Genetica I PDF - Giampiero Valè

GENETICA I Giampiero Valè Processo della traduzione Codice genetico e sue caratteristiche  Gli aminoacidi Neutro, non polare Neutro, polare Neutro, non polare basici...

GENETICA I Giampiero Valè Processo della traduzione Codice genetico e sue caratteristiche  Gli aminoacidi Neutro, non polare Neutro, polare Neutro, non polare basici acidi L’unione di aminoacidi e la loro interazione forma proteine con varie strutture  Foglietto-beta Ad ogni giro completo dell'elica vengono coinvolti 3,6 amminoacidi. Le α eliche possono essere destrorse o sinistrorse anche se le seconde rappresentano rare eccezioni. Ogni giro d'elica è unito a quelli adiacenti da tre o quattro legami idrogeno tra i gruppi –NH (aminici) e – CO (carbossilici) di aminoacidi vicini sulla catena interazioni a lunga distanza: sono il legame ad idrogeno, le interazioni ioniche, le interazioni dipolo-dipolo (attrazione elettrostatica tra 2 molecole con carica diversa). In alcune proteine sono presenti anche dei ponti disolfuro IL CODICE GENETICO È a triplette (codoni); non è sovrapposto; è senza punteggiatura (mRNA è letto in maniera continua); è degenerato ma non ambiguo (più codoni per 1 AA, ma ogni codone 1 solo AA); è quasi universale; esistono codoni di inizio e di fine IL CODICE GENETICO 61 codoni codificanti e 3 codoni non senso (o codoni di stop) Codice degenerato: solo 2 AA, Trp e Met, sono codificati da un solo codone; es 6 codoni per Ser AA con proprietà strutturali simili hanno codoni simili es Asp (GAU, GAC) e Glu (GAA e GAG) Cosa simile per AA aromatici, es Phe (UUU, UUC), Tyr (UAU, UAC), Trp (UGG), tutti iniziano con U Fenomeno del vacillamento Per molti dei codoni che specificano stesso AA le prime 2 basi della tripletta sono costanti mentre la terza può variare, es Pro (CCU, CCC, CCA, CCG) Quando un aminoacil tRNA si allinea a un codone, l’interazione iniziale avviene tra il nt al 5’ del codone con quello al 3’ dell’anticodone, la seconda interazione tra le basi intermedie; una volta che si sono verificati questi 2 appaiamenti è permesso un vacillamento (wobbling) per la terza posizione Se tRNA contiene al terminale 5’ Inosina, quel tRNA può riconoscere 3 codoni diversi  Il codice genetico dei mitocondri Nel codice dei mitocondri umani: UGA non è segnale di stop ma codifica per Trp AUA codifica Met e non Ile AGA e AGG sono segnali di stop e non codificano Arg I 60 rimanenti codoni hanno lo stesso significato nei mitocondri dei mammiferi e negli mRNA nucleari  Il codice genetico dei mitocondri (2) NON ESISTE UN CODICE UNIVERSALE DEI MITOCONDRI: ci sono es differenze nella interpretazione dei codoni tra mitocondri di lievito, umani, di mais ecc (es mitocondri di mais leggono UGA come stop invece che Trp): i sistemi genetici dei mitocondri di specie diverse hanno seguito vie evolutive indipendenti Esigenze di risparmio nel numero di geni che codificano tRNA: 23 tRNA nei mitocondri umani, sufficienti per il riconoscimento delle 60 triplette senso IL CODICE GENETICO DEI CLOROPLASTI NON PRESENTA GROSSE ECCEZIONI ALLA UNIVERSALITA’ DEL CODICE Su 12 genomi PLASTIDICI noti (2008), sono state viste differenze a carico di soli 11 codoni. SCHEMA GENERALE DELLA TRADUZIONE Sito amminoacilico (A); sito peptidilico (P); sito di uscita (E) Struttura e funzione del tRNA Struttura a trifoglio con steli e anse: 1) stelo accettore, stelo di 7-9 bp; al 5’ è presente un gruppo fosfato, mentre al 3’ la sequenza CCA ; è la regione dove si attacca AA trasportato; 2) braccio D, stelo di 3-4 bp che Sono presenti da 1 a 4 termina con ansa di 5-7 basi, diversi tRNA per ciascuno spesso contenente residuo dei 20 aminoacidi modificato diidrouridina; 3) braccio dell’anticodone, stelo di 5 bp che termina con l’ansa che contiene l’anticodone; 4) braccio Stelo T, stelo di 5 bp, che termina con accetore ansa che contiene sequenza TΨC (Ψ=pseudouridina); 5) ansa supplementare tra braccio T e quello dell’anticodone; può Braccio T Braccio D contenere fino a 20 nt e serve a conferire stabilità termodinamica Braccio anticodone allo stato tridimensionale. Caricamento del tRNA Prima tappa: AA e ATP si legano alla aminoacil-tRNA sintetasi specifica; enzima catalizza reazione in cui ATP perde PP e si lega come AMP all’AA per dare aminoacil- AMP Seconda tappa: il tRNA si lega a aminoacil-tRNA Dal pdv chimico, AA lega con sintetasi che trasferisce AA suo gruppo carbossilico l’OH da aminoacil-AMP al tRNA presente in 2’ o 3’ del ribosio rilasciando AMP. La dell’adenosina presente al 3’ molecola di aminoacil-tRNA del tRNA, con rilascio di AMP prodotta si stacca a sua volta NB: aminoacil-tRNA sintetasi, enzima che riconosce specificamente un dall’enzima. solo AA e tutti i tRNA che possono caricare quel AA; qdi, salvo poche eccezioni, esiste una aminoacil-tRNA sintetasi per ogni AA Riconoscimento specifico tra AA e tRNA sintetasi  Attività di proofreading delle tRNA sintetasi NB: Alcuni agenti chimici antifungini lavorano per intrappolare i tRNA nel sito di editing dell’enzima, impedendo il loro rilascio e inibendo perciò il processo di traduzione nei funghi. Ribosomi FASI DELLA SINTESI PROTEICA IN PROCARIOTI E EUCARIOTI  INIZIO DELLA SINTESI PROTEICA: Procarioti sito di legame al ribosoma (RBS) o Sequenza di Shine-Dalgarno (3-10 nt a monte del sito di inizio) complesso di inizio 30S complesso di inizio 70S NB: A questo punto, fMet-tRNAfMet occupa sito P ALLUNGAMENTO NELLA SINTESI PROTEICA Un ribosoma ha tre siti che possono essere occupati dai tRNA; il sito amminoacilico (A); il sito peptidilico (P) e il sito di uscita (E) Un tRNA carico si posiziona al sito A: il fattore di allungamento Tu (EF-Tu) si unisce al GTP e poi si lega a un tRNA carico per formare un complesso che comprende tre componenti. Questo complesso entra nel sito A del ribosoma. Formazione del legame peptidico fra gli amminoacidi attaccati al tRNA nei siti P e A. La formazione di questo legame peptidico libera l’amminoacido dal suo tRNA nel sito P. La formazione del legame peptidico si verifica all’interno del centro peptidil-transferasico Il ribosoma si sposta in modo tale che il tRNA, che in precedenza occupava il sito P, ora passa a occupare il sito E, dal quale entra nel citoplasma, dove può essere ricaricato con un altro amminoacido. Con la traslocazione anche il tRNA che occupava il sito A (che è attaccato alla catena polipeptidica in allungamento) viene ora a trovarsi nel sito P, e lascia libero il sito A.  Formazione del legame peptidico La peptidil transferasi non è un enzima proteico, ma un RNA catalitico (RIBOZIMA) L’attività catalitica è a carico dell’rRNA 23S della subunità 50S TERMINAZIONE DELLA SINTESI PROTEICA La sintesi proteica termina quando il ribosoma raggiunge il codone di stop Si legano al ribosoma proteine chiamate fattori di rilascio; Il legame del fattore di rilascio RF-1 o RF- 2 al sito A del ribosoma promuove il distacco della catena polipeptidica dal tRNA situato nel sito P e il rilascio del polipeptide. Il fattore di rilascio 3 si lega al ribosoma e forma un complesso con il GTP. Questo complesso determina un cambiamento conformazionale nel ribosoma, rilasciando l’RF-1 o l’RF-2 dal sito A e determinando lo spostamento del tRNA nel sito P verso il sito E Una ulteriore funzione di RF3: alcuni ribosomi batterici sono dotati di un tipo di correzione di bozze: contribuisce a determinare la fine della traduzione qualora sia stato utilizzato un tRNA sbagliato TERMINAZIONE II: Dissociazione del complesso mRNA-tRNA-ribosoma Il complesso tRNA-ribosoma ed il ribosoma devono essere smantellati perché le componenti possano essere riciclate Questo richiede un altro fattore di terminazione (RF3) per eliminare RF1, e di fattori di riciclaggio del ribosoma (RRF) Vengono idrolizzate altre 2 molecole di GTP UNA SINTESI DEI PROCESSI IMPLICATI NELLA TRADUZIONE INIZIO DELLA SINTESI PROTEICA: Eucarioti CBC  DIFFERENZE NELLA TRADUZIONE TRA PROCARIOTI E EUCARIOTI 1) il codice genetico delle cellule batteriche ed eucarioti è praticamente identico; l’unica differenza è che nelle cellule batteriche l’AUG di inizio codifica per un tipo di metionina modificata, la N-formilmetionina, mentre nelle cellule eucarioti l’AUG di inizio codifica per la metionina non formilata. 2) la trascrizione e la traduzione si verificano simultaneamente nelle cellule batteriche, ma nelle cellule eucarioti l’involucro nucleare separa questi due processi. 3) l’mRNA nelle cellule batteriche ha vita breve, di solito pochi minuti, mentre nelle cellule eucarioti può durare ore o giorni. 4) la subunità maggiore del ribosoma eucariote contiene tre rRNA (28S+5,8S+5S), mentre il ribosoma batterico ne contiene solo due (23S+5S). 5) nelle cellule batteriche la subunità minore del ribosoma si attacca direttamente alla regione che circonda il codone di inizio, invece la subunità minore del ribosoma eucariote si lega prima alle proteine attaccate al cappuccio in 5′ sull’mRNA e successivamente migra lungo quest’ultimo. 6) alla fase di inizio eucariote, rispetto a quella batterica, partecipa un numero maggiore di fattori di inizio Terminazione della traduzione nelle cellule eucarioti: La traduzione nelle cellule eucarioti termina in modo analogo ai procarioti, a eccezione del fatto che ci sono due fattori di rilascio: eRF-1 che riconosce tutti e tre i codoni di stop, e eRF-2 che si lega al GTP e stimola il rilascio del polipeptide dal ribosoma. Traduzione in archeo-, eubatteri e eucarioti: Gli archeobatteri utilizzano come amminoacido iniziatore metionina non formilata, proprio come avviene negli eucarioti. Negli archeobatteri, alcuni fattori di inizio e di rilascio sono simili a quelli presenti negli eubatteri, mentre altri sono simili a quelli che si trovano negli eucarioti. Infine alcuni degli antibiotici che inibiscono la traduzione negli eubatteri non hanno alcun effetto su quella negli archeobatteri, il che fornisce una prova ulteriore delle differenze fondamentali fra eubatteri e archeobatteri. I poliribosomi Una molecola di mRNA può essere tradotta contemporaneamente da diversi ribosomi sia nei pro- che negli eucarioti. (a) Quattro ribosomi stanno traducendo una molecola di mRNA; i ribosomi si spostano dall’estremità 5′ verso l’estremità 3′ dell’mRNA. (b) In questa microfotografia elettronica il lungo filamento orizzontale è il DNA, i granuli scuri sono i poliribosomi e i filamenti sottili che collegano i ribosomi sono gli mRNA. La trascrizione del DNA procede da destra a sinistra; gli mRNA sulla destra sono più corti di quelli sulla sinistra. Ogni mRNA viene tradotto da molteplici ribosomi. Nonsense-mediated RNA decay (NMD) Per evitare la sintesi di proteine anomale (troncate) derivanti da mutazioni nonsenso, le cellule eucariotiche hanno sviluppato un meccanismo chiamato nonsense-mediated mRNA decay Il meccanismo responsabile del nonsense-mediated mRNA decay, nei mammiferi, sembra consista di proteine che si legano alle giunzioni esone-esone. Queste proteine di giunzione esonica possono interagire con gli enzimi che degradano l’mRNA. Una possibilità è che il primo ribosoma a tradurre l’mRNA (durante il pioneer round della traduzione) rimuova le proteine di giunzione esonica, proteggendo in questo modo l’mRNA dalla degradazione. Tuttavia, quando il ribosoma incontra un codone di stop prematuro, non attraversa l’intero mRNA, e le proteine di giunzione esonica a valle del codone di stop non vengono rimosse, il che ha come conseguenza il nonsense-mediated mRNA decay Risoluzione dei “ribosomi in stallo” Può verificarsi nella traduzione che un ribosoma si blocchi e si trovi in stallo sull’mRNA prima che la traduzione si sia conclusa. Questa situazione può verificarsi quando la trascrizione termina prematuramente, dando luogo a un mRNA tronco privo di codone di stop. In questi casi il ribosoma raggiunge la fine dell’mRNA senza incontrare codoni di stop e finisce in stallo, ancora attaccato all’mRNA I batteri hanno evoluto RNA transfer messaggero (tmRNA) che rimuove i ribosomi in stallo. Questa molecola di RNA possiede le proprietà sia del tRNA sia dell’mRNA; la sua componente tRNA di solito è caricata con l’amminoacido alanina. Quando un ribosoma va in stallo su un mRNA, l’EF-Tu trasporta il tmRNA al sito A dei ribosomi. Viene creato un legame peptidico fra l’amminoacido nel sito P del ribosoma e l’alanina (attaccata al tmRNA) che ora si trova nel sito A, trasferendo la catena polipeptidica al tmRNA e rilasciando il tRNA nel sito P. Il ribosoma poi riprende la traduzione passando all’mRNA che fa parte del tmRNA. La traduzione aggiunge 10 amminoacidi codificati dal tmRNA, e successivamente un codone di stop che pone fine alla traduzione e rilascia il ribosoma Negli eucarioti: nonstop mRNA decay (degradazione mRNA anomalo) Smistamento delle proteine Le proteine devono essere inviate ai vari comparti cellulari oppure secrete: controllo genetico mediato da sequenze segnale specifiche che indirizzano le proteine PROTEINE SECRETE: transitano attraverso il reticolo endoplasmatico Hanno una sequenza di 15-20 aa al N-terminale (peptide segnale) che viene riconosciuto da un complesso RNA+proteine (SRP: particella di riconoscimento del segnale) che a sua volta lega un recettore SRP sulla membrana del reticolo Modello per il trasporto delle proteine all’interno del reticolo endoplasmatico degli eucarioti