente strutturale della parete: il peptidoglicano 1. singola macromolecola 2. lunghissimo polimero lineare, stabilizzato da fitti legami trasversi 3. avvolge la cellula, formando un astuccio rigido e resistente 4. determina la forma 5. impedisce il rigonfiamento La parete cellulare e caratteristiche dei procarioti 2 di 17  Maria Luisa Savo Sardaro Organizzazione della parete batterica Organizzazione diversa della parete nei Gram positivi Gram negativi La parete cellulare e caratteristiche dei procarioti 3 di 17  Maria Luisa Savo Sardaro Organizzazione della parete batterica Gram positivi Gram negativi Strato unico Strato doppio Strato spesso di mureina con molti Strato più sottile di mureina con legami crociati meno legami crociati – nel contesto proteine, ac teicoici, ac lipoteicoici al di sopra membrana esterna – proteine, lipidi, lipoproteine, lipopolisaccaridi La parete cellulare e caratteristiche dei procarioti 4 di 17  Maria Luisa Savo Sardaro Parete P: peptidoglicano; ME: membrana esterna; MC: membrana citoplasmatica. La parete cellulare e caratteristiche dei procarioti 5 di 17  Maria Luisa Savo Sardaro Struttura del peptidoglicano Gram-positivi Membrana esterna Gram-negativi La parete cellulare e caratteristiche dei procarioti 6 di 17  Maria Luisa Savo Sardaro Struttura e differenze della parete cellulare nei batteri gram-positivi e gram- negativi La parete cellulare e caratteristiche dei procarioti 7 di 17  Maria Luisa Savo Sardaro Capsula Sia i batteri Gram-positivi che Gram-negativi possono presentare un ulteriore involucro esterno mucoso detto capsula. Prodotto di secrezione della cellula batterica. Proprietà: – Polisaccaridi o Polipeptidi – Adesione al “substrato” – Difesa (sistema immunitario, batteriofagi, disinfettanti chimici) – Protezione dalla disidratazione – Patogenicità (Streptococcus pneumoniae) La parete cellulare e caratteristiche dei procarioti 8 di 17  Maria Luisa Savo Sardaro La parete cellulare e caratteristiche dei procarioti 9 di 17  Maria Luisa Savo Sardaro La parete cellulare e caratteristiche dei procarioti 10 di 17  Maria Luisa Savo Sardaro La formazione delle endospore nei batteri In condizioni ambientali sfavorevoli alcuni batteri formano endospore: una porzione del citoplasma e una copia del cromosoma si disidratano e vengono racchiusi all’interno di un rivestimento protettivo duro. La parete cellulare e caratteristiche dei procarioti 11 di 17  Maria Luisa Savo Sardaro I procarioti si riproducono per via asessuata I procarioti si riproducono per via asessuata mediante la scissione binaria, un processo che produce due cellule figlie di dimensioni e contenuto pressoché identici. L’immagine illustra i tre stadi della scissione binaria. La parete cellulare e caratteristiche dei procarioti 12 di 17  Maria Luisa Savo Sardaro Scissione binaria – Scissione in 2 cellule uguali Gemmazione – Produzione cellule più piccole da una “madre” Ricombinazione genetica – Scambio di DNA tra 2 cellule diverse La parete cellulare e caratteristiche dei procarioti 13 di 17  Maria Luisa Savo Sardaro La riproduzione dei batteri è asessuata e avviene mediante la divisione di un individuo in due cellule figlie uguali tra loro e identiche alla progenitrice e viene definito scissione binaria, processo molto simile, ma molto più semplice della mitosi cellulare, e comprende anche la riorganizzazione del citoplasma e la costituzione di nuove strutture cellulari. Questo processo si ripete, ogni divisione impiega circa 30 minuti, e la coltura batterica cresce. La parete cellulare e caratteristiche dei procarioti 14 di 17  Maria Luisa Savo Sardaro Nucleoide Porzione del citoplasma dove si concentra il DNA DNA procariotico: Unica molecola circolare Pochissime proteine legate Attaccato alla MP La parete cellulare e caratteristiche dei procarioti 15 di 17  Maria Luisa Savo Sardaro L’informazione genica nei batteri Nei batteri il programma viene registrato su di una lunga molecola di DNA, chiusa ad anello à cromosoma batterico Nella cellula batterica possono essere presenti altri piccoli anelli di DNA che portano poche informazioni -geni- à i plasmidi plasmide cromosoma I plasmidi possono passare da una cellula batterico batterica a un’altra à trasformazione batterica La parete cellulare e caratteristiche dei procarioti 16 di 17  Maria Luisa Savo Sardaro STRUTTURA del DNA La parete cellulare e caratteristiche dei procarioti 17 di 17 Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Parametri estrinseci che influenzano la crescita microbica  Maria Luisa Savo Sardaro FATTORI CHE INCIDONO SULLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI NEGLI ALIMENTI pH DEL SUBSTRATO Aw INTRINSECI POTENZIALE REDOX E DISPONIBILITÀ DI O2 COMPOSIZIONE ALIMENTO- CONTENUTO DI NUTRIENTI TEMPERATURA ESTRINSECI ATMOSFERA DI CONSERVAZIONE DELL’ ALIMENTO Parametri estrinseci che influenzano la crescita microbica 2 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro COMPOSIZIONE DELL’ALIMENTO I microrganismi per crescere negli alimenti hanno bisogno di una sorgente di energia e di composti chimici Negli alimenti: MICRORGANISMI CHEMIOETEROTROFI I microrganismi trovano negli alimenti il nutrimento necessario per il proprio metabolismo plastico ed energetico La composizione di un alimento influisce sulla crescita e selezione microbica Tutti gli alimenti presentano una composizione chimica in grado di permettere lo sviluppo di quasi tutti i microrganismi Parametri estrinseci che influenzano la crescita microbica 3 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro COMPOSIZIONE DELL’ALIMENTO Gram-positivi più esigenti di Gram-negativi entrambi i gruppi sono più esigenti di lieviti e muffe I microrganismi predominanti negli alimenti sono quelli che più facilmente sono in grado di utilizzare i nutrienti presenti. In genere i carboidrati e gli amminoacidi sono utilizzati per primi e solo quando essi diventano limitanti vengono utilizzate le forme più complesse di nutrienti Parametri estrinseci che influenzano la crescita microbica 4 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro COMPOSIZIONE DELL’ALIMENTO Alcuni alimenti sono provvisti di strutture esterne che rappresentano una barriera efficace contro la penetrazione dei microrganismi proteggendoli dalle alterazioni: Pelle degli animali Cuticola della frutta Guscio di noci Guscio dell’uovo La raccolta, la macellazione e i trattamenti tecnologici a cui sono sottoposte le materie prime diminuiscono o eliminano l’efficacia di queste barriere. Parametri estrinseci che influenzano la crescita microbica 5 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro COMPOSIZIONE DELL’ALIMENTO Molti alimenti possiedono naturalmente delle sostanze dotate di attività antimicrobica, che gli conferiscono un certo livello di stabilità microbiologica I vegetali sono ricchi di costituenti antimicrobici, come gli oli essenziali, i tannini, i glicosidi e le resine Anche alimenti di origine animale possiedono naturalmente sostanze con azione antimicrobica. Alcuni esempi sono rappresentati dal lisozima nelle uova Parametri estrinseci che influenzano la crescita microbica 6 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro COMPOSIZIONE DELL’ALIMENTO Gli alimenti sono un ecosistema costituito dall’ambiente e dai microrganismi che vivono in esso. L’alimento è un ecosistema nel quale fattori intrinseci (pH, aw, nutrienti) ed estrinseci (temperatura, presenza di altri microrganismi) regolano lo sviluppo microbico Le interazioni dei fattori ambientali determinano che un microrganismo possa o no svilupparsi in quell’ecosistema Parametri estrinseci che influenzano la crescita microbica 7 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro FATTORI CHE INCIDONO SULLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI NEGLI ALIMENTI pH DEL SUBSTRATO Aw INTRINSECI POTENZIALE REDOX E DISPONIBILITÀ DI O2 COMPOSIZIONE ALIMENTO- CONTENUTO DI NUTRIENTI TEMPERATURA ESTRINSECI ATMOSFERA DI CONSERVAZIONE DELL’ ALIMENTO Parametri estrinseci che influenzano la crescita microbica 8 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro TEMPERATURA E COMPORTAMENTO DEI MICRORGANISMI Ogni microrganismo presenta un intervallo di temperature entro cui può crescere Parametri estrinseci che influenzano la crescita microbica 9 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro TEMPERATURA E COMPORTAMENTO DEI MICRORGANISMI Si possono individuare tre limiti di temperatura (temperature cardinali): Minima: al di sotto non vi è più crescita in quanto le proprietà della membrana sono alterate non consentendo più il trasporto dei materiali all’interno della cellula. Attività enzimatiche rallentate Ottimale: massimo tasso di crescita temperatura. Range piuttosto ampio, anche di 5-7°C Massima: al di sopra non vi è più crescita in quanto gli enzimi sono denaturati. Anche proteine e lipidi di membrana sono danneggiati. Parametri estrinseci che influenzano la crescita microbica 10 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro FATTORI CHE INFLUENZANO LA RESISTENZA TERMICA Tipo di cellula Età della cellula Tenore in grasso Temperatura di crescita Presenza di sali Contenuto in acqua Presenza di carboidrati Composizione substrato Presenza sostanze proteiche pH Presenza sostanze inibenti Temperature superiori alla massima di crescita provocano la morte delle cellule (azione microbicida) a seguito di: Danni irreversibili a carico di strutture vitali Fenomeni di coagulazione delle proteine Rottura della parete Parametri estrinseci che influenzano la crescita microbica 11 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro TEMPERATURA Non sono le temperature di resistenza!!! Parametri estrinseci che influenzano la crescita microbica 12 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro CURVA DI CRESCITA TERMOFILI Il ciclo vitale è molto breve (8-9 ore) ed i massimi livelli di carica vengono raggiunti in poche ore (4-5). Caratterizzata da una lag fase e da una fase stazionaria molto brevi, e da una log fase e fase di morte veloce MESOFILI Il ciclo vitale ha un andamento più lento (48-72 ore) Caratterizzata da una lag fase e da una fase stazionaria più lunghe, e la pendenza della log fase e fase di morte è meno ripida dei termofili PSICROFILI Il ciclo vitale è molto lungo (120 ore), tutte le fasi durano di più, i massimi livelli di carica raggiunti sono inferiori a quelli raggiunti dagli altri due gruppi Parametri estrinseci che influenzano la crescita microbica 13 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro MICRORGANISMI PSICROFILI Si sviluppano alle temperature di refrigerazione degli alimenti (-5°C/+7°C). Quindi importanti perché responsabili delle alterazioni degli alimenti refrigerati. Fanno parte di questo gruppo alcuni batteri, lieviti, muffe. Perché possono crescere anche a basse temperature? I lipidi di membrana contengono un’alta percentuale di acidi grassi insaturi i quali abbassando il punto di solidificazione consentono alla membrana citoplasmatica di svolgere le proprie funzioni di assorbimento e trasporto dei nutrienti anche a bassa temperatura. Parametri estrinseci che influenzano la crescita microbica 14 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro DEFINIZIONI “PSICROFILO” termine coniato nel 1902 da Schmidt-Nielsen per i microrganismi che crescono nel range di temperature compreso tra 0°C e non superiore a 15°C, con un optimum di circa 10°C “PSICROTROFO” termine coniato nel 1960 per i microrganismi in grado di crescere tra 0° e 7°C. ma con un optimum maggiore 25-30°C La maggior parte degli psicrotrofi sono mesofili. Parametri estrinseci che influenzano la crescita microbica 15 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro MICRORGANISMI MESOFILI Questo gruppo comprende tutti i microrganismi patogeni per l’uomo e gli animali per cui la loro presenza in un alimento rappresenta sempre un fattore di rischio Sono largamente diffusi nell’ambiente (suolo e acqua). Molti di questi microrganismi patogeni sono in grado tuttavia di riprodursi, anche se con tempi di duplicazione lunghi, a temperature inferiori a 10°C Parametri estrinseci che influenzano la crescita microbica 16 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro MICRORGANISMI TERMOFILI E’ un gruppo di microrganismi di scarsa importanza pratica in microbiologia alimentare (alterativa o patogena), almeno nei nostri climi. Tuttavia la loro presenza può rappresentare una causa di alterazione per quei prodotti, in particolare conserve, commercializzati in luoghi dove la temperatura ambiente può raggiungere valori elevati. Questi microrganismi invece sono importanti come protecnologici (colture starter) Parametri estrinseci che influenzano la crescita microbica 17 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro EFFETTO TEMPERATURA ALTE TEMPERATURE BASSE TEMPERATURE Cell. vegetative morte Cell. vegetative Arresto crescita Spore Ne determinano morte Spore Non ne influenzano vitalità Tossine Vengono inattivate per la maggior Tossine Non ne influenzano l’attività parte (eccezione: tossina S. aureus, E. coli, B. cereus) Enzimi microbici Enzimi microbici Alcuni svolgono attività anche a basse Alcuni sopportano trattamenti sterilizzanti e danno temperature (sotto 0°C) fenomeni alterativi nei prodotti finiti durante la conservazione Parametri estrinseci che influenzano la crescita microbica 18 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro CONTROLLO DEI MICRORGANISMI CON LA TEMPERATURA congelamento Utilizzo di basse temperature refrigerazione pastorizzazione Utilizzo di alte temperature sterilizzazione Nel settore dell’industria alimentare vengono utilizzate sia le basse che le alte temperature, singolarmente oppure associate tra loro quando ad esempio un alimento sottoposto a trattamento termico elevato viene successivamente conservato a bassa temperatura fino al momento del consumo Parametri estrinseci che influenzano la crescita microbica 19 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro FATTORI CHE INCIDONO SULLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI NEGLI ALIMENTI pH DEL SUBSTRATO Aw INTRINSECI POTENZIALE REDOX E DISPONIBILITÀ DI O2 COMPOSIZIONE ALIMENTO- CONTENUTO DI NUTRIENTI TEMPERATURA ESTRINSECI ATMOSFERA DI CONSERVAZIONE DELL’ ALIMENTO Parametri estrinseci che influenzano la crescita microbica 20 di 21  Maria Luisa Savo Sardaro ATMOSFERA DI CONSERVAZIONE DELL’ ALIMENTO Il confezionamento degli alimenti, oltre a proteggerli da alterazioni di natura chimica, fisica e biologica, consente di controllare il tipo di atmosfera che circonda l’alimento stesso, influenzando così lo sviluppo microbico. La composizione e la concentrazione dei gas dell’ambiente di conservazione di un alimento, dipende dalla permeabilità della confezione ai diversi tipi di gas utilizzati. Gli alimenti conservati in imballaggi permeabili ai gas, le condizioni sono quelle tipicamente aerobiche, con le note conseguenze sullo sviluppo microbico. Utilizzando imballaggi in materiale impermeabile o con permeabilità selettiva a diversi gas, è possibile sostituire l’aria della confezione con concentrazioni note di ossigeno, anidride carbonica e azoto. confezionamento in atmosfera modificata o protettiva Parametri estrinseci che influenzano la crescita microbica 21 di 21 Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento Parametri che influiscono sulla crescita microbica: Eh e O2  Maria Luisa Savo Sardaro FATTORI CHE INCIDONO SULLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI NEGLI ALIMENTI pH DEL SUBSTRATO Aw INTRINSECI POTENZIALE REDOX E DISPONIBILITÀ DI O2 COMPOSIZIONE ALIMENTO- CONTENUTO DI NUTRIENTI TEMPERATURA ESTRINSECI ATMOSFERA DI CONSERVAZIONE DELL’ ALIMENTO Parametri che influiscono sulla crescita microbica: Eh e O2 2 di 13  Maria Luisa Savo Sardaro POTENZIALE REDOX E DISPONIBILITÀ DI O2 Definizione: il potenziale di ossido-riduzione o redox (Eh) può essere definito come una misura (espressa in mVolt) della tendenza di un substrato ad acquisire elettroni (diventando RIDOTTO) o a cedere elettroni (diventando OSSIDATO). Infatti in presenza di O2 atmosferico il potenziale redox assume sempre valori positivi (Eh+) mentre in assenza i valori sono sempre negativi (Eh-). La classificazione dei microrganismi in funzione dell’ossigeno è strettamente correlata al potenziale redox (Eh) richiesto per la moltiplicazione. Parametri che influiscono sulla crescita microbica: Eh e O2 3 di 13  Maria Luisa Savo Sardaro Ossigeno - O2 La maggior parte dei microrganismi richiede O2 per il proprio sviluppo come ultimo accettore di elettroni (AEROBI). Tuttavia esistono altri microrganismi per i quali l’O2 è tossico ed in sua presenza pertanto non si sviluppano. Questi microrganismi ricavano l’energia necessaria per il proprio sviluppo dai processi fermentativi ed utilizzano come accettori di elettroni sostanze come l’acido piruvico che viene ridotto (ANAEROBI). Gli aerobi hanno enzimi necessari alla distruzione delle forme tossiche dell’ossigeno (acqua ossigenata e anione superossido) che sono le catalasi e la superossido dismutasi. Anche nei batteri ossigeno-tolleranti (batteri lattici) e anaerobi facoltativi sono presenti alcuni di questi enzimi mentre i batteri anaerobi non possiedono questi enzimi Parametri che influiscono sulla crescita microbica: Eh e O2 4 di 13  Maria Luisa Savo Sardaro CLASSIFICAZIONE IN FUNZIONE DELLA RICHIESTA DI OSSIGENO AEROBI STRETTI: richiedono ossigeno per produrre l’energia necessaria per la loro crescita. L’ossigeno funge da accettore finale di elettroni durante la respirazione aerobica che coinvolge la glicolisi, il ciclo di Krebs e il sistema di trasporto degli elettroni. Es: Pseudomonas, micrococchi, muffe MICROAEROFILI: richiedono ossigeno per produrre l’energia necessaria per la loro crescita, ma in concentrazione minore di quello presente nell’aria. Parametri che influiscono sulla crescita microbica: Eh e O2 5 di 13  Maria Luisa Savo Sardaro CLASSIFICAZIONE IN FUNZIONE DELLA RICHIESTA DI OSSIGENO ANAEROBI FACOLTATIVI: possono crescere sia in presenza che in assenza di ossigeno. In presenza di sufficienti quantità di ossigeno respirano, in assenza di ossigeno fermentano. Es: Enterobacteriaceae, molti lieviti ANAEROBI OBBLIGATI: crescono solo se non è presente ossigeno libero che risulta tossico per la cellula. Traggono energia da processi di fermentazione o respirazione anaerobia. Es: Clostridium OSSIGENO-TOLLERANTI: Non usano l’ossigeno per trarre energia ma lo tollerano poiché producono alcuni enzimi in grado di detossificare i composti tossici dell’ossigeno (perossidasi). Es: batteri lattici Parametri che influiscono sulla crescita microbica: Eh e O2 6 di 13  Maria Luisa Savo Sardaro Il potenziale redox di un alimento è determinato da: composizione chimica dell’alimento concentrazione (tensione) di ossigeno dell’atmosfera circostante grado di accesso dell’atmosfera nell’alimento metabolismo microbico processi di trasformazione a cui l’alimento è sottoposto Parametri che influiscono sulla crescita microbica: Eh e O2 7 di 13  Maria Luisa Savo Sardaro POTENZIALE REDOX E DISPONIBILITÀ DI O2 COMPOSIZIONE CHIMICA DELL’ALIMENTO: esistono sostanze negli alimenti che contribuiscono a mantenere l’ambiente riducente (Eh-) Esempi: Acido ascorbico in vegetali e frutta Gruppi -SH associati alle proteine della carne PRESENZA DI OSSIGENO E CAPACITÀ DI PENETRAZIONE: I valori di Eh non sono uniformemente distribuiti su tutto l’alimento. Si hanno valori più elevati (Eh+) in corrispondenza degli strati superficiali, a contatto con l’aria, mentre diventano negativi andando in profondità dell’alimento. Parametri che influiscono sulla crescita microbica: Eh e O2 8 di 13  Maria Luisa Savo Sardaro POTENZIALE REDOX E DISPONIBILITÀ DI O2 METABOLISMO MICROBICO: - aerobi stretti (muffe, Bacillus, Pseudomomas,etc.) crescono solo quando l’O2 è disponibile (quindi alla superficie di cibi solidi) e riducono rapidamente l’Eh; -anaerobi facoltativi e gli anaerobi ossigeno tolleranti possono iniziare la crescita quando l’O2 è presente e continuarla anche quando è esaurito, passando alla fermentazione - anaerobi stretti (es: Clostridium) crescono solo quando l’O2 è assente o a livelli molto bassi (Eh basso) e durante la loro crescita possono ridurre ulteriormente l’Eh per produzione di H2; Parametri che influiscono sulla crescita microbica: Eh e O2 9 di 13  Maria Luisa Savo Sardaro Parametri che influiscono sulla crescita microbica: Eh e O2 10 di 13  Maria Luisa Savo Sardaro POTENZIALE REDOX E DISPONIBILITÀ DI O2 PROCESSI DI TRASFORMAZIONE A CUI L’ALIMENTO È SOTTOPOSTO Omogeneizzazione: la miscelazione di materie prime in presenza di aria aumenta il loro Eh Macinazione: la macinazione aumenta la superficie di esposizione dell’alimento all’aria aumentandone il suo Eh. La carne macinata presenta un Eh di + 200 mV comparata con la carne della carcassa (Eh da -150 a -200 mV) Trattamenti termici: il riscaldamento determina una riduzione dell’Eh (es: gli alimenti in scatola hanno Eh negativo) Parametri che influiscono sulla crescita microbica: Eh e O2 11 di 13  Maria Luisa Savo Sardaro POTENZIALE REDOX NEGLI ALIMENTI Questi valori sono fortemente influenzati dalle operazioni tecnologiche a cui l’alimento è sottoposto Parametri che influiscono sulla crescita microbica: Eh e O2 12 di 13  Maria Luisa Savo Sardaro CONTROLLO POTENZIALE REDOX Il controllo del potenziale redox avviene generalmente limitando l’accesso dell’ossigeno mediante confezionamento. Il confezionamento permette di controllare l’atmosfera intorno all’alimento utilizzando confezioni impermeabili o parzialmente permeabili ai diversi tipi di gas. L’atmosfera intorno agli alimenti viene modificata in vari modi, ma soprattutto manipolando in modo attivo o passivo la presenza di 3 gas principali: Ossigeno Azoto Anidride carbonica Parametri che influiscono sulla crescita microbica: Eh e O2 13 di 13 Professore Maria Luisa Savo Sardaro Argomento I parametri che influenzano la crescita microbica: Aw  Maria Luisa Savo Sardaro FATTORI CHE INCIDONO SULLA CRESCITA DEI MICRORGANISMI NEGLI ALIMENTI pH DEL SUBSTRATO Aw INTRINSECI POTENZIALE REDOX E DISPONIBILITÀ DI O2 COMPOSIZIONE ALIMENTO- CONTENUTO DI NUTRIENTI TEMPERATURA ESTRINSECI ATMOSFERA DI CONSERVAZIONE DELL’ ALIMENTO I parametri che influenzano la crescita microbica: Aw 2 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro ATTIVITA’ DELL’ ACQUA La crescita ed il metabolismo dei microrganismi richiedono acqua. L’esigenza di acqua varia per i diversi microrganismi. Non tutta l’acqua degli alimenti è disponibile per i microrganismi La quantità totale di acqua è chiamata umidità. Il grado di disponibilità dell’acqua è misurato dall’ attività dell’acqua (aw) I parametri che influenzano la crescita microbica: Aw 3 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro ATTIVITA’ DELL’ ACQUA aw: aw è il rapporto tra la tensione di vapore acqueo di un alimento (P) e la tensione di vapore dell’acqua pura (Po) alla stessa temperatura. aw= P / Po 0 < aw < 1 ERH: L’Umidità Relativa all’equilibrio, cioè il contenuto di acqua nell’atmosfera sopra un alimento in equilibrio con l’alimento stesso (in pratica l’umidità atmosferica) è correlata con aw secondo la relazione: ERH=100 x aw aw=ERH/100 Max 100 I parametri che influenzano la crescita microbica: Aw 4 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro ATTIVITA’ DELL’ ACQUA L’ acqua può essere non disponibile per i microrganismi perché: contiene soluti disciolti come sali o zuccheri; è cristallizzata sotto forma di ghiaccio; è presente come acqua di idratazione; è assorbita sulle superfici. solo l’acqua libera presente in un ambiente consente la crescita dei microrganismi I parametri che influenzano la crescita microbica: Aw 5 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro ATTIVITA’ DELL’ACQUA Alcuni gruppi di microrganismi sono particolarmente specializzati in ambienti con bassi valori di attività dell’acqua o contenenti sale I parametri che influenzano la crescita microbica: Aw 6 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro aw e MICRORGANISMI Ogni microrganismo è caratterizzato da una aw ottimale e aw minima di crescita. Ogni abbassamento rispetto al valore ottimale comporta 1. una diminuzione del tasso di sviluppo prolungamento lag fase e tempi di duplicazione, diminuzione del numero di microrganismi raggiunto in fase stazionaria, fase di morte più rapida fino all’arresto completo della crescita. 2. Quando poi i valori di aw scendono al di sotto del minimo di crescita si arriva alla morte I parametri che influenzano la crescita microbica: Aw 7 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro Aw e MICRORGANISMI I microrganismi presentano vari meccanismi di adattamento alle variazioni di aw. La strategia generale è quella di accumulare all’interno della cellula i soluti. I batteri possono adattarsi a variazioni di aw nel range dei valori che ne consentono lo sviluppo mediante accumulo di soluti fisiologicamente compatibili (non tossici) che ristabiliscono le condizioni osmotiche ottimali. Tali soluti possono essere sintetizzati dalla cellula oppure sono presi dall’ambiente di crescita. In particolare i batteri possono accumulare ioni K+ e amminoacidi, mentre lieviti e muffe accumulano K+ e, a seconda della specie, trealosio, saccarosio, glucosio e glicerolo. I parametri che influenzano la crescita microbica: Aw 8 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro MICRORGANISMI E aw Al di sotto dei valori minimi di aw, il comportamento dei microrganismi dipende molto da come l’acqua viene rimossa. Quando essa è rimossa rapidamente (liofilizzazione di un alimento) dalla cellula microbica, consente una sua sopravvivenza per lunghi periodi. Quando l’aw di un alimento è abbassata attraverso l’aggiunta di sale o zucchero, le cellule microbiche sono soggette a fenomeni osmotici che ne causano una morte più rapida. La cellula subisce danni spesso irreversibili. La morte sopraggiunge per danni alla membrana e ai suoi enzimi citoplasmatici; I parametri che influenzano la crescita microbica: Aw 9 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro ATTIVITA’ DELL’ACQUA DEFINIZIONI ALOFILI: MICRORGANISMI IN GRADO DI SVILUPPARSI IN PRESENZA DI NaCl. OSMOFILI: MICRORGANISMI IN GRADO DI SVILUPPARSI IN PRESENZA DI ZUCCHERI. XEROFILE: MUFFE IN GRADO SI SVILUPPARSI A BASSI VALORI DI Aw I parametri che influenzano la crescita microbica: Aw 10 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro La maggior parte dei batteri crescono bene ad aw > 0,98. ATTIVITA’ DELL’ACQUA Nessun organismo cresce ad aw 0.98 TUTTI I parametri che influenzano la crescita microbica: Aw 12 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro aw 0.93-0.98 C. botulinum non può crescere né produrre tossina con aw minore di 0.93 S. aureus non produce tossine con aw < 0.93 (anche se può crescere) I parametri che influenzano la crescita microbica: Aw 13 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro aw 0.85-0.93 I parametri che influenzano la crescita microbica: Aw 14 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro aw 0.60-0.85 E. Sgarbi- Contaminanti Microbici I parametri che influenzano la crescita microbica: Aw 15 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro aw La maggior parte degli alimenti freschi (carne, vegetali, frutta) hanno valori di aw tali da permettere la crescita della maggior DEGLI ALIMENTI parte dei microrganismi. Più è bassa l’aw più è limitata la varietà di microrganismi che possono crescere, anche se molti possono sopravvivere per lunghi periodi Alimenti con alti valori di attività dell’acqua sono soggetti a rapida alterazione, mentre quelli con valori inferiori a 0,61 sono stabili da un punto di vista microbiologico I parametri che influenzano la crescita microbica: Aw 16 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro CLASSIFICAZIONE DEGLI ALIMENTI IN BASE ALLA aw Alimenti ad altissima aw (0,99-0,95): alimenti freschi o processati poco drasticamente carne, pollame, latte, uova, vegetali, formaggi freschi Alimenti ad alta aw (0,95-0,90): alimenti processati come formaggi e salami fermentati, prosciutto, pane Alimenti ad intermedia aw (0,90-0,61): alimenti trattati con processi di essiccazione o mediante l’aggiunta di elevate quantità di sale o zuccheri. Prosciutto e formaggi lungamente stagionati, frutta secca, marmellate Alimenti ad bassa aw (>0,61): latte in polvere, cioccolato, vegetali disidratati, miele, pasta, crackers, zucchero. I parametri che influenzano la crescita microbica: Aw 17 di 18  Maria Luisa Savo Sardaro aw DEGLI ALIMENTI Alimenti altamente deperibili: aw > 0.95 Tutti i prodotti freschi. Sviluppo soprattutto di Gram- Alimenti deperibili: 0.95 > aw > 0.90 Sviluppo soprattutto di Gram+ Alimenti con Aw intermedia: 0.90 > aw > 0.60 Se non vengono conservati in ambienti umidi non consentono lo sviluppo di batteri (eccetto alofili e alotolleranti) mentre sono soggetti allo sviluppo di muffe Alimenti stabili: aw