Práctica Laboratorio: Extracción de Pigmento Vegetal y pH en Suelo PDF

UNIVERSIDAD DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES DEPARTAMENTO DE QUÍMICA PROGRAMA INGENIERIA AGRONOMICA LABORATORIO: Extracción de un pigmento vegetal y su aplicación como indicador de pH en el suelo OBJE...

UNIVERSIDAD DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES DEPARTAMENTO DE QUÍMICA PROGRAMA INGENIERIA AGRONOMICA LABORATORIO: Extracción de un pigmento vegetal y su aplicación como indicador de pH en el suelo OBJETIVOS: - Extracción de las antocianinas (indicador) del repollo morado - Estudiar la estructura y cambios estructurales de las antocianinas en un medio ácido o básico - Identificar los cambios de coloración de las antocianinas en un medio ácido, básico o neutro - Identificar el pH de dos muestras de suelo usando el indicador extraído FUNDAMENTO La col morada o Brassica oleracea var. capitata f. rubra, de nombre común lombarda, col lombarda, repollo morado, es una planta de la familia del repollo. Este repollo es usado de forma empírica por los campesinos para identificar el pH del suelo, este vegetal contiene unos pigmentos denominados antocianinas (ACNs). Las antocianinas se pueden extraer de recursos naturales estos compuestos son susceptibles a la concentración de H+, es decir que exhiben cambios de color a pH ácido o básico. La comunidad científica ha visto potencial en el uso de las antocianinas como un colorante eco amigable para lanas y seda, la baja tóxicidad y alta biodegrabilidad de estos compuestos los hacen atractivos, ya que su uso tiene un impacto ambiental menor que cuando se usan otro tipo de colorantes. CONSULTAS - Dibujar la estructura de las antocianinas en un medio ácido y en un medio básico - Investigar el color de las antocianinas a pH básico y ácido - Por qué el solvente de extracción de las antocianinas puede ser agua o etanol (identificar la polaridad de estas moléculas) - Consultar que otros vegetales o frutas contienen antocianinas PROCEDIMIENTO Primera parte: 1. Tomar la mitad de un repollo morado (puede usar moras) y colocarlo en un recipiente que pueda calentar 2. Agregar agua hasta que se tape la porción de repollo morado utilizado 3. Calentar hasta ebullición a fuego lento y dejar que ebulla 1 minuto 4. Esperar a que se enfríe Preguntas:  - ¿Por qué esperamos que el pigmento disuelva en agua? Explique - Por qué debemos calentar a fuego lento hasta ebullición Segunda parte: 1. Tomar tres beaker, marque cada uno como 1, 2 y 3 2. Agregar dos cucharadas al vaso 1 de vinagre, al vaso 2 agua y al vaso 3 agua con una pizca de bicarbonato de sodio 3. Agregar una cucharadita a cada uno del extracto de repollo Reportar los cambios de coloración Vaso Solución o sustancia Color 1 Vinagre 2 Agua 3 Solución bicarbonato Preguntas: - ¿Qué cambios observó? - ¿Cuáles fueron los colores según el medio al que expuso el indicador? - ¿Por qué sirve como indicador? Tercera parte: 1. Tome dos beaker a cada uno agregue una cucharada de tierra (tome las porciones de tierra de diferentes zonas) 2. Agregue tres cucharas del indicador extraído y reporte los datos Muestra Color pH 1 2 Referencias - Boyer R. MODERN EXPERIMENTAL BIOCHEMISTRY. Third edition. 2000. Benjamin Cummings. - Coruh, O., Gündüz, G., Çolak, U., Maviş, B. pH-Dependent Coloring of Combination Effect Pigments with Anthocyanins from Brassica oleracea var. capitata F. rubra. Colorants 2022, 1(2), 149-164. doi.org/10.3390/colorants1020010 - Haddar, W., Ticha, M B., Meksi, N., Guesmi, A. Application of anthocyanins as natural dye extracted from Brassica oleracea L. var. capitata f. rubra: dyeing studies of wool and silk fibres. Formerly Natural Product Letters 2018, 32 (2), 141-148. doi.org/10.1080/14786419.2017.1342080  UNIVERSIDAD DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES DEPARTAMENTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE INGENIERIA AGRONOMICA LABORATORIO: Alelopatía de los extractos naturales El término alelopatía (del griego allelon = uno al otro, del griego pathos = sufrir; efecto injurioso de uno sobre otro) fue utilizado por primera vez por Molisch (1937) para referirse a los efectos perjudiciales o benéficos de compuestos químicos liberados por una planta, que ejercen acción en otra planta. Siguiendo esta definición en todo fenómeno alelopático existe una planta (donor) que libera al medio ambiente por una determinada vía (por ej. lixiviación, descomposición de residuos, etc.) compuestos químicos los cuales al ser incorporados por otra planta (receptora) provocan un efecto perjudicial o benéfico sobre germinación, crecimiento o desarrollo de esta última. Los compuestos citados que desencadenan el proceso se denominan compuestos, agentes o sustancias alelopáticas. En los últimos años la actividad alelopática se ha presentado como una alternativa viable para incrementar los niveles de producción por cosecha y prevenir el uso indiscriminado de herbicidas sintéticos, los cuales generan costos elevados en la producción y conllevan a problemas de contaminación por residuos de los mismos en el producto recolectado, o como en otras ocasiones contaminación cruzada a otros cultivos y ríos cercanos en áreas de actividad agrícola (Macías et al., 2000). La manipulación adecuada de los cultivos, utilizando la alelopatía para la mejora de la productividad de los mismos, ayuda a la protección del medio ambiente a través del ecoamigable control de malezas y plagas, la conservación de nitrógeno en la tierra de cultivo y la síntesis de nuevos productos agroquímicos a base de productos naturales, han ganado la atención prominente del científico dedicado a esta investigación (Sang-Uk et al., 2005). Se ha confirmado que los metabolitos secundarios constituyen una fuente de productos naturales con actividad biológica diversa, comprobándose su actividad antibacteriana, antifúngica, antiviral, antineoplásica, anticancerígena, anticoagulante, citotóxica entre otras. Esta gama de propiedades, permite a estos compuestos tener un gran potencial de aplicación, ya sea aislados o usando directamente el extracto o infusión del compuesto al que se le ha detectado una actividad biológica específica, empleándose como precursor en la síntesis de compuestos orgánicos o para caracterizar la estructura de sus centros activos con el fin de modelar nuevas sustancias con propiedades prestablecidas. METERIALES: Extracto 25 mg, 10 mL de solución de sacarosa al 2%, 4 platos desechables de icopor, papel filtro, algodón, 2 frasco de spray (uno para el extracto y uno para el agua), semillas de lechuga batavia. PROCEDIMIENTO: Es importante que tenga claro que se van a hacer 4 tratamientos, el denominado blanco que se sometera a las mismas condiciones que los otros platos pero solo se rociara con agua, los otros platos denominados 1, 2 y 3 corresponden a replicas, cada uno se rociara con la solución que conteiene el extracto. Las medidas debe procurar hacerlas a la misma hora durante 7 días. Siga atentamente cada uno de los pasos. ¿Qué hacer con los datos obtenidos? 1. Durante 7 días usted midió el epicótilo e hipocótilo del blanco y de los platos 1, 2 y 3 determine el promedio de crecimiento de cada uno, de esta forma se concluirá como el extracto afecto el crecimiento. (Tenga como referencia el blanco) 2. Debe determinar la desviación estándar para todas las semillas, por día (use el valor obtenido en los promedios) recuerde: la desviación estándar indica qué tan dispersos están los datos con respecto a la media. Mientras mayor sea la desviación estándar, mayor será la dispersión de los datos. Donde N numero total de semillas (30), la variable x puede ser del epicótilo o del hipócotilo y μ es el promedio por día, bien, se del epicótilo o del hipócotilo 3. Determinar el % de actividad alelopática (%AA), primero debe determinar la velocidad de crecimiento por día (V0) para cada plato Con los datos obtenidos del % de actividad alelopática (%AA), realice un histograma (gráfica) donde relaciona eje el %AA y en el eje x los días, de ésta forma se visualiza si el extracto ejerció una actividad herbicida o actúo favoreciendo el crecimiento Referencias: Cátedra de Fitoquímica. Instituto de Estudios Vegetales "Dr. Antonio R. Sampietro". ING. AGR. DIEGO A. SAMPIETRO ACTIVIDAD ALELOPÁTICA Y ANTIBACTERIANA DE FRACCIONES POLARES F1-C, F1-D Y F1-F OBTENIDAS DE Henriettella trachyphylla Triana (MELASTOMATACEAE)  UNIVERSIDAD DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES DEPARTAMENTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE INGENIERIA AGRONOMICA LABORATORIO 3: Determinación de Vitamina C. INSTRUCCIONES: - Desarrollar en una hoja tipo parcial y las graficas en hoja milimetrada, buena letra y buen orden. - Contenido del reporte: Diagrama de flujo, resultados, análisis de resultados, respuestas a las preguntas propuestas en la guía. - Se tendrá en cuenta para la nota la capacidad de análisis y de síntesis. - Recordar las citas bibliográficas para las respuestas a las preguntas. - Tamaño Máximo del reporte 4 páginas (2 hojas), adicional hoja milimetrada con graficas. OBJETIVOS: - Preparar soluciones y realizar el cálculo de concentraciones. - Estudiar la estructura, función y la importancia de la vitamina C. - Calcular la concentración aproximada de vitamina C en frutas y verduras. - introducir el tema de carbohidratos y su clasificación. - Estudiar algunas propiedades de los carbohidratos. PREGUNTAS INTRODUCTORIAS: - Dibujar la estructura del almidón y reportar alguna clasificación de polisacáridos - Dibujar la estructura de la vitamina C y describir la función. - Que es el Lugol y para qué se utiliza? - Consultar y reportar la composición aproximada de macromoléculas del arroz. PROCEDIMIENTO: Primera parte: 1. Lavar un poco de arroz con agua y guardar el producto del lavado en un matraz erlenmeyer. 2. Disolver una pastilla de 500mg de vitamina C en 500mililitros de agua en un vaso de precipitados. 3. En un tubo de ensayo adicionar 3mL de agua de arroz y adicionar 1mL de la solución de vitamina C. 4. En otro tubo de ensayo adicionar 3mL de agua de arroz y añadir 3 gotas de lugol. 5. En un tercer tubo de ensayo adiciona 3mL de agua de arroz, 1mL de solución de vitamina C y añadir gotas de lugol hasta observar algún cambio en la coloración. Preguntas: - Cuantos miligramos de vitamina C están contenidos en un mililitro de solución? - A que sustancia del arroz se le puede atribuir el cambio que se presenta en la coloración en el ensayo? - Cual es la función del lugol en este ensayo? - Cual es la función de la vitamina C en este ensayo? Segunda parte: 1. Numerar 6 tubos de ensayo y añadir en cada uno 3mL de agua de arroz. 2. Añadir en cada tubo las cantidades de vitamina C indicadas en el cuadro siguiente, calcular la concentración de Vitamina C en mg/mL: Tubo mL de agua de arroz mL de Vitamina C mg/mL de Vitamina C Gotas de Lugol 1 3 0 2 3 0,5 3 3 1 4 3 2 5 3 3 6 3 4 3. Adicionar poco a poco gotas de lugol hasta que aparezca una coloración y anota en cada caso el numero de gotas. 4. Identificar la variable independiente y la variable dependiente y realizar un grafico que represente la variación del número de gotas de lugol en función de la concentración de vitamina C. 5. Qué conclusiones puede deducir del experimento realizado. Tercera parte: 1. Obtener jugo de naranja, limón y mandarina. 2. Macerar guayaba, pimentón y manzana. 3. Tomar 6 tubos de ensayo y rotularlos, en cada uno adicionar 3mL de agua de arroz. 4. Añadir como se muestra en el cuadro 1mL de extracto de cada fruta o verdura, así: Tubo mL de agua de arroz 1mL de extracto de Gotas de Lugol 1 3 Naranja 2 3 Limón 3 3 Mandarina 4 3 Guayaba 5 3 Pimentón 6 3 manzana 5. Adicionar poco a poco gotas de lugol hasta que aparezca coloración y anotar en cada caso el número de gotas. 6. En el grafico obtenido en la segunda parte ubicar el número de gotas de lugol que se necesitaron en cada caso para que apareciera la coloración y calcular la concentración de vitamina C en cada mililitro de extracto. 7. A que conclusión puede llegar después de analizar los resultados obtenidos con respecto a la concentración de vitamina C en las muestras? REFERENCIAS: - Boyer R. MODERN EXPERIMENTAL BIOCHEMISTRY. Third edition. 2000. Benjamin Cummings. - Harvey D. MODERN ANALYTICAL CHEMISTRY. 2000. McGraw-Hill. - Holme D. & Peck H. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY. Third edition. 1998. Prentice-Hall. - Nelson D. & Cox M. LEHNINGER PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY. Fourth Edition. 2004. W.H.Freeman.  UNIVERSIDAD DE CALDAS LABORATORIO BIOQUÍMICA ESTUDIO FITOQUIMICO PRELIMINAR: IDENTIFICACIÓN DE FLAVONOIDES Maby Martínez Diana Ocampo Los flavonoides son un grupo de sustancias que favorecen el funcionamiento de la vitamina C, mejorando su absorción y protegiéndola de su oxidación. Los flavonoides confieren colores a las plantas en sus tallos, hojas, frutos y flores, además son considerados agentes antioxidantes Los flavonoides poseen una estructura química muy definida, poseen dos anillos aromáticos unidos por una cadena de tres carbonos (figura 1), en la (figura 2) por su parte se muestra uno de los flavonoides más comunes: la quercetina. Figura 1: estructura básica de los flavonoides. Figura 2: la quercetina, uno de los flavonoides más comunes. Para estudiar los más de 4000 flavonoides naturales que se encuentran en la naturaleza, se han clasificado de acuerdo a las variantes en la cadena C3 de acuerdo con esto, los podemos clasificar en varios grupos: Chalconas, flavonas, flavonoles, flavanonas, flavanonoles, etc. Pero la estructura no es tan simple, se ha comprobado que dentro de las plantas los flavonoides se encuentran la mayoría de veces ligados a moléculas de carbohidratos. Cuando están ligadas a los carbohidratos se le llama glicósidos y cuando no agliconas flavonoides. En las figuras y tablas siguientes se presentan varios ejemplos de diferentes clases de flavonoides naturales y algunas de las fuentes vegetales más conocidas. Objetivos -Identificar por TLC y por espectrofotometría los alcaloides presentes en la muestra de la planta objeto de estudio Consultas preliminares a la práctica - Busque un artículo cientifico que se base en la identificación de los metabolitos secundarios de la planta objeto de estudio y escriba al menos tres de estos, escriba su estructura y realice una busqueda bibliografica de las longitudes de inda en la que absorven estos compuestos. Extracción flavonoides: Las propiedades físicas depende de la clase de flavonoides a considerar y su forma (libre, glicósido ó sulfato), por lo tanto la solubilidad de estos compuestos depende de la forma en que se encuentren y el número y clase de sustituyentes presentes. Los glicósidos, las antocianidinas y los sulfatos son solubles en agua y alcohol. Las agliconas flavonoides altamente hidroxiladas son solubles en alcohol (etanol, metanol y n-butanol), mientras que las poco hidroxiladas lo son en solventes como éter etílico, acetato de etilo y acetona. Las agliconas flavonoides altamente metoxiladas son solubles en solventes menos polares como el éter de petróleo y el cloroformo. La característica fundamental de los flavonoides es contener varios grupos OH, por lo que se pueden extraer con solventes polares. Tomar la muestra agregarle 20 mL de etanol calentar a 30ºC durante 5 min. Dejar enfriar y filtrar. Espectrofotometría de espectro visible. Los flavonoides presentan espectros de absorción máximos de 280nm a 400nm, estos valores son aproximados, dependiendo de la especie con la que se trabaje, para flavonas y flavonoles posee valores entre 300nm y 380nm para la banda l que corresponde a la absorción causada por el anillo B y para la banda ll valores de 240nm a 280nm, que corresponden a los valores de absorbancia del anillo A. la posición de esta banda permite distinguir entre los diferentes tipos de flavonoides. Por ejemplo para flavonas y flavonoles, con grupos OH en el anillo A, pero no en el anillo B, tienden a dar un espectro en metanol con una pronunciada banda ll y débil en la banda l, pero en moléculas similares que también poseen el OH en el anillo B, la banda l es más pronunciada y aparece a mayor longitud de onda. El espectro en metanol, particularmente la posición de la banda l(entre 300nm y 30nm, proporciona información sobre el tipo de flavonoide. Figura 3. Se muestran que cual es el nombre de cada anillo. Grafica tomada de (Varas 2004). Espectrofotometría Procedimiento 1. Para la preparación de la muestra, se toma una alícuota de 1 ml de los flavonoides totales y se adiciona 3ml de etanol hasta completar un volumen de 4 ml. 2. Una vez preparada la mezcla, se adiciona la cantidad necesaria en la celda que será leída a diferentes longitudes de onda (200-400 nm), en tránsitos de 10 en 10 nm. 3. Anotar las lecturas de absorbancia a las cuales absorbe la celda con diferentes longitudes de onda y comparar con la literatura. Bibliografía. (Ávalos and Elena 2009; Martinez 2005; Martínez-Flórez et al. 2002). (Ávalos and Elena 2009; Martinez 2005; Martínez-Flórez et al. 2002) Ávalos, Adolfo, and García Elena. 2009. “Metabolismo Secundario de Plantas.” Reduca Biología Serie Fisiología Vegetal 2(3): 119–45. http://revistareduca.es/index.php/biologia/article/viewFile/798/814. Martinez, Alejandro (Universidad De Antioquia). 2005. “Alejandro Martínez M., Químico M. Sc., Doctor En Ciencias, Facultad de Química Farmacéutica.” Universidad De Antioquia: 76. Martínez-Flórez, S., J. González-Gallego, J. M. Culebras, and María Jesús Tuñón. 2002. “Los Flavonoides: Propiedades Y Acciones Antioxidantes.” Nutricion Hospitalaria 17(6): 271–78. Varas, Daniela. 2004. “Análisis de Flavonoides En Plantas Medicinales Del Sur de Chile Con Técnica HPLC.” : 49.  UNIVERSIDAD DE CALDAS LABORATORIO BIOQUÍMICA ESTUDIO FITOQUIMICO PRELIMINAR: PRUEBAS CUALITATIVAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS Maby Martínez Diana Ocampo La fitoquímica permite la identificación y aislamiento de los metabolitos secundarios de las plantas, metabolito se define como cualquier molécula que participa en el metabolismo. Los metabolitos se clasifican como primarios y secundarios; los primarios son comunes en todos los seres vivos, participan directamente en el crecimiento y reproducción, estos son: carbohidratos, lípidos, ácidos nucleícos y proteínas. Los metabolitos secundarios son compuestos que no participan directamente en el crecimiento y reproducción sino que cumplen funciones complementarias a las vitales, como por ejemplo algunos alcaloides dan un sabor desagradable a las hojas por lo que los depredadores no la comerian, siendo esto una forma de protección, otro ejemplo son los flavonoides estos se relacionan con colores vistosos favoreciendo la polinización. Algunos metabolitos secundarios son: alcaloides, flavonoides, cumarinas, taninos, glucósidos cardiotónicos y saponinas. La identificación preliminar de los metabolitos secundarios, se realiza por medio de pruebas cualitativas, estas pruebas se basan en la reaccion química de algunos metabolitos secundarios del extracto vegetal con reactivos especificos obteniendo sustancias coloreadas o precipitados si la prueba es positiva (+), es decir se confirma la presencia del metabolito. Actualmente diversas investigaciones se basan en la identificación y extracción de los metabolitos secundarios en plantas ya que se ha comprobado que algunos tiene efecto antidiabético, antiinflamatorio y antimicrobiano. Objetivos - Realizar pruebas cualitativas en tubos de ensayo - Identificar algunos metabolitos secundarios del extracto vegetal - Obtener información acerca sobre la estructura de las moléculas, su presencia o ausencia en el extracto Consultas preliminares a la práctica 1. Las pruebas cualitativas de indentificación de alcaloides en general producen un precipitado, cosulte en que cosisten estas reacciones químicas 2. El ensayo de Shinoda tiene como fín detectar flavonoides, este ensayo tiene como reactivos laminillas de Magnesio (Mg) y ácido clorhidrico (HCl), cosulte las reacciones químicas implicadas en esta detección 3. Para detección de taninos y compuestos fenolicos se usa el FeCl3, investigue en que consiste esta reacción química 4. Por qué se hace necesario tener una referencia (blanco) para la realización de las pruebas cualitativas Procedimiento Tomar 11 tubos de ensayo 10 de ellos los marca con el nombre de cada prueba y uno como blanco, el blanco será su referencia para confirmar cambios después de las adiciones del reactivo. En cada tubo agregar 1 mL del extracto vegetal, si el extracto esta en forma de goma diluirlo con 11 mL de etanol y distribuir de 1 mL en cada tubo. Proceder a agregar a cada tubo gotas del reactivo (la cantidad de reactivo no debe exceder el volumen del extracto, es decir si tiene 1 mL del extracto agrega máximo 1 mL del rectivo). Cda que agregue una gota agitar y observar Pruebas cualitativas: Reactivo de Dragendorff : Está compuesto por tetrayodo bismutato de potasio y puede indicar la presencia del alcaloide con la formación de un precipitado naranja rojizo cuando se le adiciona a la solución ácida. Reactivo de Mayer: tomar 1 mL y agragar el reactivo (tetrayodo mercuriato de potasio) Los alcaloides se detectan como un precipitado blanco o de color crema soluble en ácido acético y etanol. Reactivo de Wagner: tomar 1 mL del extracto etanólico se disuelve en ácido clorhídrico, se agita y se filtra hasta que el filtrado sea completamente transparente, a este filtrado se le agrega una alícuota del reactivo de Wagner y si aparece un precipitado será positivo para Alcaloides. Ensayo de Shinoda: Tomar tomar 1 mL de la muestra del filtrado de etanol en un tubo de ensayo, agregar varias limaduras de magnesio y por la pared del tubo dejar caer lentamente HCl concentrado (37%). La aparición de colores: naranja, rojo, violeta o rosado, indican que es prueba presuntiva de la presencia de flavonoides en el material vegetal. Tipo de flavonoide Color de reacción de Shinoda Chalconas No hay coloración Auronas No hay coloración Isoflavononas No hay coloración Isoflavonas Amarillo rojizo Flavanonas Azul magenta, violeta, rojo Flavanonoles Rojo a magenta Flavonas y flavonoles Amarillo a rojo Prueba cualitativa para leucoantocianidinas Tomar 2 ml del filtrado en un tubo de ensayo y adicionar 1 ml de ácido clorhídrico concentrado (37%). Calentar en baño maría durante 15 minutos. La aparición de coloraciones rojas es prueba presuntiva de la presencia de leucoantocianidinas en la muestra. Reacción de Kedde Tomar 1 mL y agregar el reactivo, si se forma un color azul o violeta será positivo para Glucósidos cardiotónicos. La principal propiedad de los glucósidos cardiotónicos es el incremento de la fuerza y velocidad de las contracciones cardíacas, la denominada acción inotrópica positiva. Su efecto en el miocardio se produce tanto en los pacientes enfermos como en los de corazón sano. Reactivo de Baljet A 2 o 3 mL del extracto etanólico se le adicionan 3 o 4 gotas de reactivo de Baljet, si se forma coloración anaranjada o roja oscura se considera positiva para Glucósidos cardiotónicos. Lieberman Burchard en un tubo de ensayo limpio y seco tomar 1 ml del filtrado orgánico y agregar por la pared del tubo 1 ml de anhídrido acético y con precaución 1-2 gotas de ácido sulfúrico concentrado. La aparición de coloraciones: verdes, azules, rojas o violeta es prueba positiva para esteroides y/o triterpenoides en la muestra. Reconocimiento de saponinas Tomar 1 mL del filtrado a un tubo de ensayo y agitar vigorosamente durante un minuto, si se forma abundante espuma que permanece estable durante 5 minutos es prueba presuntiva de la presencia de saponinas en la muestra. Reconocimiento de compuestos fenólicos y taninos tomar 1 ml del filtrado en un tubo de ensayo y adicionar 2 gotas de solución de tricloruro férrico (FeCl3 al 1%). La aparición de un color verde, azul o negro es prueba positiva para compuestos fenólicos. La coloración se debe a la formación de enlaces cristalinos entre el ión hierro (III) y los pares de electrones libres de los fenoles. Tabla de resultados (Si observa un cambio de coloración o precipitado la prueba se cosidera positiva (+), si no observa ningún cambio es negativa (-) Prueba Resultado Dragendorff Mayer Wagner Shinoda  Leucoantocianidinas Kedde Baljet Burchard Saponinas Compuestos fenólicos y taninos Referencias bibliográficas: - Murillo E, Tique MM, Ospina LF, Lombo Ó. Evaluación preliminar de la actividad hipoglicemiante en ratones diabéticos por aloxano y capacidad antioxidante in vitro de extractos de Bauhinia kalbreyeri Harms. Rev Col Cienc Quím Farm. 2006;35:64- 80. - Yadava RN, Reddy VM. Anti-inflammatory activity of a novel flavonol glycoside from the Bauhinia variegate Linn. Nat Prod Res. 2003;17:165-9. - Pokhrel NR, Adhikari RP, Baral MP. In vitro evaluation of the antimicrobial activity of Bauhinia variegata, locally known as Koiralo. World J Microbiol Biotechnol. 2002;18:69-71. - Ardila MI., Vargas AF., Pérez JE., Mejía LF. Ensayo preliminar de la actividad antibacteriana de extractos de Allium sativum, Coriandrum sativum, Eugenia Caryophyllata, Origanum vulgare, Rosmarinus officinalis Y Thymus vulgaris frente a Clostridium perfringens. Biosalud, 2009;8:47–57. - Gennaro, A. (2003). Farmacia de Remington (Vol. 1). Buenos Aires: Medica Panamericana. - Lock, O. (1997). Colorantes naturales. Fondo Editorial de la Pontifica Universidad Católica del Perú, Lima. - Franco, A. G., & Yepes, P. N. M. Experimentos de Química Orgánica. ELIZCOM SAS  UNIVERSIDAD DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES DEPARTAMENTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE INGENIERIA AGRONOMICA LABORATORIO: Identificación y extracción de alcaloides Maby Martínez Diana Ocampo Los alcaloides son bases nitrogenadas, producidas por las plantas como metabolitos secundarios y que presentan una acción fisiológica intensa sobre los animales aun a bajas dosis. Entre los alcaloides más famosos se encuentran aquellos presentes en las solanáceas, denominados tropanos. Las plantas que contienen estas sustancias han sido utilizadas por centenares de años como venenos. No obstante, pese a su reconocido efecto ponzoñoso, muchas de estas sustancias presentan invaluables propiedades farmacéuticas. Las solanáceas se caracterizan por contar con muchas especies que contienen diversos tipos de alcaloides más o menos activos o venenosos, tales como la escopolamina, la atropina, la hiosciamina y la nicotina. Estos se encuentran en plantas como el beleño (Hyoscyamus albus), la belladona (Atropa belladonna), el chamico (Datura stramonium), la mandrágora (Mandragora autumnalis), el tabaco y otras La belladona, de nombre binomial científico Atropa belladonna, es un arbusto resistente perenne, miembro de la familia Solanaceae. Es nativa de Europa, norte de África, y oeste de Asia, y se puede encontrar naturalizada en partes de Norteamérica.Tiene una tolerancia baja a la exposición directa al sol. Se encuentra en áreas normalmente sombreadas y con un suelo rico en limo. Ambos nombres hacen alusión tanto a su efecto venenoso como a su uso para dilatar las pupilas, consiguiendo así una mirada más hermosa. El término alcaloide se aplicó a los compuestos de origen vegetal con propiedades alcalinas, este carácter básico es debido a la presencia de nitrógeno amínico en su estructura, que no son metabolitos primarios ni glicósidos cianogénicos, cofactoras o fitohormonas. Se consideran compuestos orgánicos de origen natural ya que son comunes en hongos, bacterias y plantas. Estos compuestos nitrógenados tienen gran divesrsidad estructural, son derivados generalmente de aminoácidos, la mayoría de los alcaloides poseen acción fisiológica intensa en los animales incluso a bajas dosis con efectos psicoactivos, por lo que se emplean mucho para tratar problemas de la mente y calmar el dolor. Figura 1. Algunos ejemplos de variabilidad estructural de los alcaloides Objetivos -Identificar por TLC y por espectrofotometría los alcaloides presentes en la muestra de la planta objeto de estudio Consultas preliminares a la práctica - Busque un artículo científico en la base de datos de la Universidad donde identifiquen los alcaloides de la planta objeto de estudio y escriba al menos tres estructuras químicas de alcaloides que mencionen en los artículos escriba las técnicas de identificación de alcaloides que usan en el documento - En los artículos encontrados busque las longitudes de onda en la que absorben los alcaloides. Para su estudio, Los alcaloides se dividen en cuatro clases: 1. Alcaloides Verdaderos: Los cuales cumplen estrictamente con las características de la definición de alcaloide, tienen siempre un nitrógeno heterocíclico, son de carácter básico y existen en la naturaleza normalmente en estado de sal, biológicamente son formados a partir de aminoácidos. 2. Protoalcaloides: Son aminas simples con nitrógeno extracíclico, de carácter básico y que son productos del metabolismo de los aminoácidos. 3. Pseudoalcaloides: presentan todas las características de la definición de alcaloide pero no son derivados de aminoácidos. 4. Alcaloides imperfectos: se derivan de bases púricas (nitrogenadas) y no precipitan con los reactivos específicos para alcaloides. No son alcaloides los aminoácidos, los péptidos, los amino azúcares, las vitaminas nitrogenadas, las porfirinas. Función de los alcaloides en las plantas:  Fuente de almacenamiento.  Protectores.  Reguladores del crecimiento. La pérdida de alcaloides en la estructura de las plantas no han impedido su desarrollo, lo cual sugiere que los alcaloides no son esenciales para los vegetales. La extracción y aislamiento se fundamentan en la diferencia de solubilidad que presentan los alcaloides según se encuentren en forma de sal o de base. La extracción puede realizarse mediante métodos generales como: 1. Extracción en medio alcalino: en donde una solución alcalina desplaza los alcaloides de sus combinaciones salinas y las bases liberadas son solubilizadas en un solvente orgánico medianamente polar. 2. Extracción en medio ácido: Extracción de los alcaloides en forma de sales con agua acidulada, o alcohol, seguido de una alcalinización y extracción de los alcaloides base con un solvente orgánico no miscible Procedimiento Experimental. Recuerde si no esta seguro de cual es la fase orgánica, realice un prueba con agua en un beaker Extracción de alcaloides por el método ácido. 1) Se le adicionan 5 ml de HCl 0.5 N + 10 ml de agua destilada. 2) La fase acuosa ácida se extrae con tres porciones de 10 ml de hexano para desengrasar. 3) La fase orgánica hexánolica se descarta y la acuosa ácidas se alcalinizan con NH4OH al 25% hasta obtener un pH entre 9 y 10. 4) Posteriormente se extraen con tres porciones de 10 ml de cloroformo. 5) Descartamos la fase acuosa. 6) Obtenemos fase orgánica. 7) Filtrar sobre sulfato de sodio anhidrido y evaporar el solvente. Extracción de alcaloides por el método alcalino. 1) Se adiciona 5 ml de etanol + NH4OH al 5% hasta obtener un pH entre 10 y 11. 2) Posteriormente agregamos 5 ml de diclorometano. 3) Separamos y obtenemos fase orgánica. 4) Luego aplicamos 5 ml de cloroformo y obtenemos la fase orgánica. 5) Filtramos la fase orgánica con sulfato de sodio anhidro. Espectrofotometría UV-VIS La espectrofotometría de absorción molecular ultravioleta visible, comúnmente llamada espectrofotometría UV- VIS, tiene una larga y continua historia en el campo de la química analítica. Esta técnica está basada en la medición de absorción de radiación UV o visible por determinadas moléculas. La radiación correspondiente a estas regiones del espectro electromagnético provoca transiciones electrónicas a longitudes de ondas características de la estructura molecular de un compuesto. El espectro UV (195 a 400 nm) de los alcaloides depende de su estructura, naturaleza, número, tipo y posición de los sustituyentes. En forma general, los alcaloides poseen grupos cromóforos, que son los grupos funcionales de la molécula, responsables de la absorción. Principalmente son: dobles y triples enlaces carbono-carbono, sistemas aromáticos, grupo carbonilo, imino (C=N), diazo (N=N), nitro y enlaces C-Y (Y es un átomo con pares libres). Si hay conjugación de estos grupos, los máximos de absorción se desplazan hacia la región visible e incrementan la intensidad de la absorción. Fig. 1: Regiones del espectro electromagnético Tabla 1. Clasificación de alcaloides por grupos según la naturaleza de los heterociclos. Grupo de alcaloides Longitud de onda (nm) Isoquinolénicos Por encima y debajo 300 Bencilisoquinoleínas Máximo: 280 Mínimo: 250-260 Dehidroaporfinas 280 Quinolenicos 330-335 Aporfinas monofenólicas 315-330 Máximo 1: 245 Máximo 2 (ancho banda): Furoquinolinas 290-330 Indólicos 226, 290 Xantinas 273 Menisperinas 254, 262 Berberinas 275 Acridónicos Banda 240-280, pico a 274 Piridinas 198, 251  320 Pirrolizidínicos Procedimiento 1. Para la preparación de la muestra, se toma una alícuota de 1 ml de los alcaloides totales y se adiciona 3ml de etanol hasta completar un volumen de 4 ml. 2. Una vez preparada la mezcla, se adiciona la cantidad necesaria en la celda que será leída a diferentes longitudes de onda (200-400 nm), en tránsitos de 10 en 10 nm. 3. Anotar las lecturas de absorbancia a las cuales absorbe la celda con diferentes longitudes de onda y comparar con la literatura. Bibliografía.  Martínez M. A.; “MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUÍMICA” Facultad de Química Farmacéutica, Universidad de Antioquia, Medellín, 2008.  Farmacognosia y Fitoquímica, Alejandro Martínez , Universidad de Antioquia, Medellín, 2005.  UNIVERSIDAD DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES DEPARTAMENTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE INGENIERIA AGRONOMICA LABORATORIO: Cinética Enzimática INSTRUCCIONES: - Contenido del reporte: Diagrama de flujo, resultados, análisis de resultados, respuestas a las preguntas propuestas en la guía. - Se tendrá en cuenta para la nota la capacidad de análisis y de síntesis. - Recordar las citas bibliográficas para las respuestas a las preguntas. - Tamaño Máximo del reporte 4 páginas (2 hojas), adicional hoja milimetrada con las graficas. OBJETIVOS: - Reconocer la importancia de las enzimas en la degradación de H2O2 - Construir el diagrama de Lineawaber- Burk para determinar los parámetros cinéticos de la enzima - Determinar los parámetros cinéticos de la enzima: Km y Vmax - Interpretar los parámetros cinéticos de la enzima FUNDAMENTO: Las enzimas son proteínas catalíticas que tienen como función aumentar la velocidad de una reacción (disminuyen la Energía de activación en una reacción química). Estas proteínas son necesarias para que las reacciones en los seres vivos ocurran a la velocidad fisiológica que se necesita. En los seres vivos ocurren miles de reacciones químicas y cada una de ellas es catalizada por una enzima, para que esto suceda la enzima debe interactuar con la molécula (reactivo de una reacción) que en bioquímica se denomina sustrato (S) y se forma el complejo Enzima-Sustrato, este sitio de interacción se denomina sitio activo y tiene un área específica (área de su estructura terciaria), lo que le confiere a la enzima especificidad. Una vez se forma el complejo sucede la reacción, el sustrato se convierte en producto y deja el sitio activo. E+S ES E+P CONSULTAS PRE-LABORATORIO - Cómo se clasifican las enzimas? - En los sistemas biológicos ¿cuáles enzimas tienen como sustrato el H2O2? - ¿Por qué el H2O2 debe descomponerse en los sistemas biológicos? - Consultar la ecuación de descomposición del H2O2 - Identificar la variable dependiente e independiente del diagrama de Lineawaber Burk - Consultar: ¿qué me indican los parámetros cinéticos Km y Vmax? PROCEDIMIENTO: Primera parte: 1. Mezclar 10gr de levadura, 400mL de agua destilada y 2mL de de jabón líquido. 2. Mezclar una papa licuada, 400mL de agua destilada y 2mL de de jabón líquido. 3. Marcar dos tubos de ensayo, en el tubo 1 agregar 2mL de la solución de levadura y en el tubo 2 agregar 2mL de la solución de papa. 4. A cada tubo añadir 1 gota de peróxido de hidrogeno (H2O2) al 30%. 5. Agitar los tubos de ensayo y observar que empieza a formarse espuma. 6. Anotar el tiempo transcurrido (en segundos) hasta que termina la formación de espuma: __________________ NOTA: Cuando la espuma deja de formarse el sustrato se ha agotado Cálculos y preguntas: a) La altura de la espuma formada (en milímetros) sobre el tiempo (en segundos) durante el cual se forma la espuma equivale a la velocidad de la reacción. Calcular la velocidad de reacción: b) En la reacción que acabas de realizar plantea cual es el sustrato y cuál es el producto o los productos formados? __________________________________________________________________ _______ c) Cual es la función del jabón en el ensayo: _______________________________________________________ Segunda parte: 1. Tomar seis tubos de ensayo y numerarlos de 1 a 6. 2. Añadir en cada tubo de ensayo 2mL de solución de levadura. 3. Añadir a cada tubo 2 gotas de H2O2 al 1, 2, 4, 8, 16 y 30% respectivamente, mezclar y medir la altura de la espuma (en milímetros) formada en cada tubo durante 5 segundos y consignar los resultados en la siguiente tabla: Tubo de ensayo 1 2 3 4 5 6 Solución de Levadura en mL 2 2 2 2 2 2 2 gotas de H2O2 al: 1% 2% 4% 8% 16% 30% Altura de la espuma en mm Velocidad mm/seg* * 5 segundos Tercera parte: 1. Tomar seis tubos de ensayo y numerarlos de 7 a 12. 2. Añadir en cada tubo de ensayo 2mL de solución de papa. 3. Añadir a cada tubo 2 gotas de H2O2 al 1, 2, 4, 8, 16 y 30% respectivamente, mezclar y medir la altura de la espuma (en milímetros) formada en cada tubo durante 5 segundos y consignar los resultados en la siguiente tabla: Tubo de ensayo 7 8 9 10 11 12 Solución de papa en mL 2 2 2 2 2 2 2 gotas de H2O2 al: 1% 2% 4% 8% 16% 30% Altura de la espuma en mm Velocidad mm/seg* * 5 segundos Cuarta parte: 1. En una hoja milimetrada realizar un gráfico que represente la variación de la altura de la espuma (velocidad) en función del porcentaje de H2O2 (para levadura y papa respectivamente). Identificar la variable dependiente e independiente antes de realizar el grafico y ubicarlas en los ejes adecuadamente. Cálculos y preguntas: a) De las graficas deducir los valores de Km para la levadura y la papa, y compararlos. b) ¿Qué indican los valores de Km? _______________________________________________________________ __________________________________________________________________ _________________________ c) ¿Cuáles serian las unidades del Km para el presente ensayo? ________________________________________ d) De las graficas deducir los valores de Velocidad máxima para la levadura y la papa, y compararlos. e) ¿Qué indican los valores de velocidad máxima? ___________________________________________________ __________________________________________________________________ _________________________ f) ¿Cuáles serian las unidades de la velocidad máxima para el presente ensayo? ___________________________ REFERENCIAS: - Boyer R. MODERN EXPERIMENTAL BIOCHEMISTRY. Third edition. 2000. Benjamin Cummings. - Harvey D. MODERN ANALYTICAL CHEMISTRY. 2000. McGraw-Hill. - Holme D. & Peck H. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY. Third edition. 1998. Prentice-Hall. - Nelson D. & Cox M. LEHNINGER PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY. Fourth Edition. 2004. W.H.Freeman.  UNIVERSIDAD DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES DEPARTAMENTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE INGENIERIA AGRONOMICA LABORATORIO: Fotosíntesis y Pigmentos Fotosintéticos. Cromatografía en papel y Espectrofotometría Visible. INSTRUCCIONES: - Desarrollar en una hoja tipo parcial y las graficas en hoja milimetrada, buena letra y buen orden. - Contenido del reporte: Diagrama de flujo, resultados, análisis de resultados, respuestas a las preguntas propuestas en la guía. - Se tendrá en cuenta para la nota la capacidad de análisis y de síntesis. - Recordar las citas bibliográficas para las respuestas a las preguntas. - Tamaño Máximo del reporte 4 páginas (2 hojas), adicional hoja milimetrada con graficas. INSTRUCCIONES: - Desarrollar en una hoja tipo parcial y las graficas en hoja milimetrada, buena letra y buen orden. - Contenido del reporte: Diagrama de flujo, resultados, análisis de resultados, respuestas a las preguntas propuestas en la guía. - Se tendrá en cuenta para la nota la capacidad de análisis y de síntesis. - Recordar las citas bibliográficas para las respuestas a las preguntas. - Tamaño Máximo del reporte 4 páginas (2 hojas), adicional hoja milimetrada con graficas. OBJETIVOS: - Estudiar el proceso de la fotosíntesis. - Extraer y separar pigmentos fotosintéticos usando cromatografía en papel. - Construir un espectro general de absorción de la luz visible por fotopigmentos. - Describir los pigmentos fotosintéticos primarios y secundarios y conocer sus estructuras. FUNDAMENTO: La fotosíntesis es un conjunto de reacciones que realizan todas las plantas verdes (que poseen clorofila), las cianofíceas y algunas bacterias, y a través de las cuales se sintetizan glúcidos o hidratos de carbono por acción de la luz en presencia de la citada clorofila y otros pigmentos, y con el concurso del dióxido de carbono atmosférico y el agua. En resumen, la fotosíntesis es la transformación de la energía luminosa en energía química. Su importancia no es de índole menor, pues prácticamente toda la energía consumida por la vida de la biosfera terrestre procede de la fotosíntesis. PREGUNTAS INTRODUCTORIAS: - Describa brevemente el proceso de fotosíntesis, realice un esquema y reporte la ecuación global del proceso. - Dibuje un cloroplasto y señale sus partes. - Defina los siguientes términos tilacoide, lamelas, estroma y reporte las funciones de estos en el proceso fotosintético? - Dibuje las estructuras de los pigmentos fotosintéticos primarios y secundarios, resaltando la parte de la estructura responsable de la absorción de la luz. - Realice un esquema del espectro de absorción de la luz visible por fotopigmentos. PREGUNTAS: - Balance de la fotosíntesis: En 1804 Theodore de Saussure observo que el peso total del oxígeno y de la materia orgánica seca producida por las plantas es mayor que el peso del dióxido de carbono consumido durante la fotosíntesis. ¿De dónde proviene el peso extra? Use la ecuación global del proceso de fotosíntesis para enfocar su respuesta. - Eficiencia fotoquímica de luz de diferentes longitudes de onda: La velocidad de fotosíntesis, medida según la producción de oxígeno O2 es mayor cuando una planta se ilumina con luz de 680nm de longitud de onda que con luz de 700nm. Pero la iluminación con una combinación de 680nm y 700nm da una velocidad de fotosíntesis mayor que la de cualquiera de las dos longitudes de onda por separado. Explíquelo. PROCEDIMIENTO: - Preparación de la cromatografía en papel: Recortar una tirilla de papel filtro de 10x2cm. Preparar un vaso de precipitados de 200 o 250mililitros conteniendo 2 a 5mililitros de etanol (la altura del etanol en el fondo del recipiente no debe exceder los 3 milímetros). - Obtención del extracto de hojas de espinaca para cromatografía en papel: Macerar el material vegetal (traer 2 hojas de espinaca) en 5 mililitros de etanol y una pequeña cantidad de carbonato cálcico (Tritura la mezcla hasta que las hojas se decoloren y el disolvente adquiera un color verde intenso). Con un capilar colocar una gota del extracto en un extremo de la tirilla de papel filtro y con la gota de extracto hacia abajo introducir la tirilla de papel filtro hasta que toque el fondo del vaso de precipitados. Esperar unos treinta minutos y aparecerá en la parte superior de la tira de papel unas bandas de colores que señalan los distintos pigmentos. Al observar el papel donde hemos hecho la cromatografía, vemos cuatro bandas o zonas, que corresponden a los distintos pigmentos fotosintéticos presentes en las hojas de espinaca. Según su grado de solubilidad en etanol se reconocen las bandas de Clorofila b, Clorofila a, Xantofilas y Carotenos. Consultar los colores de cada pigmento para realizar el reconocimiento y ubicación en la práctica. Calcular y reportar las movilidades relativas de los pigmentos usando como referencia el frente de corrido del solvente. - Obtención del extracto vegetal para espectrofotometría: Macerar el material vegetal (hojas frescas) en 10 mililitros de etanol y una pequeña cantidad de carbonato cálcico (Tritura la mezcla hasta que las hojas se decoloren y el disolvente adquiera un color verde intenso), medir el volumen del extracto obtenido, luego realizar una filtración con algodón para remover el material solido (debe quedar cristalino para poder realizar la medida en el espectrofotómetro), se debe medir también el volumen de extracto después de la filtración. - Construcción del espectro de absorción de la luz visible por fotopigmentos: Los datos para esta grafica se obtienen al medir la absorbancia en un rango de 380 a 700nm para el extracto vegetal filtrado a intervalos de longitud de onda de 20nm, obteniéndose la siguiente tabla de datos. Longitud 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 de onda 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Absorban cia Realizar una grafica de Absorbancia (y) versus Longitud de onda (x) y ubicar en las diferentes longitudes de onda los posibles pigmentos responsables de la absorción. - Calcular la concentración de las clorofilas a y b: Medir la absorbancia del extracto a 647 y 664nm y usando la siguiente ecuación calcular la concentración de clorofilas: REFERENCIAS: - Boyer R. MODERN EXPERIMENTAL BIOCHEMISTRY. Third edition. 2000. Benjamin Cummings. - Harvey D. MODERN ANALYTICAL CHEMISTRY. 2000. McGraw-Hill. - Holme D. & Peck H. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY. Third edition. 1998. Prentice-Hall. - Nelson D. & Cox M. LEHNINGER PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY. Fourth Edition. 2004. W.H.Freeman.  UNIVERSIDAD DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES DEPARTAMENTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE INGENIERIA AGRONOMICA LABORATORIO: Espectrofotometría UV-Visible INSTRUCCIONES: - Desarrollar en una hoja tipo parcial y las graficas en hoja milimetrada, buena letra y buen orden. - Contenido del reporte: Diagrama de flujo, resultados, análisis de resultados, respuestas a las preguntas propuestas en la guía. - Se tendrá en cuenta para la nota la capacidad de análisis y de síntesis. - Recordar las citas bibliográficas para las respuestas a las preguntas. - Tamaño Máximo del reporte 4 páginas (2 hojas), adicional hoja milimetrada con las graficas. OBJETIVOS: - Conocer el fundamento teórico-práctico del análisis espectrofotométrico. - Aprender a seleccionar la longitud de onda de máxima absorbancia para la sustancia a analizar. - Construir una curva de calibración. - Determinar la concentración de sustancias problema. - Comprobar experimentalmente la ley de Lambert-Beer. - Ver y consultar la importancia que tienen los métodos espectrofotométricos en Bioquímica. FUNDAMENTO: El análisis bioquímico de sustancias contenidas en sangre, tejidos, orina, alimentos, entre otros en la mayoría de los casos requiere del uso de la técnica espectrofotométrica, la cual relaciona la intensidad del color de una solución con la concentración de la sustancia coloreada. Todo método espectrofotométrico se basa en la comparación de la absorbancia de una sustancia de concentración desconocida con la de una solución de la misma sustancia cuya concentración se conoce y a la cual se denomina solución patrón o estándar. La absorbancia de una solución es la resultante de la absorbancia del soluto cuya concentración se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben también a esa longitud de onda. Estos compuestos se denominan interferencias. Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga todos los componentes del sistema menos aquel que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de éste debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0. PREGUNTAS INTRODUCTORIAS: - En qué consiste la ley de Lambert-Beer? - Consultar Aplicaciones en bioquímica experimental de la ley de Lambert-Beer. - Consultar la longitud de onda de absorción del permanganato de potasio (KMnO4) - Realizar un esquema de un espectrofotómetro UV-Visible, con sus partes principales - Que es una curva de calibración y para que se usan en espectrofotometría. - Reportar la ecuación de la recta para una regresión lineal y las ecuaciones para calcular la pendiente y el punto de corte de la recta sobre el eje (y). PROCEDIMIENTO: - Selección de la longitud de onda máxima: Los datos para esta grafica se obtienen al medir la absorbancia para una solución de concentración fija de permanganato de potasio 0,4mM a diferentes longitudes de onda en intervalos de 25nm, así: Longitud de onda 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 Absorbancia Realizar una grafica de Longitud de onda (x) versus Absorbancia (y) y hallar la longitud de onda de máxima absorción. - Curva de calibración: Realizar diluciones seriadas con volumen final de 10mL en las siguientes proporciones v:v 1:4, 1:3, 1:2 1:1, tenemos 5 muestras incluyendo la inicial (0,4mM). Medir la absorbancia de las 5 soluciones de concentración conocida a la longitud de onda hallada en el paso anterior y construir una tabla con estos datos. Además reportar los cálculos de las concentraciones de las diluciones. Usando los datos de Absorbancia (x) y concentración (y) de la tabla anterior construir una grafica y calcular la pendiente y el corte en el eje (y) y reportar la ecuación correspondiente a dicha grafica. - Calculo de concentración en muestras problema: En el transcurso de la práctica serán entregadas 2 muestras de concentración desconocida, realizar la medida de absorbancia para cada una y calcular la concentración usando los dos métodos, el grafico y despejando de la ecuación. Comparar los resultados de concentración de cada muestra hallados por el método grafico y por la ecuación. Por qué razón se presentan diferencias en el valor de la concentración dependiendo del método usado para hallarla?. Si una de las soluciones problema sobrepasa los límites inferior o superior de la grafica, será posible calcular la concentración usando extrapolación? Explique su respuesta. Proponga una estrategia experimental para determinar esta concentración usando la curva de calibración construida anteriormente. REFERENCIAS: - Boyer R. MODERN EXPERIMENTAL BIOCHEMISTRY. Third edition. 2000. Benjamin Cummings. - Harvey D. MODERN ANALYTICAL CHEMISTRY. 2000. McGraw-Hill. - Holme D. & Peck H. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY. Third edition. 1998. Prentice-Hall. - Nelson D. & Cox M. LEHNINGER PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY. Fourth Edition. 2004. W.H.Freeman.