Bacteriële groei, Hoofdstuk 4 PDF

Welkom in de online les Microbiologie We starten om 16u… 19/01/2025 Microbiologie: Hoofdstuk 4 Bacteriële groei Inhoud 4. Bacteriële groei 4.1 Groeivoorwaarden 4.2 Voedingsbodems 4.3 Groei van een bacteriecultuur 4.1 Groeivoorwaarden Fysische groeivoorwaarden 1) Fysisc...

Welkom in de online les Microbiologie We starten om 16u… 19/01/2025 Microbiologie: Hoofdstuk 4 Bacteriële groei Inhoud 4. Bacteriële groei 4.1 Groeivoorwaarden 4.2 Voedingsbodems 4.3 Groei van een bacteriecultuur 4.1 Groeivoorwaarden Fysische groeivoorwaarden 1) Fysische groeivoorwaarden 1) Temperatuur Minimumtemperatuur Optimumtemperatuur Maximumtemperatuur Naar gevoeligheid voor temperatuur: vier groepen bacteriën 2) Zuurtegraad Op basis van hun optimum pH kunnen de bacteriën ingedeeld worden in drie klassen: neutrofielen: neutrale pH (6,5 – 7,5), de meeste bacteriën acidofielen: zuurtolerant (vb lactobacillen)  zuurafhankelijk (vb Thiobacillus: pH 1 – 4,5) alkalofielen: alkalisch milieu (pH 9 – 11) 3) Osmotische druk  Bacteriën  Voldoende stevige celwand Bacteriën die een hoge osmotische druk nodig hebben: In super zoute  Halofielen Hoge zeeën zout  Hoge Saccharofielen suiker Wateractiviteit aw 19/01/2025 In de praktijk moeilijk om osmotische waarden te bepalen wateractiviteit aw aw = maat voor de beschikbaarheid van water in een oplossing. aw van water = 1,0 Technieke n om  zout of suiker   aw  veel bacteriën geremd in groei voedsel te  19/01/2025 Wateractiviteit (aw ) materiaal Voorbeeld organisme 1,000 zuiver water Spirillum 0,995 menselijk bloed Streptococcus, Escherichia 0,980 zeewater Pseudomonas, Vibrio 0,950 brood meeste G(+) staafjes 0,900 ham G(+) kokken 0,850 salami Saccharomyces rouxii (gist) 0,750 gezouten vis Halobacterium, Halococcus 2) Chemische factoren Bacteriën groeien op voedingsbodems of “medium”:  Water + nutriënten (in opgeloste vorm)  80% bacteriële celmassa = water  Grote verschillen:  Spirocheten en Gramnegatieve cellen: snellere uitdroging  Grampositieve: behouden langst intracellulair water  Sporen: resistent aan uitdroging Nutriënten:  opbouw van de cel  energievoorziening  groeifactoren Welke atomen nodig?  C: ?  autotroof  heterotroof Autotroof: halen Co2 uit de lucht. De meeste bacterien zijn  N: ? hetrotroof.  12-15% drooggewicht  Bron: organisch of anorganisch: NH 4+,NO2-, NO3-  P: ?  kaliumfosfaten K2HPO4 en KH2PO4  Sporen-elementen: Na, K, Mg, Ca,…. essentieel voor activiteit van enzymen Hele kelien hoeveelheden  Groeifactoren: Vb: aminozuren, purines, pyrimidines, vitaminen,… Prototroof: bacterie kan alles zélf aanmaken  kan groeien op minimaal medium Auxotroof: verstoring in synthese van één of meerdere groeifactoren. 4.2 Voedingsbodems Waarom voedingsbodems? 19/01/2025 Vermenigvuldiging bacterie  zichtbare kolonies  Aantonen aanwezigheid  Beter bestuderen! Soorten voedingsbodems 1) (Synthetische voedingsbodem) natuurlijke voedingsbodem 2) Vloeibare voedingsbodem vaste voedingsbodem 3) Andere voedingsbodems: selectieve en differentiële voedingsbodem 1) (Synthetische voedingsbodem) = medium met exact gekende chemische samenstelling 2) Natuurlijke voedingsbodem = rijk medium 4.2.3. Bereiden van voedingsbodems (labo)  Recept  Poedervorm  Koken tot helder medium  Schottflessen, schuine agar of proefbuisjes STERILISER EN Autoclaaf: 121°C gedurende 15 minuten Bereiden van voedingsbodems  Autoclaveren: 121°C gedurende 15 min.  Warmwaterbad afkoelen tot 55°C  Warmtegevoelige stoffen aseptisch toevoegen na sterilistatie en afkoeling (±55°C)  na afkoelen tot 55°C: schottflessen aseptisch uitgieten in petriplaten proefbuisjes schuin stolen: schuine agar Soorten voedingsbodems 1) (Synthetische voedingsbodem) natuurlijke voedingsbodem 2) Vloeibare voedingsbodem vaste voedingsbodem 3) Andere voedingsbodems: selectieve en differentiële voedingsbodem Vloeibare voedingsbodem  Vloeibare voedingsbodem = bouillon  extract van vlees in een zoutoplossing + andere voedingsmiddelen en groeifactoren  In proefbuizen  Groei = troebeling  Nadeel: geen morfologische en macroscopische groeikenmerken  Voordeel: snel aankweken van grote aantallen bacteriën Vaste voedingsbodem Agar = polysacharide uit zeewier = verdikkingsmiddel = vast medium  extract van vlees in een zoutoplossing aangevuld met andere voedingsmiddelen en groeifactoren + agar (1,5%)  agar is geen voedingstof, niet toxisch, kwaliteit blijft behouden Voordelen vaste bodem: 19/01/2025 Beoordelen macroscopische kenmerken! Cultuurtechnieken Enten  Entoog (= öse) of entnaald: chroomnikkel, enten van een vaste voedingsbodem  Drigalskispatel: glas of metaal: gelijkmatig uitspreiden  Steriele pasteurpipet: enten van vloeibaar materiaal Entoog of öse Drigalski-spatel Pasteurpipet Homogeen enten Enten in vijfhoek  veel entstof (inoculum):  weinig inoculum: aparte kolonies confluente groei  Pleomorf = morfologische verschillen Incubatie in de broedstoof gedurende 18u – 24u  Aanleggen van een reincultuur Mengcultuur Reincultuur   Minstens 2 soorten bacteriën 1 bacteriesoort per agar   Geen identificatie wel identificatie Bewaren van bacteriën Reincultuur schuine agar Belangrijk: Geen suikers Metabolisme beperken koelkast (4°C)  Sommige bacteriën: week, weken tot maanden  Na interval overenten op verse voedingsbodem Langere bewaring  Invriezen (-80°C)  Lyofiliseren (vriesdrogen) Kweken van anaëroben Anaërobe bacteriën: zuurstofarme omgeving Voedingsbodem: reductoren redoxpotentiaal verlaagd Redoxindicator als controle vb: methyleenblauw Incubatie: anaerobe container (Jar pot) met gaspak of anaërobe kast (glove box) Soorten voedingsbodems 1) (Synthetische voedingsbodem) natuurlijke voedingsbodem 2) Vloeibare voedingsbodem vaste voedingsbodem 3) Andere voedingsbodems: selectieve en differentiële voedingsbodem Selectieve en differentiele voedingsbodems: Selectief medium = selectie van bacteriegroep Differentieel medium = onderscheid tussen  soorten bacteriën Voorbeelden: MSA = Mannitol Salt Agar Mac Conkey Agar  Mannitol Salt Agar = MSA Selectief:  hoge zoutconcentratie  enkel groei van stafylokokken, remt de groei van andere bacteriën Differentieel:  Mannitol  vergisting?  pH?  pH-indicator fenolrood (rood geel)  identificatie van Staphylococcus aureus  MacConkey agar Selectief:  galzouten en kristalviolet  groei van Gramnegatieve bacteriën, remt de groei van Grampositieve bacteriën Differentieel:  lactose  pH-indicator neutraalrood (kleurloos roos)  onderscheid tussen Lactose + Lactose - 4.3 Groei van een bacteriecultuur (Tellen van het aantal kiemen) Telkamer:  Tellen van het aantal levende bacteriën 1) Spreidplaatmethode 2) Gietplaatmethode! 3) Filtratiemethode Tellen van het aantal levende kiemen 1) Spreidplaatmethode 2) Gietplaatmethode Belangrijk:  Aantal kolonies per plaat niet te hoog geen kolonievorming maar een overgroeid geheel  Aantal kolonies per plaat niet te laag geen nauwkeurig resultaat 30 – 300 kolonies = statistisch beste resultaat  Verdunningsreeks maken  Verdunningsreeks  Verdunningsreeks GIETPLATEN MAKEN VAN ELKE VERDUNNING EN INCUBEREN  Verdunningsreeks KVE = aantal kolonies op de plaat vermenigvuldigd met de verdunningsfactor 19/01/2025 3) Filtratiemethode:  membraanfilter met zeer kleine poriën (0,45 µm)  bacteriën worden tegengehouden  filter voedingsbodem incuberen KVE tellen Toepassing: microbiologisch onderzoek van water 19/01/2025 Turbidimetrie met spectrofotometer Lichtbundel bacteriesuspensie foto-elektrische cel bacterie  transmissie licht  optische densiteit (OD)  Groeicurve Deling van bacteriën: Binaire deling met 4 stadia:  Kernmateriaal splitsen  Vorming van een dwarswand  Splitsen in 2 gescheiden dochtercellen  Uitgroeien van 2 dochtercellen De tijd nodig voor dit delingsproces waarbij uit één cel twee cellen worden gevormd = generatietijd Exponentiële groei Groei van een populatie toename van het aantal cellen Groeisnelheid (“generatietijd”) = tijd nodig voor de verdubbeling van het aantal cellen Op basis van deze celdeling = toename van het aantal cellen exponentieel Grafiek: Generatietijd = tg = tijd nodig om het aantal cellen te verdubbelen N = aantal micro-organismen op een bepaald tijdstip groeisnelheid voldoet aan: N = N0. ek.t Bv. tg = 20 min Bacteriële groeicurve: 4 fasen:  Lag fase  Log fase  stationaire fase  afstervingsfase Lag fase Delingssnelheid = 0, aantal cellen = cte Aanpassingsfase Cellen bereiden reproductie voor: synthese van nieuw DNA/vorming van specifieke enzymen Na lag-fase neemt delingssnelheid langzaam toe bacteriën in versnellingsfase Log fase Exponentiële fase Maximale reproductiesnelheid Bereikte delingssnelheid specifiek voor elke bacterie milieu-omstandigheden Stationaire fase Maximum populatie Uitputting van de voedingsstoffen, opstapeling van toxische afvalstoffen, minder uitwisseling van gassen, overmaat aan cellen Aantal cellen blijft constant Afstervingsfase-fase celdood > aanmaak van nieuwe cellen Continue cultuur 19/01/2025 In de natuur:  Constante toevoer van nieuwe nutriënten + afvoer afvalproducten  Bacteriën voortdurend op het einde van de logfase  Aantallen blijven constant = stabiele situatie In het labo:  Enten steriel medium  lagfase  logfase  stationaire fase  afstervingsfase  overenten in vers medium! = discontinue cultuur Einde