Genetika - Textbook PDF

Genetika Soubor kapitol ze stránek http://www.genetika-biologie.cz/ Verze 1.0 (11.9.2011) MUDr. Antonín Šípek jr. (Azrael) Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-Nevyužívejte dílo komerčně-Zac...

Genetika Soubor kapitol ze stránek http://www.genetika-biologie.cz/ Verze 1.0 (11.9.2011) MUDr. Antonín Šípek jr. (Azrael) Uvedená práce (dílo) podléhá licenci Creative Commons Uveďte autora-Nevyužívejte dílo komerčně-Zachovejte licenci 3.0 Česko 1. Základy genetiky 1) Genetika obecně Genetika je věda zabývající se dědičností a proměnlivostí ţivých soustav. Patří mezi biologické vědy a vyděluje se podle hlediska studia organismů (podobně jako anatomie - která se zabývá tělesnou stavbou nebo fyziologie - která se zabývá jednotlivými pochody a procesy v organizmu). Genetika sleduje variabilitu, rozdílnost a přenos druhových a dědičných znaků mezi rodiči a potomky i mezi potomky navzájem. S genetikou a jejími principy se člověk setkával jiţ od pradávna. Umění dávných šlechtitelů bylo s principy genetiky neomylně provázáno. Genetika - jako samostatná vědní disciplína - ovšem vzniká aţ relativně pozdě. Její historie se začala psát aţ v 19. století. K velkému rozvoji došlo ve druhé polovině 20. století a dá se očekávat, ţe rychlý rozvoj bude pokračovat i ve století 21. (a zatím tomu skutečně tak je...). Genetika je jednou z nejdůleţitějších (ne-li přímo nejdůleţitější) teoretických věd z hlediska popisu jakékoli ţivé soustavy. U genetické informace je počátek kaţdého současného ţivého organismu. Genetická informace určuje budoucí anatomickou stavbu organismu, určuje jaké látky budou účastníky biochemických a fyziologických procesů v organismu a v neposlední řadě je nepostradatelnou součástí pohlavního i nepohlavního rozmnoţování. Poznatky genetiky jsou velmi důleţité pro celou řadu přírodovědných oborů, například evoluční biologii, antropologii, mikrobiologii a mnoho dalších. V oboru molekulární biologie se kombinují poznatky genetiky, biochemie a buněčné biologie. Genetika je sice původem teoretickou vědou, ale jiţ dnes má velmi mnoho moţností praktického uplatnění. Mimo lékařství nachází genetika vyuţití v zemědělství při šlechtění nových odrůd rostlin stejně jako při chovu (nejen) hospodářských zvířat. S rozvojem biotechnologií a genetického inţenýrství se objevují i geneticky upravené hospodářské organizmy, které se stávají přínosem, ale i ekologickou a etickou otázkou. Díky genetickému inţenýrství, je dnes moţné vyrábět řadu tzv. rekombinantních látek (a mnoho takových látek nachází uplatnění v terapii různých chorob). Vyuţití genetiky pro různé biotechnologické metody a postupy je jiţ dnes na denním pořádku a do budoucna se i toto uplatnění jistě dále rozšíří. Velký význam pro člověka má lékařská neboli klinická genetika. Zkoumá člověka, různé genetické choroby a vady, jejich četnost a genetickou determinaci různých lidských znaků. Klinická genetika je dnes samostatným lékařským oborem, oddělení lékařské genetiky najdete dnes ve většině fakultních a krajských nemocnic; existuje také řada soukromých pracovišť. Genetika se uplatňuje při výzkumu rakovinného bujení, imunitního systému a imunitních reakcí a v mikrobiologickém výzkumu. Samostatnou kapitolou se pak stává klonování, kde vyvstávají ekologické a etické otázky jiţ při klonování zvířat, natoţ při klonování člověka. Úplnou revoluci v medicíně pak můţe přinést ovládnutí genové terapie. Dnes jiţ nelze ani opomenout význam genetiky ve forenzních metodách. Genetické testy pomáhají při usvědčování zločinců, při identifikaci tělesných ostatků nebo ztracených osob. V současné době také přichází do módy genetické testy otcovství. Mezi podobory genetiky patří například: molekulární genetika, cytogenetika, imunogenetika, onkogenetika, populační genetika, klasická (Mendelovská) genetika, genetika rostlin (bakterií, virů...), evoluční genetika, a lékařská (klinická) genetika. V genetickém výzkumu se pouţívá mnoho rozličných metod. Jde zejména o metody biochemické, fyzikální, mikroskopické, metody analytické chemie a bioinformatiky. Mnoho specifických metod bylo objeveno výhradně pro genetický výzkum - zejména různé sekvenovací a značkovací metody. 2) Historie genetiky Genetika je vědou poměrně mladou. Za zakladatele genetiky je povaţován Johann Gregor Mendel (1822 - 1884). Tento augustiniánský mnich z brněnského kláštera se v 2. polovině 19. století zabýval hybridizačními pokusy u rostlin. Za své působiště si zvolil zahrádku kláštera a za objekt svého zájmu hrách. Při následném kříţení sledoval 7 dědičných znaků (tvar semen a lusků, zbarvení děloh, květů a nezralých lusků, délku stonku a postavení květů). Po matematickém zhodnocení výsledků zjistil, ţe se nedědí přímo znaky, ale "vlohy" pro ně. Mendel tak dal za vznik klasické genetice. Mendelovy zákony a mezialelární vztahy patří k základům a dodnes mají své vyuţití třeba i v medicíně u sledování monogenně dědičných onemocnění. Mendel vydal roku 1866 o svých pozorováních práci nazvanou Versuche über Pflanzenhybriden(Pokusy s rostlinnými kříţenci). Ve své době však neměla jeho práce vůbec ţádný ohlas a byla dokonce zapomenuta. Ke znovuobjevení Mendelovy práce a ke vzniku genetiky jako plnohodnotného vědního oboru tak dochází aţ na počátku 20. století. Dochází zde k potvrzení pravdivosti Mendelových zjištění. To je spojeno se jmény holandského profesora Huga de Vriese (1848 - 1935), rakouského profesora Ericha Tschermaka von Seysenegg (1871 - 1962) a profesora Carla Corrense (1863 - 1933). Mezi další významné vědce patří anglický profesor William Bateson (1861 - 1926), který jako první pouţil termín genetika (1906), heterozygot a homozygot. Dán Wilhelm Johannsen (1857 - 1927) zase jako první zavádí pojmy gen, genotyp a fenotyp. Větší pozornost si zaslouţí Američan Thomas Hunt Morgan (1866 - 1945) a jeho práce o chromozomech (Chromosomes and heredity). Jako modelový organismus pouţíval octomilku (Drosophila melanogaster). Přinesl spoustu nových poznatků o genech a genové vazbě. Roku 1933 se stal prvním genetikem, který získal Nobelovu cenu. Klíčovým okamţikem byl samozřejmě objev DNA. Jako nositelka genetické informace byla prokázána jiţ v roce 1944 týmem Američana Oswalda T. Aweryho. Další poznatky ohledně komplementarity bází přinesl Erwin Chargaff. Na jejich práci navazují James D. Watson aFrancis H. Crick, kteří onoho památného roku 1953 předloţili strukturní model dvoušroubovice DNA. Významným dílem k tomuto objevu přispěly i RTG studie DNA Maurice H. F. Wilkinse a Rosalindy Franklinové. Roku 1962 se Watson, Crick a Wilkins dočkali Nobelovy ceny. Crick se dále věnoval proteosyntéze a genetickému kódu. Zanedlouho je potvrzen tripletový genetický kód. Japonec Reiji Okazaki (1930 - 1974) osvětluje diskontinuální syntézu opoţděného řetězce při replikaci DNA. Roku 1966 jsou k jednotlivým tripletům přiřazeny aminokyseliny, které kódují. V roce 1956 je stanoven počet chromosomů v lidské buňce a roku 1959 Francouz Jerome Lejeune (1926 - 1994) odhaluje chromosomální podstatu Downova syndromu. Nastává rozvoj i na cytogenetické úrovni. Objev moderních sekvenovacích principů umoţnil sekvenování genomů jednoduchých organismů (1965 - genom kvasinky), s rozvíjejícím se technickým pokrokem bylo moţné sekvenovat stále větší genomy, coţ vyvrcholilo sekvenováním lidského genomu (draft roku 2001, kompletní sekvence roku 2003). I v současné době probíhá výzkum, zaměřený zejména na vyuţití znalostí lidského genomu např. v oblasti farmakogenomiky nebo genové terapie. Vyuţívá se stále dokonalejších bioinformatických technologií. Intenzivní výzkum probíhá v oblasti genetiky nádorového bujení. Nových objevů se v oblasti genetiky budeme dočkávat kaţdým dnem… 2. Cytogenetika 1) Eukaryotní buňka Většinu dnešních organismů (kromě bakterií, archebakterií a sinic) řadíme do podříše Eucaryota. Eukaryotní organismy jsou tvořeny buňkami (nebo buňkou) eukaryotního typu. Ty jsou značně sloţitější neţ prokaryotní buňky. Obsahují i membránové organely jako mitochondrie, Golgiho aparát, endoplazmatické retikulum, vakuoly / lyzosomy či plastidy, které u prokaryot nenajdeme. Značně se také liší samotné jádro, jak je popsáno níţe. Jádro Jádro je většinou největší organelou buňky a je odděleno membránou - karyoplastem (ve skutečnosti je membrána dvojitá a mezi jednotlivými membránami je tzv. perinukleární prostor). Velkou část jeho hmoty tvoří chromatin - hmota sloţená z nukleozómů, které nejsou nic jiného neţ DNA a histony (bílkoviny - rozeznáváme 5 typů: H1, H2A, H2B, H3, H4). Rozlišujeme světlý chromatin - euchromatin - dekondenzovaný, je místem aktivní transkripce, a tmavý, kondenzovaný chromatin - heterochromatin. Dále jádro obsahuje jadérko (nucleolus), které můţe být zastoupeno i ve více exemplářích. Je tvořeno především RNA a proteiny. Jeho součástí jsou také části DNA z chromosomů tzv. organizátory nukleolu, coţ jsou sekvence bází, které kódují ribozomální RNA. Dozrávající ribozomy v jadérku tvoří malá granula, která označujeme jako pars granulosa - granulózní část. Další buněčné organely Mitochondrie Mitochondrie jsou kulovité aţ podlouhlé organely slouţící jako energetické centrum buňky. Probíhají zde významné metabolické pochody jako citrátový cyklus a β-oxidace mastných kyselin. Mitochondrie jsou ohraničeny dvojitou membránou; vnitřní membrána vybíhá v hojné výběţky - kristy. Vnitřní hmotu mitochondrie označujeme jako mitochondriální matrix. Mitochondrie patří mezi tzv. semiautonomní organely - část svých proteinů si díky své kruhové molekule DNA a vlastnímu proteosyntetickému aparátu mohou nasyntetizovat samy. Nejen pro podobnost této kruhové molekuly s genetickou informací bakterií se uvaţuje, ţe mitochondrie jsou z hlediska evoluce heterotrofní bakterie, které nejen přeţily uprostřed cytoplasmy jiné buňky, ale dokázaly s ní navázat trvalé souţití (tzv. endosymbióza). Plastidy Plastidy jsou organely rostlinných buněk. Taktéţ o plastidech se uvaţuje, ţe vznikly procesem endosymbiózy a obsahují vlastní genetickou informaci. Leukoplasty - neobsahují barviva; zato se v nich ukládají různé zásobní látky. Chromoplasty - obsahují různé, především ţluté, oranţové nebo červené pigmenty - karoteny a xantofyly. Chloroplasty - mají zelené zbarvení díky pigmentu chlorofylu. Jsou ohraničeny dvojitou membránou; vnitřní membrána vybíhá v ploché váčky - tylakoidy, které jsou uspořádány ve sloupečcích (grana). Hlavní úlohou chloroplastů je samozřejmě fotosyntéza. Endoplazmatické retikulum Jde o organelu membránovou, sestávající se ze systému plochých váčků. Rozlišujeme endoplasmatické retikulum drsné (granulární), nazvané podle přítomnosti ribozomů na jeho  povrchu, ve kterém dochází především k posttranslační úpravě proteinů, a endoplazmatické retikulum hladké (agranulární), které na povrchu ribozomy nemá, a které se např. hojně zapojuje v metabolických procesech. Přesná funkce endoplazmatického retikula je často typická pro konkrétní buňky (např. v určitém orgánu atd.). Golgiho aparát Jde o membránovou organelu, sloţenou z plochých cisteren a různých váčků. V Golgiho aparátu se dokončuje modifikace produktů syntetizovaných buňkou (přicházejících např. z endoplazmatického retikula), které se potom pomocí transportních váčků dostávají na místo určení (často jde o produkty určené na export z buňky). Organela je strukturně i funkčně polarizována - na jednom pólu vstupují "suroviny" dovnitř, z opačného pólu pak vychází jiţ hotové produkty. Váčkovité útvary V eukaryotních buňkách se vyskytuje velké mnoţství stavebně i funkčně různých váčkovitých útvarů. Jde o různě veliké, membránou ohraničené organely, slouţící k transportu nebo uchovávání různých látek, tvořících jejich obsah. Vakuoly - organely typické zejména pro rostliny, v jejichţ buňkách se často vyskytují velké vakuoly se zásobní funkcí. Drobné vakuoly se ovšem vyskytují i u ţivočichů, např. v tukových tkáních obsahují lipidy. Lyzosomy - obsahují celou škálu různých hydrolytických enzymů a účastní se tak zejména nitrobuněčného trávení. "Nové" lyzosomy, vznikají odškrcením od Golgiho aparátu a dokud nevstoupí do trávicího procesu, je označujeme jako primární; tudíţ lyzosomy, ve kterých jiţ trávicí proces probíhá, označujeme jako sekundární. Fagozomy - jsou membránovité útvary, které vznikly endocytózou (tedy fagocytózou, ale třeba i pinocytózou) různého materiálu z vnějšího prostředí buňky. Většinou dochází k jejich splynutí s lyzosomy, které přináší potřebné trávicí enzymy, případě látky pro sníţení Ph, aby byla aktivita těchto enzymů nejvyšší. Peroxizomy - slouţí k ochraně buňky před škodlivým vlivem peroxidu vodíku pomocí specifických enzymů. Ribozomy Ribozomy jsou malé zrnkovité útvary skládající se z proteinů a rRNA. Vyskytují se volně v cytoplazmě, a to osamoceně nebo v nakupeninách (nazývaných polyribozomy) nebo přidruţeny ke granulárnímu endoplazmatickému retikulu. Ribozomy eukaryot se skládají ze dvou podjednotek - větší a menší. Menší podjednotka je tvořena asi 33 proteiny a 1 molekulou rRNa (18S rRNA), zatímco větší podjednotka je tvořena asi 49 proteiny a 3 molekulami rRNA (5S rRNA, 5.8S rRNA a 28S rRNA). Ribozomy jsou místem translace, přičemţ malá podjednotka se podílí na navázání mRNA a velká podjednotka na vzniku peptidové vazby mezi jednotlivými aminokyselinami. Cytoskelet Cytoskelet tvoří jakousi opěrnou a pohybovou soustavu buňky - pomáhá udrţovat tvar buňky a podílí se na pohybech organel i celé buňky. Jako sloţky cytoskeletu označujeme mikrotubuly (trubicovité útvary) a mikrofilamenta (jemné, vláknité útvary). Řasinky a bičíky - jsou pohyblivé útvary na povrchu buňky, které mohou slouţit k jejímu pohybu nebo k rozkmitání okolního prostředí buňky. Mají stejnou strukturu, kterou je 9 párů mikrotubulů (jsou tak těsně u sebe, ţe mají společnou část stěny), tvořících kruh okolo centrální dvojice mikrotubulů, která je umístěna ve středu útvaru. Centrioly - jsou válcovité útvary, vyskytující se v jednom či ve dvou (v dělící se buňce) exemplářích v buňce. Skládají se z 9 trojic mikrotubulů, které jsou uspořádány do tvaru ozubeného kolečka. Před dělením buňky se centriol zdvojí a oba pak putují k opačným pólům buňky, kde se podílejí na vzniku dělícího vřeténka. Buněčné inkluze  Jde o různé látky, které se nachází rozptýleny volně v cytoplazmě, bez membránového ohraničení. Mohou to být kapénky lipidů, shluky sacharidů nebo třeba různé pigmenty. 2) Chromozomy Genetická informace v buňkách eukaryotních organizmů není uloţena v jediné molekule DNA. Namísto toho je rozdělena do několika úseků. Tyto úseky DNA tvoří komplex s různými proteiny a existují v jádře jako určité funkční jednotky. Je to podobné, jako kdyţ máme v počítači data uloţená na několika pevných discích a ne pouze na jednom. Tyto jednotky obecně nazýváme chromozomy. Název pochází z řečtiny a je sloţeninou výrazů chroma a soma a doslova znamená barevné tělísko. Chromozomy jsou nejlépe pozorovatelné aţ v průběhu buněčného dělení, během kterého se spiralizují a získávají svůj známý tvar. Jako první uceleně popsal chromozomy a jejich chování v průběhu mitózy německý vědec Walther Flemming. Makrostavba chromozomů V průběhu interfáze se jednotlivé chromozomy nachází v buněčném jádře v rozvolněném - despiralizovaném stavu a nemůţeme je mikroskopem pozorovat. To se mění v průběhu buněčného dělení (typicky v mitóze), kdy se chromozomy spiralizují a získají svůj typický tvar, který jiţ v mikroskopu pozorovat můţeme (pozorování metafázických chromozomů je jednou z klasických vyšetřovacích metod klinické genetiky). V průběhu metafáze vypadá chromozom jako podlouhlý objekt se dvěma rameny (či chcete-li raménky), mezi nimiţ je ztenčená oblast (primární konstrikce - centromera. Koncová část ramen se potom označuje jako telomera. Ramena často nebývají stejně dlouhá - proto na chromozomu (podle polohy centromery) rozlišujeme krátké rameno (p rameno) a dlouhé rameno (q rameno). Při pozorování chromozomu v metafázi si rovněţ všimněte, ţe je tvořen dvěma chromatidami, spojenými v oblasti centromery, neboť jde o fázi buněčného dělení kdy jiţ došlo k replikaci DNA. Obecně pak chromozomy podle uloţení centromery (přesněji - podle tzv. centromerického indexu) dělíme na chromozomy:  Telocentrické (pouze s 1 ramenem, u člověka se nevyskytují)  Metacentrické (s přibliţně stejně dlouhými rameny)  Submetacentrické (jedno raménko je mírně kratší)  Akrocentrické (jedno raménko je extrémně kratší) Akrocentrické chromozomy mají typicky velmi krátká krátká ramena, na kterých je (sekundární konstrikcí) oddělena speciální struktura - tzv.satelit. Tato struktura tvoří tzv. organizátor nukleolu (podílí se tedy na stavbě jadérka) a obsahuje geny pro syntézu rRNA. Tvar, velikost a počet chromozomů v buňce jsou poměrně charakteristické a konstantní druhové znaky. Např. člověk má 23 párů chromozomů, ţíţala - 18 párů, pes - 39 párů. Soubor chromozomů v buňce označujeme jako karyotyp. O lidském karyotypu se dočtete více v kapitole karyotyp člověka. Mikrostavba chromozomů Jak jiţ bylo zmíněno, chromozomy jsou ve skutečnosti komplexem sloţeným z nukleové kyseliny (DNA) a proteinů (histonové a nehistonové proteiny). Základní stavební jednotkou chromozomu jsou tzv. nukleozomy - malé útvary tvořené 8 histony, které jsou obtočeny přibliţně 146 páry bazí molekuly DNA. Spiralizací těchto nukleozomů vznikají chromatinová vlákna a další spiralizací těchto vláken vznikají jiţ celé chromozomy. Histony jsou specifické bazické bílkoviny, které tvoří komplex s DNA. Rozeznáváme 5 typů histonů: H1, H2A, H2B, H3, H4. V rámci 1 nukleozomu je histonový otamer tvořen dvojicí kaţdého z těchto typů histonů: H2A, H2B, H3 a H4. Poslední typ - H1 - je umístěn mimo tento oktamer. Autozomy a gonozomy Mezi chromozomy existují ještě určité rozdíly a to vzhledem k pohlaví. Chromozomy se totiţ dělí na chromozomy somatické (autozomy, které tvoří homologní (shodné) páry a jejich přítomnost není specifická pro určité pohlaví, a dále na chromozomy pohlavní (gonozomy), které určují pohlaví jedince a jsou heterologní (liší se svou stavbou). Například u člověka nacházíme 22 párů autozomů a 1 pár gonozomů - přičemţ pohlavní chromozomy označujeme písmeny X a Y. Chromozomální určení pohlaví a dědičnost pohlavně vázaných znaků je podrobněji rozebrána v kapitole dědičnost. 3) Buněčný cyklus Buněčný cyklus je cyklus, kterým prochází buňka mezi svými děleními. Doba trvání cyklu se nazývá generační doba. Buněčný cyklus se skládá z několika fází přípravných (souborně nazývaných jako interfáze - tj. období mezi dvěma následnými mitózami) a vlastního buněčného dělení. Časy zde uvedené jsou pouze orientační a liší se druh od druhu a i buňku od buňky (tyto přibliţně odpovídají dělící se modelové lidské buňce). Regulaci buněčného cyklu má na starosti velké mnoţství látek enzymové i neenzymové povahy (Cykliny a CDK proteinkinázy). Obecně existují faktory, které dělení buňky urychlují, a faktory, které naopak dělení buňky zpomalují, či zcela zastavují. Ve sloţitém mnohobuněčném organismu (jakým je například člověk) je přísná regulace buněčného dělení zcela nezbytná, neboť jen tak lze dosáhnout harmonické funkčnosti organismu, kde se dělí pouze ty buňky, u kterých je to momentálně potřeba. Nekontrolované buněčné dělení nacházíme u různých nádorových onemocnění. Naopak i omezení schopnosti dělení můţe mít závaţné následky (vzpomeňme například na sníţenou produkci krevních elementů u pacientů po cytostatické léčbě). G0 fáze - fáze, kdy se buňka jiţ dále nedělí, zastavení buněčného cyklu. Setkáváme se u diferencovaných buněk. Její nástup je ovlivněn kontrolním uzlem, umístěným na počátku G1 fáze. Pokud se jiţ buňka nemá dále dělit, vstoupí do G0 (nula) fáze, místo do G1 fáze. Plně diferencované buňky (např. neurony) se dále jiţ nedělí. Naopak některé jiné buňky (např. jaterní buňky - hepatocyty) jsou schopny v případě potřeby přejít z G0 fáze do G1 fáze a začít se opět dělit. G1 fáze - Nazývána téţ postmitotická. Období růstu buňky, přípravná fáze na další dělení. Dochází zde ke kontrole a opravám DNA, před její budoucí replikací v následující fázi. Trvá asi 10 - 12 hodin. S fáze - DNA se replikuje na dvojnásobné mnoţství. Kaţdý chromozom je od této doby zdvojený, tvořený párem sesterských chromatid. Trvá asi 6 - 8 hodin. G2 fáze - Zdvojování organel, tvorba struktur potřebných pro dělení buňky. Trvá asi 2 - 4 hodiny. M fáze - Skládá se z jaderného dělení (mitózy či meiózy) a vlastní cytokineze. Trvá asi 1 - 2hodiny. Dělení buňky se skládá ze 2 fází. Karyokineze (jaderné dělení) a cytokineze (dělení celé buňky). 4) Mitóza Jaderné dělení je nedílnou součástí komplexního buněčného cyklu. Mitóza je poté nejčastější typ jaderného dělení (karyokineze). V průběhu mitotického dělení vznikají z jedné buňky mateřské dvě zcela rovnocenné buňky dceřiné, coţ mimo jiné znamená, ţe mateřská i dceřiná buňka mají stejné mnoţství genetické informace a stejný počet chromozomů (čímţ se významně liší od meiózy). Proto se mitóze také říká ekvační či také homotypické dělení. Mitóza má celkem 4 fáze: 1) Profáze Rozpuštění jaderné membrány a jadérek, vznikají 2 centrioly -> vzniká dělící vřeténko (mikrofilamenta, mikrotubuly), z chromatinu a jadérek vznikají pentlicovité chromozomy. (Touto dobou je jiţ dávno po S fázi a veškerý genetický materiál je tudíţ znásobený. Chromozomy jsou zdvojené, jsou ale stále spojeny v centromeře, neţ budou v anafázi roztrţeny). Přechodná fáze mezi profází a metafází se někdy specificky označuje jako prometafáze. 2) Metafáze Chromozomy se seřazují do rovníkové (ekvatoriální) roviny. Dělící vřeténko se navazuje na centromery chromozomů. Chromozomy zůstávají spojeny jen v centromerách. 3) Anafáze Roztrţení chromozomů v centromerách zkracováním mikrotubulů dělícího vřeténka. Chromozomy putují k pólům buňky. 4) Telofáze Zánik dělícího vřeténka, despiralizace chromozomů, vzniká jaderná membrána a jadérka, počátek cytokineze. Je třeba si uvědomit, ţe můţe dojít k chybnému rozestupu chromozomů (nondisjunkci). Pokud se tak stane, potom vznikající buněčné linie budou nést určité chromozomové aberace (nebo buňky zahynou, pokud je vzniklá kombinace pro buňku letální). Následuje samotná cytokineze. Při cytokynezi vzniká přepáţka mezi dceřinnými buňkami trojím způsobem: a) Pučením typické pro některé prvoky, kvasinky. Na mateřské buňce se vytvoří pupen (nestejné mnoţství cytoplazmy), který se oddělí a teprve později doroste. b) Rýhováním ţivočišné buňky. Dostředivé dělení. Buňka se jakoby "zaškrtí" od krajů do středu. c) Přehrádečným dělením rostlinné buňky. Přehrádka mezi buňkami vzniká od středu ke kraji. Odstředivé dělení. 5) Meióza Meiotické neboli redukční dělení (dříve také heterotypické) dává za vznik haploidních buněk (coţ jsou typicky pohlavní buňky). Jejím cílem je tedy zajistit, aby buňka získala pouze polovinu genetického materiálu. Pokud má mateřská buňka celkem 2n chromozomů, potom dceřinné buňky budou mít pouze n chromozomů, tedy přesně polovinu původního počtu. Původní počet 2n chromozomů se obnoví aţ splynutím dvou gamet v průběhu oplození. Dalším rozdílem oproti mitóze je skutečnost, ţe výsledkem kompletní meiózy jsou celkem 4 buňky (oproti 2 buňkám u mitózy). Meióza má 2 hlavní fáze, a to 1. a 2. meiotické dělení. 1. Meiotické dělení Homologní chromozomy tvoří v ekvatoriální rovině tzv. tetrády. Můţe mezi nimi dojít k rekombinaci genetického materiálu (crossing-over - výměna genů mezi homologickými, avšak nesesterskými chromatidami). Chromozomy nejsou roztrhávány, k pólům buňky putují celé sady. Na kaţdém pólu tak zůstane vlastně 2krát jedna polovina genetického kódu. Redukčním dělením je tak vlastně právě a pouze první část meiotického dělení (meióza I). Profázi I ještě můţeme dělit na následující fáze: Leptoten - vláknité chromozomy se začínají kondenzovat Zygoten - párování homologních chromozomů, vznik bivalentů Pachyten - pokračuje kondenzace, čtveřice chromatid jsou dobře patrné jako tzv. tetrády, dochází ke crossing-overu Diploten - tetrády se rozestupují, místa překříţení chromatid (po crossing-overu) lze pozorovat jako tzv. chiasmata Diakineze - chiasmata zanikají (terminalizace chiasmat), rozpadá se jaderný obal, profáze končí 2. Meiotické dělení Navazuje na první meiotické dělení. Mezi nimi jiţ NEDOCHÁZÍ k další replikaci DNA. Probíhá téměř stejně jako normální mitóza. Výsledkem jsou tedy 4 dceřinné buňky, kaţdá s jednou polovinou genetické výbavy. Stejně jako u mitózy i v průběhu meiózy můţe dojít k chybnému rozestupu chromozomů. Situace je o to váţnější, ţe pohlavní buňka se špatnou chromozomální výbavou dává za vznik zygotě, ze které vzniká celý plod, jehoţ kaţdá buňka ponese příslušnou chromozomovou aberaci (nebo jeho vývoj bude předčasně ukončen). 6) Diferenciace buněk U vícebuněčných organismů dochází k procesu diferenciace (viz G0 fáze v kapitole buněčný cyklus), díky němuţ se buňky svou stavbou přizpůsobují roli, kterou mají v organismu vykonávat. Všechny buňky organismu jsou sice vybaveny stejnou genovou výbavou, ale v konkrétní buňce dochází k realizaci pouze části genetické informace (např. působením hormonů, různých růstových faktorů apod.; které geny nakonec budou v buňce přepisovány záleţí na přítomnosti specifických transkripčních faktorů). V průběhu vývoje organismu je takováto diferenciace nesmírně důleţitá, neboť jen plně vyvinuté tkáně mohou plnit svojí fyziologickou úlohu na 100 %. V časných embryonálních stádiích jsou ještě buňky nediferencované, mají schopnost změnit se prakticky v jakýkoliv typ buňky (tato schopnost se označuje jako totipotence. V průběhu vývoje se buňky stále více specializují a diferencují aţ se z nich nakonec stávají plně diferencované buňky. Typickým příkladem plně specializované buňky, která se jiţ dále nemění a nevyvíjí je nervová buňka - neuron. I u dospělého organizmu nacházíme buňky, které jsou stále schopné diferenciace do několika různých typů buněk. Patří sem například kmenové buňky krvetvorné kostní dřeně, ze kterých se mohou vyvinout různé typy krevních buněk (krvinek). Schopnost diferencovat se v několik různých typů buněk (ovšem v omezené mnoţství typů) se označuje jako pluripotence. V průběhu onotgenetického vývoje jedince i v průběhu ţivota dochází k velkému "koloběhu" buněk, kdy řada buněk hyne, nebo je dokonce cíleně odstraňována. Tyto nepotřebné, staré nebo poškozené tedy potom hynou nekrózou nebo apoptózou. 7) Buněčná smrt V mnohobuněčném organizmu, jakým je i člověk, se kaţdý den vytvoří obrovské mnoţství nových buněk a na druhé straně jich i obrovské mnoţství zahyne v procesu nazvaném buněčná smrt. A zatímco proces vzniku - buněčné dělení - probíhá relativně stejně u všech buněk organizmu, buněčná smrt probíhá dvěma hlavními cestami a to nekrózou a apoptózou. Nekróza Nekrózu je třeba chápat jako patologický proces. Je vyvolána různými vlivy na buňku, ať jiţ mechanickými, chemickými či tepelnými. Nekrózu také můţe vyvolat virová infekce buňky, různé bakteriální toxiny nebo třeba i náhlé vyčerpání buněčných energetických zásob (například vlivem ischémie). Důleţité je, ţe při nekróze dochází k narušení integrity cytoplazmatické membrány, coţ vede k narušení rovnováhy vnitřního prostředí buňky. To vede k objemovým změnám (edém) jak celé buňky, tak některých organel (mitochondrie, endoplazmatické retikulum). Celý proces nakonec vede k enzymatickému poškození buňky (náhodné štěpení jaderné DNA) a jejímu rozpadu. Celé vnitřní prostředí buňky se tak uvolní do okolí, přičemţ enzymy takto uvolněné mohou indukovat nekrózu okolních buněk a způsobit tak "řetězovou reakci", kdy dojde k rozsáhlejšímu poškození tkáně a následnému zánětu. Různé patologické externí vlivy nemusí vyústit pouze v nekrózu, ale při určité konstelaci mohou spustit i apoptotický proces. Apoptóza Apoptóza, neboli programovaná buněčná smrt je zcela fyziologický děj. Na rozdíl od nekrózy, která postihne víceméně náhodnou buňku, která měla zrovna smůlu a byla vystavena nepříznivým vlivům, je apoptóza indukována naprosto cíleně a buňka je usmrcena a následně odstraněna takovým způsobem, ţe nedojde k poškození okolních buněk. Je to tedy organizovaný a přísně regulovaný děj. Apoptóza můţe být indukována signálem zvenčí i z buňky samotné. Podnětem zvenčí můţe být například akce cytotoxického (CD8+) T lymfocytu, kterému se buňka určitým způsobem znelíbila (nádorové a virem infikované buňky). Jiným signálem můţe být naopak absence jakéhokoli signálu. Buňka izolovaná od kontaktu s ostatními buňkami a bez stimulace určitými cytokiny tak můţe také podlehnout apoptotickému procesu. Buňka sama pak můţe apoptózu spustit například při neopravitelném poškození jaderné DNA. Vlastní průběh apoptózy vyuţívá enzymatické regulační kaskády buňky. Uplatňují se zde tzv. kaspázy, které se nacházejí v buňce v neaktivním stavu a jejich aktivace proapoptotickým signálem vede k dějům, kterými se buňka připravuje na svou smrt. Dochází k fragmentaci jaderné DNA, na rozdíl od nekrózy je však fragmentace nenáhodná a fragmenty jsou stejně dlouhé. Buňka se také trochu smrští a změní se i charakter různých organel. Zdá se, ţe významnou úlohu v apoptóze hrají mitochondrie. Celý proces končí rozpadem buňky do apoptotických tělísek, coţ jsou membránou ohraničené buněčné fragmenty, které jsou následně fagocytovány bílými krvinkami (makrofágy). Důleţité je, ţe nitrobuněčné enzymy nepoškodí okolní buňky. Apoptóza se nejvíce uplatňuje v prenatálním vývoji jedince, kdy celé skupiny buněk hynou apoptózou během vývoje tkání a orgánových soustav (například rozestup tkání během vývoje prstů). Za ţivota potom dochází například k "probírání" dozrávajících T lymfoycytů v brzlíku, kdy autoreaktivní klony T lymfocytů (buňky, které by spouštěly imunitní reakci proti buňkám vlastního těla) hynou apoptózou, stejně jako klony, které naopak reakce s antigenem nejsou schopny vůbec. 8) Genetika mitochondrií Mitochondrie jsou zajímavé organely eukaryotických buněk. Slouţí jako energetické centrum buňky. Obsahují vlastní genetickou informaci a dokonce i vlastní proteosyntetický aparát. Mitochondrie jsou kulovité aţ podlouhlé organely široké asi 1µm a dlouhé aţ 10µm. Jsou uzavřeny 2 membránami - vnější mitochondriální membránou a vnitřní mitochondriální membránou, která vybíhá v četné výběţky - tzv. kristy. Prostor mezi oběma membránami označujeme jako intramembranózní, prostor ohraničený vnitřní membránou označujeme jako interkristální. V prostoru mezi kristami najdeme matrix mitochondrie - amorfní hmotu, obsahující proteiny, koncentrovanou směs enzymů (včetně enzymů Krebsova cyklu a β-oxidace mastných kyselin), mitochondriální genom, speciální mitochondriální ribozomy a RNA. Většina buněk obsahuje alespoň 1000 mitochondrií. Mitochondrie je energetické centrum buňky. Probíhá zde cyklus kyseliny citrónové (Krebsův cyklus, citrátový cyklus), kde je oxidován získaný acetylkoenzym A (acetyl-CoA). Cyklus vydává CO2 a energii ve formě vysokoenergetických elektronů. Ty jsou z cyklu vyneseny nosiči (NADH, FADH2), které v dýchacím řetězci (elektrontransportní řetězec) odevzdávají tyto elektrony za vzniku vody a syntézy ATP díky protonovému gradientu, získanému transportem elektronů vnitřní membránou. Bez mitochondrií by buněčné zásoby ATP byly odkázány jen na méně účinné metody získání energie, jako je např. glykolýza. Díky částečné nezávislosti mitochondrií na zbytku buňky je označujeme jako tzv. semiautonomní organely. Z evolučního hlediska je povaţujeme za bakteriální buňky, které pronikly do jiné buňky a tomuto prostředí se dokázaly přizpůsobit (tzv. endosymbióza). Pro bakteriální původ hovoří např. dvojitá membrána, cirkulární molekula DNA nebo přehrádečný typ dělení, který lze pozorovat u dělících se mitochondrií. Nyní k vlastnímu genomu mitochondrie. Bylo prokázáno, ţe tento je jako u bakterií tvořen kruhovou molekulou DNA (mtDNA) o velikosti (u člověka) 16569 nukleotidových párů, které představují 37 genů, z toho 24 genů kóduje různé části proteosyntetického aparátu mitochondrie (2 typy rRNA a 22 tRNA) a zbytek se podílí na malé části enzymatické výbavy mitochondrie. Naprostá většina mitochondriálních proteinů je ale kódována v jádře buňky a tyto sem musí být přeneseny z místa vzniku v cytosolu. Stejně jako u bakterií, nejsou v mitochondriálním genomu nekódující sekvence (introny). Proteosyntetický aparát mitochondrie se také výrazně liší od normálního aparátu eukaryotické buňky. Liší se např. velikostí ribozomálních podjednotek, menším počtem typů molekul tRNA (pouhých 22!) a odlišnosti najdeme i v genetickém kódu, zejména v kódování methioninu a stop-kodonů. Přes zdánlivou nepodstatnost mohou být mutace v mtDNA zdrojem různých závaţných chorob. Vzhledem k tomu, ţe všechny mitochondrie v zygotě jsou z vajíčka (všechny mitochondrie ze spermie jsou odbourány), mluvíme zde o tzv. maternální dědičnosti (tedy jeden z typů neMendelovské dědičnosti). Jinými slovy, pokud je matka přenašečkou mutace v mtDNA, pak tuto předá všem svým potomkům, zatímco pokud je přenašečem otec, pak tuto mutaci ţádnému potomkovi předat nemůţe. Další zvláštností je, ţe při dělení buňky nedochází k ţádné kontrolované segregaci mitochondrií do dceřiných buněk. Proto je mtDNA mezi nové buňky distribuována zcela náhodně a dceřiné buňky tak mohou získat zcela různý počet normálních a mutací zatíţených mitochondrií. Stav, kdy buňka obdrţí pouze normální mitochondrie, či naopak pouze mutované mitochondrie se nazývá homoplazmie. Stav, kdy obdrţí směs normálních a mutovaných mitochondrií, se nazývá heteroplazmie. Případná nefunkčnost mitochondrií je neslučitelná se ţivotem, ale vzhledem k tomu, ţe fenotypový projev závisí na podílu normálních a zmutovaných mitochondrií v buňce, je ţivot takového jedince nejen moţný, ale v případě malého počtu zmutovaných mitochondrií v buňce, se tato skutečnost nemusí projevit vůbec. Proto se u pacientů s těmito mutacemi mitochondrií setkáváme s variabilní expresivitou choroby a její neúplnou penetrací v rodokmenu (a aby to nebylo jednoduché, existuje mezi jadernou DNA a mtDNA poměrně těsný vztah a byly pozorovány takové interakce, které v rodokmenu následně vykazují AD či AR dědičnost). Existují různorodá onemocnění, podmíněná mutací v mtDNA. Uvedu zde několik příkladů: Leberova hereditární optická neuropatie Náhlá a rychlá nekróza optického nervu s preogresivní ztrátou zraku vedoucí k úplné slepotě. Projeví se zejména u muţů a to mezi 16 - 25 lety věku. Hluchota Progresivní hluchota, jen málo případů dědičné hluchoty je způsobeno mutací v mtDNA. NARP MELAS Pearsonův syndrom 3. Mikrobiologie 1) Viry Viry jsou nebuněčné (skupina subcelullata) parazitické organismy. Samy o sobě jsou neaktivní a k rozmnoţování potřebují hostitelskou buňku (nemají vlastní proteosyntetický aparát). Při tomto "vyuţití" často způsobí smrt napadené buňky. Proto jsou viry označovány jako vnitrobuněční parazité. Stavba viru je velmi jednoduchá. Základní část (jakousi obdobu buněčného jádra) tvoří nukleová kyselina a okolo ní je bílkovinný obal - kapsida. Dále mají některé viry ještě membránový obal (obalené viry), jeden nebo více bičíků (např. některé bakteriofágy) nebo si v kapsidě dokonce přinášejí některé enzymy, potřebné pro rozmnoţení viru (např. reverzní transkriptáza u retrovirů). Důleţité jsou povrchové glykoproteiny viru, díky kterým se virová částice můţe vázat na specifické receptory buněk. Genetická informace u virů Genetickou informaci u virů tvoří DNA nebo RNA (ale nikdy oba typy naráz). Tato DNA můţe být jednořetězcová i dvouřetězcová (častěji), lineární i cyklická. I RNA najdeme jako jednořetězcovou nebo dvouřetězcovou molekulu (lineární nebo segmentovaná podoba). Pokud má virus DNA (DNA viry), dochází k přímým transkripcím a translacím virových genů. Má-li jednovláknovou RNA (RNA viry), můţe tato RNA slouţit přímo jako mRNA pro proteosyntézu (pozitivní RNA viry), nebo je nejprve zreplikována za vzniku komplementárního RNA vlákna, které teprve plní roli mRNA (negativní RNA viry). Přepis je katalyzován RNA dependentní RNA polymerázou, která je do buňky přinesena v kapsidě virionu. Pokud je informace kódována dvouvláknovou RNA, dochází přímo k přepisu do mRNA. DNA viry se většinou replikují v buněčném jádře, zatímco RNA viry volně v cytoplazmě. Translaci zajišťuje vţdy proteosyntetický aparát infikované buňky. Mimo transkripce virových genů si musí virus zajistit replikaci své původní genetické informace, která bude pouţita při stavbě nových virových částic. U reovirů nacházíme dvouvláknovou RNA. U poxvirů pouze jednovláknovou DNA. Zvláštní skupinou jsou retroviry, jejichţ RNA je po vpravení do hostitelské buňky nejprve přepsána do DNA. Na tomto procesu se podílí enzym reverzní transkriptáza, který je schopný katalyzovat reverzní transkripci, tj. přepis informace z RNA do DNA. Reverzní transkriptáza, schopná přepsat virovou RNA do DNA se v hostitelské buňce nenachází, a proto musí být přinesena v kapsidě retroviru. Některé retroviry jsou schopny takto vyrobenou DNA dokonce včlenit do genomu buňky, která tak stále produkuje další viry. Pokud se infikovaná buňka dělí, dělí se s ní i virová informace. Retroviry mohou slouţit jako vektory genetické informace v biotechnologiích a uvaţuje se o nich i jako vektorech pro genovou terapii. Mezi retroviry patří i virus HIV (původce AIDS). Virus hepatitidy B (HBV) je DNA virus se zvláštním replikačním cyklem. Ačkoliv se jedná o DNA virus, je do nově syntetizovaných virových částic uzavírána komplementární sekvence RNA, podle které je teprve později virovým enzymem s aktivitou reverzní transkriptázy vytvořena virová DNA. Bakteriofágy jsou viry napadající bakterie. Podobně jako retroviry umí integrovat svou genetickou informaci do bakteriálního chromozomu. Umoţňují i šíření části bakteriální DNA mezi jednotlivými bakteriemi - tzv. transdukce. Průběh virové infekce Kaţdý virus má svůj vlastní infekční cyklus, během kterého se pomnoţí uvnitř určitých buněk a dále uvolní do okolí. Jedná se však o relativně komplikovaný proces, neboť kaţdý virus má svá specifika, především co se týká vnímavých buněk a průniku do nich, replikace a realizace genetické informace a uvolňování z buňky. Obecně lze ovšem průběh infekce shrnout do několika základních bodů.  Průnik do buňky - viry jsou závislé na specifických receptorech buněk, které jsou důleţité pro zprostředkování kontaktu viru s cílovou buňkou. Viry jsou schopny infikovat pouze buňky s příslušným receptorem, coţ vysvětluje proč určitá virová onemocnění poškozují pouze určité a vţdy stejné tkáně (například virus HIV cíleně infikuje TH lymfocyty - neboť specificky rozeznává jejich CD4 receptor). Samotný průnik viru do buňky probíhá většinou endocytózou (u některých bakteriofágů ale například proniká pouze nukleová kyselina).  Zpřístupnění genomu - po průniku do buňky se virus musí zbavit veškerých obalů okolo své genetické informace. Tím je umoţněna transkripce virových genů.  Replikace - nejdříve dochází k transkripcím genů časných virových proteinů (rozdíly mezi templáty transkripce u různých typů virů jsou uvedeny výše). Časné virové proteiny modifikují metabolismus buňky tak, aby usnadnil replikaci viru a zároveň umoţňují transkripci genů pozdních virových proteinů. Tyto pozdní proteiny jsou převáţně strukturní proteiny kapsidy a virových receptorů, případně i virové enzymy, které budou spolu s nukleovou kyselinou (musí tedy dojít i k replikaci původní virové genetické informace) zabudovány do kapsidy.  Únik virových částic z buňky - po zkompletování virových částic jsou tyto uvolňovány z buňky do okolí, coţ můţe vést i k smrti infikované buňky. Obalené viry se pře opuštěním buňky ještě obalí buněčnou membránou (můţe jít nejen o cytoplazmatickou membránu, ale třeba i o jadernou membránu nebo membránu endoplazmatického retikula). Je třeba si uvědomit, ţe ne vţdy vede infekce buňky virem k okamţité replikaci virových částic a lýze buňky. Pokud není buňka pro replikaci viru zcela vhodná, umí se některé DNA viry podobně jako retroviry stát součástí buněčného genomu, případně perzistovat v buňce v podobě samostatných DNA molekul. Tato schopnost virů je vyuţívána v genové terapii, kde viry slouţí jako vektory nesoucí příslušnou DNA. O retrovirech v této souvislosti jiţ byla řeč, z DNA virů se vyuţívají adenoviry. Určité viry jsou spojeny se vznikem určitých nádorů. Tyto tzv. onkogenní viry fungují jako biologické kancerogeny (avšak pro vznik nádoru je potřeba i spoluúčast dalších faktorů). Uvedeme si několik klinicky významných případů:  Lidský papillomavirus - je spojený s rizikem karcinomu děloţního čípku  Virus Ebsteina-Barrové - je spojený s Burkittovým lymfomem, nazofaryngeálním karcinomem, nebo Hodgkinovými nádory  Virus hepatitidy B a hepatitidy C - jsou spojeny s karcinomem jater 2) Prokaryota a bakterie Prokaryota obecně Prokaryotní organismy jsou tvořeny tzv. prokaryotní buňkou, která má mnohem jednodušší stavbu neţ buňka eukaryotní. Její jedinou membránou je plazmatická membrána, tvořící povrch buňky. Neobsahuje tudíţ membránové organely (vakuoly, mitochondrie, plastidy), jejichţ funkce je různě nahrazována (např. metabolické děje volně v cytoplazmě, jádro bez obalu, tylakoidní útvary u fotosyntetizujících prokaryot se tvoří z vychlípenin plazmatické membrány apod.). Se samotným zařazením těchto organismů bývá někdy potíţ, proto se můţete v různé literatuře setkat s určitými rozdíly. Mně osobně se nejvíce líbí toto zařazení: Prokaryota tvoří samostatnou nadříši ţivých organismů s prokaryotickou buňkou. Mezi ně patří archebakterie, bakterie a sinice. Právě na bakterie bychom se zde nyní zaměřili. Bakterie Co je vlastně na bakteriích tak zajímavého, ţe se o nich tolik mluví v genetických souvislostech? Bakterie jsou totiţ neuvěřitelně vhodné pro genetický výzkum. Rozmnoţují se sice nepohlavně, ale velmi rychle se mnoţí a ve velmi krátké době lze vytvořit mnohamiliónové populace, a to přesně za těch podmínek, které jsme chtěli navodit. Je to mnohem jednodušší neţ u vyšších organismů, u kterých by se navíc neúměrně zvýšily finanční náklady na tyto pokusy. Mnohamilionové populace nám také zvyšují šanci na vznik velmi vzácných mutací, které by se u menších populací téměř jistě neprojevily. Některé bakteriální enzymy - tzv. restrikční endonukleázy umoţnily vznik technologiím rekombinantní DNA. Bakteriální populace se pouţívají i pro klonování DNA, nebo pro uchovávání DNA knihoven. Bakteriální chromozom a jeho replikace Chromozom bakterií je tvořen jedinou, kruhovitě sevřenou dvouvláknovou šroubovicí deoxyribonukleové kyseliny (DNA). Tím, ţe obsahuje pouze jeden chromozom, je bakteriální buňka trvale haploidní. Tato struktura je označována jako nukleoid (neplést s nucleus - eukaryota) a funkcí tak odpovídá buněčnému jádru. Při replikaci nedochází k meioze ani k mitoze. Chromozom bakterií neobsahuje introny a z funkčního hlediska jej tedy můţeme povaţovat za jediný exon (introny, exony viz. transkripce). Bakteriální chromosom obsahuje nepostradatelnou genetickou informaci. Jeho replikace probíhá souměrně, symetricky a z jednoho místa (narozdíl od eukaryot, kde se při replikaci tvoří replikačních počátků více). Hlavním enzymem replikace je opět DNA polymeráza (u bakterií rozlišujeme polymerázu I, II a III), rozpletení šroubovice i případné nadšroubovice mají na starosti topoizomerázy a helikázy, vznik RNA primeru nutného pro iniciaci replikace katalyzuje DNA primáza a spojení Okazakiho fragmentů na opoţděném řetězci provede DNA ligáza. Mimo nukleoid je genetická informace obsaţena i jinde. Jde především o plazmidy a genomy bakteriálních virů (bakteriofágů). Plazmidy Plazmidy jsou nezávisle se replikující molekuly cirkulární DNA, které mohou existovat mimo chromosom bakterie a mohou nést různé informace. Tyto informace nejsou pro bakterii ţivotně nezbytné, ale mohou ji určitým způsobem zvýhodňovat, například pokud plazmid kóduje rezistenci na některá antibiotika. Za zmínku stojí především plazmidy F, které geneticky umoţňují konjugaci - tedy způsob přenosu genetické informace mezi bakteriemi. Bakterie s F plazmidy tvoří tzv. pohlavní pilus, který zprostředkuje kontakt s další bakterií. Mezi oběma bakteriemi vznikne cytoplazmatický můstek, kterým prochází jedno vlákno z dvoušroubovice plazmidu. V buňce donorové i recipientní je pak vlákno dosyntetizováno zpět na dvoušroubovici. Přenos plazmidové DNA je tak stejně jako replikace DNA semikonzervativní proces. Bakterie, která takto získala F plazmid, můţe nadále konjugaci sama iniciovat. Plazmidy se mohou přenášet i mezi bakteriemi různých druhů, přesto zde však platí různá omezení (grampozitivní bakterie většinou neumí předat plazmidy gramnegativním bakteriím a naopak). Transdukce a transformace Transformace - Transformací nazýváme přenos volné DNA do bakteriální buňky. Je to aktivní proces, který je limitovaný schopností bakterie tuto DNA přijímat (membránové receptory, enzymatická výbava), ale i velikostí transformované DNA. Pokud bakterie fragment DNA přijme - můţe být tento integrován do bakteriálního chromosomu. Transdukce - Transdukce je přenos genetické informace zprostředkovaný bakteriofágy. Bakteriofágy mají schopnost integrovat svou genetickou informaci do bakteriálního chromosomu. Tato informace můţe být z chromosomu opětovně vyštěpena a virus opouští buňku. Pokud nedojde k přesnému vyštěpení této DNA - potom s sebou virus přenáší i část původně bakteriální DNA. Jakmile tento virus infikuje další bakterii - přenese se i tato část genetické informace. Konjugace, tranformace a transdukce jsou děje, při kterých dochází k šíření genetické informace i mimo klasickou cestu - tj. dělení bakteriálních buněk. Tyto děje označujeme jako parasexuální děje. Tranformace a transdukce mají velké uplatnění při různých biotechnologických metodách. Transkripce u prokaryot Mezi nejdůleţitější rozdíly oproti transkripci u eukaryot patří absence transkripčního komplexu. Trankripci zde uskutečňuje DNA dependentní RNA polymeráza a její podjednotka - σ faktor (sigma faktor). ζ faktor je zodpovědný za rozpoznání promotoru (tedy zastává roli eukaryotních transkripčních faktorů). Za ukončení transkripce je opět odpovědná signální sekvence - terminátor. Translace u prokaryot Stejně jako u eukaryot, probíhá i u bakterií translace na ribozomech. Ty mají však mírně odlišnou stavbu - velká podjednotka (50S) je tvořena přibliţně 30 proteiny a 2 molekulami rRNA (5S rRNA a 23S rRNA), zatímco malá podjednotka (30S) je tvořena přibliţně 20 proteiny a molekulou 16S rRNA. Transkripty mRNA neprocházejí u prokaryot ţádnými dalšími úpravami, ani nemusí překonávat jadernou membránu (která u prokaryot neexistuje). U prokaryot se tak často setkáváme se spřaţením dějů transkripce a translace, kdy můţe být na jednom konci mRNA stále elongována během transkripce, zatímco na druhý - jiţ volný - konec mRNA začínají nasedat ribozomy a je zde zahájena translace. To vede ke značnému urychlení proteosyntézy. Za iniciaci translace je odpovědná malá podjednotka ribozomu a tRNA nesoucí (formyl)methionin (nasedající na AUG kodon). Prokaryotní mRNA nemá čepičku (CAP), místo toho je však v mRNA před AUG kodonem speciální signální sekvence pro navázání ribozomální podjednotky. Translace tedy můţe začínat i zprostřed mRNA, z jedné molekuly mRNA tak můţe vzniknout i několik polypeptidových vláken (umoţňuje translaci operonů - viz níţe). Další zvláštností prokaryot jsou tzv. operony. Operony jsou geny, které jsou přepisovány do jedné molekuly mRNA. Tyto geny jsou společně regulovány - buď jsou přepisovány všechny - nebo ţádný. Nejznámějším příkladem je lac operon u bakterií. Jedná se o tři geny, jejichţ exprese umoţní bakterii pouţít laktosu jako zdroj energie v situaci, kdy je jiných energetických zdrojů nedostatek. Naopak - pokud o primární zdroje není nouze - k expresi lac operonu nedochází. 3) Onkogenní viry Úloha virů v procesu maligní transformace Z hlediska kancerogeneze (podrobněji popsané v kapitole Onkogenetika) je třeba viry řadit mezi biologické kancerogeny. Viry jsou nitrobuněční parazité, kteří vyuţívají vnitřního prostředí a organel buňky k replikaci sebe sama. Během virové infekce buňky dojde k proniknutí virové částice (někdy jen některých částí; vţdy proniká virová dědičná informace) do buňky, obnaţení virové dědičné informace a zahájení exprese této informace. Různé viry mají různé replikační potřeby a mechanizmus replikace se u různých virů samozřejmě liší (nejmarkantnější rozdíly jsou např. mezi DNA a RNA viry). V kaţdém případě však virová dědičná informace a virové proteiny představují cizorodé molekuly, které mohou reagovat s buněčnými proteiny i buněčným genomem. Tato interakce můţe mít různé následky, vzhledem k tématu práce se budeme dále soustředit na mechanizmy, kterými virová infekce můţe spustit proces maligní transformace. Pro retroviry je typický následující postup při replikaci. Virová RNA je přepsána specifickou RNA-dependentní DNA-polymerázou (reverzní transkriptázou) do DNA (dvouvláknové). Jako ostatní DNA polymerázy potřebuje i reverzní transkriptáza pro syntézu primer - za tímto účelem slouţí molekula tRNA, kterou si retrovirus přináší s sebou v kapsidě. Tato dvouvláknová DNA je následně inkorporována do jaderného genomu hostitelské buňky jako tzv. provirus. Následné transkripce virových genů probíhají pouze pomocí enzymů hostitelské buňky. U modelového retroviru nacházíme 3 geny (nejedná se přímo o pouhé 3 geny, jde spíše o 3 oblasti virového genomu), které označujeme gag, pol a env. Jedná se o základní genetickou informaci, která zajišťuje replikaci virové částice (gag kóduje antigenní proteiny kapsidy, pol kóduje virovou polymerázu - reverzní transkriptázu a gen env především strukturní proteiny kapsidy a virového obalu). Produkty těchto genů transformační účinek nemají. Proto tyto retroviry mají většinou nízkou transformační aktivitu. Označují se také jako pomalu transformující retroviry. Jejich transformační účinek je způsoben náhodnou integrací proviru do buněčného genomu, kde naruší sekvenci nějakého buněčného protoonkogenu. Vlastní mechanismus transformace je pak způsoben silným virovým promotorem, který aktivuje transkripci (a tím pádem i zvýšenou expresi) příslušného protoonkogenu (který jiţ nyní vystupuje jako onkogen). Existují však i retroviry, v jejichţ genomu se nachází další gen - označovaný jako src. Toto označení pochází od viru Rousova sarkomu, u kterého byl poprvé tento extra gen objeven. Tento gen není důleţitý pro vlastní replikaci viru a jeho případné mutace replikační cyklus nikterak neovlivňují. Podobných genů bylo později objeveno mnohem více - viz dále. Během dalšího výzkumu se zjistilo, ţe v buněčném genomu (je třeba podotknout, ţe jde o buňky organizmu, na který má příslušný virus primární transformační účinek - u Rousova sarkomu jde například o kuřata) existují homologní úseky k těmto virovým genům. Tak byly objeveny buněčné protoonkogeny (původ těchto genů je opravdu buněčný a do virového genomu se dostává při chybném "vyštěpení z buněčného genomu; jde o podobný mechanismus šíření genetické informace jakým je transdukce bakteriálních buněk pomocí bakteriofágů). V kontextu virové transformace potom o buněčném protoonkogenu mluvíme jako o c-src (obecně c-onc) a o jeho virové formě jako v-src (obecně v-onc). Jest třeba připomenout, ţe buněčné (proto)onkogeny jsou standardní součástí buněčného genomu a mají introny (na rozdíl od virových onkogenů, které introny nemají). Virové onkogeny vykazují určité rozdíly ve svých sekvencích (jak jiţ bylo řečeno, exprese těchto genů neovlivňuje replikační cyklus viru, a tak mutace těchto genů mají minimální selekční tlak; buněčné (proto)onkogeny naopak mají vysoce konzervativní sekvence); často v nich (či v jejich blízkosti) nacházíme variabilní repetitivní sekvence, které se zde vytvořily během formování proviru (tyto sekvence se nacházejí i v jiných genových oblastech proviru). Obecně se tyto sekvence označují jako LTR (long terminal repeats) a označují aktivní promotorová místa s enchancerovou aktivitou. Virový onkogen integrovaný do buněčného genomu představuje nadbytečnou sekvenci buněčného (proto)onkogenu. Tato nadbytečná kopie by jiţ sama od sebe mohla mít transformační aktivitu, která je ovšem umocněna silným virovým promotorovým místem a případně i mutovanou sekvencí. Retroviry s takovýmito geny mají značnou transformační aktivitu, proto je označujeme jako rychle (rapidně) transformující retroviry. Následující seznam obsahuje některé nejznámější (rychle transformující) retroviry a jejich virové onkogeny. Retroviry a virové onkogeny Virus V-onkogen  virus Fujinamiho sarkomu v-fps virus Harveyho myšího sarkomu v-Ha-ras virus Kirstenova myšího sarkomu v-Ki-ras virus Moloneyho myšího sarkomu v-mos virus opičího sarkomu v-sis virus ptačí erytroblastózy v- erbA, v-erbB virus ptačí myelomatózy v-myc virus Rousova sarkomu v-src Kromě onkogenních retrovirů se setkáváme i s dalšími RNA i DNA viry, které mají vliv na transformaci buňky. Stejně jako u retrovirů se můţe virová genetická informace integrovat do buněčného genomu a narušit tak sekvenci některého buněčného (proto)onkogenu (tato "taktika" je častá například při virové infekci nepermisivních buněk, ve kterých virus nemůţe dokončit svůj replikační cyklus a namísto toho v buňce perzistuje). Dále se zde však uplatňuje řada dalších transformačních mechanizmů. Jmenujme například interakci produktů virových genů s buněčnými tumor-supresorovými geny (respektive jejich produkty), které jsou touto interakcí inaktivovány, čímţ se otevírá cesta transformačnímu procesu (uveďme si alespoň inaktivaci p53 a p105-Rb proteinu u infekcí vyvolaných některými variantami lidského papillomaviru). Virové proteiny mohou interagovat i se základními regulačními proteiny buněčného cyklu (cykliny a CD-kinázami); případně mohou přímo ovlivňovat transkripci a tím i expresi určitých buněčných genů (obojí opět ve smyslu maligní transformace). Kromě podpory buněčné proliferace se rovněţ setkáváme s antiapoptotickým účinkem. Dalším, velmi zajímavým mechanismem, kterým některé viry napomáhají transformačnímu procesu, je zvýšení telomerázové aktivity v buňce. Telomery jsou nukleoproteinové terminální části eukaryotních chromozomů, které hrají důleţitou roli ve stabilitě příslušných chromozomů, a to především během buněčného cyklu. V průběhu kaţdého dělení buňky se telomery zkracují (dle určitých, dnes většinou přijímaných teorií existuje přímý vztah mezi délkou telomer a stářím buňky; po určitém počtu dělení buňky by se tak buňka jiţ dále nedělila). Enzym telomeráza umoţňuje telomery prodluţovat a tím prodluţovat i další schopnost buňky dělit se. Telomerázová aktivita je fyziologicky v buňkách přítomna během prenatálního vývoje a v ojedinělých skupinách buněk (např. buňky hemopoetické řady) i během ţivota jedince. V normálních somatických buňkách je telomerázová aktivita takřka nedetekovatelná. V posledních třech letech byl objeven vztah mezi zvýšenou aktivitou telomerázy a infekcí lidským papillomavirem (HPV 16), herpesvirem HHV8 nebo EB virem. V genomu těchto virů však nebyla ţádná komponenta telomerázy identifikována. Prvním virem, u kterého byl objeven gen kódující subjednotku telomerázy (vTR), je MD (Marek's disease) virus, který způsobuje maligní T-lymfomy u kuřat. Na konec ještě poznámka - přestoţe dnes jiţ existují přesvědčivé důkazy o transformačním účinku některých virů - v konkrétním případě nádorového bujení u člověka nelze prokázat, ţe přítomnost viru v transformovaných buňkách byla opravdu onou příčinou maligní transformace. V následující části budou blíţe probrány nejvýznamnější onkogenní viry, způsobující maligní transformaci u člověka. Významné lidské onkogenní viry Lidský papillomavirus (HPV) Viry > dsDNA viry > Papillomaviridae Jedná se o DNA virus vyskytující se v mnoha různých subtypech (identifikováno více neţ 70 subtypů). Má vysokou afinitu k epiteliím kůţe a sliznic a keratinocytům. Kromě toho, ţe způsobuje bradavice, je papillomavirus spojován s řadou benigních hyperplazií a tumorů a s některými vysoce maligními tumory - jakým je karcinom děloţního čípku. Přenáší se tělesným kontaktem nakaţených částí těla - nejčastěji při sexuálním styku, přičemţ narušení integrity povrchu můţe přenos znatelně usnadnit. Transformační aktivita jednotlivých subtypů se tedy liší - s mírnou dysplazií jsou většinou asociovány subtypy 6 a 11 (jsou identifikovány aţ v 90% případů genitálových bradavic); s těţšími maligními neoplaziemi jsou spojeny subtypy 16, 18, 31 a 33, 35 a 51 (některý z těchto subtypů nacházíme aţ u 85% případů karcinomu čípku děloţního). Transformační aktivita je pravděpodobně spojena s integrací virového genomu do genomu buňky. Zatímco v benigních hyperplaziích nacházíme virovou genetickou informaci v epizomech mimo buněčný genom, v případě karcinomů je virový genom integrován do buněčného genomu. Tato integrace je náhodná, avšak v případě mnohobuněčného karcinomu nacházíme virus integrován ve všech buňkách na stejném místě, z čehoţ lze usuzovat, ţe tato integrace předcházela klonální expanzi původní infikované - a následně transformované buňky. Vlastní transformační účinek pravděpodobně obstarají produkty virových genů. Integrace virové genetické informace do buněčného genomu otevře čtecí rámec virového genu E2 a způsobí jeho transkripci. To následně způsobí zvýšenou expresi virového E6 a E7 genu. Virový protein E6 ovlivňuje buněčný protein p53, který buď inaktivuje nebo zajistí jeho zvýšenou degradaci, dále aktivuje telomerázu, inaktivuje inhibitor CDK p16(INK4) a interaguje i s dalšími buněčnými proteiny. Virový protein E7 interaguje s buněčným p105-Rb proteinem a narušuje jeho vazbu na E2F transkripční faktor, čímţ odblokovává buněčný cyklus. Dále inaktivuje buněčný protein p21 (coţ vede ke stejnému účinku jako interakce s p105-Rb) a negativně ovlivňuje transkripční aktivitu buněčného TP53 genu. Objevují se přímo i mutace ve sktruktuře buněčného TP53 genu. Celkový účinek by se dal shrnout pod několik hesel: zvýšení proliferační aktivity, zablokování apoptózy, získání nesmrtelnosti, změny morfologické a zvýšení genetické nestability. Na druhou stranu je třeba zmínit, ţe podle současných průzkumů je infekce (i potenciálně nebezpečným subtypem) papillomavirem pouze počátkem celého transformačního procesu a musí se vyskytnout další faktory, které jsou nezbytné pro dokončení transformačního procesu. Mezi tyto faktory patří například kouření, souběţné bakteriální infekce, špatná výţiva nebo hormonální změny. Jelikoţ karcinom děloţního čípku je celosvětově druhou nejčastější (po rakovině prsu) příčinou úmrtí ţen na nádorové onemocnění, existuje jiţ delší dobu snaha o vyvinutí účinné očkovací látky proti určitým subtypům papillomaviru. Většina vyvíjených vakcín se snaţí svým protektivním účinkem pokrýt zejména nejnebezpečnější subtypy HPV 16 a 18. Vyuţívá se především imunizačního účinku virového L1 proteinu. Ačkoliv klinické studie běţí jiţ několik let a v některých zemích (včetně ČR) jiţ byly zahájeny první zkušební programy na očkování obyvatelstva, existuje stále mnoho nezodpovězených otázek. Jelikoţ největší protektivní účinek lze očekávat u osob, které doposud nepřišly do kontaktu s HPV (který má schopnost v nakaţených jedincích perzistovat po dlouhou dobu), provádí se očkování především u mladých dívek (řádově 16 - 26 let), které doposud neměly pohlavní styk (a tudíţ se s HPV pravděpodobně doposud nesetkaly; u mladé - sexuálně aktivní dívčí populace lze HPV diagnostikovat aţ v 30% případů). Existuje moţnost rozšířit očkování i na starší ţeny, které rovněţ dosud neměly pohlavní styk, nebo byly po delší dobu sexuálně zdrţenlivé. Nicméně uvaţuje se, ţe některé vakcíny by mohly mít i přímý "terapeutický efekt", kdy by i očkování sexuálně aktivní populace mohlo přinášet přínosné účinky. Ačkoliv se mluví většinou pouze o očkování ţen, u vakcín pokrývajících i spektrum subtypů HPV 6 a 11 (subtypy asociované se vznikem genitálových bradavic) by mělo jistě smysl očkovat i muţskou populaci. Nicméně tato varianta není zajisté tak aktuální jako očkování ţen proti nebezpečným formám, spojených se vznikem karcinomu děloţního čípku. Rovněţ je třeba si uvědomit, ţe karcinom děloţního čípku je problémem především rozvojových zemí (odkud pochází aţ 80% případů tohoto onemocnění), ve kterých je zavádění plošného očkování většinou problematické, nejen z finančních důvodů (a finanční náklady na očkování proti HPV jsou stále poměrně vysoké). Virus Ebsteina-Barrové (EBV) Viry > dsDNA viry > Herpesviridae > Gammaherpesvirinae > Lymphocryptovirus Patří mezi Herpesviry. Je znám jako původce infekční mononukleózy i jako virus spojený se vznikem řady nádorových onemocnění. Jedná se především o Burkittův lymfom, nazofaryngeální karcinom, různé Hodgkinovy i nehodgkinské nádory a snad i o některé nediferencované karcinomy ţaludku. Největší afinitu má EB virus k epiteliálním buňkám orofaryngu a B lymfocytům (méně pak i k T lymfocytům a NK buňkám). Do B lymfocytů proniká virus díky povrchové molekule CD21; replikuje se a způsobuje latentní infekci, kdy ve formě epizomů přetrvává v B lymfocytech (podle odhadů má tuto latentní infekci aţ 90% populace v ČR). Transformační účinek EB viru je komplexní a není přímo spojený s inaktivací tumor-supresorových genů jako transformace HPV. Zahrnuje interakci řady virových proteinů s buněčnými molekulami, které vedou k immortalizaci a k transformaci infikovaných buněk. Jmenujme alespoň aktivaci cyklinu D2 (člen rodiny SRC proteinů, aktivuje přechod buňky z G0 do G1 fáze), aktivaci antiapoptotického bcl-2 proteinu a aktivaci některých růstových faktorů (IL-6 a 10). Podobně jako u infekcí HPV nestačí samotná infekce k dokončení maligní transformace infikované buňky. Burkittův lymfom je nádor z B lymfocytů, vyskytující se nejčastěji ve střední Africe a na Nové Guinei, kde tvoří nejčastější dětské nádorové onemocnění. Jedná se o první lidské nádorové onemocnění, u kterého byla prokázána souvislost s virovou infekcí. Nacházíme zde jednu z nejznámějších chromozomových přestaveb u nádorových onemocnění a to sice translokaci mezi osmým a čtrnáctým chromozomem t(8;14). Při bliţším průzkumu zjistíme, ţe při této translokaci je buněčný protoonkogen c-myc z 8. chromozomu přemístěn na chromozom č. 14, kde se dostává pod vliv aktivního promotoru genu pro těţký imunoglobulinový řetězec. Tato varianta chromozomální aberace se nachází přibliţně v 75% případů; u zbylých přestaveb nacházíme zejména translokace t(2;8) a t(8;22), kde je c-myc přemístěn k promotoru genu pro kappa (respektive lambda) lehký řetězec imunoglobulinu. Endemický i sporadický (mimo Afriku se vyskytující) Burkittův lymfom je často spojován s některou z těchto chromozomálních přestaveb. Aţ u 90% případů endemické varianty rovněţ nacházíme genom EB viru, naopak u sporadického Burkittova lymfomu je genom EB viru identifikován sotva ve 20% případů. Zdá se, ţe existuje spojitost mezi výskytem malárie v endemických oblastech střední Afriky a zvýšenou transformační schopností EBV infekce. Uvaţuje se o určité "vyčerpanosti" imunitního systému malárií, díky které dostávají nesmrtelné a proliferačně aktivnější lymfocyty selekční výhodu. V případě nazofaryngeálního karcinomu nacházíme genom EB viru údajně ve 100% případů. Tato infekce je endemická v oblasti jiţní Číny a v některých afrických a arktických oblastech (sporadicky se vyskytuje celosvětově). Viry hepatitidy B a C (HBV, HCV) Viry > dsDNA Retroviry > Hepadnaviridae > Orthohepadnavirus (HBV) Viry > ssRNA+ Viry > Flaviviridae > Hepacivirus (HCV) Ačkoliv jsou taxonomicky odlišné (HBV = DNA virus; HCV = RNA virus), jelikoţ oba způsobují určitou formu virové hepatitidy a u obou je uvaţována spojitost se vzniku karcinomu jater, budou popsány spolu. U HBV existuje mnohem silnější podezření z transformačního účinku infekce neţ u HCV. Úloha HBV v procesu maligní transformace není stále zcela zřejmá, nicméně genom viru je izolovatelný z nádorových buněk téměř ve všech případech karcinomu jater spojeného s HBV infekcí. Podobně jako u infekcí HPV - i zde nacházíme genom viru integrovaný v genomu buněk (na stejném místě, coţ odpovídá klonální expanzi transformované buňky). Dále jmenujme účinek virového Hbx proteinu, který ovlivňuje transkripci určitých buněčných genů (většinou jde o geny, jejichţ produkty podporují buněčnou proliferaci) a můţe interagovat i s p53 proteinem. Transformace HBV virem je však pravděpodobně nepřímá a celkově multifaktoriální. V případě HCV je transformační účinek podpořen pouze výsledky epidemiologických studií, z transformovaných buněk jeho genom izolován nebyl. U virových hepatitid typu C je obecně zvýšená proliferační-regenerační aktivita jaterních buněk, coţ je často dáváno do spojitostí s moţným transformačním účinkem HCV infekce. Pravděpodobně se zde rovněţ uplatňuje multifaktoriální vliv - často zmiňovaný je například synergizmus HBV - HBC - aflatoxiny. V případě HBV je třeba zmínit se o existenci účinné očkovací látky, která spolehlivě chrání před HBV infekcí a tím i před karcinomem jater touto infekcí způsobeným. Jedná se o první "protinádorovou" očkovací látku na světě. Virus lidské T - buněčné leukémie (HTLV-1, HTLV-2) Viry > ssRNA Retroviry > Retroviridae > Orthoretrovirinae > Deltaretrovirus V obecné části byla uvedena řada retrovirů s prokazatelným onkogenním účinkem, ovšem pouze virus lidské T - buněčné leukémie (lymfomu) je spojen s častějším transformačním účinkem u lidí. Jako první byla identifikována HTLV-1 forma z koţního lymfomu; HTLV-2 forma byla identifikována později v Japonsku z vlasatobuněčné leukémie. Endemickými místy infekce je oblast jiţního Japonska, dále karibská oblast a některé oblasti Afriky. Ve zbylých oblastech světa je výskyt sporadický (v Evropě byla infekce diagnostikována pouze u imigrantů). Jedná se o klasický retrovirus, jehoţ transformační aktivita je pravděpodobně zaloţena na účincích virového TAX proteinu (produkt virového TAX genu). Mezi tyto účinky patří inaktivace p16 proteinu, aktivace D2 cyklinu, zvýšení exprese některých buněčných genů podporujících proliferaci a sníţení stability buněčného genomu. Tento retrovirus tedy neobsahuje onkogen, nýbrţ podobně jako u DNA virů je onkogenní aktivita viru způsobena účinkem virového proteinu. Lidský herpes virus 8 = virus Kaposiho sarkomu (KSHV) Viry > dsDNA viry > Herpesviridae > Gammaherpesvirinae > Rhadinovirus Jedná se o herpesvirus, který je asociovaný s výskytem Kaposiho sarkomu zejména u jedinců s imunosupresivní léčbou nebo imunodeficitem (v popředí s AIDS). Existují však i endemické (v Africe) či sporadické formy Kaposiho sarkomu. Ačkoliv je genom KSHV izolovatelný téměř ze všech nádorových buněk, existuje stále mnoho nezodpovězených otázek ohledně transformačních mechanizmů. Je téměř jisté, ţe infekce KSHV je sama o sobě nedostatečná k transformaci buňky a je třeba dalších kofaktorů. Zdá se, ţe takovým kofaktorem můţe být například imunosuprese u HIV infekce, či samotná infekce HIV (potom se ovšem nabízí otázka, co je oním kofaktorem u HIV negativních jedinců s Kaposiho sarkomem). Jako moţné transformační mechanizmy KSHV je uváděn homolog cyklinu D virového původu a různé inaktivátory p53 proteinu. Další onkogenní viry V této kapitole uvedu několik virů, u nichţ není přímý onkogenní účinek prokázán, uvádějí se však jako "kofaktory" transformační aktivity jiných virů. Nicméně i klasifikace viru jako nádorového kofaktoru je problematická, neboť se většinou jedná o viry, u kterých nelze přímý onkogenní účinek prokázat a jsou uváděny spíše z hlediska "setrvačnosti" některých autorů, i kdyţ přímý onkogenní účinek je jiţ přisuzován jinému viru. Na pomyslných stranách hranice mezi onkogenními viry a jejich kofaktory tvoří HCV, u nějţ se nyní autoři přiklánějí k přímému účinku a HIV, u kterého se spíše počítá s nepřímým účinkem navozením imunodeficitu - viz dále. Na závěr této kapitoly se krátce zmíním i o problematice zvířecích onkogenních virů. Virus lidského imunodeficitu (HIV) Viry > ssRNA Retroviry > Retroviridae > Orthoretrovirinae > Lentivirus Tento retrovirus je znám jako původce AIDS u lidí. Tento syndrom je spojený i s výskytem určitých nádorových onemocnění (jde například o Kaposiho sarkom, některé nehodgkinské B-lymfomy a karcinomy děloţního čípku či rekta). Přesto se zdá, ţe přímý onkogenní potenciál HIV nemá a za transformaci jsou odpovědné jiné viry (KSHV, EBV respektive HPV), přičemţ HIV pouze "usnadňuje práci" navozením imunodeficitu. Virus Herpes simplex typ II (HSV-2) Viry > dsDNA Viry > Herpesviridae > Alphaherpesvirinae > Simplexvirus U tohoto viru se předpokládala asociace s karcinomem děloţního čípku, kde měl působit jako kofaktor HPV. Pravděpodobně je to však pouze HPV, který má přímou transformační aktivitu. Lidský Cytomegalovirus (HCMV) Viry > dsDNA Viry > Herpesviridae > Betaherpesvirinae Zde se předpokládal pomocný účinek při vzniku Kaposiho sarkomu (a rovněţ karcinomu čípku děloţního). Momentálně se hlavní úloha při vzniku Kaposiho sarkomu přisuzuje KSHV. Onkogenní viry u zvířat Virů s prokazatelným onkogenním účinkem je celá řada, tato práce je však psána s ohledem na lékařskou mikrobiologii, a proto zde byly rozebrány pouze nejvýznamnější viry z hlediska lidské medicíny. Pokud budeme zjišťovat i onkogenní potenciál některých virů na zvířecích modelech, dojdeme k dalším rozsáhlým objevům a závěrům. Pro zajímavost se odvolávám na výčet rychle transformujících retrovirů v obecné části této práce, dále vzpomeňme různé adenoviry, které mají u zvířat vysokou transformační aktivitu. Onkogenně u zvířat působí i některé polyomaviry, včetně lidského polyomaviru JC. 4. Molekulární genetika 1) Nukleové kyseliny Nukleové kyseliny jsou nositelkami dědičné informace. Díky nim dochází k přenosu dědičných znaků na potomstvo a k evoluci. Jejich nejdůleţitější vlastností je schopnost replikace. Nukleové kyseliny se skládají z mnoha stavebních jednotek - nukleotidů, patří tedy mezi tzv. biopolymery. Nukleotidy se skládají z pětiuhlíkatého cukru (pentózy), zbytku kys. fosforečné (H3PO4) a dusíkatých bází. Na cukr se váţe v pozici 5' onen zbytek kys. fosforečné (esterová vazba) a v pozici 1' N-báze (N-glykosidická vazba). V poloze 3' je pak pentóza připojena přez sousední zbytek kyseliny k sousední pentóze. Vzniká polynukleotidové vlákno. O konkrétních zástupkyních nukleových kyselin, tedy o DNA a RNA se více dočtete v jednotlivých kapitolách. 2) DNA DNA, neboli kyselina deoxyribonukleová. Její molekula je tvořena dvěma polynukleotidovými řetězci (přitom jeden řetězec má směr fosfodiesterových vazeb 5' » 3' a druhý 3' » 5' => hovoříme o 3' případně 5' konci). Její cukerná sloţka je 5C cukr 2-deoxy-D-ribóza (oproti normální ribóze jí v poloze 2' chybí kyslík ). Jakoţto dusíkaté báze jsou zastoupeny deriváty purinu (Adenin, Guanin) a pyrimidinu (Cytosin,Thymin). Mezi N-bázemi protějších vláken dochází k vazebným interakcím. Mluvíme zde o zákonu komplementarity, Spolu se váţí vţdy jen 2 specifické N-báze (vţdy 1 báze pyrimidinová a 1 purinová) a to sice Adenin a Thymin (spojeny 2 vodíkovými můstky) a Cytosinem a Guaninem (3 vodíkové můstky). Z toho plyne, ţe platí tato rovnice (A+C)/(T+G)=1, naopak (A+T)/(C+G) bývá asi 0,25 - 0,75. Mezi sousedními bázemi navíc působí van der Waalsovy síly (pomáhají k celkové stabilitě molekuly). Obě polynukleotidová vlákna (primární struktura DNA) vytváří (nejčastěji) pravotočivou šroubovici označovanou jako double helix (sekundární struktura DNA). Jako denaturaci DNA označujeme jev, kdy dojde (např. zvýšenou teplotou, extrémním pH...) k oddělení obou vláken od sebe. Nejde přitom o permanentní oddělení - vlákna se mohou opět připojit k sobě (nebo se mohou spojit s jiným komplementárním vláknem) - to označujeme jako hybridizaci. Hybridazace nachází vyuţití v metodách molekulárně genetické diagnózy nebo metodách rekombinantní DNA. V eukaryotní buňce existuje ještě nadstavbová struktura DNA v komplexu s bílkovinami - vizte kapitolu o stavbě chromozomů. Replikace DNA Jak jiţ bylo řečeno, právě replikace DNA je schopnost zajišťující dědičnost. Pro rozmnoţování je nezbytné, aby potomek dostal plnohodnotnou genetickou informaci. Při replikaci vzniknou z jedné mateřské molekuly DNA dvě naprosto stejné DNA dceřiné (kaţdá s jedním vláknem z původní DNA). Klíčovou roli při replikaci DNA mají enzymy (DNA polymerázy). U člověka se vyskytuje 5 druhů enzymů označované jako DNA dependentní DNA polymerázy. Při své práci vţdy postupují od konce 5' ke konci 3'. Aby DNA polymeráza mohla zahájit připojování nukleotidů nového vlákna DNA, musí být vodíkové můstky = vazby mezi oběma vlákny nejprve narušeny (vyuţití DNA dependentní RNA polymerázy). Místa, kde tato narušení vzniknou, jsou označovány jako replikační počátky. U bakterií bychom takovýto počátek našli pouze jeden, zatímco mnohem větší lidská DNA vytváří takovýchto počátků okolo 10 000. To jí umoţňuje zreplikovat se také v poměrně krátké době. Poté co jsou k předlohovým (templátovým) vláknům dosyntetizována vlákna nová, je replikace DNA dokončena. DNA 7 polymeráza udělá 1 chybu asi na 10 zreplikovaných bází (teoreticky mohou vznikat i dvojice G-T a A- C, jsou ovšem mnohem méně stabilní), navíc má sama korekční funkci. Replikace DNA je semikonzervativní děj, neboť v obou nově vzniklých DNA je jedno vlákno z původní dvoušroubovice. V eukaryotních buňkách rozlišujeme několik typů DNA polymeráz - (α, β, γ, δ). Vzhledem k tomu, ţe polymerázová aktivita je pouze ve směru od 5' konce ke 3' konci (je důleţité si uvědomit, ţe polymeráza čte matrici - vlákno DNA - ve směru 3' → 5', zatímco syntéza RNA řetězce probíhá ve směru 5' → 3'.) - můţe tímto směrem probíhat replikace pouze na jednom vlákně. Na tomto vláknu probíhá replikace kontinuálně a označujeme je jako vedoucí řetězec. Na druhém řetězci je situace sloţitější. Replikace zde probíhá proti směru rozplétání dvoušroubovice a to diskontinuálně po menších úsecích. Tyto části se nazývají Okazakiho fragmenty a celý řetěz nazýváme opoţďující se řetězec. Takto vzniklé fragmenty napojí k sobě do jednolitého vlákna enzym DNA ligáza. Posledním enzymem, který je nezbytný pro replikaci je DNA primáza. DNA polymeráza totiţ neumí zahájit polymeraci od jediného nukleotidu - proto zde nastupuje právě DNA primáza (coţ je vlastně DNA dependentní RNA polymeráza), která nasyntetizuje krátký úsek RNA - tzv. primer - od kterého uţ můţe DNA polymeráza zahájit polymeraci. Takovýto primer vznikne nejen na vedoucím řetězci, ale musí vzniknout i před kaţdým Okazakiho fragmentem na opoţďujícím se řetězci. Primery jsou posléze vyštěpeny - chybějící úseky dosyntetizovány a vlákno je spojeno DNA ligázou. 3) RNA RNA = kyselina ribonukleová. Její molekula je tvořena jen jedním (není zcela pravda, existují i dvouřetězcové RNA, např. u některých virů) polynukleotidovým vláknem. Sacharidovou sloţku tvoří 5C cukr D-ribóza, N-báze tvoří Adenin, Cytosin, Guanin a Uracil (zařazován místo Thyminu, pyrimidinová báze). RNA (díky OH skupinám v poloze 2' i 3') můţe sama vykonávat i některé enzymatické funkce (štěpení esterové vazby, katalýza polymerace...). Také díky tomu se usuzuje, ţe u prvních praorganismů byla nositelkou genetické informace právě RNA. RNA je narozdíl od DNA nestabilní v alkalickém prostředí. Vyskytují se 3 základní typy RNA: mRNA: messenger RNA neboli informační. Přenáší informaci o pořadí aminokyselin z jádra k místu proteosyntézy. tRNA: transferová RNA. Přináší aminokyseliny na proteosyntetický aparát buňky. Funkčně se na nich rozlišuje několik míst, nejdůleţitější je antikodon se specifickou trojicí bazí (různým antikodonům odpovídají různé aminokyseliny) a místo kde je samotná aminokyselina navázána. rRNA: ribozomální RNA. Tvoří stavební sloţku ribozomálních podjednotek. Vyskytuje se několik velikostně odlišných typů. Více viz kapitoly eukaryota, prokaryota. 4) Transkripce Transkripcí rozumíme přepis genetické informace z DNA do mRNA. Jedná se v drtivé většině o informaci z jednoho genu, slouţící k tvorbě 1 specifické bílkoviny, kterou buňka zrovna potřebuje. Poté, co je informace přepsána, je díky mRNA přenesena na proteosyntetický aparát, kde se podle opsaného pořadí zahájí proteosyntéza. Iniciace a přepis Transkripce je opět enzymatický proces, tentokrát je jako enzym vyuţívána DNA dependentní RNA- polymeráza (U eukaryot rozeznáváme typ I, II a III). Prozkoumávání řetězce má opět směr od konce 5' ke konci 3'. Rna-polymeráza hledá v DNA startovní sekvenci nukleotidů, tzv.promotor (jde o některé specifické sekvence nukleotidů, umístěných v řetězci několik desítek bází před začátkem transkripce - např. TATA [sekvence opakujících se A a T] box nebo CAT [CCAAT] box). Ke správnému navázání polymerázy je nutná přítomnost transkripčních faktorů, které jakoţto další makromolekuly, vytvoří s polymerázou trojrozměrný komplex, který pak zajistí správné nasadnutí polymerázy na sekvenci, od které má být zahájena transkripce. Ačkoli je molekula DNA dvouřetězcová, je promotor asymetrický, z čehoţ plyne, ţe dochází vţdy k přepisu jen z jednoho vlákna (tzv. vlákno pracovní, negativní či antikódující), zatímco druhé vlákno pro transkripci tohoto genu význam nemá (tzv. vlákno paměťové, kódující či pozitivní). Druhé vlákno má samozřejmě zase smysl při transkripci jiných genů. Po rozpoznání promotoru a rozpojování vodíkových můstků se podle komplementarity bází k pracovnímu vláknu DNA nasyntetizuje RNA vlákno (pozor: místo T je U). Jakmile polameráza narazí na stop sekvenci v řetězci (terminátor - specifická sekvence DNA), dojde k zastavení přepisu a uvolněná RNA můţe putovat dále. Regulace transkripce Ačkoli mají buňky vícebuněčného organismu stejnou genetickou informaci - dochází ke tvorbě určitých specifických proteinů pouze v některých tkáních. Tvorba těchto produktů tedy musí být "zapnuta" pouze někde. Pro regulaci tvorby určitých produktů byl vyvinut mechanizmus regulace exprese. Tato regulace můţe být na úrovni transkripce, translace i sestřihových úprav. Co se týče regulace transkripce u eukaryot - je ovlivněna dvěma typy molekul, které se váţí na specifické úseky DNA (často několik tisíc bazí před regulovaným genem) a podílí se svojí strukturou na vzniku transkripčního komplexu s RNA polymerázou (nebo naopak znemoţňují jeho vznik). Podle funkce dělíme tyto faktory na enchancery (podporují transkripci) a silencery (utlumují transkripci). Posttranskripční úpravy U bakterií a prokaryot obecně k ţádným posttranskripčním úpravám mRNA nedochází. Zato u eukaryotních buněk je situace značně sloţitější. Primární transkript prochází tzv. sestřihem, kdy jsou z něj odstraněny nekódující sekvence. Lasovitým stáčením primárního transkriptu dochází k odstřiţení intronů (části řetězce nekódující ţádné aminokyseliny) Kódující úseky (exony) jsou pak pospojovány do finálního řetězce. Opět se zde uplatňují specifické sekvence, které označují hranice mezi introny a exony. Odstřiţené introny jsou ihned odbourávány. Primární transkript je na 5' konci vybaven tzv. čepičkou vytvořenou zvláštním nukleotidem (7-methylguanosin, připojený třemi zbytky kyseliny fosforečné) a na opačném 3' konci je vybaven tzv. polyadenilovým koncem (několik set adeninových zbytků). 5) Translace Translace je vlastně přenos genetického kódu mRNA do pořadí aminokyselin v polypeptidovém vláknu. K proteosyntéze (tj. biosyntéze bílkovin) dochází na ribozómech (stavba eukaryotního ribozomu - vizte ribozomy). Kromě mRNA vzniklých transkripcí jsou zapotřebí i tRNA z cytoplazmy. Základní popis platí pro eukaryotní buňky, zvláštnosti prokaryot a virů jsou probrány v příslušných kapitolách. Genetický kód Po řadě pokusů bylo dokázáno, ţe genetický kód je tripletový, to znamená, ţe kaţdá trojice bází kóduje jednu aminokyselinu. Tyto trojúseky na mRNA se nazývají kodony. Celkem jsou 4 báze, takţe pro kombinaci máme celkem 4x4x4=64 moţností. Důleţitý je triplet AUG, neboť jde o triplet iniciační (zároveň kóduje methionin) a triplety UAA, UAG a UGA, které jsou označovány jako tripletety terminační, neboli beze smyslu. Genetický kód je degenerovaný, protoţe pro asi 20 aminokyselin existuje mnohem více kódujících kodonů, z toho plyne, ţe některé aminokyseliny jsou kódované více triplety. Na druhou stranu tento genetický kód je platný pro všechny organismy na Zemi (existují ale i výjimky - např. u genetického kódu lidských mitochondrií). Tato degenerace má své výhody - například pokud dojde k bodové mutaci (substituci) na třetí pozici kodonu - je ve většině případů zařazena stejná aminokyselina. Tabulka genetického kódu Tabulka určuje druh aminokyseliny, který je při proteosyntéze přinesen pomocí tRNA na ribozóm. Určující je pořadí nukleotidů v tripletu na mRNA, kaţdému odpovídá nějaká aminokyselina. Některé aminokyseliny jsou kódovány více neţ jednou moţností. Speciální význam mají triplety AUG, který zahajuje proteosyntézu a triplety UAA, UAG a UGA, které ji ukončují. Obrázek 1 - Tabulka genetického kódu Proteosyntéza Proteosyntéza je zahájena iniciační tRNA, to jest tou, která nese methionin. Ta se naváţe na malou ribozomální podjednotku a začne pomalu projíţdět molekulu mRNA od 5' konce. Jakmile objeví iniciační sekvenci AUG - naváţe se a translace začíná. Na další sekvence (kodony) nasedají další tRNA podle komplementarity bází (systém kodon na mRNA - antikodon na tRNA). Mezi přinesenými aminokyselinami vznikají peptidové vazby. Za tuto část translace - elongaci - je zodpovědná zejména velká ribozomální podjednotka. Jakmile zbývá jiţ jen kodon beze smyslu (terminační) je proteosyntéza ukončena a vzniklé polypeptidové vlákno můţe být dále v buňce upravováno na poţadovanou bílkovinu. Drsné endoplazmatické retikulum (s ribozomy) je specializováno pro tvorbu transmembránových proteinů (různé iontové kanály či receptory) nebo proteinů určených "k zabalení", které se zabudují do vnitřku membrán (sekreční granula, lyzosomy). Naopak volné ribozomy se podílejí především na tvorbě cytoplazmatických proteinů (enzymy, atd.). Posttranslační úpravy Vzniklé polypeptidové vlákno je v buňce samozřejmě dále upravováno, ať jiţ v endoplazmatickém retikulu nebo v Golgiho systému. V endoplazmatickém retikulu je to jiţ výše zmíněné zabudovávání neno "balení" do membrán a zahájení procesu glykosylace. Velké mnoţství proteinů není ve své finalní podobě čistými proteiny, ale tzv. glykoproteiny, coţ jsou proteiny s navázanými řetězci oligosacharidů (vícečetných cukrů). To je velmi důleţité pro finální 3D strukturu výsledného produktu. V Golgiho aparátu je proces gylkosylace jemnějšími prostředky dokončen. Velké mnoţství produktů proteinové povahy nemá biologickou aktivitu, dokud z něj nejsou odštěpeny určité části řetězce. To se můţe dít extra- i intracelulárně. Příkladem budiţ některé trávicí enzymy, které jsou buňkami produkovány v neaktivní formě a jsou aktivovány aţ v patřičné části trávicího traktu, kde jiţ jejich účinek neohroţuje okolní tkáně. 6) Enzymy v genetice a molekulární biologii Enzymy jsou biokatalyzátory a jako takové katalyzují obrovské mnoţství biochemických reakcí. Z hlediska genetiky jsou zajímavé zejména ty enzymy, které katalyzují takové procesy jako je replikace DNA nebo transkripce z DNA do RNA. Z hlediska genetiky klinické jsou potom zajímavé enzymy, jejichţ deficit, způsobený mutací v genetické informaci jedince, je odpovědný za vznik některých dědičných onemocnění. Uvedený seznam není rozhodně vyčerpávající a je pouze ilustrační. Adenosindeamináza Katalyzuje přeměnu z adenosinu na inosin. Její deficit se projeví jako těţká kombinovaná imunodeficience (SCID - Severe Combined ImunoDeficiency) s úbytkem T- i B-lymfocytů. Aminoacyl-tRNA-syntetáza Katalyzuje připojení příslušné aminokyseliny na 3' konec příslušné tRNA (s příslušným antikodonem). A-transferáza Účastní se syntézy aglutinogenu A (krevní skupiny). Připojuje N-acetyl-galaktosamin na antigen H. B-transferáza Účastní se syntézy aglutinogenu B (krevní skupiny). Připojuje D-galaktosu na antigen H. DNA-dependentní DNA-polymerázy Skupina enzymů, které katalyzují polymeraci DNA řetězce, přičemţ jako matrice je vyuţíváno vlákno DNA. Během polymerace postupují pouze od 5' konce ke 3' konci (matrice je čtena opačným směrem) a potřebují mít volný 3' konec předchozího nukleotidu s OH skupinou. Nejdůleţitější funkcí je tedy replikace DNA. Některé typy mají i 5' -> 3' exonukleázovou aktivitu. Rozlišujeme některé prokaryotické a eukaryotické DNA-dependentní DNA- polymerázy Prokaryotické DNA-polymerázy Funkce Typ  polymerázy Vyštěpení RNA primerů na opoţďujícím se řetězci a dosyntetizování Polymeráza I vlákna, reparační funkce Polymeráza II ?? Reparační funkce ?? Polymeráza III Hlavní replikační enzym prokaryot Eukaryotické DNA-polymerázy Typ polymerázy Funkce Polymeráza α Replikace na opoţďujícím se řetězci Polymeráza β Reparační funkce Polymeráza γ Replikace mitochondriální DNA Polymeráza δ Replikace na vedoucím řetězci DNA-dependentní RNA-polymerázy Skupina enzymů, které katalyzují transkripci, tedy přepis z DNA do RNA. Během polymerace postupují pouze od 5' konce ke 3' konci (matrice je čtena opačným směrem). Nevyţadují volný 3' konec. U prokaryot nacházíme pouze jeden typ DNA-dependentní RNA-polymerázy. U eukaryot nacházíme typy tři, které odlišujeme na základě produktů transkripce. Eukaryotické RNA-polymerázy Typ polymerázy Produkt transkripce Polymeráza I 45S pre-RNA (Základ pro 5.8S, 18S a 28S rRNA) Polymeráza II pre-mRNA (všechny) Polymeráza III snRNA, 5S rRNA, 7S RNA, pre-tRNA (všechny) DNA-fotolyáza Účastní se reparace DNA tím, ţe vyštěpuje nukleotidové dimery (např. dimery thyminu). Její aktivita je závislá na světelné energii. Fenylalaninhydroxyláza Katalyzuje přeměnu fenylalaninu na tyrosin. Deficit tohoto enzymu podmiňuje fenylketonurii (viz genetické choroby). Fukosyltransferáza Účastní se syntézy antigenu H tím, ţe přenáší L-fukosu na konec 4-cukerného řetězce. Antigen H je prekurzorem pro vznik antigenů A a B (viz krevní skupiny). Galaktosa-1-fosfáturidyltransferáza Enzym se účastní metabolismu galaktosy (obousměrná přeměna glukosy-1-fosfátu a galaktosy-1-fosfátu). Jeho deficience je příčinou galaktosemie. Glukosa-6-fosfátdehydrogenv Je hlavním ezymem pentosafosfátové metabolické dráhy glukosy. Její deficience se projevuje hemolýzou, zejména po podání určitých léčiv (sulfonamidy, antimalarika) nebo favových bobů (favismus). Helikáza Helikázy jsou schopny rozplétat dvoušroubovici DNA a zpřístupnit tak jednotlivá vlákna dalším enzymům (účastní se tak například replikace DNA). Ligáza Ligáza je enzym napojující nespojené konce nukleové kyseliny (účastní se tak například spojování Okazakiho fragmentů; velký význam má v genetickém inţenýrství pro konstrukci rekombinantní DNA). Existují DNA- i RNA-ligasy. Methylentetrahydroftolátreduktáza Enzym známý pod zkratkou MTHFR se účastní metabolismu kyseliny listové a přeměny homocysteinu na methionin. U matek s deficitem tohoto enzymu je vyšší riziko narození dítěte s defektem neurální trubice (NTD). Nukleázy Jde o enzymy štěpící nukleové kyseliny. Můţe jít o enzymy s degradační funkcí (trávicí) nebo funkcí reparační (vyštěpování chybných úseků DNA). Podle substrátu rozlišujeme ribonukleázy (RNA) a deoxyribonukleázy (DNA), podle způsobu štěpení pak exonukleázy aendonukleázy. Zvláštní skupinou jsou restrikční endonukleázy - viz níţe. Peptidyltransferázy Katalyzuje vznik peptidové vazby mezi dvěma aminokyselinami během tvorby polypeptidového řetězce na ribozomu. PolyA-polymeráza Připojuje okolo 200 adeninových nukleotidů (poly-A konec) na 3' konec mRNA u eukaryot. Primáza Je to vlastně DNA-dependentní RNA-polymeráza. Jako taková je schopná bez volného 3' konce nasyntetizovat krátký úsek RNA (primer) a od jeho 3' konce jiţ můţe polymeraci provádět příslušná DNA-dependentní DNA-polymeráza. Uplatňuje se při replikaci DNA. Restrikční endonukleázy  Původem bakteriální enzymy mají dnes největší vyuţití v genetickém inţenýrství. Štěpí DNA v určitých specifických sekvencích (často jde o palidromické sekvence) a u bakterií slouţí jako ochrana před cizorodou DNA. Reverzní transkriptáza Je to RNA-dependentní DNA polymeráza. Umoţňuje tedy přepis z RNA do DNA. Jde o enzym typický pro retroviry. Jako DNA-polymeráza potřebuje pro zahájení primer jako zdroj volného 3' konce. RNA-dependentní RNA-polymeráza Jde o enzym negativních RNA virů. Provádí přepis z virové RNA do mRNA, která je vyuţitelná pro syntézu virových proteinů. Topoizomerázy Tyto enzymy pracují s nadšroubovicí DNA, kterou ruší nebo znovu vytvářejí. Za tímto účelem jsou schopny rozpojovat a znovu napojovat vlákna DNA. Tyrozináza Katalyzuje přeměnu tyrozinu na Dopa. Z této metabolické cesty vzniká melanin (pigment), proto deficience tohoto enzymu způsobuje jednu z forem albinizmu. Ribozymy Bylo zjištěno, ţe katalytickou (lépe řečeno autokatalytickou) funkci má i RNA. Taková RNA se označuje jako ribozym. Tento objev je významný z evolučního hlediska, neboť nabízí způsob, jakým docházelo ke katalýze nejdůleţitějších procesů nukleových kyselin bez komplexnějších proteinových enzymů, které musely vzniknout aţ později. Proto se dnes předpokládá, ţe současnému světu DNA organismů