Hücre Biyoloji Laboratuvarı (MBG2015) 2009-2010 Öğretim Yılı Ders Notları PDF

Hücre Biyoloji Laboratuvarı (MBG2015 ) 2009-2010 Eğitim Öğretim Yılı Deney Klavuzu Prof. Dr. Sezai TÜRKEL  2 Program. 1- (17 Şubat). Giriş ve çalışma gruplarının oluşturulması, aç...

Hücre Biyoloji Laboratuvarı (MBG2015 ) 2009-2010 Eğitim Öğretim Yılı Deney Klavuzu Prof. Dr. Sezai TÜRKEL  2 Program. 1- (17 Şubat). Giriş ve çalışma gruplarının oluşturulması, açıklamalar. 2- (24 Şubat). Hücreyi inceleme yöntemleri, mikroskop tekniği ve özel mikroskopi yöntemleri. (Ders ve uygulama). 3- (3 Mart). Hücre çeşitlerinin mikroskopik ve makroskopik incelenmesi. Serbest Hücreler ve doku halinde hücre. Çizim ve tanıma. Prokaryotik hücre olarak yoğurt bakterisi, Dil Epiteli Hücresi, S. cerevisiae hücresi (haploid, diploid, poliploid), Bitki serbest hücresi (domates hücresi), Yumurta hücresi. Doku halindeki hücreler. Yaprak epiteli doku hücreleri, vb. 4- (10 Mart). Fiksasyon ve boyama yöntemleri. Dil epiteli, domates hücresi ve bitki gövde enine kesiti boyanması. Metilen mavisi, Eosin, Hematoksilin, Sudan-III, ile hücre kısımlarının (Nükleus, Sitoplazma) boyanması. (Rapor hazırlanacak). Ders ve uygulama. 5- (17 Mart). Hücre zarı ve lipidler, Plazmoliz ve deplazmoliz ile hücre zarının gösterilmesi, Lipid Bilayer tabakanın alkol ve kloroformda çözünürlüğü. Ders ve uygulama (Rapor Hazırlanacak) 6- (24 Mart). Hücre alt birimlerini inceleme, ayrıştırma yöntemleri, Kloroplast izolasyonu ve lugol ile boyama. (Rapor hazırlanacak). Ders ve uygulama. 7- (31 Mart). Mikrotom tekniği ve mikrotom ile kesit alma Ders ve Uygulama. Mikrotom’un tanıtılması ve parafine gömülmüş örneklerin gösterilmesi. 7- Ara sınav. (7-14 Nisan Sınav tarihi bölüm sınav programına göre ayrıca ilan edilecektir). 9- (14- 21Nisan). Elektron Mikroskobu tekniği, Hücre organellerinin Elektron mikrograflarından incelenmesi Kloroplast, kromoplast, Nucleus, nucleolus, mitakondri (Janus yeşili ile boyanması), çizgili kasta hücre iskeleti elemanları (aktin miyosin). (Ders, Çizim ve tanıma). 10- (28 Nisan). Hücre organellerinin Elektron mikrograflarından incelenmesi (devam). (Mikroskopik analiz ve boyama.) 11- (28 Nisan). Hücre organellerinin Işık Mikroskobu ile incelenmesi (Mikroskobik analiz ve organellerin boyanması). 12- (5 Mayıs). Hücre bölünmesi. (ders ve uygulama) Kök ucu hücrelerinde asetokarmin ile mitoz preparatı hazırlama ve mitozun aşamalarının tanınması ve çizimi. 13- (12 Mayıs). Hücre döngüsünün (S. cerevisiae’da ve Candida’da) mikroskobik analizi, Bakteri, Bitki ve hayvan Hücre kültürleri ve hücre senkronizasyonu. (Ders ve uygulama, Çizim) 14- (12 Mayıs). İmmunofloresans yöntemi, İmmunositokimya, FACS, Cell Sorting etc. Tekniklerinin açıklanması. (Ders- Hazır preparat izlenmesi)  3 1 Laboratuar: Genel Açıklamalar, gurupların oluşturulması ve laboratuarda yapılacak uygulamaların tanıtımı. Sitoloji laboratuarı zorunlu derstir. Laboratuara devam zorunludur. Devamsızlık dolayısıyla öğrencinin katılamadığı laboratuar ve uygulamalar için deney veya uygulama tekrarları yapılmayacaktır. Sitoloji laboratuarına (BYL1056) kayıt yaptıran öğrenciler laboratuar içeriğinin tamamından sorumludurlar. A ve B gurubu olarak planlanan Sitoloji laboratuarına öğrencilerin kendi guruplarında gelmeleri ve kendilerine gösterilen laboratuar masası ve mikroskobunda çalışmaları laboratuarın planlandığı şekilde yürütülebilmesi için çok önemlidir. Sitoloji laboratuarı 1 kredilik bir ders olduğundan tek ara sınav yapılacaktır. Laboratuar ara sınavı ve yarıyıl sonunda yapılacak olan final sınavı uygulamalı değildir. Başarı notunu belirlemede kullanılacak olan sınavların başarı notuna olan etkilerinin oranları: Ara sınav 1 : % 25 Laboratuar raporları: % 25 Final sınavı: % 50 olarak uygulanıp başarı notu bağıl değerlendirme sistemi ile belirlenmektedir. Laboratuara gelen öğrencilerin lam, lamel ve temiz mikroskop bezi getirmeleri; laboratuarda uygulamalar sırasında yapılacak olan açıklamalar için bir defter veya dosya / klasör tutmaları gerekir. Ayrıca her laboratuar için gerektiğinde çizimlerini yapacakları temiz beyaz kağıt, yumuşak uçlu kurşun kalem ve silgi ile gelmeleri gerekir. Önlük kullanmaları tavsiye olunur. Laboratuarda yapılacak olan çizimler laboratuar bitiminde ilgili guruptan sorumlu araştırma görevlisine verilecektir. Araştırma görevlileri tarafından değerlendirilen çizimler ve raporlar öğrencilere iade edilir. Çizimlerin değerlendirilmesinde; temiz ve düzgün çizim, orantı ve görüntü detaylarının verilip verilmediğine bakılır. Çizimlerde objenin adı, büyütme oranı ve inceleme ortamı, boyama vb. bilgiler şekil altına yazılır. Sitoloji laboratuarında çoğunlukla normal büyütme aralıklarında çalışan ışık mikroskopları kullanılır. Kullanılan mikroskobun bakımından ve düzgün kullanımından öğrenci sorumludur. Bu nedenle her laboratuarda öğrenci aynı mikroskobu kullanacaktır. Sitoloji laboratuarının içeriği aşağıda haftalara göre belirtilmiştir. Laboratuar veya uygulamaların sırası tabloda verildiği şekilde planlanmıştır.  4 II. laboratuar: Hücre ve Hücre yapılarını inceleme yöntemleri Hücreyi ve hücre yapılarını incelemede kullanılan çok çeşitli yöntemler bulunmaktadır. Hangi yöntemin kullanılacağı yapılacak olan inceleme ve araştırmanın amacına göre değişebilir. Bu yöntemler dört ana gurup altında sınıflandırılabilir. I- HÜCRELERİN DİREKT (CANLI) İNCELENMESİ. Serbest veya doku halinde bulunan hücrelerin in-vivo veya in-vitro olarak incelenmesidir. Direkt incelemede hücre yapısı ve canlılığı bozulmadan inceleme yapılmaktadır. Bu tür incelemelerde şeffaf yapılı organizmalar örneğin bazı Annelidler, Drosophila erginleri veya larvaları, bazı bitkisel doku ve organlar direkt olarak ve çoğunlukla çeşitli mikroskoplar yardımıyla incelenmektedir. Bazen dokulardan kesit alınarak bazen de dokuları homojenize edip dokuyu oluşturan hücre karışımlarının mikroskobik incelemesi yapılır. Direkt inceleme in-vivo, in-vitro, doku kültürü olarak veya vital boya kullanılarak yapılabilir. İn-vivo inceleme canlı organizma ya da hücrelerin yaşadıkları ortam içinde incelenmesidir. Örneğin bir doku kültürünün bulunduğu doku kültürü sıvısı içinde ve doku kültürü kabında incelenmesi, bir Drosophila larvasının incelenmesi in-vivo yöntemlere örnek olarak verilebilir. İn-vitro inceleme ise organizmadan alınan hücre veya dokunun canlı olarak fakat canlı dışında incelenmesidir. İn-vitro incelemeye örnek olarak lam-lamel arası preparat yapılarak yanak epiteli hücresinin incelenmesi veya domatesten alınacak serbest hücrelerin incelenmesi verilebilir. Direkt incelemede bazen de doku kültürü yöntemi kullanılabilir. Bir doku veya organ parçası belirli bir tampon sıvıda homojenize edilerek hücrelerine ayrıştırılır. Doku veya organdan ayrıştırılan hücreler doku kültürü ortamında üretilerek hücrelerin yapısı incelenebilir. Canlı hücrelerin incelenmesinde bazı hücre bölümlerinin, organel yapılarının, daha iyi analiz edilebilmesi için çeşitli boyar maddeler de kullanılmaktadır. Hücre içindeki çeşitli organelleri boyayan fakat bir süre için hücrenin canlılığını etkilemeyen bu tür boyar maddelere Vital Boyalar denir. Vital boyalar hücre biyolojisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Örneğin gelecek laboratuarlarda kullanılacak olan metilen mavisi, nötr kırmızısı, janus yeşili birer vital boyadır. II- HÜCRELERİN TESPİT EDİLEREK (FİKSE EDİLEREK) İNCELENMESİ). Bazı araştırmalarda hücrelerin canlı olarak incelenmesi pek mümkün olmayabilir. Bunun için hücreler veya doku parçaları çeşitli kimyasal maddeler ile inkübe edilerek tespit (fiksasyon)  5 işlemi yapılır. Tesbit edilen hücre veya doku canlılığını kaybetmesine rağmen yapısal özelliklerini bozulmadan korumaktadır. Hücre veya doku fiksasyonunda kullanılacak olan fiksatif maddeler hücre, doku ve hatta organizma tipine göre farklılık göstermektedir. Fikse edilen hücre veya dokular ayrıca çeşitli boyalar ile de boyanarak daha ayrıntılı incelemelerde kullanılmaktadır. Fiksasyon konusu ayrı bir laboratuarda ayrıntılı olarak işlenecektir. III- HÜCRE ALT BİRİMLERİNİN İNCELENMESİ. Belirli bir hücre veya doku tipinden hücre organellerini ve membran sistemlerini ayrı ayrı izole ederek inceleme yöntemleridir. Bu yöntemde önce doku veya hücre süspansiyonu homojenize edilerek hücrenin parçalanması sağlanır. Hücre homojenatından değişik santrifüj yöntemleri kullanılarak ayrı ayrı ve saf olarak organeller izole edilir. Bu yöntem ile kloroplast mitakondri, nükleus ve ribozomlar kolayca ve saf olarak ayrıştırılabilir. Bu organellerden başka hücre içi membran sistemini oluşturan endoplasmik retikulum ve golgi kompleksi de karışım olarak (mikrozom) elde edilebilir. IV- HÜCRE MAKROMOLEKÜLLERİNİN İNCELENMESİ. Temel biyokimyasal yöntemler kullanılarak hücreyi oluşturan lipid, protein, karbonhidrat ve nükleik asitleri de incelemek mümkündür. Bu makromoleküllerin çeşidi, miktarı, ve bazı yapısal özellikleri de analiz edilmektedir. Bu işlemlerde kromatografi, elektroforez, spektrofotometrik yöntemler, santrifügasyon, dializ ve fitrasyon gibi temel teknikler kullanılmaktadır.  6 Mikroskopik yöntemler Mikroskopik yöntemler hücre biyolojisi uygulamalarında en yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir. Yapılacak incelemenin amacına göre belirli bir mikroskop çeşidi seçilerek hücre veya doku incelemeye alınır. İnsan gücünün ayırma gücü 0.1 mm (100μm) dur. 0.1 mm’den daha küçük objeleri insan gözüyle ayrı objeler olarak görülemez. Işık mikroskobunda ise ayırma gücü 0.17μ - 0.25μ olarak gerçekleşir. Büyüklükleri yaklaşık olarak 1.17 mikron ile 1 mm aralığında olan objelerin analizinde faklı tiplerde ışık mikroskopları kullanılmaktadır. Işık mikroskobu ile incelenen hücreler ve hücre bileşenleri eukaryotik ve prokaryotik hücreler ve bazı hücre organelleridir. Bu objeler elektron mikroskobu ile de incelenebilir. Fakat elektron mikroskobunun asıl kullanım aralığı büyüklükleri 1 mikrondan küçük olan objelerin inclenmesidir. Hücre biyolojisinde yaygın olarak kullanılan bazı mikroskop çeşitleri ve genel özellikleri aşağıda özetlenmiştir. 1- Işık Mikroskobu: Normal, rutin analizler için kullanılan bir mikroskop çeşidi olup bir dizi mercek sistemlerinden oluşur. Bunlar en alttan başlayarak kondansör merceği, objektif ve oküler mercekleridir. Ayna veya ışık kaynağı olarak kullanılan lamba'dan gelen ışık kondansatör merceği ile tabla üzerinde bulunan objenin yani incelenecek materyalin üzerinde toplanır. Bilindiği gibi objeye yakın olan mercek sistemine "Objektif", göze yakın olan merceğe de “Oküler” denir. Objektifler mikroskop tüpünün alt kısmında döner tablada okülerler ise mikroskop tüpünün üst bölümünde yer alır. Objektifler ile obje belirli ölçüde büyütülür. Oküler merceği objektiften gelen görüntüyü bir derece daha büyüterek görüntü verir. Objektifler büyütüldükçe görüntü alanı daralır. O nedenle büyük objektif kullanılırken incelenecek obje görüntü alanı ortasında olmalıdır. Ayrıca objektiflerde daha büyük büyütmeye gidildikçe görüntü derinliği de azalır. O nedenle daha fazla ışığa ihtiyaç duyulur. Büyük objektife geçildiğinde diyafram (ışık ayarı) açılarak objeye daha fazla ışık gelmesi sağlanır. Işık mikroskoplarında mikroskobun marka ve modeline göre objektif mercekleri Akromatik veya Apokromatik olabilir. Akromatik objektifler görüntü alanı ortasında güzel net görüntü verdikleri halde, kenarlarda kesin bir görüntü vermezler. Bu durum değişik dalga boylu ışıkların başka başka odaklarda toplanması nedeni ile olur. Objektiflerdeki bu eksiklik Apokromatik objektif merceklerinde düzeltilmiştir. Apokromatik objektif mercekleri değişik dalga boylu ışınları aynı odak noktasında toplayarak görüntü alanının tamamında net bir görüntü oluşumunu sağlar. Özellikle renkli fotoğraf ile görüntülenecek objelerde apokromatik objektifler kullanılmalıdır.  7 Normal ışık mikroskobunda farklı büyütme özellikleri olan 2-4 adet objektif bulunabilir. Ortalama olarak genelde 3 objektifli mikroskoplar kullanılır. Birinci objektif boyu en kısa olan ve küçük büyütme veren objektiftir. 3-10x olabilir. Orta objektif biraz daha uzunca olup 20-40x yapabilir. Kullanacağınız mikroskoplarda en büyük objektif ise 100x olup immersiyon objektifi de denir. Mikroskopların marka ve modellerine göre farklı olsalar bile görüntü netliği sağlandığında objektifler ile preparat arasındaki uzaklıklar yaklaşık olarak şöyledir. 10x küçük objektif = 40 mm (4 cm) 20-40x orta objektif = 7 mm (0.7 cm) 100x büyük objektif = 0.4 mm (0.04 cm) Bundan dolayı mercek sistemlerine ve kullanılan preparata hasar vermemek için bu uzaklıklar unutulmamalı, özellikle 40X ve 100X objektiflerini kullanırken mikrovida kullanılarak görüntü netliği sağlanmalıdır. İyi bir mikroskop objeyi sadece büyütmekle kalmamalı aynı zamanda görüntünün ayrıntılarını da göstermelidir. Bu da mikroskobun ayırma gücü (Resolution) ile açıklanır. Ayırma gücü birbirinden ayrı olarak görülebilen iki nokta arasındaki en küçük uzaklığın tersidir. R=1/r ile gösterilir. Bu formülde R= ayırma gücü, r ile birbirine en yakın olan ve net görülebilen iki nokta arasındaki uzaklıktır.  8 MİKROSKOBUN KULLANIMI Mikroskop çok fazla sarsmadan ve ışık ayarları iyi yapılarak kullanılır. Oküler ve objektif mercekleri ve varsa ayna ve kondansör çok temiz tutulmalıdır. Önce mercekler, temiz bir mercek temizleme kağıdı veya laboratuar bezi ile temizlenir. Eğer mercekler çok kirli ise hafif olarak saf alkol veya ksilen ile ıslatılmış temizleme bezi ile temizlenerek kurulanır. Bu sıvıların fazlası mercekleri bulundukları yere yapıştırılan maddeyi de çözüp mercekleri yerinden oynatabilir. İmmersiyon objektifi kullanırken çok fazla sedir yağı damlatılmamalıdır. Kullandıktan sonra sedir yağı önce temiz bez ile veya mikroskop temizleme kağıdı ile alınır, sonra çok az miktarda ksilen veya kloroform ile tamamen temizlenir. Bu objektifler çok dikkatli kullanılmalı, görüntü ayarları sırasında preparata değmemeli ve hiçbir zaman sedir yağlı bırakılmamalıdır. Normal ışık mikroskobundan başka kullanılan diğer mikroskop çeşitleri de vardır. Bunlar sırasıyla aşağıda özetlenmiştir. 2- Diseksiyon mikroskobu: Büyük ve opak materyallerin incelenmesinde kullanılan bu tip mikroskoplarda büyütme genellikle 4x ile 40x arasında değişir. Bu tür mikroskoplar daha çok morfoloji laboratuarlarında ve diseksiyon amaçları için kullanılır. Bu labarotuvarda kullanılmayacaktır. 3- Karanlık alan mikroskobu: Canlı ve saydam hücrelerin incelenmesin de kullanılan bir mikroskoptur. Bu mikroskopta temel farklılık normal kondansör yerine karanlık alan kondansörü adı verilen özel bir kondansör yerleştirilir. Bu kondansörün özelliği dışarıdan hiçbir direkt ışığın objektife iletmeyişidir. Karanlık alan kondansatörü yardımı ile ancak objeden (preparattan) yansıyarak gelen ışınlar objektife girerler. O nedenle incelenecek obje karanlık bir ortamda parlak olarak görülür. Bu yöntem daha çok tıpta ve mikrobiyolojide kullanılır. 4- Faz kontrast mikroskobu: Bu yöntem de canlı hücrelerin incelenmesinde kullanılır. Canlı hücreler görünen ışıkta, beyaz ışıkta saydamdır. Hücrelerin çeşitli bölümlerini görmek için genellikle boyama yapılır. Özel boyalarla farklı organeller farklı renklere boyanarak görünür hale getirilirler. Normal ışık mikroskobunda hücrenin çeşitli bölgelerinden gelen ışınlar arasında faz farkı çok azdır. Faz konrast mikroskobunda ışınların fazlarını (kırılma indislerini) arttırıcı bir sistem eklenmiştir. Bu da hücrelerin farklı bölümlerinin ayırt edilmesini sağlar ve daha net görüntü verir. 5- Polarizasyon mikroskobu: Herhangi bir ışık mikroskobuna polarize ışık veren parçanın eklenmesiyle oluşturulur. Dolayısıyla obje polarize olma özelliği olan ışıkta incelenir. Taze ve tespit edilmemiş materyalin incelenmesinde kullanılır. İğ iplikleri, kas ve sinir lifleri vb. 6- Ultraviole mikroskobu: Fluoresans özelliği olan maddelerin analizinde veya fluoresans maddelerle boyanmış doku, hücre yapılarını incelemede kullanılır. Işık kaynağı UV aralığında  9 ayarlanır ( ≈ 200 - 300 nm). Ayrıca ultraviole cam veya plastikten geçmediğinden mikroskobun aydınlatma sisteminde kuvars mercekler ve kuvars lam, lamel kullanılır. Bir mikroskobun ayırma gücü objeyi aydınlatan ışığın dalga boyu küçüldükçe arttığından, UV mikroskobunun ayırma gücü ışık mikroskobundan çok daha fazladır. UV aralığı 200-300 nm görünür ışık 400-800’dir 7- İnterferens mikroskobu: Faz kontrast mikroskobu ile aynı prensip üzerine oluşturulmuştur. Bu yöntemde de objeden gelen ışınların kırılma indisleri farkından yararlanılır. Faz farkları mercek sistemleriyle daha iyi görüntü elde edilmesini sağlamaktadır. Ayrıca bu mikroskop ile objenin kalınlığı vb. kriterler de hesaplanabilmektedir. 8- Elektron mikroskobu: Genel yapısı ışık mikroskobuna benzemekle birlikte, önemli farkları da vardır. Işık kaynağı yerine ısıtılmış bir metalden yayılan elektronlar kullanılır. Optik mercekler yerine ise manyetik mercekler kullanılır. Elektronlar rastgele değil bir silindir içinden elektron demeti olarak objeye gönderilir. Vakum sistemi elektronların dağılımını önler. Görüntü bir fotoğraf plağı üzerine düşer veya ekrandan gözle de incelenebilir. Elektron mikroskobunun büyütme aralığı 3000 ile 1000.000 dir. Ayırma gücü ise 3-7 A° dur. Elektron mikroskobunda iki değişik model kullanılır. Bunlar ; Scanning Elektron Mikroskobu (SEM). Daha çok kesit yerine yüzeyleri incelemede kullanılır. Ayırma gücü Transmission Electron Microskopy'den (TEM) daha azdır. Objeden yansıyan elektronlar görüntüyü oluşturur. Transmission Elektron Mikroskopy. (TEM). Standart elektron mikroskobuna verilen isimdir. Elektronlar objeden geçerler. (Elektron mikroskopları ile ilgili daha ayrıntılı bilgiler daha sonraki laboratuarlarda verilecektir). 9) Konfokal mikroskop : 1980’de geliştirilmiş yeni bir mikroskop ve tekniğidir. Konfokal lazer mikroskobu olarak da adlandırılmıştır. Bu mikroskobun en önemli iki avantajı vardır. Bunlar; a: Objeyi optik planlarda inceleme avantajı sağlar. Optik kesitler olarak objenin iç kısımları daha iyi analiz edilir. b: Kemik, kıkırdak, hücre iskeleti elemanları gibi elemanları standart ışık mikroskobu ile incelemek çok zordur. Opak yapıda olan bu objeler confocal mikroskopda lazer ışığı sayesinde çok net olarak incelenebilir. 20 - 25 mm'lik objeleri bu yöntemle çok kolay incelemek mümkündür.  10 10) Atomic Force mikroskobu : 1985’de geliştirilmiş bir teknik olup maddelerin yüzey görüntülerini atomic seviyede incelemeye yarar. Bir DNA iplikçiği üzerindeki çift zincirli yapıyı çok net olarak bu mikroskop tekniği ile görüntülemek mümkün olmuştur. Moleküler genetikte yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. Ayırma gücü 0.1 nm'ye kadar olabilir. Atomic force mikroskobu scanning force microskopy olarak da bilinir. Elektron mikroskobundan farkı elektron kaynağı obje üzerinde hareketlidir.  11 III Laboratuar: Hücre kavramı, çeşitli hücre tiplerinin mikroskopik analizi. Bu laboratuarda çeşitli canlı guruplarına ait hücre örnekleri ışık mikroskobunda incelenecektir. İn-vivo ve in-vitro şartlarda bazı hücre çeşitlerinin analizi yapılacaktır. In-vivo inceleme hücrenin bulunduğu ortam içinde canlılığını bozmadan doku yapısını bozmadan değiştirmeden yapılan incelemedir. İn-vitro inceleme ise organizmadan alınan hücrelerin organizma dışında fakat canlılıklarını kaybetmeden yapılan incelemedir. Bu laboratuarda, çeşitli hücre türleri arasındaki büyüklük, şekil farkı ve orantıları analiz edilecektir. İncelenecek objeler : 1. Domatesin etli dokusundan alınacak (serbest hücre) bitki hücresi. (40x ve 10x da incelenecek). 2. Temiz kürdanla alınacak dil/yanak epiteli (serbest hücre) (10x ve 40x da incelenecek) 3. Haploid ve diploid S. cerevisiae hücreleri (10x ve 40x incelenecek) 4. Yaprak veya gövde dokusundan enine kesit 10x, 40x 'da incelenecek 5. Yumurta hücresi. 6. Prokaryotik hücreye örnek olarak lactobacillus 'un 10x, 40x ve immersiyon objektifindeki görüntüleri incelenecek. Çizimler 40x objektifindeki görüntülere göre yapılacaktır.  12 IV. Laboratuar. Sitolojide Kullanılan Boyalar ve boyama yöntemleri. Hücrelerin veya dokuların farklı kısımlarını birbirinden ayırt etmek için hücre veya dokular çeşitli maddeler ile boyanmaktadır. Farklı hücre yapılarını örneğin organelleri ve dokuların çeşitli bölgelerini boyamak için kullanılan boyar maddeler çeşitli şekillerde guruplandırılmaktadır. En yaygın olarak kullanılan sınıflandırmada sitoloji veya histolojide kullanılan boyalar Doğal ve Sentetik boyalar olarak iki guruba ayrılabilir. Doğal boyalardan hücre yapılarını görünür hale getirmek için en yaygın olarak kullanılanlar karmin, hematoksilin ve orsein gibi boyalardır. Doğal boyalar çeşitli bitki ve hayvanlardan elde edilir. Sentetik boyalar da sitoloji ve histolojide yaygın olarak kullanılmaktadır. Örnek olarak Azo boyaları (Sudan III, Metil oranj, Kongo kırmızısı), Kinon-imin gurubu boyalar verilebilir. Laboratuarda yapılacak uygulamada sitoplazma ve nükleusun farklı boyalar ile boyanması yapılacaktır. Nukleus hematoksilin, aseto karmin ve bazik analin boyaları ile boyanır. Hematoksilin bazik bir boya olup asidik kısımlara bağlanır (nükleus, kromotin vb). Bu tür boyalara bazofilik de denir. Bazofilik bazik boyalar ile boyanabilme özelliğidir. Karmin, aseto-karmin de nükleus boyama da kullanılır. Bu tür boyalarda sitoplazmadaki RNA'yı da boyayabilir. Dolayısıyla her ne kadar nükleus kadar koyu olmasa da sitoplazmadaki asidik RNA'lar ile reaksiyona girebilirler. Asidik boyalar ile boyanabilme özelliğine de asidofilik özellik denir. Nükleik asitler bazik boyalar ile boyanırken, sitoplazma daha çok asidik boyalar ile boyanır. Bu tür genel boyalardan başka sadece bir organele özel boyalar da vardır. Örneğin Janus yeşili olarak bilinen boya sadece mitakondrinin boyanmasında kullanılır. DAPI ise özel bir nükleus boyasıdır. Eosin tipik bir sitoplazma boyasıdır. Eosin ile boyanan bileşikler pembe-kırmızı arası tonlarda olabilirler. Ayrıca, bordo kırmızısı ve kongo kırmızısı da sitoplazma boyası olarak kullanılabilir. Laboratuarda 3-4 farklı boya ile dil/yanak epiteli, domates hücresi ve yaprak dokusundan alınacak ince enine kesitler boyanacaktır. Boyama sonucu her üç hücre tipinde oluşan renkleri ve oluştukları kısımlar belirtilecektir. Bu laboratuarın sonuçları çizim olarak değil, rapor olarak hazırlanacaktır. Raporlar; giriş, materyal ve yöntem ve sonuçlar olarak 3 alt bölümden oluşacaktır.  13 V. Laboratuar: Hücre zarının varlığının gösterilmesi Hücre zarı ışık mikroskobu ile direkt olarak gözlenemez. Bu nedenle indirekt olarak varlığı test edilebilir. A) Bu deneyde ilk olarak lipidlerin organik çözücülerde çözünme ve hücre zarının da bundan dolayı bozunma, çözülme özelliği gösterilir. Deney için hücre içeriği antoksiyanin gibi yoğun pigment içeren kırmızı pancar veya lahana kullanılır. Kırmızı pancar: Beta vulgaris, ssp.rapa, f. rubra, Kırmızı lahana : Brassica acephala'nın ssp'idir. Önce bu bitkilerden ince kesit alıp mikroskop altında hücresel yapıları incelenir. Sonra % 50'lik EtOH ve MeOH'dan ayrı ayrı birer damla preparatlarına damlatarak hücre zarının parçalanması sonucu pigment içeriğinin hücre dışına çıkışının mikroskop altında gözlemlemeleri istenir. Kloroform, MeOH ve EtOH'un etki etme, hücre membranı lipid-bilayer tabakasını çözme süreleri çok farklıdır. Difuzyon katsayısı daha büyük olan alkol daha hızlı etki ederek daha hızlı çözünme sağlar. B) İkinci deneyde de ozmoz ile plazma zar varlığı kanıtlanır. Brassica acephala yaprağından ince yüzeysel kesit alınır. Mikroskopta 40X objektifi ile incelenen kesitin hücrelerin ayrı ayrı ve net olarak görülmesi için uygun olup olmadığı analiz edilir. Daha sonra bu ince kesitler üzerine 0.5 M NaCl damlatılarak hücre zarının büzülmesiyle sitoplazmanın içe doğru çekildiği sitoplazmadaki pigmentlerin oluşturduğu rengin ortada toplanmasıyla anlaşılır. Hücre sitoplazmik suyunu kaybetmiştir. Hücre zarı çeperden ayrılarak içeriye doğru hareket eder. Aynı deney kırmızı pancar ile de yapılır. Burada da sitoplazmanın su kaybetmesiyle pigmentlerin hücre ortasında toplandığı görülür. Yapılan deneylerin sonuçları bir rapor olarak hazırlanır.  14 VI. Laboratuar: Mikrotom Tekniği Mikrotom sitolojik veya histolojik araştırmalar için dokulardan çok ince (1-2 μ) kesit hazırlamak için kullanılan mekanik bir cihazdır. Çeşitleri daha sonra açıklanacaktır. Mikrotom ile kesit almadan önce kesit alınacak doku parçası veya canlının bu işlem için hazırlanması gerekir. Kesit öncesi hazırlıklar, kesit alınması ve kesit sonrası işlemler , işlem sırasına göre şöyle sıralanır : Doku seçimi ve fiksasyon Fiksasyon sonrası yıkama Dehidratasyon Saydamlaştırma ve Parafine gömme Parafin kesitlerinin alınması (Doku kesitinin alınması) Parafinin kesitlerden uzaklaştırılması Kesitlerin boyanması Preparatların sürekli hale getirilmesi Mikrotom ile kesit alınmasında izlenen bu işlemlerden bazıları dokuya göre değişebilir. Alternatif metodlar araştırıcının tercihine bağlıdır. Sırasıyla bu işlemlerde yapılanlar açıklanacaktır. Doku seçimi ve Fiksasyon Çalışılmak istenen hücre veya doku tipine göre canlı bireylerden doku/organ parçaları alınır. Bazen omurgasızlarda , Arthropodlarda vb canlılarda canlının tamamından kesit almak gerekebilir. Dokunun özelliğini kaybetmemek için doku parçası alınmadan önce genellikle hayvanlara uyuşturucu verilip hareketsiz hale getirilirler. Omurgalı hayvanlar için eter, kloroform gibi maddeler kullanılırken, omurgasızlar için farklı kimyasallar kullanılır. Örneğin; Crustacea --------> Etilüretan veya kloretan Mollusca -------> %1 Etil üreten veya kloretan Böcek larvaları ------> % 5 Etil üreten veya kloretan Deniz mollusk’ları için ------> MgSO4, %1 hidroksil amin. Bazı dokuların canlıdan direkt olarak alınması çok zordur. Bunun için maserasyon denilen ön işlemden geçirilirler. Maserasyon dokunun fiksasyondan önce kolay hazırlanabilmesi için farklı çözeltiler içinde bekletilmesidir. Daha sonra doku küçük parçalara daha kolay ayrılır. Alınacak dokunun veya hücrenin aslına en yakın şekilde incelenmesi gerekir. Dokunun bozulmasını önlemek, parafin alkol gibi maddelerde yapısının değişmesini önlemek için yapılan işleme fiksasyon , bu işlemler için kullanılan kimyasal maddelere de fiksatif denir. İyi bir fiksatifte olması gereken özellikler ise şöyle özetlenebilir;  15 a- Hücre veya dokunun bozunmasını önlemek için doku/hücre içine çok çabuk geçebilmelidir. b- Hücre içeriğini eritmeden ve bozmadan korumalıdır. c- Doku veya hücreleri daha sonra yapılacak işlemler sırasında büzülmekten ve şekil değişikliklerinden korumalıdır. d- Fiksasyon sonrası yapılacak olan boyama işlemleri için de uygun olmalı boyama reaksiyonları için inhibitör etki yapmamalıdır. Fiksatif seçimi ve fiksasyon süresi de incelenecek dokuya göre değişebilir. Fiksasyon için bazı kimyasallar tek tek kullanılabileceği gibi, karışım olarak da kullanılabilirler. Dokunun yıkanması Fiksatiflerin fiksasyon işleminden sonra fazlası dokudan çıkarılmalıdır. Bazı fiksatifler kesit alınmasını veya boyamayı engelleyebilir. Fiksasyon sonrası yıkamada kullanılan fiksatife göre değişir. Direkt olarak su ile yıkanabileceği gibi % 50 'lik EtOH ile de bazı fiksatifler uzaklaştırılabilir. Dehidratasyon Doku içinde suyun bulunması kesitlerin iyi alınmasını engeller. Parafinin dokuya girişini de engeller. Bu yüzden fiksatiften kalan, dokunun kendisinde bulunan veya ile dokuya giren suyun uzaklaştırılması gerekir. Bu da dokuyu alkol serilerinden geçinerek yapılır. Doku parçaları %30, 50, 70, 80, 90 ve % 100 alkolde bekletilir. Alkol suyu emeceğinden % 100 alkol ile yıkanan / bekletilen dokularda teorik olarak hiç su bulunmaz. her bir alkol içinde bekletme süresi doku büyüklüğüne göre değişiklik gösterir. EtOH 'den başka diğer alkoller de, örn Bütanol, su çekici olarak kullanılmıştır. Saydamlaştırma ve Parafine Gömme Dokunun alkol serilerinden geçirilmesinden sonra alkolün dokudan uzaklaştırılması gerekir. Çünkü parafin alkolde erimez, alkol ile karışmaz. Bunun için doku Toluen veya ksilene aktarılır. Bu ana işleme saydamlaştırma denir. Saydamlaştırma işleminden sonra doku erimiş parafin içine alınır. Parafinin içine girişi yine doku tipine de ve dokunun büyüklüğüne göre farklılık gösterir. Parafinde bekletme süresi sonunda doku kesit almaya hazırlanmak için uygun bloklara dökülerek dokunun gömülmesi sağlanır. parafin blokların donması beklenir ve daha sonra kesit alma aşamasına geçilir. Parafin Kesitlerinin Alınması Hazırlanan parafin bloklar mikrotoma yerleştirilir, ve kesit alma işlemine geçilir. Mikrotomlar çok çeşitlidir. El mikrotomu, Kızaklı mikrotom, Döner mikrotom, Dondurma mikrotomu ve Ultra mikrotom gibi çeşitleri vardır  16 Bölümümüzde kullanılan mikrotom, döner mikrotom dur. Mikrotom ile kesit alınmadan önce mikrotomun hazırlanması gerekir. Bunun için önce parafin bloklar mikrotom tablalarına monte edilir. Daha sonra Mikrotom bıçağı cihaza monte edilir ve kesit alınmaya hazır hale getirilir. Parafin bloktan kesitler alınır. Normal mikrotomlarda 3-10 μm kalınlıkta kesitler alınabilir. Kesit alındıktan sonra temiz ve hazırlanmış lam'lara aktarılırlar. Parafinin Kesitlerden Uzaklaştırılması Kesitlerin boyanması için parafinin dokudan uzaklaştırılması gerekir. Bu da preparatların önce ksilen sonra alkolde bekletilmesiyle yapılır. Üzerinde kesitler bulunan lamlar I. ksilen ve II. Ksilen banyosunda bekletilir. Daha sonra da % 100 -- % 70 EtOH'e sırayla alınıp re-hidre edilirler. boyaların çoğu suda çözündüğnden gerekirse daha düşük alkol konsantrasyonu olan ortamlara kadar indirgenebilir. Tercihen boyanın hazırlandığı çözelti içinde kesitler bir süre bekletilebilir. Boyama Boyama yine incelenecek dokuya göre değişir. Kullanılacak boya türü incelenecek yapı ve mikroskop türü göz önüne alınarak seçilir. Preparatların Kapatılması Bütün bu işlemlerden sonra hazırlanan kesitlerin sürekli hale getirilmesi istenebilir. Bunun için iyi boyanmış ideal kesitler seçilir ve tekrar kesitlerdeki su alkol serilerinden geçirilerek (hızlı bir şekilde) su uzaklaştırılır. Kesitlerin kurumasından sonra doğal veya sentetik reçineler konularak kesitlerin üzerleri kapatılabilir. Reçine kalınlığı fazla olmamalıdır. Fazla kalın olduğunda immersiyon objektifi ile inceleme yapılamayabilir.  17 Laboratuar VII: Hücre / Doku Homogenizasyonu ve Organel İzolasyonu Hücre yapısını oluşturan elemanlar çeşitli araştırmalar için ayrıştırılabilirler. Herhangi bir organel in-vitro çalışmalar için hücre parçalanarak santrifüj ile izole edilebilir. Bu işleme hücre alt birimlerine ayrıştırma (Cell fractination) denir. Hücreyi organellerine ayrıştırmada birinci aşama ilgili dokunun homogenizasyonudur. Çoğunlukla homogenizasyon için kolay parçalanan karaciğer gibi yumuşak hayvan dokuları ve yaprak ya da genç bitki kök uçları gibi bitki dokuları kullanılır. Homogenizasyondan önce doku steril bir tampon çözelti ile yıkanır. Burada amaç hayvansal dokulardan kan ve doku sıvısını uzaklaştırmak, bitkisel dokulardan ise toprak parçaları gibi kirleticileri dokudan temizlemektir. Daha sonra mümkün olduğunca soğuk ortamda bir tampon çözelti içinde homojenize edilir. Homojenizasyonda, homojenizatör, blender gibi aletler kullanıldığı gibi el ile de yapılabilir. Homogenizasyonda kullanılacak çözelti pH ≈ 7.5-8 arası olup proteaz inhibitörü içerebilir. Mitokondri, kloroplast gibi organellerin izolasyonunda ozmotik stabilizer olan sorbitol veya sukroz (0.3-0.4 m) kullanılır. Homojenizasyon sırasında ozmotik stabilite sağlanmaz ise organeller kendiliğinden patlar, bozulurlar. Hücre homojenatı önce kalın bir süzgeçten geçirilerek homogenize olmamış doku parçaları giderilir. Daha sonra düşük hızda ~1000g 1-2dak. Santrifüj edilip, bozulmamış hücreler ve nükleus çökelti olarak izole edilir. Süpernatant (sıvı kısım) alınıp tekrar 6000g de 10-30 saniye santrifüj edildiğinde kloroplastlar çöker. Bu ayrıştırma şartları sadece ıspanak bitkisi için geçerlidir. Farklı bitki kloroplastları farklı büyüklükte olduğundan çökme hızları ayrı ayrı belirlenmelidir. Sıvı kısım tekrar alınıp 20.000g'de 15 dakika santrifüj edildiğinde mitokondri çökeltisi oluşturulur. Süpernatant kısmı daha fazla ayrıştırılabilir. Bu kısmı ~100.000 de 60 dakika santrifüj edilirse mikrozom fraksiyonu çökelti oluşturur. Kalan sıvı kısım çoğunlukla sitoplazmik enzimler ve metabolitlerden oluşur. Ispanak Kloroplastlarının İzolasyonu Homogenizasyon tampon çözeltisi 0.02 M Tris tampon çözeltisi (pH:8). 0.01 M NaCl. 0.4 M sukroz. 50 gr ıspanak yaprak materyali için 100 ml olarak hazırlanmalı ve soğuk kulanılmalıdır.  18 Method Yaklaşık 50 gr ıspanak önce temizlenir, yaprak orta damarlarından ayrılır. Soğuk blender içine 100 ml homogenizasyon çözeltisi konur ve yapraklar ilave edilir. Yapraklar Max hızda 5 saniye homogenize edilir. Süre aşılmamalıdır. Homojenat cheesecloth (2 tabakalı tülbent bezi, veya sargı bezi olabilir) 'dan süzülüp, parçalanmamış dokular ayrıştırılır. Süzme soğuk huni ile erlen veya behere yapılabilir veya direkt santrifüj düpleme yapılabilir. Santrifüj tüplerinde 1000 g'de 1 dakika santrifüj edilip, sağlanan hücreler ve bir miktar nükleus ayırt edilir, çöktürülür. Sıvı kısım alınıp bu kez 6000 g'de 15-20 saniye santrifüj edilip kloraoplastların çökmesi sağlanır. Mikroskopik Analizler Elde edilen ilk homojenattan örnek alındığında hem tek hücre hem de nükleus ve kloroplast karışımının bulunduğu gözlenir. Homojenat içindeki nükleusların sayısı oldukça az olduğundan metilen mavisi veya hematoksilen ile boyama nükleusların görüntülenmesini, incelenmesini kolaylaştıracaktır. 1 damla homojenat alınıp lam-lamel arası preparat'da nükleus boyaması ile tek nükleuslar, kloroplastlar ve sağlam hücreler 10x40 büyütme ile incelenir. 1000 g çökeltisi bir miktar homogenizasyon bufferinde çözülerek mikroskopik analize hazırlanır. Kloroplast çözeltisi bir miktar (8-10 ml) homogenizasyonun bufferında çözülerek, 10x10 ve 10x40 büyütmeler ile sırasıyla incelenip izole kloroplastlar kolaylıkla görülebilir. Alternatif olarak kloroplastların iyot ile boyanması önerilebilir. Bu şekilde hazırlanan organellerden DNA izole edilebilir, saf organeller örneğin kloroplastlar in-vitro fotosentez deneylerinde, mitakondriler solunum deneylerinde, nükleuslar ise transkripsiyon, kromatin incelemesi, kromozom analizi gibi deneylerde kullanılır. RCF (relative centrifugal force, g) RPM (revalution per minute) dönüşümü: RCF:(g) = 1.12 r (RPM/1000)2 r = mm olarak Rotar yarıçapı  19 VIII. Laboratuar: Elektron mikroskobu yöntemi ve Mikrografların incelenmesi Elektron mikroskobu tıp ve biyolojide çok yaygın olarak kullanılmaya başlanmışlardır. E.M'nın genel prensipleri daha önce açıklanmıştır (Lab 1-2). Ayırma gücü normal ışık mikroskobuna göre çok çok yüksektir. Dolayısıyla büyütmesi de ışık mikroskobundan çok çok fazladır. Daha çok submikroskobik parçaların analizinde kullanılmış ve hücre yapılarının anlaşılmasını sağlamıştır. E.M'da analiz edilecek parçaların hazırlanması da ışık mikroskobundan farklıdır. temel farklılıklar şöyle özetlenebilir. Fiksasyon: Fiksasyon çok hızlı yapılmalıdır. Bu hücredeki ince yapı değişikliklerini önler. Hatta materyal lam üzerine bir damla fiksatif damlatılarak lam üzerinde yapılabilir. Fiske edilecek materyal 1 mm3 kadar olmalıdır. Dokunun parçalanması keskin bıçaklar ile stereomikroskop altında da yapılır. EM materyallerini fiske etmede kullanılacak fiksatiflerin genel özellikleri şunlardır: pH'ları doku pH'ına uygun (yakın olmalıdır) Fiske edilecek dokuya göre izotonik olmalı Fiksasyon soğukta 4°C'de yapılmalıdır Fiske edilecek materyale göre fiksatif seçilir Fiksatifler E.m'de iyi kontrast verecek nitelikte olmalıdır. Glutaraldehit ve formalin hücreyi iyi fiske ettikleri halde iyi kontrast sağlamazlar. Bunlara prefiksatif denir. Bu tür işleme de prefikasyon denir. bu işlemden hemen sonra dokular ikinci bir fiksatifle fiske edilir. İkinci fiksatifler dokuya elektronlar için kontrast sağlar. En çok kullanılan ise osmium tetroksittir. Bu tür fiksatiflere post-fiksatif , işleme de post-fiksasyon denir. Parçaların Yıkanması: Fiksatifin fazlası saf su ile yıkanır. Yıkanan parça tampon çözelti içinde uzun süre saklanabilir. Dehidrasyon ve saydamlaştırma : Alkol serlerinden dehidre edilen materyaller toluen, propilen oksit'te saydamlaştırılır. Plastik maddelere Gömme : Dokudan ince kesit alınması için parafin uygun değildir. Kesit ultra-mikrotomlarda alınır. E.M için kesit alınacağında sadece plastik gömme materyali kullanılır. En çok kullanılan materyal Araldit'tir. Epon da yaygın olarak kullanılan bir materyaldir. Plastik maddelerin içindeki dokudan daha iyi kesit almak için bazen Araldit 'e başka maddeler de ilave edilir. Plastik içine konulan doku , plastiğin katılaşması için (polimerizasyon için) 35-45 °C de etüv de iki gün bırakılır. Ultramikrotom ile ince kesit alma : Ultramikrotomlar E.M için kesit almada kullanılırlar. Bunlar prensipte normal mikrotom gibi çalışır. Fakat çok daha ince kesitlerdir. Ultramikrotomda  20 kesit alınacak materyallerden kesit almada metal bıçaklar yerine cam bıçaklar veya elmas bıçaklar kullanılır. elmas bıçaklar çok pahalı olduğundan genellikle cam bıçaklar tercih edilir. Cam bıçak hazırlamada kullanılan özel cihazlar bulunmaktadır. Alınan kesitler lam üzerine değil, metal plakalar (metal grid) üzerine alınır. Gridler bakır, nikel, çelik, altın gibi elektron yoğun metallerden yapılır. E.M'de inceleme, fotograflama : Gridler üzerine alınan kesitler kontrastın artması için kurşun asetatı , kurşun nitrat gibi metal tozlarıyla kaplanır. Boyamanın özelliğine göre pozitif boyama veya negatif boyama yapılabilir. Organeller veya hücresel yapıların görüntüleri yapılan boyama türüne göre değişiklik gösterir. Organeller koyu, çevre açık renk ise pozitif boyama denir. çevre koyu renk, organeller açık renk ise negatif boyama dan bahsedilir. Bu şekilde hazırlanan kesitlerin görüntüleri E.M'da floresans ekrana düşürülür. Ayrıca görüntü fotograf makinesi ile de görüntülenebilir. Bu şekilde hazırlanmış fotograflara elektron mikrografı denir. Bu laboratuarda ve gelecek laboratuar saatlerinde çeşitli hücre organellerine ait elektron mikrografları incelenecektir. Dondurma - Kırma Yöntemi : E.M'da incelenecek materyallerden bazen ince kesit almak yerine dondurma-kırma (freze-fracture) yöntemi kullanılmaktadır. Bu yöntemde incelenecek materyal önce -196°C de sıvı azot'ta dondurulur. Dondurulan doku -100°C -120°C mikrotomda çelik bıçak kullanılarak kırılır. Kırılma hücre içinde zayıf noktalardan geçerek gerçekleşir. İkinci aşmada vakum ile dokunun kırılma yüzeyindeki suyun uçurulması gerekir. Kırılan yüzeyler daha sonra platin-karbon karışımlarıyla kaplanırlar. Ayrı bir işlemle doku eritilerek geriye sadece dokunun doğal görünümünün kopyası olan platin-karbon kalıbı (replika) kalır. Bu replikalar E.M gridleri üzerine alınarak incelenir. Bu yöntem daha çok zor yapılarını incelemede kullanılır. Lab VIII de incelenecek materyaller: Hücreler arası bağlantılar, Dezmozom, hemidezmozom, Hücre yüzey farklılaşmaları, mikrovillus, Düz ve Granüllü Endoplazmik Retikulum, Golgi, Endositoz. Verilen EM Mikrografları Ayrı ayrı incelenecektir. Mikrograflar üzerinde ilgili bölümler açıklanacak, materyalin adı ve büyütme gibi teknik özellikler açıklnacaktır. Her yapı için tek şekil hazırlanacak.  21 IX. Laboratuar: Elektron mikroskobu yöntemi ve Mikrografların incelenme (devam) Kloroplast, Vakuol (1 şekil) Mitokondri , nükleus, nükleous (2 şekil) Hücre iskeleti elemanları, mikrotübül, mikrofilament, arafilamentler (3 farklı şekil) Verilen EM Mikrografları Ayrı ayrı incelenecektir. Mikrograflar üzerinde ilgili bölümler açıklanacak, materyalin adı ve büyütme gibi teknik özellikler açıklanacaktır. Her yapı için tek şekil hazırlanacak.  22 X. Laboratuar: Hücre organellerinin ışık mikroskobunda incelenmesi Telgraf çiçeği (Tradescantia) yaprağı üst epidermisinde vakuol, nükleus ve leukoplastlar yapraktan ince yüzeysel kesit alınarak incelenecektir. Ayrıca kesitler lugol ile boyanacaktır. Buna ek olarak aynı bitkiden gövde enine kesitleri de alınıp lugol ile boyanarak incelenecektir. Havuç kökünde (Daucus) Kromoplast ve karoten kristalleri ve yedek nişasta incelemek için çok ince kesit alınıp düşük ışıkta 10x10 ve 10x40 büyütmelerde incelenecektir. Elde edilen görüntüler çizim olarak hazırlanacaktır. Elodea yaprağında veya karayosununda kloroplastların bölündüğü gözlenecektir. Bu örneklerin hücrelerindeki kloroplastların sitoplazmada hareketi de görülebilir. Elodea yaprağının janus yeşili ile boyanmasıyla mitakondriler de görünür hale gelecektir. Janus yeşili ile boyama yanak epitelinde de yapılabilir. Aşağıdaki tabloda bazı organellerin yaklaşık büyüklükleri ve ışık mikroskobu ile elektron mikroskobunda gözlenebilen bazı özellikleri özetlenmiştir.  23 Hücre organellerinin ve diğer yapılarının büyüklüklerinin karşılaştırılması. Organel veya Büyüklük I.M’da I.M Özellikleri E.M. Özellikleri Yapı (Mikron) Görünürlük Nükleus 3-10 ++ Hücre içinde büyük ve İki farklı bi-layer ve por ayrı bir yapı olarak komleksleri, koyu renkli olarak görünür, nükleolus da eukromatin ve heterokromatin belirgindir. bölgeler görünür. Nükleolus 1-2 + Nükleus içinde yoğun Nükleus içinde yoğun ve ve küresel yapı olarak küresel yapı olarak görünebilir. görünebilir. Plasma 0.008- ---- Direkt olarak İç ve dışta elektron yoğun lipid membranı 0.10 Gözlenemez tabakaları orta kısımda ise elektron geçirgen kısım olarak üç katlı bir yapı olarak gözlenir. Granüllü E.R Geniş bir  Hafif şekilli genel bir Yassı keseler, kanalcıklar ve alanı kaplar bölge olarak bazı hücre bunlara bağlı ribozomlar olarak tiplerinde görülebilir. görülür Düz E.R. Geniş bir ---- ----- Yassı keseler ve tüpler alanı kaplar kanalçıklar olarak görülür. Ribozom içermez. Golgi Yaklaşık 5  Özel boyalar ile bazı Yassı membran tabakaları Kompleksi mikronluk hücre tiplerinde olarak ve çoğunlukla nükleusa alanı görülebilir. yakın bölgelerde görülür. kaplayabilir Salgı 0.050-1.0  Zymojen granülleri Çok sayıda küçük küresel Kesecikleri olarak bazı hücre yapılar olarak veya tiplerinde görülebilir. membranlara bağlı olarak bulunurlar Mitakondri Çapları  Janus yeşili ile İki membranı ve krista yapısı yaklaşık 1-2 boyandıklarında küçük çok net olarak görülür. mikrondur. nokta şeklinde ve bazen Uzunlukları de boyanmadan küçük ve şekilleri siyah noktalar olarak hücre tipine görülebilir. göre değişebilir. Plastidler Farklı ++ Kloroplastlar çok Kloroplastların iki membranı, çaplarda ve kolaylıkla bulundukları granum ve tilakoid membran şekillerde hemen hemen her türde sistemleri de çok net olarak olabilirler hücrede gözlenebilir. görülebilir. Diğer plastid tipleri de görülebilir. Endosomlar 0.02-0.5 ---- -------- Küçük, elektron geçirgen açık renkli küresel yapılar olarak görülebilirler. Lizozom 0.2-0.5 ----- ----------- Membran ile çevrili elektron yoğun ve koyu küreciklerdir. Peroksizom 0.2-0.5 ------ ----------- Membran ile çevrili elektron yoğun ve koyu küreciklerdir. Hücre İskeleti 0.008-  Özel yapı olarak Çeşitli çaplarda uzun lineer 0.025 organize olduklarında yapılar olarak görülebilirler. (Örneğin kas lifçikleri) görülebilirler. Ribozom 0.025 ---- --------- Küçük siyah noktalar olarak serbest veya E.R’a bağlı olarak görülürler.  24 Glikojen 0.010-  Tolidin mavisi ile boyanmış Çok koyu salkım şeklinde Granülleri 0.040 bazı hücre tiplerinde pembe yapılar olarak bazı hücre gölgemsi yapılar olarak tiplerinde görülebilir. görülebilir Lipid 0.2-5 veya  tanecikleri bazı hücre Adipositlerde çok kolay Kesitlerde membransız büyük tiplerinde 80 görülebilir. Kesitlerde boşluklar olarak görülürler. mikron kadar büyük boşluklar olarak olabilir. görülür. Özel boyalar ile boyandığında kolayca görülebilir. Nişasta Bitki  Tanecikleri hücrelerinde Bitki hücrelerinde renksiz farklı küresel veya oval yapılar çaplarda olarak çeşitli büyüklüklerde bulunabilir gözlenebilir. Lugol ile koyu boyanan yapılardır.  25 XI. Laboratuar: Hücre Bölünmesinin Analizi Bu uygulamada soğan kök ucu hücrelerinde mitoz bölünmenin farklı aşamaları incelenecektir. Laboratuarda kullanılacak kök uçları önceden hazırlanıp fikse edilmiştir. Uygulanacak yöntem kısaca aşağıda özetlenmiştir. Mitoz bölünmenin bitkilerde en iyi ve en kolay incelenebileceği doku taze kök uçlarıdır. Bunun için 3-4 günlük çimlenme aşamasındaki soğan kök ucu dokuları alınıp, 1-2 cm'lik uzunlukta kesilirler ve aseto-alkol karışımında yaklaşık 18 saat fikse edilirler. Fikse edilen kök uçlarından biri alınıp uç kısmı (bölünmenin çok yoğun olduğu ~0.2 cm'lik uç) 1 damla 1NHCl, 1 damla % 36'lık etil alkol konulur ve ~10 dakika beklenir. Bu karışım dokunun kısmen hidrolizini ve dolayısıyla daha kolay ezilmesini sağlar. Doku temiz bir lam üzerine alınır ve üzerine ikinci bir lam kapatılarak sıkıca bastırılıp dokunun iki lam arasında ezilmesi sağlanır. daha sonra lamlar birbirinden ayrılarak ezilmiş doku üzerine 1-2 damla aseto karmin damlatılır. Kromozomların boyanması için 10 dakika beklenir. Aseto-karminin fazlası emici kağıt ile alınır ve lamel kapatılır. Mitoz bölünme aşamaları 10x ve 40x objektifi ile incelenir. Her mitoz bölünmenin aşamaları olan Profaz, Metafaz, Anofaz ve Telofaz ile İnterfaz nükleusunu içeren hücreler ayrı ayrı incelenir ve bu bölünme aşamaları şekil olarak hazırlanır.  26 XII. Laboratuar: Hücre Kültürleri ve Hücre Döngüsünün Analizi. Çeşitli bitki ve hayvan dokularına ait hücreler in-vitro şartlarda da üretilebilirler. Bu şekilde bir dokuya ait hücrenin in-vitro olarak üretilmesine doku veya hücre kültürü denir. Hücre kültürlerini oluşturmak için önce doku homojenize edilip parçalanmamış hücreler izole edilir. Daha sonra besi yerlerinde üretimlerine başlanır. Gerekli besinler (Temel makromoleküller, mineral ve vitaminler) sağlandığında bitki veya hayvan hücrelerini kültürde çoğaltmak mümkündür. Doku kültürlerinin steril şartlarda yapılması ve mümkün olduğunca mikroorganizmalardan korunmaları sağlanmalıdır. Doku kültürlerinin bazı özellikleri belirlendiğinde bunlara " cell line veya hücre hattı " da denir. Doku kültürlerindeki hücrelerin bölünmeleri farklı aşamalardadır. Bu tür hücre kültürlerine asynchronous veya batch culture denir. Bu tür hücre kültürlerinde her hücre, hücre döngüsünün farklı aşamasındadır. Örneğin G1, S, G2 , vb. Bu tür hücre kültürlerinde hücre sayısı artışı belirli bir hızda ve lineer olarak devam eder. Ortamda besin maddeleri bittiğinde ise hücre üremesi durur. Bu tür kültürlere kesikli kültür de denir. Bazen de çeşitli amaçlar için hücre kültürlerindeki bütün hücrelerin aynı hücre döngüsü aşamasında olması istenir. Çeşitli işlemlerle hücre kültüründeki bütün hücrelerin aynı hücre döngüsü aşamasında olması sağlanır. bu tür hücre kültürlerine de senkronize (synchronous) hücre kültürleri denir. hücre kültürlerinin senkronizasyonu çeşitli şekillerde sağlanabilir. Bu yöntemleri kısaca şöyle özetleyebiliriz ; Isı şoku ile senkronizasyon: Özellikle protozoa grubu için kullanılan bir yöntemdir. Hücreler önce 8-9°C de bir süre bekletilir. Sonra da oda veya üreme sıcaklığına çıkarılır (22- 37°C) düşük sıcaklıkta çok fazla üreme olmaz ve hücreler genelde G1 aşamasında durur. Birkaç kez tekrardan sonra senkronize kültürler elde edilir. Işık ile Senkronizasyon: Fotosentetik hücrelerde ışık-karanlık uygulamasıyla senkronizasyon oluşur. Fotosentez yapamayan hücreler bölünmelerini tamamlayıp G1 de durur. Işık verildiğinde devam eder. Birkaç tekrardan sonra bütün hücreler aynı aşamaya girerler. Kimyasallar ile Senkronizasyon: Örneğin kolsişin vererek hücreler metafazda durdurulur. Daha sonra kolsisin yıkanarak ortamdan uzaklaştırıldığında hücreler metafazdan başlayarak döngüye devam ederler. Isıya Duyarlı Mutant Hücre Kullanılarak Senkronizasyon: Örneğin; Cyclin (Cln) veya DNA Polimeraz için ısıya duyarlı mutantlar kullanılarak senkronizasyon yapılabilir. Hücre döngüsünün belirli bir aşaması için gerekli olan bu proteinlerin bazı mutant ırkları normal ısıda çalışırken ısı artınca çalışamaz ve hücre döngüsü o proteinin gerektiği aşamada durur. Isı normale döndüğünde hücreler aynı noktadan başlayarak hücre döngüsüne devam eder.  27 Hücre kültürlerindeki senkronizasyon miktarı veya senkronize olup olmadıkları mitotik indeksleri ölçülerek belirlenebilir. Mitotik index bir hücre topluluğunda herhangi bir zaman biriminde mitoz aşamasındaki hücreler sayısının toplam hücre sayısına oranıdır. Im = [ Nm / N] x 100 Bu formülde; Im : mitotik index Nm : mitoz geçiren hücrelerin sayısı N : incelenen toplam hücre sayısı Asenkronize hücre kültürlerinin logaritmik üreme aşamasında Im yaklaşık olarak bir sabit sayı olup genelde düşüktür (% 10-20). Senkronize kültürlerde ise Im log aşamada 0-1 arasında (% 0- % 100) değişir. İdeal olarak her hücre döngüsünün mitoz aşamasında kısa bir süre için Nm % 100 olur. Son yıllarda senkronizasyonda kullanılan bir diğer yöntem de yavru hücrelerin filtrasyon ile ayrılmasıdır. Bazı canlı türlerinde mitoz bölünme sonucu oluşan yavru hücreler genelde ana hücreden daha küçük olduklarından belirli aralıktaki gözeneklerden geçerek bölünmeden hemen sonra yani G1'de ana hücrelerden ayrılabilirler. Özellikle S. cerevisiae deneylerinde senkronize hücre elde etmek için kullanılan bu yönteme de Cell Elutration denir. Hücre döngüsü G1, S, G2 ve M aşamalarından oluşur. Hücre döngüsünün süresi çevresel şartlara, hücre, organizma türüne göre çok faklılıklar gösterir. Hücre döngüsü Cyclin (Cln), Cyclin dependent protein kinase (Cdk), Cyclin dependent kinase inhibitors (CKI) ve Cyclin dependent kinase activators (CAK) proteinleri gibi düzenleyici faktörlerin kontrolü altındadır. Hücre döngüsünün kontrol edilmesi ile ilgili bilgiler Sitoloji dersinde ayrıntılı olarak verilmiştir. Hücre döngüsünün aşamaları S. cerevisiae hücrelerinde izlenecektir. Yüksek canlılara ait bazı hücrelerde hücre döngüsünün tamamlanması 10 saat ile 25 saat kadar sürebilmektedir. Fakat, tek hücreli bir eukaryotik organizma olan S. cerevisiae hücrelerinde normal ortam şartlarında hücre döngüsü 90 dakikada tamamlanmaktadır. Bu nedenle laboratuarınızda hücre döngüsünün analizinde model sistem olarak S. cerevisiae’nin hücre döngüsü aşamaları analiz edilecektir. Mikroskopta 10x10 ve 10x40 büyütmelerde verilen ve asenkronize olarak üretilen S. cerevisiae kültüründen hücre döngüsünün farklı aşamalarındaki hücreler tanınarak çizimleri yapılır.  28 XIII. Laboratuar: İmmunositokimyasal Yöntemler Bu yöntem işaretli antikorlar kullanılarak hücrenin belirli bir yapısını göstermek için kullanılan yöntemdir. Bilindiği gibi antikorlar organizmaya giren yabancı maddelere karşı vücut içinde spesifik hücreler tarafından oluşturulan protein molekülleridir. Antikorların tanıdığı bağlandığı moleküllere antijen denir. Antikorlar belirli bir antijen molekülüne karşı çok özeldirler. Hangi antijene karşı oluşurlar ise sadece o antijeni tanırlar. Antikorlara Ig immünglobin de denir. Belirli bir kısmı kanda ve vücut sıvılarında bulunabilir. Antikorlar genellikle istenilen moleküle karşı deney hayvanlarında da üretilir ve kan plazmasından saflaştırılırlar. Örneğin insana ait bir proteine karşı antikor geliştirlmesi istendiğinde önce insan hücrelerinden ilgili protein saf olarak elde edilir. Daha sonra saflaştırılan bu protein tavşan veya koyun, keçi, fare gibi insana filogenetik olarak uzak bir canlıya enjekte edilip, bu proteine karşı deney hayvanlarının (antijene karşı) antikor IgG geliştirmesi beklenir. Hayvandan kan serumu alınıp anti-protein X IgG'ler saflaştırılır. Antikorların izole edilmesinden sonra genellikle iki farklı yöntem izlenir. Bunlar direkt ve indirekt yöntemlerdir. Genellikle saflaştırılmış antikorun bağlandığı protein ile oluşturduğu kompleks normal olarak ışık mikroskobunda görülmez. Bunun için UV veya floresans mikroskobunda antikoru ve dolayısıyla antijen-antikor kompleksini görünür hale getirecek bir floresans madde ile antikor işaretlenir. Floresans boya antikora kovalent olarak bağlanır. Bu şekilde işaretli antikor ve onun tanıdığı antijenin oluşturduğu kompleks UV mikroskobunda incelenebilir. Bu yönteme direkt boyama, işaretleme yöntemi de denilir. Bazen de spesifik antijene karşı geliştirilen antikoru işaretlemek yerine işaretli anti-IgG antikorları kullanılır. Bu yönteme indirekt boyama, işaretleme yöntemi de denir. İmmünositokimyasal olarak incelenecek yapılar genellikle ince kesitler olarak hazırlanır ve kesitlerin bulunduğu yapı ile antikor karışımı bir süre bekletilir. Sonra analiz edilir. Kullanılacak antikorlar monoklonal veya poliklonal olabilir. Monoklonal antikorlar bir molekül üzerinde sadece bir yapıyı (epitopu) tanıyan antikorlardır. Örneğin, mikrotübül üzerinde sadece belirli bir yerdeki amino asit dizisini tanırlar. Poliklonal antikorlar ise bir yapı üzerinde birden çok, farklı bölgeleri tanırlar. Antikorları işaretlemede kullanılan floresans maddeler de çok farklı olabilirler. Bunlara genel ad olarak fluorochrome da denir. Bazı örnekleri aşağıda verilmiştir. Fluorescein isothiocyanate (FITC): çok yaygın olarak kullanılan bir fluorochrome’dur. Dalga boyu 450-490 aralığında kullanılır. Mavi ışıkta uyarılıp, parlak yeşil floresans yayar.  29 Tetrametil rhodamine isothiocyanate (TRITC): Bu fluorochrome da yaygın olarak kullanılır. Dalga boyu 510-560 aralığında olan ışıkta çalışır yeşil ışık ile uyarılıp, kırmızı floresans yaymaktadır. Bazen antikorlara enzim de bağlanabilir. Örneğin ; I. veya II. IgG ye Alkaline Fosfotoz veya Horse radish Peroxidase (HRPO) enzimleri bağlanabilir. Bu durumda ortama o enzimin substratı konulur. Substratın enzim tarafından parçalanması sonucu renkli bir madde oluşur. Bu da bize IgG-Ag kompleksinin olduğu yeri gösterebilir. Bazen aynı slayt/kesit üzerinde birden çok yapıyı aynı anda incelemek için çok sayıda işaretli antikor kullanılmaktadır. İmmünositokimyasal yöntemler ile hazırlanmış bazı slaylar örnek olarak gösterilecektir. Floresans ile Aktive Edilmiş Hücre Ayrıştırma Yöntemi (Cell Sorting) (FACS) Bazı floresans maddeler hücre yüzeyinde yani hücre zarında bulunan belirli moleküllere bağlanabilir. Dolayısıyla farklı tip hücrelerde bulunan yüzey özellikleri farklı olacağından bağlanan floresans maddenin çeşidi ve bağlandığı miktar da farklı olacaktır. Hücrelerin bu özelliğinden faydalanarak son yıllarda geliştirilmiş bir teknikte hücre ayrıştırma tekniğidir. Bu yöntemde bir karışım halindeki hücreleri farklı türlere ayırmak mümkündür. Örneğin; eritrositi leukositten veya fibroblasttan ayırt etmek mümkün olmaktadır. Bunun için önce belirli tipteki hücrenin bir özelliğini tanıyıp bağlanan floresans bir boya veya floresans özellik kazandırılmış IgG hücreye tutturulur. Sonra hücreler bir elektrolit çözeltisinde çözülür ve elektrikle yükleme yapılır. FACS cihazı hücreleri elektrik yüklerine göre (-)'den (+)'ya doğru hareket etmelerini sağlayarak cihaz içinde farklı hücrelerin ayrışmasını sağlar. SİTOLOJİ LABORATUARI DENEY KLAVUZUNUN HAZIRLANMASINDA KULLANILAN KAYNAKLAR: 1- Mikropreparasyon Yöntemleri. 3. Baskı. Prof. Dr. Neriman Özban, Doç. Dr. Özden Özmutlu İ. Ü. Fen Fakültesi Basımevi (1994). 3- Hücre Biyolojisi laboratuarı. Prof. Dr. Meral Ünal, Ar.Gör. Filiz Vardar, Ar. Gör. Işıl İsmailoğlu. Nobel Yayın Dağıtım. (2008). 2- Cell Biology, Organelle Structure and Function. David E. Sadava. Jones and Bartlett Publ. (1993). 4- Cell Biology: Structure, Biochemistry and Function. Phillip Sheeler, Donald E. Bianchi John Wiley & Sons. (1980).