Norwegian Bokmål Lecture Notes on Methods in Natural Product Chemistry and Pharmacognosy

Metoder i naturstoffkjemi og farmakognosi Kapittel 7 BIOASSAY-METODER Bioassay-styrt isolering E...

Metoder i naturstoffkjemi og farmakognosi Kapittel 7 BIOASSAY-METODER Bioassay-styrt isolering Ekstrahering fra plantemateriale Antioksidant-tester Isoleringsmetoder inkludert introduksjon til Arakidonsyremetabolisme kromatografi Andre enzymtester Strategi for isolering av rene naturstoffer Antimikrobielle tester Toksisitetstester Etc. Preparative metoder Soxhlet-ekstrahering Trinn 1 er ofte å få ut et ekstrakt fra en (vanligvis ganske komplisert) matriks Ekstraksjon Romtemperatur / oppvarming Kontinuerlig Stillestående / røring / ekstrahering ved Franz Ritter von Soxhlet bruk av løsemidler perkolering (Soxhlet-ekstraktor) (1848-1926) Soxhletekstraktorens med økende oppfinner (1879) polaritet 1  Soxhlet- Soxhlet-ekstraktor ekstraktor Plantemateriale plasseres i beholder laget av filterpapir gjennom hvilket løsemiddel blir 1: Magnetrører refluksert kontinuerlig 2: Rundkolbe Soxhletapparatet vil tømme sitt 3: Destillasjonsvei innhold inn i rundkolben når 4: Beholder laget av filterpapir for væskenivået har nådd et visst plantemateriale som ekstraheres nivå 5: Plantemateriale 6: Sifongtopp Siden ferskt (rent) løsemiddel 7: Sifongutgang kontinuerlig blir tilført 8: Ekspansjonsadapter plantematerialet fra kjøleren ved 9: Vannkjøler refluksprosessen er 10: Kjølevann inn ekstraheringsmetoden svært effektiv 11: Kjølevann ut Utmerket metode for å få høye utbytter, men fare for termisk nedbrytning av produktene Ekstrahering fra plantemateriale Ekstrahering fra plantemateriale Ekstrahering av Ekstraksjon av fast stoff med væske: forbindelser med ulike muligheter: begrenset stabilitet blir Ekstrahere med en serie løsemidler ofte utført ved lavere (vanligvis med stigende polaritet) temperaturer eller (kjøleskap eller Ekstrahere med et relativt generelt romtemperatur) løsemiddel (f.eks. metanol) og fordele råekstraktet mellom andre løsemidler Ekstrahering fra plantemateriale Metodikk for isolering av naturstoffer Suksess for Superkritisk væske som ekstraheringsmiddel: En kort innføring i kromatografi ☺ Industriell skala utvinning av lykopen fra tomater Enkelt å bli kvitt løsemiddelet etterpå! 2  Før-kromatografiske metoder Destillasjon Krystallisering Utmerket metode, men ikke alle Destillasjon - vanligvis mindre aktuelt, forbindelser kan krystalliseres men termostabile flyktige forbindelser (f.eks. noen eteriske oljer) kan utvinnes med vanndampdestillasjon: Destillasjon Vanndamp blåses gjennom en Kun et begrenset antall suspensjon av materialet som skal organiske forbindelser tåler behandles, og en blanding av destillasjon uten å vanndamp og flyktige forbindelser dekomponere destilleres over Destillasjon Kromatografi Chroma = farge Grafein = skrive Michail Semjonowitsch Tswett (1903 ) On a new category of adsorption phenomena and on its application to biochemical analysis. Trudy Varhavskago Carlo Matteucci (1811-1868) Obshchestva Lectures on the physical estevoispytatelei Otd phenomena of Living Beings Biol (Tr Warsawsk (London 1847) Obst Jestesv Otd Biol) 14: 20-39 3  Kromatografisk separasjon Kromatografi En forbindelse vil fordele seg mellom Et kromatografisk system består av en stasjonær og mobil fase. mobilfase (som beveger seg) og en stasjonærfase (som er i ro) Separasjon er basert på at ulike forbindelser har ulik fordeling i stasjonær og mobil fase – ulik retensjon. Dette betyr at de beveger seg med forskjellig hastighet gjennom kolonnen. For hvert av stoffene får man en spredning langs kolonnen. Am Bm Mobil fase As Bs Stasjonær fase Ved likevekt er forbindelse A hovedsakelig tilstede i mobil fase Ved likevekt er forbindelse B hovedsakelig tilstede i stasjonær fase Figuren viser en av kanalene som går gjennom en kolonne. forbindelse A vil bevege seg raskest gjennom kolonnen De enkelte forbindelsene som beveger seg gjennom kolonnen vil fordi forbindelsene ikke vil bevege seg når de oppholder oppholde seg både i den stasjonære og mobile fasen. seg i den stasjonære fasen Faktorer som påvirker separasjonen: Et kromatogram kan beskrives ved tre egenskaper: Type stasjonær fase tR Type mobil fase Kolonnedimensjoner (lengde og diameter) Retensjonstid: tR Prøvemengde tw tid Båndseparasjon er basert på forskjell i retensjonstid. Trykk Temperatur Båndbredde: tW som måles ved grunnlinjen. Den er uttrykk for båndspredning. Dersom vi har en statistisk tilfeldig fordeling av enkeltmolekyler, har osv vi en Gauss kurve. 4  Et stoff kan fordele seg mellom to løsningsmidler separasjonsprinsipp som ikke er blandbare med hverandre. VANN adsorpsjon KAFFEIN eksklusjon DIKLORMETAN fordeling ionebytter Løselighet av kaffein i vann (g/ mL) k= Løselighet av kaffein i diklormetan (g/ mL) k = FORDELINGS KOEFFISIENT Fordelingskromatografi Papir og tynnsjiktkromatografi Papiret (sjiktet) er bærer av stasjonær fase. Et stoff kan fordele seg i to faser som ikke er blandbare med hverandre. Stasjonær fase er ofte vann eller vann mettet med et organisk løsningsmiddel. Gasskromatografi – Superkritisk væskekromatografi Dette prinsippet kan benyttes i kromatografi når Stasjonær fase er impregnert som tynn film den ene væskefasen er mobil og den andre er (polysiloksaner) på fast bæresubstans eller på veggen stasjonær (eks. DCCC og CPC). til en kapillærkolonne. Prinsippet er også benyttet ved å binde eller Mobile fase er gass (evnt. superkritisk væske). adsorbere en av to ikke-blandbare løsningsmidler Væskekromatografi til en bæresubstans og deretter lede den andre Stasjonær fase er impregnert på eller bundet til bæresubstans. fasen over den første (brukt f. eks. i TLC, LC, GC og SFC). I HPLC er stasjonærfasen som regel kjemisk bundet. Stasjonær-fasen er da ikke lenger en væske og separasjons- prinsippene er ikke så enkle som i ren fordelingskromatografi. Klassisk fordelingskromatografi: normal fase fordeling I dag dominerer omvendt fase kromatografi på kjemisk Eks.: Butanol, eddiksyre og vann (4:1:5) ristes i skilletrakt og bundne stasjonærfaser innen HPLC og tildels TLC. danner to faser. Øvre fase: Butanol mettet med vann Nedre fase: Vann mettet med butanol (begge faser inneholder eddikksyre) Normal fase Omvendt fase Stasjonær fase: Hydrofil Lipofil Dersom vannfasen f. eks. skal benyttes som stasjonærfase i en Mobil fase: Lipofil Hydrofil kolonne, behøves et bæremateriale for å holde vannfasen på plass i kolonnen. Cellulose kan brukes som bæremateriale. Cellulose blir da svellet i den vandige fasen, pakket i en kolonne og eluert med butanolfasen. På kolonnen befinner det seg da en stasjonær og en mobilfase i likevekt med hverandre. 5  DCCC 1. Et to-fase væskesystem blir laget i en Prøvekammer Upolar Polar Ca 300 rør skilletrakt. mobil fase mobil fase 2. Den nedre væskefasen (stasjonære Polar overflate på Upolar overflate fase) blir pumpet inn i de tomme stasjonær fase på stasjonær fase glassrørene. 3. Den øvre væskefasen (mobil fase) blir Polare Upolare først pumpet gjennom et prøve- forbindelser forbindelser kammer og deretter som dråper gjennom den stasjonære fasen. 4. De ulike forbindelsene blir separert dersom de fordeler seg ulikt i den mobile og den stasjonære fasen. Upolare forbindelser Polare Mobil Pumpe forbindelser fase Tanimura et al. (1970) Science 169, 54-56 Fraksjonssamler DCCC Coil planet centrifuge (CPC) og Det er mulig å separere gram mengder. High Speed Counter Current Chromatography (HSCCC) Den stasjonære fasen blir pumpet inn i en kveilet Bare et begrenset antall væsker danner brukbare kolonne. dråper (avhengig av overflatespenning, tetthet etc.). Den mobile fasen blir først pumpet gjennom et prøve- kammer og deretter gjennom den stasjonære fasen. Den kveilede kolonnen roterer nå, og den stasjonære fasen holdes på plass av sentripetalkraften. De ulike forbindelser blir separert dersom de fordeler seg ulikt i den mobile og den stasjonære fasen. Adsorpsjonskromatografi adsorpsjon – intermolekylære krefter Liquid - solid chromatography, LSC Gas - solid chromatography, GSC Et fast stoff (stasjonær fase)opptar og binder på dispersjon sin overflate stoff fra en omgivende væske eller kovalent binding gass (mobil fase). (syre-base interaksjon kompleksdannelse) dipol Den stasjonære fasen er finfordelt fast hydrogen-binding adsorpsjonsmiddel. 6  Adsorpsjonsmidler Upolare Polare Kull Sure Basiske retarderer aminer retarderer sure og andre basiske forbindelser Polare forbindelser som fenoler og karboksylsyrer Sure Basiske Økende retensjon på polare adsorbsjonsmidler: Silika Magnesiumoksid Mettede hydrokarbon < aromatisk hydrokarbon < eter Magnesiumsilikat Aluminiumoksid < ester / aldehyd / keton < aminer / alkoholer < karboksylsyre Silika (silikagel, kiselgel) Adsorbsjon er knyttet til silanolgruppene. Silika er det mest brukte adsorpsjonsmiddel (nyttig til labile Disse vil normalt være proton-donor (inngå i H-binding). forbindelser, høy effektivitet og lineær kapasitet). Gjennomsnittlig Tre typer gir overflaten ulik surhetsgrad. porediameter på 80-150 Å Silanolgruppene gjør overflaten svak sur (pH rundt 5) mest sur (pKa rundt 4) På overflaten finnes silanolgrupper (Si-OH) og siloxangrupper Deaktivering med vann kan hindre uønsket adsorbsjon, men (Si-O-Si). kan også gjøre overflate langt mindre aktiv. Aluminiumoksid Basisk aluminiumoksid (overflate har pH 9-12) kan Adsorpsjonsmekanismen er kompleks. virke som kationbytter. Eksponerte aluminium-atomer (lokaliserte Basisk aluminiumoksid kan omgjøres til surt plussladninger) vil virke som Lewis-syrer og aluminiumoksid (overflate har pH 3), som kan virke adsorbere Lewis-baser. (En slik adsorbsjon-senter kan spalte labile stoffer, men deaktivering med 1-3% som anionbytter. vann vil redusere faren.) Nøytralt aluminiumoksid kan virke både som kation Basiske sentre som skyldes overflateoksid ioner og anionbytter. vil retardere syrer. Overflatehydroksyl spiller mindre rolle. Gjennomsnittlig porediameter på 100 – 200 Å 7  Kull Ionebytter kolonner Dispersjon er den viktigste faktor som bestemmer retensjonen. En ionebytter består av en uløselig matriks som er Stoffer som lett lar seg polarisere vil retarderes bundet med kovalente bindinger til ioniske grupper. best. De ioniske gruppene er elektrostatisk assosiert til God til separasjon av basiske (aminer) uten motioner (med motsatt ladning). haledannelse. Disse motionene kan reversibelt bli utbyttet med andre ioner med samme ladning uten forandringer av matriks. Betingelser blir valgt slik at forbindelsene som skal separeres får ulik elektrostatisk tiltrekning til ionebytteren. Kationbytter bytter ut Anionbytter bytter ut sine positive motioner sine negative motioner Ionebyttermaterialet sitter normalt på en kolonne, men kan også være på en tynnsjiktplate. Som mobilfase benyttes vandige løsninger av salter, syrer eller baser. –SO3–H+ + K+ = SO3–K+ + H+ –R3N+ X– + A– = –R3N+ A– + X– Retensjon påvirkes av: – pH (retensjon avhenger av type forbindelse og pH) – ionestyrke (til mobil fase) – ionebytterkapasitet https://www.youtube.com/watch?v=q3fMqg – bufferselektivitet (retensjon avhenger av type forbindelse T1do8 og buffer) – påsatt mengde stoff (retensjon kan synke med økende stoffmengde) – temperatur (retensjon kan synke med økende temp) 8  Ulike typer kolonnemateriale – matriks som funksjonelle grupper er bundet til (i ionebytter kromatografi): Kolonnemateriale – matriks som funksjonelle grupper er bundet til bestemmer fysiske egenskaper som: – Polymerer basert på styren/polyfenoler – Polymere karbohydrater (cellulose, – mekanisk styrke (HPLC anvendelighet) dekstran, agarose) – kapasitet – Silika-derivater – flow-egenskaper – oppførsel mot biologisk materiale (adsorbsjon?) Væskekromatografi (LC) er den mest anvendbare kromatografiske teknikk. Kromatografiske teknikker Bare 25% av alle organiske forbindelser kan bli analysert v.h.a. GC (flyktighet og stabilitet). Væskekromatografi (HPLC) HPLC Prøveinnføring: væskefase (løsning) Opprinnelig: High Pressure Liquid Chromatography Temperatur: vanligvis romtemperatur (HPLC utføres ved 100-300 bar (1500-4500 psi), Arbeidstrykk: vanligvis 100-300 bar langt under 1000 bar som må overskrides før trykket i seg selv blir en separasjonsparameter.) Væskehastighet: ca 1-2 mL/min for 4,6 mm i.d. kolonne I dag: High Performance Liquid Chromatography Analysetid: ca 3-30 min (gradient 10-45 min.) Minste detekterbare mengde: 1 pg – 1 µg Maksimal påsetting: µg – g Detektorprinsipp: UV, brytningsindeks, fluorescens, elektrokjemisk m.m. Separasjonsprinsipp: adsorpsjonskromatografi, omvendt fase, ionebytting, ionepar, I dag styres gradienter, injeksjon, detektorinnstillinger samt eksklusjonskromatografi oppsamling og behandling av data oftest av en PC. 9  Isokratisk separasjon av noradrenalin og adrenalin HPLC på antocyaner i blokkebær - gradientutvikling R1 OH CH3 HO O HN NH2 R2 HO HO OR3 OH HO HO OH OH Adrenalin Noradrenalin 0 10 20 (min) Egenskaper til løsningsmidler (mobil fase) HPLC kolonner og pakkematerialer Pakkematerialene er plassert i glass eller Transparente (avhenger av detektor) rustfrie stålkolonner som tåler høyt trykk. Rene (HPLC grad) Lav viskositet (gir lavt trykk og høy kromatografisk effektivitet) Pakkematerialene er av tre typer: Lav toksisitet – Porøse: Størst kapasitet og resolusjon, men lav hastighet. Lite brennbare – Overflate porøse: Større resolusjon men Egnet til destruksjon lavere kapasitet enn porøse partikler. Ikke-reaktive – Faste partikler: Lav kapasitet og resolusjon, men svært høy hastighet. Typer pakkemateriale brukt til HPLC: Silikabaserte materialer Si-OH gruppene på overflaten av silikapartiklene kan modifiseres Porøst glass med irregulær størrelse. slik at kolonnen får forskjellige egenskaper (polaritet etc). Polystyren/divinylbenzen resiner brukes til ione–bytter og eksklusjons kromatografi. Silikagel kan være både normal fase (cyano, amino, og hydroksyl gruper) eller omvendt fase. (C2,C4,C6,C8,C18) Alle typer kromatografiske prinsipp Etter R-gruppe og substitusjonsgrad kan kolonnen brukes til: (partisjon, adsorpsjon, ionebytting og omvendt fase kromatografi (majoriteten) eksklusjonskromatografi) blir benyttet til adsorpsjons kromatografi ionebytterkromatografi HPLC-separasjon. Partisjon på C18-kolonne eksklusjonskromatografi blir mest benyttet. spesielle anvendelser (kirale kolonner) 10  Upolar Polar mobil fase mobil fase Polar overflate på Upolar overflate stasjonær fase på stasjonær fase Polare Upolare forbindelser forbindelser ”Normal fase”: Stasjonærfase er polar og kan inneholde funksjonelle grupper som –CN, –NH2 –OH. ”Omvendt fase”: Stasjonærfase er upolar og består normalt Upolare Polare av alkaner, C2, C8, C18. (C18 = ODS = forbindelser forbindelser oktadecylsilan) Universelle detektorer UV-synlig lys detektor måler en forandring i mobil fase Spesifikke detektorer måler en egenskap med forbindelse selektiv for forbindelser som absorberer lys ved bølgelengder Brytningsindeks over 190 nm (refraksjonsindeks) UV egner seg godt til gradienteluering Detektor opptil tusen ganger mer følsom enn brytningsindeksdetektoren Elektrokjemisk Fluorescens (forutsatt forbindelser med høy molar absorptivitet) MS Ledningsevne stort dynamisk lineært område (forhold mellom lineær respons IR og støynivå) på ca. 105 Lysspredning Radioaktiv Basert på Lambert-Beers lov: A = ε l c = log (I0/I) Selektiv deteksjon i HPLC oppnåes både gjennom separasjon A = absorbans, AU og deteksjon. ε = molar absorptivitet (ekstinksjonskoeffisient), L/mol cm l = lysvei, cm c = konsentrasjon, mol/L spektrofotometer Diode array detektor tillater simultan deteksjon av mange bølgelender (fullstendige spektre). generelt mest brukte detektor i HPLC må brukes til forbindelser som har absorbsjonsmaksima som flowcelle ikke ligger nær noen emisjonslinjer i et linjespektrum for UV-målinger: deuterium lampe (kan varieres i området Lyskilde 190-350 nm) eller xenon lampe for synlig lys målinger: wolfram lampe wolfram lampe diode array deteksjon deuterium lampe 11 Med diode-array detektorer kan det fremstilles tredimensjonale kromatogram, hvor absorbans blir gitt som funksjon av Massespektrometer som detektor Det er voksende bølgelengde og tid. nytteverdi i LC-MS 15 [A+H]+ 287 14+15 [A+H]+ 347 [M+H] + 449 OMe 15 OH [M+H]+ 655 HO O OMe 15 OH 509 O HO O OH O OH O OH O UV og MS spektre detektert H 3C under HPLC analyse HO OH Tynnskiktkromatografi (TLC) TLC – anvendelse en generell metode med stort anvendelsesområde brukes mye til «screening» (f. eks. identifisering av farmasøytiske produkter) brukes mye til renhetstesting brukes til å få oversikt over hele innholdet i en sammensatt prøve TLC TLC Rf = Ls/Lmf Mobilfase Rf = retardasjonsfaktor Det er få begrensninger med hensyn til valg av mobilfase (blant annet fordi den fjernes før deteksjon). Stasjonærfase Rf (rød) = 3,1 / 5,6 Ligger som et tynt sjikt på en flat plate av glass, plast eller = 0,55 metall. TLC-plater som representerer alle de kromatografiske Rf (grønn) = 1,0 / 5,6 prinsippene er kommersielt tilgjengelig, men hovedsaklig = 0,18 benyttes silika og kjemisk bundne faser. 12  Lineær utvikling på rektangulær plate Lineær Sirkulær Eluering Todimensjonal OPLC – overpressured layer chromatography Sirkulær eller radiell eluering Sirkulær eller radiell eluering Prøvene påsettes i en sirkel rundt midtpunktet, og fremkommer som konsentriske bånd etter endt eluering. Muliggjør bruk av gradienteluering. Separasjon av antrakinoner fra rabarbra (A), trollhegg (B) og aloe (C). Stasjonær fase: silika Mobil fase: petrol eter- etylacetat-maursyre (75:25:1) To-dimensjonal eluering Trykk TLC (OPLC – overpressured layer chromatography) Prøven påsettes i det ene hjørnet. Platen elueres normalt med valgt mobilfase. Mobilfasen drives med trykk istedenfor kapillærkrefter Mobilfasen dampes vekk. (ca 10 bar). Platen elueres på ny 90° på første eluering. Fordeler: kortere analysetid - Gir større resolusjon gradient-eluering kan utføres - Større båndspredning lavere deteksjonsgrenser - Begrenset bruk av standarder reproduserbare Rf-verdier 13  Visuell deteksjon Instrumentell deteksjon - naturlig farge - naturlig fluorescens ved bestråling med UV lys - «quenching» av fluorescens ved bestråling av UV lys på en plate belagt med en fluorescerende forbindelse Densitometer Flammeionisasjon (UV absorberende forbindelser) - derivatisering/dekomponering til synlige, UV absorberende eller fluorescerende forbindelser (v.h.a. sprayreagenser, iod-krystaller, sølvnitrat, kons. svovelsyre, etc) - radiokjemisk og enzymatisk deteksjon kan også benyttes Densitometer Densitometer Stasjonær fase: Cellulose Mobil fase: HCOOH–kons. HCl–H2O (24:25:51) Deteksjon: 525 nm Består av: a. lyskilde (synlig/UV) b. filtere eller monokromatorer for bølgelengdevalg c. fotomultiplikator eller fotodiode for deteksjon. Separasjon av antocyaner i solbær TLC platen plasseres i en bevegelig holder og scannes med en stråle av monokromatisk lys gjennom en spalte med tilsvarende høyde som største bånd eller flekk. Reflektert eller transmittert lys måles og et kromatogram fremkommer. Flamme ionisasjons detektor (FID) Flammeionisasjon Ved flammeionisasjonsdeteksjon (FID) benyttes en sylinderformet kvartsstav som utvendig er belagt med stasjonærfase. Det er lagt inn en spenning (300 V) Prøvene påsettes og elueringen utføres som i vanlig TLC. + mellom flammespissen (–) og Mobilfasen fjernes med varme. kollektor (+) Staven føres inn i flammeionisasjonsdetektoren. – Under forbrenning dannes ioner og elektroner. Strømmen i detektoren er Kan brukes for forbindelser som mangler en kromofor (og er proporsjonal med mengde stoff relativt lite flyktige). Instrumentell deteksjon. som forbrenner. 14  Visuell sammenligning Eksklusjonskromatografi med standarder gel filtrering (i vandige løsninger) ’size exclusion chromatography’ Spektrofotometri etter Kvantitative eluering fra sjiktet bestemmelser Separasjon er Densitometri basert på basert på spektrofotometri molekylstørrelse ”store molekyler blir ekskludert” FID Skjematisk separasjon av to forbindelser med ulik molekylmasse Store molekyler vil elueres først. Stasjonær fase består av porøst materiell Veien deres blir kortere med bestemt porestørrelse fordi de ikke kan komme inn i alle porene. I prinsippet (og ofte ikke i praksis) er retensjonen i Ulike stasjonære faser har ulike porestørrelser gelkromatografi utelukkende en funksjon av molekylstørrelse / porestørrelse og uavhengig av mobilfase og forbindelsenes egenskaper. Valg av porestørrelse: Velger en porestørrelse hvor en mindre del av forbindelsene i Viktige faktorer for separasjon: prøven blir ekskludert og resten fordeler seg mellom V0 og V0 + Vi. Type kolonnemateriell Størrelse på hulrom Velger en porestørrelse hvor et bestemt molekylmasse- Partikkelstørrelse område blir adskilt fra resten. Kolonnelengde Flow hastighet Et fraksjoneringsområde er oppgitt til 30 000 - 200 000 (proteiner). Dette innebærer: proteiner > 200 000 blir ekskludert proteiner med molmasse rundt 30 000 får maksimal retensjon. 15 Separasjon av tre stoffklasser. Den i midten består av et bredt utvalg av masser. https://www.youtube.com/watch?v=oV5VB 5kO3tQ Dekstran - Sephadex 1 Stasjonærfaser 6 Dekstraner består av glukose-enheter Polysakkarid sammenbundet ved 2 dekstran Polymer- og silika-basert eterbindinger. materialer til HPLC agarose Ved forskjellig grad av tverrbinding produseres 2 forskjellige materialer. polyakrylamid Jo større grad av tverrbinding, desto mindre porestørrelse og tilsvarende mindre vannopptak ved polystyren svelling. Sephadex G og Sephacryl egner seg til separasjon av vannløselige forbindelser som proteiner, peptider, polysakkarider, etc. Sephadex LH-20 kan brukes til separasjon av Svellingsgraden til dekstraner er avhengig av lipider, steroider, fettsyrer, flavonoider, vitaminer og løsningsmidlet. hormoner. Sephadex: – Kjemisk stabil (NB! Tåler ikke sterke syrer eller baser) – Mekanisk lite stabil (egner seg ikke til HPLC) – Hydrofil 16 Gasskromatografi Når en gass blir brukt som mobilfase i et kromatografisk system kalles teknikken gasskromatografi (GC). Stoffer som skal analyseres med GC, må være flyktige og stabile ved de temperaturer som benyttes. Med utgangspunkt i den stasjonære fase skilles det mellom to typer gasskromatografi: 1. Gas-solid chromatography (GSC) eller gass-fast stoff kromatografi, hvor den stasjonære fase er et adsorpsjonsmiddel. 2. Gas-liquid chromatography (GLC) eller gass-væske kromatografi, hvor den stasjonære fase er en ikke-flyktig væske. Gasskromatograf Gasskromatograf Gasskromatografi Den mobile fase i GC kalles bæregass. Injektor Via reduksjonsventiler strømmer Prøve bæregassen gjennom injektoren, kolonnen og til detektoren. Prøven introduseres i den oppvarmede injektoren hvor den fordamper, og blir brakt til kolonnen med bæregassen. Detektor Datasystem Stoffene i prøven separeres i kolonnen og passerer detektoren Kolonne hvor det genereres et elektrisk signal som etter forsterkning skrives ut som et kromatogram på en skriver. Bæregass Kolonneovn En termostatert ovn styrer temperaturen i injektoren, i kolonnen og i detektoren. Gasskromatografi – fordeler Superkritisk fluid kromatografi Hurtige analyser Høy oppløsningsevne Mobil fase: superkritisk fluid Høy følsomhet (deteksjon i ng og pg området) Stasjonær fase: pakkede kolonner eller åpne GC kan benytte mange typer detektorer (f. eks. kapillærer GC/MS) Deteksjon: både GC og HPLC detektorer GC kan lett automatiseres (autoinjeksjon, databearbeidelse) 17  Fasediagram Superkritisk Superkritisk fluid fluid region Komprimert gassfase Trykk Tc ved en temperatur over Fast Væske den kritiske temperatur stoff Gass og ved et trykk over det kritiske trykk. Temperatur Endringer i trykk eller temperatur over det kritiske punkt kan ikke medføre faseforandringer. Dersom trykket i en superkritisk fluid blir redusert til under det kritiske trykk, skjer det en glidende overgang fra superkritisk tilstand til gassfase. Dersom temperaturen reduseres til under den kritiske temperatur, skjer en glidende overgang til væskefase. SFC sammenlignet med GC SFC sammenlignet med GC Kan brukes på forbindelser Kan brukes på som er termisk labile og forbindelser med middels polare (f. eks. relativt høye EPA flerumettede fettsyrer). molekylvekter (f. eks. polyetylenglykol). Bar Separasjon av oligomere i polyetylenglykol med MW Flerumettede fettsyrer 1470. Kolonne: 1 mm x 25 DHA (eikosapentaensyre, EPA, og cm pakket med 5 µm dokosaheksaensyre, DHA) i en Dynosphere P5 Q232. marin olje. Kolonne: 50 µm x 10 Mobilfase: 15% metanol i m Biphenyl 30. Mobilfase: CO2. CO2. Detektor: Lysspredning. Detektor: FID. SFC sammenlignet med HPLC Fordeler: Til flyktige og temperaturstabile forbindelser vil GC Kan brukes med GC detektorer. normalt være en bedre metode bl.a. på grunn av Raskere separasjon (sml. diffusjonskoeffisienter). enklere instrumentering Ulemper: Vanskelig å bruke på: forbindelser som er vannløselig og ioniske (f. eks. antocyaner). forbindelser som har meget høy molekylvekt (f. eks. proteiner). 18  Strategi for isolering av Isolation of pure compounds naturstoffer fra plantemateriale Først ekstrahering fra plantemateriale med dertil egnet løsemiddel/metode Trenger deretter å benytte en kombinasjon av Extraction Absorption CC XAD-7 Liquid-Liquid CC DCCC/HSCCC forskjellige kromatografiske metoder for å isolere rene naturstoffer Bioassay-styrt isolering –Testing av biologisk aktivitet av ekstrakter og rengjorte fraksjoner/forbindelser fra ekstrakter med interessant biologisk aktivitet Gel filtration CC Preparative HPLC Analytical HPLC 19