Genetica I PDF - Struttura del DNA e Cromosomi

GENETICA I Giampiero Valè Struttura del DNA e cromosomi. Replicazione del DNA  Eucarioti Dove è localizzata l’informazione genetica? Batteri Virus  STRUTTURA CHIMICA DEGLI ACIDI NUCLEICI DNA E RNA, SONO COSTITUI...

GENETICA I Giampiero Valè Struttura del DNA e cromosomi. Replicazione del DNA  Eucarioti Dove è localizzata l’informazione genetica? Batteri Virus  STRUTTURA CHIMICA DEGLI ACIDI NUCLEICI DNA E RNA, SONO COSTITUITI DA CATENE POLINUCLEOTIDICHE, cioè polimeri lineari di unità monomeriche chiamate nucleotidi; nucleotidi: basi azotate + zucchero+ gruppo fosfato Differenza uracile e timina: CH3 legato al C5 della base Basi azotate e zuccheri degli acidi nucleici IL GRUPPO FOSFATO È SEMPRE LEGATO ALL’ATOMO DI CARBONIO-5′ DELLO ZUCCHERO DEL NUCLEOTIDE Differenza adenina e guanina: NH2 in C6 per adenina e in C2 per guanina Componenti dei nucleotidi I 4 tipi di nucleotidi del DNA I nucleotidi del DNA sono più esattamente noti col nome di desossiribonucleotidi o desossiribonucleosidi 5′-monofosfati. I nucleotidi equivalenti dell’RNA sono chiamati ribonucleotidi o ribonucleosidi 5′- monofosfati. DENOMINAZIONI  STRUTTURA CHIMICA DEI NUCLEOTIDI Il gruppo fosfato dei nucleotidi si trova legato al carbonio 5’, o più raramente al carbonio in 3’ dello zucchero I nucleotidi possono contenere 1 solo gruppo fosfato, oppure 2 o 3 quando non sono inseriti nella catena polinucleotidica STRUTTURA DELLE CATENE POLINUCLEOTIDICHE La catena polinucleotidica consiste di uno scheletro in cui si alternano zuccheri e gruppi fosfato legati da legami 5’-3’ fosfodiesterici Il legame fosfodiesterico conferisce una polarità alla catena polinucleotidica La polarità 5’ -3’ delle catene polinucleotidiche è importante per le reazioni di replicazione, trascrizione e traduzione e anche per la maturazione e degradazione degli acidi nucleici Per convenzione le sequenze degli acidi nucleici si scrivono in direzione 5’ a 3’ STRUTTURA DEL DNA: STUDI PRELIMINARI DI CHARGAFF STRUTTURA DEL DNA: STUDI PRELIMINARI DI ROSALIND FRANKLIN E MAURICE WILKINS Diffrazione dei raggi X Spettro di diffrazione dei raggi X Il modello messo a punto da Watson e Crick indicava che il DNA era composto da due filamenti di nucleotidi orientati in direzione opposta (sono detti antiparalleli) che si avvolgono l’uno attorno all’altro per formare UN’ELICA DESTRORSA, con zuccheri e fosfati all’esterno e le basi verso l’interno STRUTTURA SECONDARIA DEL DNA A DOPPIA ELICA DI WATSON E CRICK BASATO SUI DATI DI DIFFRAZIONE AI RAGGI X 5’ 3’ 3’ 5’ STRUTTURE ALTERNATIVE DEL DNA Forma B: in soluzione acquosa e condizioni di alta umidità; è quella proposta da Watson e Crick; circa 10 bp per ogni rotazione di 360° dell’elica Forma A: poca acqua, elica destrorsa; 11 coppie di basi per giro dell’elica; passo elica 2,5 nm e diametro 2,3 nm; coppie di basi con > angolatura rispetto al piano dell’asse della doppia elica; si può trovare in vivo in duplex di RNA e in ibridi (eteroduplex) di DNA e RNA. Forma Z: elica sinistrorsa; passo elica 4,6 nm e diametro 1,8 nm (quindi più allungata della B). Una piccola percentuale del DNA delle cellule si trova nella forma Z. Sono state isolate proteine che si legano specificamente a tratti di DNA Z Il DNA Z è generato da un cambiamento di orientamento del legame glucosidico tra guanina e desossiribosio Nella forma B, lo zucchero e la base sono sempre presenti nella conformazione anti Base (G) legata al C Nella forma Z, lo zucchero e la base 1’ dello zucchero; sono presenti anche nella legame glicosilico conformazione syn. La forma a zig-zag, da cui deriva in nome Z, si deve alla alternanza di conformazioni syn e anti di nucleotidi contigui STRUTTURE SPECIALI CHE SI POSSONO FORMARE NEL DNA E NELL’RNA Triplex o H-DNA Il DNA deve essere impacchettato per essere contenuto nella cellula: E.coli: unica molecola di DNA di circa 4,6 x 106 pb, se disteso sarebbe 1000 volte più lungo della cellula Cellule umane: 3 x 109 pb; se disteso avrebbe lunghezza > 2 metri La maggior parte del DNA è superavvolto negativamente; questo facilita: i) la separazione dei filamenti durante la replicazione e la trascrizione; ii) l’impacchettamento in uno spazio più piccolo IL SUPERAVVOLGIMENTO È UN TIPO DI STRUTTURA TERZIARIA DEL DNA Impacchettamento del cromosoma batterico avviene grazie a proteine In una cellula batterica il DNA appare spesso come una massa definita, il nucleoide, isolato in una precisa regione del citoplasma; il nucleoide di E coli è composto per 80% da DNA e 20% da proteine e RNA Superavvolgimenti negativi = il DNA è avvolto intorno al suo asse in direzione opposta a quella della doppia elica destrorsa L’intero chr di E coli è constituito da un’unica molecola di DNA organizzata in circa un centinaio di anse della lunghezza media di circa 40 Kb. Ogni ansa è ancorata a una struttura proteica Il DNA eucariote è strettamente associato a proteine in una combinazione chiamata cromatina Eucromatina: durante il ciclo cellulare subisce i normali processi di condensazione e decondensazione; Eterocromatina: permane in una condizione di elevata condensazione anche durante l’interfase Componente peptidica più abbondante della cromatina sono gli istoni, proteine di piccole dimensioni, cariche positivamente; di cinque tipi fondamentali: H1, H2A, H2B, H3 e H4. Carica positiva netta che deriva dalla percentuale elevata di Arg e Lys,carichi positivamente. Le cariche positive attraggono le cariche negative presenti sui gruppi fosfato del DNA  Dimensioni dei cromosomi nell’uomo Mb metafase-interfase Cromosoma 1 Cromosoma 21 Istoni IL NUCLEOSOMA STRUTTURA TERZIARIA DEL DNA 145-147 pb 30-40 pb L’H1 SI LEGA A 20-22 PAIA DI BASI DI DNA NEI PUNTI IN CUI IL DNA SI UNISCE E SI SEPARA DALL’OTTAMERO 20.000-100.000 pb 20.000-100.000 pb anse costituite da fibre di 30 nm, CIASCUNA ANCORATA ALLA SUA struttura che si osserva in metafase: BASE PER MEZZO DI singoli cromatidi con una larghezza di circa 700 nm «coda» flessibile, che contiene da 11 a 37 amminoacidi (+ Arg e Lys) e si protende all’esterno. le code dei nucleosomi possono inoltre interagire con i nucleosomi vicini, il che favorisce la loro compattazione reciproca L’isolamento di nucleosomi mediante trattamento con nucleasi consente di evidenziare la struttura del nucleosoma modello tridimensionale del nucleo centrale o core, che consiste di due copie ciascuna di H2A, H2B, H3 e H4, intorno alle quali si avvolge il DNA (bianco) La struttura della cromatina cambia in relazione alla attività genica: prove della sensibilità alla DNasi I La struttura del centromero I CENTROMERI SONO IL SITO DI AGGANCIO PER IL CINETOCORE AL QUALE SI ATTACCANO LE FIBRE DEL FUSO. NELLA DROSOPHILA, NELL’ARABIDOPSIS E NELL’UOMO I CENTROMERI COMPRENDONO CENTINAIA DI MIGLIAIA DI PAIA DI BASI. I nucleosomi nei centromeri della maggior parte degli eucarioti possiedono una variante della proteina istonica chiamata CenH3, che prende il posto dell’usuale istone H3. L’istone CenH3 causa un cambiamento nel nucleosoma e nella struttura della cromatina che si ritiene promuovere la formazione del cinetocore e l’aggancio delle fibre del fuso al cromosoma.  La struttura del telomero Sequenze telomeriche: 5’-(A o T)m Gn-3’ m compreso tra 1 e 4; n = o > a 2 Stringa di C o G verso il telomero Stringa di T o A verso il centromero  La struttura del telomero Un filamento ricco in G sporge oltre quello complementare ricco in C telomeri dei mammiferi: il filamento 3′ sporgente ha una lunghezza che va da 50 a 500 nucleotidi Speciali complessi proteici (shelterin) avvolgono la sequenza a singolo filamento ricca in G, proteggendo il telomero dalla degradazione e impedendo alle estremità dei cromosomi di incollarsi fra loro. Le estremità dei chrs lineari sono allungate dalla telomerasi: allunga estremità 3’ del telomero sintetizzando sequenze di 5-8 bp ripetute in tandem centinaia di volte In alcune cellule il singolo filamento sporgente (G-strand) può piegarsi all’indietro e appaiarsi con un tratto corto di DNA a formare una struttura chiamata t-loop (ANSA TELOMERICA). Anche il t-loop protegge le estremità dei telomeri dalla degradazione Le estremità dei telomeri assumono strutture t-loop e D-loop La lunghezza delle ripetizione telomeriche varia da specie a specie Le strutture t-loop e D-loop sono stabilizzate da complessi multiproteici TRF1, TRF2=TTAGGG-repeat binding factors Complesso denominato shelterin (shelter=rifugio) Possibili modelli per la replicazione del DNA Filamenti parentali sono mostrati in rosso, quelli di neosintesi in blu Esperimento di Meselson e Stahl (1958)  CHIMICA DELLA SINTESI DEL DNA Elementi necessari: - 4 deossinucleosidi trifosfati (dNTP) - Complesso innesco stampo: DNA a singolo filamento che dirige l’aggiunta dei dNTP complementari alla catena di neo-sintesi NB: la replicazione avviene sempre in direzione 5’ – 3’ Deossiadenosina trifosfato Deossiguanosina trifosfato Deossicitidina trifosfato Deossitimidina trifosfato Il legame fosfodiesterico si forma tra 3’-OH di un deossiribosio con gruppo α-fosfato del dNTP  CHIMICA DELLA SINTESI DEL DNA II La sintesi del DNA inizia mediante un attacco nucleofilo del 3’ OH del deossiribosio al fosfato α del Deossiadenosina trifosfato dNTP Idrolisi del PPi da pirofosfatasi fornisce energia libera addizionale che è il motore per la sintesi del DNA DNA POLIMERASI I L’enzima usa un unico sito attivo per catalizzare l’aggiunta dei 4 dNTP: verifica la capacità del nucleotide che deve essere aggiunto di formare le coppie aventi un ingombro sterico identico (A-T o G-C), piuttosto che verificare la correttezza del nucleotide che entra nel sito attivo NB: DISCRIMINA TRA DEOSSI E RIBONUCLEOSIDI TRIFOSFATO, QUESTI ULTIMI SONO INCORPORATI A VELOCITÀ 1000 VOLTE INFERIORI ANCHE SE SONO 10 VOLTE PIÙ CONCENTRATI SITO ATTIVO DNA POLIMERASI I PROCESSIVITA’: legame iniziale innesco-stampo richiede 1 sec; aggiunta nucleotidi richiede millisecondi ERRORI: in media 1 nucleotide non corretto ogni 105 nucleotidi incorporati; attività di correzione esonucleasica di molte DNA polimerasi riduce errori a 1 ogni 107 MODELLO MOLECOLARE DELLA REPLICAZIONE: LA FORCA REPLICATIVA Perché la neosintesi abbia inizio sono richiesti 2 requisiti: 1) Un priming alla elica del DNA che è fornito da un primer a RNA; 2) Una origine di replicazione: nel DNA delle cellule eucariote sono presenti diverse origini di replicazione Nella cellula, entrambi i filamenti della doppia elica sono replicati contemporaneamente; i due filamenti si devono quindi separare ed il punto in cui si separano è detto forca replicativa LA REPLICAZIONE CONTINUA E DISCONTINUA Il filamento stampo che è esposto in direzione 3′ → 5′ permeEe che il nuovo filamento venga sintetizzato in conFnuazione nella direzione 5′ → 3′; il nuovo filamento, che è soggetto a replicazione continua, è chiamato filamento guida o, in inglese, leading Il filamento stampo che è esposto in direzione 5′ → 3′ guida la sintesi del nuovo filamento in modo discontinuo, sempre nella direzione 5′ → 3′; il nuovo filamento, che è soggetto a replicazione discontinua, è chiamato filamento ritardato o, in inglese, lagging I brevi tratti di DNA prodotti dalla replicazione discontinua dei filamenti lagging sono chiamati frammenti di Okazaki LA REPLICAZIONE CONTINUA E DISCONTINUA REPLICAZIONE SUL LAGGING E ELIMINAZIONE DELLE INTERRUZIONI Primasi (RNA polimerasi nei procarioti, DNA polimerasi α negli eucarioti) permette la formazione di corti primer di RNA detti inneschi, fornisce inneschi sui filamenti che vengono poi allungati fino a raggiungere il 5’ del precedente tratto di DNA già sintetizzato Affinchè la replicazione sia completa i primer di RNA devono essere eliminati e rimpiazzati con deossinucleotidi; negli eucarioti questo è fatto da RNA-H (H indica ibrido RNA-DNA), che lascia uno spazio (gap) a singolo filamento che viene successivamente riempito da una DNA polimerasi. Nei procarioti, la rimozione del RNA e riempimento dei gap è fatto dalla DNA polimerasi I. Dopo la azione della DNA polimerasi, le risultanti interruzioni (nick) di un legame fosfodiesterico tra il terminale 3’-OH e quello 5’-fosfato vengono eliminate da una DNA ligasi che usa ATP come fonte di energia per creare il legame fosfodiesterico. Solo dopo che tutti i primer sono stati rimpiazzati e i nick saldati la sintesi del DNA è stata completata. In una molecola di DNA circolare, quando la nuova elica ha compiuto un giro completo la sua estremità 3′-OH libera si trova subito davanti al primer. Dopo che il primer è stato rimosso, i nucleotidi di DNA di sostituzione possono quindi essere aggiunti a questo gruppo 3′-OH. IL PROBLEMA DELLA REPLICAZIONE ALLA ESTREMITA’ DEI CROMOSOMI Nei cromosomi lineari con origini multiple di replicazione, l’allungamento del DNA nei repliconi adiacenti fornisce anche un gruppo 3′-OH davanti a ogni primer, tranne uno; Infatti, dopo che il primer all’estremità 3′ del cromosoma è stato rimosso, non c’è un altro replicone adiacente da usare come innesco per completare la replicazione Telomerasi è una ribonucleoproteina. Ha 2 componenti: 1) una proteina chiamata TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) che agisce come una trascrittasi inversa (sintetizza DNA da uno stampo a RNA); 2) una molecola RNA stampo chiamata TERC Telomerase RNA component). L’ENZIMA TELOMERASI E’ RESPONSABILE DELLA REPLICAZIONE DELLE ESTREMITA’ DEL CROMOSOMA una DNA polimerasi α-primasi sintetizza un primer di RNA sull’estremità 5′ dello stampo esteso (ricco di G) ed avendo a disposizione uno stampo più lungo copia il filamento sporgente in 3’ esteso dalla telomerasi INIZIO DELLA REPLICAZIONE IN E. coli 13bp: ricca in AT Quindi in ori C ci sono sequenze di legame per DnaA-ATP; dopo il legame di queste e apertura dell’elica nella regione 13 bp, interviene DNA elicasi DNA elicasi: queste si legano e si spostano lungo il singolo filamento usando energia fornita da idrolisi di ATP per denaturare la doppia elica sono proteine esameriche che assumono conformazione ad anello REPLICAZIONE BATTERICA: INIZIO Il cromosoma circolare di E. coli ha una sola origine di replicazione (oriC)  REPLICAZIONE BATTERICA: SVOLGIMENTO Un gruppo di antibiotici, chiamati 4-chinoloni, uccide i batteri legandosi alla loro DNA girasi e inibendo la sua azione  REPLICAZIONE BATTERICA: ALLUNGAMENTO primasi, sintetizza brevi tratti di nucleotidi di RNA (lunghi circa 10-12 nucleotidi), detti primer, che forniscono un gruppo 3′-OH al quale la DNA polimerasi può attaccare i nucleotidi di DNA La terminazione della replicazione di E. coli è controllata da ripetizioni di brevi sequenze di 23 bp chiamata TER, posizionate a circa 180° rispetto a oriC e legate da una proteina chiamata TBP (TER binding protein).  DNA POLIMERASI DI E. COLI E coli: 5 DNA pol; Due di queste, la DNA polimerasi I e la III, effettuano la sintesi del DNA nella replicazione; le altre tre svolgono funzioni particolari nella riparazione del DNA. La DNA polimerasi I ha una minore affinità per l’elica stampo rispetto alla DNA polimerasi III. La sua funzione principale sembra infatti essere la rimozione e la sostituzione dei primer DNA polimerasi III è un grande complesso multiproteico. L’elevata affinità della DNA polimerasi III all’elica stampo è garantita da un polipeptide che fa parte dell’enzima e che svolge la funzione di pinza per l’enzima: DNA clamp o sliding clamp, la mantiene attaccata al filamento stampo durante la replicazione. LA DNA LIGASI SALDA L’ULTIMA INTERRUZIONE LASCIATA DALLA DNA POLIMERASI I NEL NUOVO FILAMENTO DI DNA ENZIMI COINVOLTI NELLA REPLICAZIONE DEL DNA BATTERICO DIFFERENZE PRINCIPALI DELLA REPLICAZIONE DEL DNA NELLE CELLULE EUCARIOTI RISPETTO AI PROCARIOTI DIMENSIONI MAGGIORI DEI GENOMI EUCARIOTI SITI DI ORIGINE DELLA REPLICAZIONE MULTIPLI CROMOSOMI LINEARI IL DNA STAMPO è ASSOCIATO ALLE PROTEINE ISTONICHE SOTTO FORMA DI NUCLEOSOMI Nei cromosomi degli eucarioti sono presenti molteplici origini di replicazione lungo il cromosoma 50000-60000 bp/minuto: 20-30 minuti 3000 bp/minuto, ma fase S è di 8-10 ore  I siti di origine negli eucarioti Le sequenze dei siti di origine della replicazione variano notevolmente nei differenti organismi eucarioti, anche se normalmente contengono molte paia di basi A-T. Un complesso multiproteico, il complesso di riconoscimento dell’origine (ORC), si lega all’origine e svolge il DNA in quella regione. L’autorizzazione della replicazione del DNA I siti di origine devono essere «approvati» per la replicazione, un processo che avviene all’inizio del ciclo cellulare. Un fattore di autorizzazione eucariote è il complesso chiamato MCM (minichromosome maintenance) che contiene una DNA elicasi in grado di svolgere un breve tratto di DNA all’inizio della replicazione. Dopo che la replicazione ha avuto inizio a livello di un’origine, una proteina detta geminina impedisce all’MCM di legarsi al DNA e di far partire un’ulteriore replicazione da quell’origine. Al termine della mitosi la geminina si degrada permettendo all’MCM di legarsi ancora al DNA e di autorizzare nuovamente l’origine. Lo srotolamento Nelle cellule eucarioti sono state isolate numerose elicasi che separano il doppio filamento del DNA, e così pure delle proteine che si legano al singolo filamento, e topoisomerasi, che svolgono una funzione equivalente alla DNA girasi nelle cellule batteriche. L’assemblaggio dei nucleosomi Nella replicazione, la struttura cromatinica viene disgregata dall’avanzare della forcella di replicazione, ma i nucleosomi si riformano immediatamente sulle due nuove molecole di DNA. Il riassemblaggio dei nucleosomi durante la replicazione è facilitato da proteine chiamate chaperoni istonici, che sono associate all’enzima elicasi che svolge il DNA. DNA polimerasi eucarioti DNA polimerasi α: svolge un’attività primasica e inizia la sintesi del DNA nucleare sintetizzando un primer di RNA, seguito da una breve sequenza di nucleotidi del DNA DNA polimerasi δ: porta a termine la replicazione sul filamento lagging DNA polimerasi ε: simile per struttura e funzione alla DNA polimerasi δ, replica invece il filamento leading Altre DNA polimerasi: presentano un grado di fedeltà più basso ma sono in grado di superare regioni in cui il DNA stampo è alterato: DNA polimerasi translesione