Fisiologia Cellulare PDF

FISIOLOGIA CELLULARE Domanda esame: ruolo del calcio nella fisiologia (presente a bassissime concentrazioni all’interno della cellula e ad altissime concentrazioni all’esterno nella cellula e nel reticolo sarcoplasmatico; il calcio determina molti eventi cellulari, come per esempio la coagulazione,...

FISIOLOGIA CELLULARE Domanda esame: ruolo del calcio nella fisiologia (presente a bassissime concentrazioni all’interno della cellula e ad altissime concentrazioni all’esterno nella cellula e nel reticolo sarcoplasmatico; il calcio determina molti eventi cellulari, come per esempio la coagulazione, infatti rappresenta il fattore quarto della coagulazione – per esempio quando si dona il sangue si usa un chelante detto EDTA che rimuove il calcio dal sangue e inibisce quindi la coagulazione del sangue –. LEZIONE 1 – 06/10/2022 Scrivere un protocollo di laboratorio (viene chiesto all’esame) che comprenda: principio del metodo e scopo equipaggiamento richiesto (consumabili richiesti – cuvette, puntali, pipette… – , vetreria richiesta, tamponi e reagenti richiesti) procedura operativa calcoli note Esistono tre modi per esprimere una concentrazione: mg/mL %(p/V) molarità È importante scegliere una tara adatta al volume da pesare; inoltre per preparare una soluzione si inserisce prima il soluto e poi si porta a volume (e non il contrario). Il pH del sangue è 7.4 (leggermente basico), quindi bisogna utilizzare tamponi che siano in grado di mantenere il pH fisiologico; tra i tamponi più utilizzati si trova il tampone fosfato (H+ + Na2HPO4 NaH2PO4 + Na+ ). Uno dei tamponi più utilizzati in fisiologia è PBS con concentrazione 300 mOsm in cui il tampone fosfato è 10 mM, mentre NaCl ha concentrazione 137 mM e KCl ha concentrazione 2.7 mM. Un altro tampone è TRIS formato da 50 mM di TRIZMA e da 150 mM di NaCl. Un tampone più complesso è invece HBSS. Le proprietà colligative delle soluzioni sono: innalzamento ebullioscopico abbassamento crioscopico osmosi Nella seconda esperienza di laboratorio vengono preparati tre tubicini di dialisi contenenti acqua, glucosio 1 M e glucosio 2 M di cui si misura sia il peso iniziale sia il peso finale (nel caso dell’acqua il peso non deve variare, mentre nel secondo caso il peso aumenta e nel terzo raggiunge quasi il doppio del peso iniziale). Si possono fare misure assolute e misure relative (questo nel caso in cui si utilizzino due gruppi di cui uno è un campione di riferimento rispetto a cui si confronta un campione trattato). Più il valore di R2 è vicino a 1 tanto più il coefficiente angolare è attendibile e questo dipende dalla precisione e dall’efficacia della modalità di pipettaggio. La terza esperienza di laboratorio prevede di realizzare un omogenato di fegato. Alla fine del processo di centrifugazione si formano due fasi: un pellet e un surnatante. Esistono diverse tipologie di rotore, tra cui il rotore oscillante (il pellet è sul fondo della provetta), il rotore ad angolo fisso e il rotore verticale. Quando si utilizza una centrifuga le provette devono avere lo stesso peso e devono essere posizionate in modo tale da bilanciare il loro stesso peso. La centrifuga si usa per separare le varie componenti cellulari, quindi si effettua una centrifugazione differenziale in cui si frutta la diversa densità degli organuli (nella prima centrifugazione si ottiene un pellet contenente nuclei mentre gli altri organelli rimangono in sospensione, poi con la seconda centrifugazione si ottiene un pellet con mitocondri e perossisomi, mentre con la terza centrifugazione si ottengono i microsomi). Nel processo di frazionamento cellulare si utilizzano marcatori così da riconoscere specifiche componenti, per esempio nel caso dei nuclei si utilizza il DNA come marcatore mentre per i mitocondri si utilizza la succinato deidrogenasi. Nel protocollo bisogna scrivere temperatura, tempo e G (cioè le gravità a cui è sottoposto il campione). LEZIONE 2 – 07/10/2022 TRASPORTI La membrana plasmatica discrimina un ambiente interno alla cellula rispetto a un ambiente esterno. Il movimento dei soluti attraverso una membrana può avvenire in forma libera (quindi senza la formazione di un legame covalente tra la proteina e la molecola da trasportare) oppure attraverso la formazione di un legame tramite trasportatori detti carrier. Il movimento in forma libera comprende: diffusione semplice diffusione attraverso canali ionici Il movimento attraverso la formazione di un legame comprende: diffusione facilitata (o trasporto mediato passivo) trasporto attivo (primario o secondario) La diffusione semplice, la diffusione attraverso canali ionici e la diffusione facilitata prevedono che le molecole vengano trasportate secondo gradiente di concentrazione (da una regione a concentrazione maggiore a una regione a concentrazione minore); mentre il trasporto attivo, sia primario sia secondario, prevede che una molecola venga trasportata contro gradiente di concentrazione consumando energia sotto forma di ATP. Diffusione semplice Consideriamo una superficie ideale (1 cm x 1 cm) in cui sono presenti molte molecole di soluto sulla faccia 1 e poche molecole sulla faccia 2, quindi si osserva un flusso dalla superficie 1 verso la superficie 2 ma è presente anche un flusso che va dalla superficie 2 verso la superficie 1. Il flusso è una velocità, quindi rappresenta quante moli vengono trasportate per unità di tempo in n una certa superficie, e ha formula F1 → 2 = N × A × ∆t dove n = n° particelle, N = numero di Avogadro, A = area e ∆t = tempo. Si può quindi misurare il flusso netto F = F1 → 2 − F2 → 1 Per esempio il flusso da 1 a 2 implica il trasporto di 100 moli e il flusso da 2 a 1 di 25 moli, quindi il flusso netto (cioè le moli effettivamente trasportate) sono 75. In un altro caso il flusso da 1 a 2 implica il trasporto di 100 moli e il flusso da 2 a 1 implica il trasporto di 100 moli, quindi il flusso netto è 0 ma si ha comunque movimento di particelle! L’equazione di Teorell determina l’intensità di flusso e richiede che le particelle di soluto che si muovono in soluzione non interagiscano tra loro. Ha formula: 𝐹𝑖 = 𝐾𝑖 × 𝑋𝑖 in cui 𝐹𝑖 = intensità di flusso, 𝑋𝑖 = driving force, 𝐾𝑖 = costante di proporzionalità. Quindi la driving force può essere definita come una forza che favorisce il movimento e quindi il flusso delle particelle. Nel caso del flusso di massa, la driving force è la differenza di pressione idraulica tra regioni diverse della soluzione. Nel disegno si misura un flusso che va dal vaso a sinistra verso quello a destra (il vaso a sinistra è più pieno di quello a destra, quindi la pressione nel vaso a sinistra è maggiore), quindi in questo caso la driving force è la pressione che è maggiore nel vaso a sinistra rispetto a quello a destra. Nel caso di migrazione in un campo elettrico o elettroforesi di particelle elettricamente cariche (ioni) la driving force è generata da una differenza di potenziale elettrico tra regioni diverse di una soluzione. La diffusione è una proprietà fisica fondamentale di tutti i processi biologici e costituisce il motore tramite il quale le cellule possono generare segnali. Inoltre in questo caso la driving force è generata da una differenza di concentrazione delle particelle in zone diverse della soluzione. Che cosa spinge le particelle a diffondere? La diffusione è il movimento molecolare generato dall’energia termica dei moti browniani. La diffusione ha caratteristiche specifiche: è un processo passivo che non richiede fonti di energia (principalmente sotto forma di ATP) le molecole diffondono da una zona a maggiore concentrazione verso zone a più bassa concentrazione (quindi la driving force è la differenza di concentrazione) la diffusione delle molecole procede fino a quando la concentrazione è uguale in entrambi i lati della membrana [C1 = C2] (le molecole continuano a diffondere ma il flusso netto è 0) la diffusione è rapida a breve distanza (a livello cellulare) e molto lenta su scala macroscopica la diffusione è direttamente proporzionale alla temperatura (aumenta l’energia cinetica delle molecole e quindi si raggiunge più velocemente l’equilibrio) la diffusione è inversamente proporzionale alla dimensione molecolare (maggiori sono le dimensioni della molecola minore è la sua velocità di diffusione) 1° legge di Fick (sapere la formula): la velocità di diffusione è direttamente proporzionale al gradiente di concentrazione e ha formula J = kd (C1 − C2), dove J = velocità di diffusione = numero di molecole al secondo ovvero moli/secondo, C1,C2 = gradiente di concentrazione (mol/m3) e kd = coefficiente di diffusione. Quindi questa legge descrive come le molecole possano attraversare una membrana semipermeabile; inoltre maggiore è C1 − C2 , e quindi il ∆C, tanto maggiore è la velocità di diffusione. Esempio: nel compartimento 1 ho tante molecole mentre nel compartimento 2 sono poche; al tempo 2 si osserva un movimento che va da 1 a 2, mentre al tempo 3 si osserva un flusso che va da 2 verso 1 e al tempo 4 si raggiunge l’equilibrio, quindi il flusso netto è pari a 0. Nel grafico si osserva C1, cioè la concentrazione di glucosio nel compartimento 1, che progressivamente diminuisce man mano che si raggiunge il tempo 4, mentre C2 è la concentrazione di glucosio nel compartimento 2 che aumenta progressivamente fino a raggiungere il tempo 4, in cui si raggiunge una situazione di equilibrio in cui il flusso netto è pari a 0. Nel caso di una membrana plasmatica, non essendo più una superficie ideale, nella legge di Fick kd può essere sostituito da 𝐷𝑚 Pi, definito come Pi = 𝛽𝑖 , dove βi è definito come il ∆𝑥 rapporto tra la concentrazione del soluto nei lipidi e la concentrazione del soluto in acqua (quindi rappresenta quanto una molecola sia in grado di attraversa una membrana tramite un processo di diffusione). Nella legge di Fick, ∆xrappresenta lo spessore della membrana mentre Dm è inversamente proporzionale allo spessore della membrana, quindi più la membrana è sottile più semplice è il movimento di diffusione. Tra le sostanze che attraversano la membrana attraverso un movimento di diffusione si trovano gas, molecole piccole oppure ormoni steroidei (sono derivati del colesterolo e stanno “meglio” in una soluzione lipofila rispetto a una soluzione idrofila e siccome diffondono liberamente hanno un loro recettore a livello del citosol). In generale più una molecola è grande e carica tanto meno diffonde per diffusione semplice. Quindi la permeabilità è maggiore nel caso di una molecola lipofila, senza carica, piccola e con grosso gradiente di concentrazione; mentre si ha permeabilità minore nel caso di una sostanza idrofila, con carica, grande e con poco o nullo gradiente di concentrazione. La taglia e la carica influenzano la velocità di diffusione delle molecole attraverso la membrana che rappresenta una barriera semipermeabile alle molecole. Inoltre i fattori che influenzano la velocità di diffusione attraverso una membrana cellulare sono: solubilità dei lipidi dimensione molecolare spessore della membrana ◊ gradiente di concentrazione area di superficie di membrana ◊  composizione dello strato lipidico ◊ Le caratteristiche indicate con il simbolo ◊ indicano caratteristiche della membrana, in particolare, per quanto riguarda la composizione dello strato lipidico, a seconda della quantità di colesterolo e della tipologia di fosfolipidi cambia l’affinità della membrana. Le altre caratteristiche (prive di simbolo) indicano caratteristiche della molecola/soluto. Quindi la legge di Fick afferma che la velocità di diffusione sia direttamente proporzionale all’area della superficie, al gradiente di concentrazione e alla permeabilità di membrana. Esempio: diffusione non ionica di una base Consideriamo una membrana che separi due compartimenti, in uno c’è un ambiente acido e nell’altro c’è un ambiente basico (questo esempio fa riferimento al tubulo renale), quindi l’ammoniaca è presente in forma neutra a livello dell’ambiente basico (citosol della cellula epiteliale), di conseguenza può diffondere liberamente, e una volta passata la membrana plasmatica incontra un ambiente acido, quindi diventa ione ammonio che non può più tornare indietro per diffusione perché è una molecola carica. La diffusione non ionica è data dal fatto che siano presenti differenze di pK tra un lato e l’altro della membrana, quindi le basi possono essere cariche da un lato e non dall’altro, di conseguenza si osserva un flusso unidirezionale. Esempio: diffusione non ionica di un acido Nello stomaco un generico acido HA non è carico perché si trova in un ambiente acido, quindi diffonde attraverso la membrana plasmatica e raggiunge il citosol di una cellule epiteliale della mucosa gastrica, di conseguenza, trovandosi in un ambiente basico, si carica negativamente, quindi non può più tornare indietro perché è una molecola carica e la diffusione è quindi unidirezionale. La membrana plasmatica è un bilayer fosfolipidico costituito da fosfolipidi, colesterolo, proteine e carboidrati (formano il glicocalice); inoltre ha diverse funzioni: contenimento (gli ioni sono da una parte e non dall’altra) separazione scambio di informazioni trasduzione interazione riconoscimento I fosfolipidi possono muoversi in modo diverso, per esempio attraverso un movimento flip-flop oppure tramite diffusione laterale, ma il primo richiede molta energia perché la testa polare del fosfolipide deve attraversare la porzione apolare della membrana, quindi è molto rara. La membrana cellulare è formata da colesterolo, fosfolipidi e sfingolipidi che formano complessivamente il doppio strato fosfolipidico. La composizione della membrana plasmatica varia da cellula a cellula, per esempio nei globuli rossi si trovano molti carboidrati perché sono responsabili dei gruppi sanguigni mentre lipidi e proteine sono quasi ugualmente rappresentati. Esistono diverse tipologie di proteine presenti a livello delle membrana plasmatica, come canali e trasportatori, recettori, enzimi o proteine strutturali. Le proteine integrali di membrana possono essere monomeriche monopasso (formate da una subunità e passano una volta), monomeriche multipasso (formate da una subunità e passano più volte generalmente con sette domini transmembrana) oppure multimeriche multipasso (passano più volte e sono formate da più subunità). Le proteine multimeriche multipasso possono avere quattro subunità (tetrameri multipasso), oppure cinque (pentameri multipasso) o sei (esameri multipasso), quindi il diametro del canale aumenta all’aumentare delle subunità che compongono la proteina. Nel disegno i pallini rossi indicano quante volte una subunità passa attraverso la membrana plasmatica, per esempio nel primo caso una subunità passa quattro volte attraverso la membrana quindi in totale la proteina passa, con le sue subunità, ventiquattro volte la membrana. In un canale un cambio conformazionale può implicare un aumento del diametro del canale, quindi in base a questa variazione uno ione potrebbe attraversare o meno il canale stesso. Diffusione attraverso canali ionici Coinvolge: proteine canale: non devono legare il soluto, ma si forma un poro idrofilo per il passaggio del soluto – cioè ioni – nel doppio strato lipidico; il trasporto avviene secondo gradiente di concentrazione (la driving force è anche in questo caso il gradiente di concentrazione) Diffusione facilitata Il trasporto dei soluti avviene secondo gradiente di concentrazione (trasporto passivo) ma il soluto viene legato. Quindi le proteine trasportatrici si legano al soluto specifico e subiscono cambiamenti di conformazione in modo da trasferire attraverso la membrana il soluto legato. Il trasporto è unidirezionale e dipende dal gradiente di concentrazione (può avvenire in un senso o nell’altro, ma dipende sempre dal gradiente di concentrazione); inoltre le proteine carrier rispondono all’equazione di Michaelis-Menten. Trasporti attivi Coinvolgono proteine transmembrana multipasso multimeriche che legano il soluto e trasportano la molecola contro gradiente di concentrazione idrolizzando ATP, quindi consumano energia. Un esempio è la pompa Na+/K+, infatti il potassio è presente in elevata concentrazione all’interno della cellula mentre il sodio è presente in elevata concentrazione all’esterno, quindi mantiene le concentrazioni intracellulari di Na+ e K+ diverse da quelle extracellulari. Nei sistemi biologici il lavoro si presenta in tre forme diverse: lavoro chimico lavoro di trasporto lavoro meccanico LEZIONE 3 – 13/10/2022 ACQUA L’acqua è la componente più abbondante (60-70% nell’uomo) e, dal punto di vista fisico, è l’unica molecola presente sulla terra nei tre stati: solido, liquido e gassoso. Lo stato liquido rappresenta però lo stato in cui i composti biologici possono interagire in modo da consentire lo svolgimento delle reazioni biochimiche. Inoltre la quantità d’acqua varia in relazione all’età e si trova in elevata percentuale nel cervello (75%) e nel sangue (83%); aiuta la respirazione, elimina le tossine – vengono eliminate con le urine, prive di batteri, quindi sterili, mentre attraverso le feci si eliminano sostanze non digerite e contengono batteri –, trasforma il cibo in energia, protegge gli organi, trasporta l’ossigeno e i nutrienti alle cellule, consente al corpo di assorbire i nutrienti e percepirli (le molecole odorose e gustative devono essere immerse in un liquido, rispettivamente muco e saliva, per poter essere percepite), lubrifica le articolazioni e regola la temperatura corporea – l’acqua è un ottimo conduttore di calore –. L’acqua ha proprietà chimico-fisiche fondamentali per la vita: capacità solvente: permette ai composti in essa disciolti di dissociarsi in ioni che sono alla base di molti processi cellulari (nel corpo i sali sono presenti come ioni proprio per la presenza dell’acqua) elevata capacità termica: permette di assorbire una grande quantità di calore, aumentando pochissimo la temperatura elevato calore latente di evaporazione elevata tensione superficiale: consente alle molecole d’acqua di avere forma sferica promuove la formazione di legami idrofobici tra le molecole che vi si trovano immerse: una sostanza lipofila in un ambiente acquoso è segregata in forma sferica – la forma più stabile –, quindi, viene promossa la formazione di legami idrofobici L’acqua è un dipolo e un solvente (ogni ione ha un alone di solvatazione). Legge di Coulomb La legge di Coulomb afferma che la forza con cui si attraggono due molecole è inversamente proporzionale al quadrato del raggio delle molecole stesse. Na+ e K+ sono i due cationi più rappresentati del corpo umano e Na+ ha un raggio più piccolo rispetto a K+, quindi attrae un numero maggiore di molecole d’acqua rispetto al K+, quindi ha un alone di solvatazione maggiore. K+ invece ha un raggio maggiore, quindi attrae un minor numero di molecole d’acqua e quindi ha un alone di idratazione minore. L’alone di idratazione di una molecola rappresenta il numero di molecole d’acqua presenti intorno alla molecole stessa. Il K+, a differenza del Na+, rimane all’interno della cellula perché ha un alone di idratazione più piccolo e quindi occupa meno spazio. Composizione dei liquidi corporei L’acqua è la componente più abbondante (60-70% nell’uomo) e i principali ioni inorganici sono Na+, K+, Cl- con concentrazioni più basse di Ca2+, Mg2+ – tutte le ATPasi riconoscono e idrolizzano l’ATP se questo è ATP- Mg2+ –, SO42- PO43- e HCO3-. Inoltre molte proteine legano lo zinco. I liquidi biologici contengono numerose molecole organiche come piccole molecole quali aminoacidi, glucosio, urea ma anche macromolecole come le proteine. Per separare i grassi di una cellula dagli acidi nucleici e dalle proteine si usano due solventi immiscibili, uno polare e uno apolare, poi si formano due fasi e si separano le componenti. Un’importante proprietà chimico-fisica di una soluzione è l’osmosi che consente il mantenimento del volume cellulare. È possibile distinguere il liquido intracellulare, contenuto all’interno della cellula, e il liquido extracellulare, presente all’esterno della cellula, che si divide a sua volta in liquido interstiziale, tra una cellula e l’altra, e plasma, contenuto nel sangue. Ma la composizione in soluti è molto diversa tra il comparto intracellulare ed extracellulare. Il liquido intracellulare rappresenta il 67% del liquido presente nel nostro corpo ed è separato dal liquido interstiziale, con cui può realizzare scambi (acqua) tramite le membrane cellulari. Il liquido interstiziale è separato dal plasma tramite l’endotelio del capillare, ma si verifica comunque uno scambio di materia attraverso l’endotelio che riveste il vaso sanguigno. Inoltre l’acqua può essere introdotta nel plasma sol attraverso l’apparato digerente che costituisce anche un passaggio di acqua in uscita; inoltre reni – viene filtrato sangue arterioso –, cute e polmoni rappresentano un punto di uscita dell’acqua. Il liquido interstiziale e il plasma hanno composizione simile, mentre molto diversa è la composizione del liquido intracellulare. Nel liquido intracellulare le proteine sono molto più abbondanti rispetto al plasma e al liquido interstiziale, inoltre sono cariche negativamente, quindi nel citosol sono contenute molte cariche negative che non possono passare attraverso la membrana plasmatica. Il fosfato invece è un tampone, quindi alla giusta concentrazione mantiene il pH fisiologico (pH = 7.4); tra i cationi si trova il magnesio perché una sua assenza non consente l’idrolisi di ATP e anche il potassio. Il liquido interstiziale contiene elevate quantità di cloro e bicarbonato che rappresenta il sistema tampone all’esterno della cellula, quindi si può aumentare o diminuire la quantità di bicarbonato in base alla quantità di anidride carbonica respirata, infatti anidride carbonica e acqua formano acido carbonico che, a pH fisiologico, si dissocia formando bicarbonato. È perciò possibile regolare il pH del sangue in funzione della respirazione (si tratta di un’azione inconsapevole). Per l’uomo la concentrazione fisiologica è 150 mM di NaCl che corrisponde al 0.9% di NaCl, cioè 9 g di sale in 1 L di acqua. La composizione dei liquidi extracellulari di organismi marini è molto simile a quella dell’acqua di mare. Le proprietà colligative sono: innalzamento ebullioscopico abbassamento crioscopico osmosi Nello step 1 è presente un tubo separato da un setto poroso (membrana selettivamente permeabile) che distingue due pari con due soluzioni diverse: nella parte a si trova glucosio 0.5 M mentre nella parte b glucosio 1 M, quindi l’acqua tende a passare dal compartimento a verso b, quindi si ha una differenza tra i due volumi e la pressione osmotica è quindi la forza applicata affinché le due parti rimangano nello stesso volume. L’osmolarità* è la caratteristica per cui alcuni soluti siano in grado di dissociarsi e altri no, in particolare rappresenta il numero di particelle osmoticamente attive per litro di soluzione ed è espressa in osmoli [Osm]. L’osmolarità è un valore discreto e quantificabile in senso assoluto attraverso un osmometro e definisce il numero di * particelle osmoticamente attive in una soluzione, mentre la tonicità è un qualcosa di relativo e di comparativo ad una cellula o al sangue. L’osmolarità può essere usata per paragonare due soluzioni mentre la tonicità è sempre usata per paragonare una soluzione e una cellula; inoltre l’osmolarità non fornisce informazioni riguardo cosa succeda a una cellula e al suo volume. In caso di soluzione ipertonica i globuli rossi perdono acqua e si raggrinziscono, mentre in una soluzione ipotonica la cellula assume acqua, quindi si rigonfia e poi esplode. In questo caso la driving force è il gradiente di concentrazione dell’acqua. Il potassio è stato “scelto” come catione all’interno della cellula perché a 150 mM di potassio si ha massima efficienza di sintesi. La metionina radioattiva è un indice di sintesi proteica mentre sull’asse dello ordinate è indacata la concentrazione di potassio eccitato, quindi nell’esperimento si valuta l’efficienza della sintesi proteica in funzione della concentrazione di potassio. In particolare la sintesi proteica è massima quando la concentrazione intracellulare di potassio è pari a 150 mM. In laboratorio È necessario preparare alcune soluzioni e quando si aggiunge soluto aumenta il volume della soluzione, quindi bisogna portare a volume solo alla fine. L’osmosi avviene tramite membrane di dialisi che presentano “buchi” che consentono solo il passaggio di molecole con dimensioni specifiche. Trasporto attraverso canali ionici Le proteine transmembrana possono avere quattro, cinque o sei subunità e a mano a mano che il numero di subunità aumenta il diametro del canale diminuisce (guarda lezione precedente). In particolare le giunzioni comunicanti sono formate da proteine transmembrana dette connessine, infatti sei connessine formano un connessone che consente di mettere in comunicazione il citosol di due cellule. La diffusione attraverso canali ionici non comporta la formazione di un legame tra lo ione e la proteina canale, ma interazioni di tipo elettrostatico, inoltre non richiede energia e avviene secondo gradiente di concentrazione. Infine tende a dissipare i gradienti di concentrazione (gli ioni passano dal compartimento a maggior concentrazione verso quello a minor concentrazione). I canali ionici sono proteine integrali di membrana con strutture molecolari e funzioni diverse, formati da una o più subunità; formano un poro acquoso transmembrana permeabile a ioni carichi positivi o negativi, quindi lo ione passa attraverso un canale ionico liberandosi del suo strato di acqua di solvatazione. Sono identificati in base a: selettività (Na+, Ca2+, K+, Cl-, H2O) meccanismi di apertura (voltaggio, agonisti, 2i messaggeri) cinetiche di attivazione (inattivazione e deattivazione) blocco da ioni, farmaci e tossine (recettori nicotinici) I canali ionici possono essere sempre aperti ma la maggior parte presenta un meccanismo di chiusura. Uno dei canali sempre aperti, a livello della membrana plasmatica, è quello per il potassio, quindi questo ione passa molto più facilmente attraverso la membrana rispetto al sodio, di conseguenza il potassio è più permeabile. In generale il potassio, seguendo il suo gradiente di concentrazione, tende sempre a uscire. La maggior parte dei canali ionici presenta in realtà un meccanismo di chiusura e si possono distinguere in base al meccanismo di regolazione dello stato di apertura-chiusura, per esempio: canali voltaggio-dipendenti (voltage-gated) (Na+, Ca2+, K+, Cl-) canali ligando-dipendenti: suddivisi in canali-recettori attivati da agonisti (dall’esterno) (ligand-gated) (nAChR, GABAAR, GlyR, iGluR, P2X-R) e canali attivati da secondi messaggeri (dall’interno) (Ca2+-gated, ATPgated, cyclic- nucleotide-gated, IP3-gated, TRP, store-operated Ca2+ channels) canali meccano-sensibili (canali stretch) canali luce-sensibili canali temperatura-sensibili L’apertura del canale quindi avviene perché si verifica un cambio conformazionale della proteina che può essere dovuto, per esempio, a una cambiamento della differenza di potenziale a livello della membrana (canali voltaggio-dipendenti). Nel caso dei canali ionici chemio-dipendenti (distinguere tra ligando extracellulare e ligando intracellulare) il canale lega una molecola e questo legame determina l’apertura del canale. Esistono poi canali meccano-sensibili oppure canali temperatura-sensibili oppure canali luce-sensibili (non sono presenti a livello della retina, infatti qui si trovano canali chemio-sensibili). LEZIONE 4 – 14/10/2022 Un esempio di canale voltaggio dipendente è il canale per Na+ che può avere tre conformazioni diverse, cioè aperto, chiuso e inattivato. Il canale per Na+ è l’unico canale a presentare queste tre conformazioni come conseguenza del fatto che il canale presenti due “porte”, dette porta di attivazione e porta di inattivazione. Nella conformazione chiusa la porta di attivazione è chiusa e quella di inattivazione è aperta; questa conformazione viene definita di “standby” perché il canale è pronto ad aprirsi non appena arriva il segnale, quindi quando il canale si trova nella sua conformazione chiusa è in grado di rispondere a una variazione di potenziale a cavallo della membrana. Quando viene percepita la variazione del potenziale a livello della membrana la porta di attivazione si apre, quindi nella conformazione aperta entrambe le porte sono aperte, di conseguenza questa conformazione consente l’entrata di Na+ e dopo circa un millisecondo la porta di inattivazione si chiude mentre la porta di attivazione rimane aperta e il canale passa quindi nello stato inattivato. Nello stato inattivato il canale per Na+ non risponde a nessuna variazione di potenziale indipendentemente dalla sua entità. Dopo circa un millisecondo il canale torna nello stato chiuso. Un canale ionico ha caratteristiche specifiche, infatti presenta un filtro di selettività che garantisce il passaggio di un solo anione o catione, infatti l’α-elica presenta uno strato “esterno” formato da amminoacidi idrofobici che interagiscono con il doppio strato fosfolipidico e uno strato “interno” formato da amminoacidi idrofilici che interagiscono con il canale. Quindi si hanno residui che protrudono all’interno del canale e hanno cariche positive o negative e si possono quindi selezionare anioni o cationi perché cariche dello stesso segno si respingono. Na+ e K+ entrano sempre anidridi, quindi senza l’alone di idratazione, all’interno di un canale. Quindi se il potassio ha un alone di idratazione serve un’energia minore per rimuoverlo rispetto al sodio, quindi la forza con cui il potassio attrae le molecole d’acqua è minore rispetto a quella del sodio e questo fattore deve essere considerato nella cinetica di ingresso dello ione nel canale. All’interno del canale ciascuna subunità ha dei residui che protrudono verso l’interno e, in questo caso, si tratta di atomi di ossigeno con una parziale carica negativa perché elettronegativi, quindi mimano il comportamento dell’acqua infatti sono presenti atomi di ossigeno elettronegativi con una parziale carica negativa che protrudono nel canale e interagiscono con lo ione (così come l’acqua, come dipolo, interagisce con lo ione nell’ambiente acquoso). Il catione quindi passa e sembra trovarsi in ambiente acquoso, e l’interazione avviene tramite le forze di Van der Waals. Nel caso del canale del potassio, questo ione ha una dimensione tale da riuscire a formare un legame con tutti e quattro gli atomi di ossigeno che protrudono all’interno del canale, mentre il sodio nel canale del potassio non può passare perché, essendo più piccolo, contatta solo due atomi di ossigeno e non tutti e quattro quindi non può interagire con il canale del potassio. Un catione più grande quindi non attraversa il canale, ma lo stesso vale per un catione più piccolo in quanto non riesce a formare un sufficiente numero di legami con i residui che protrudono; in un canale quindi passa uno e un solo ione specifico ma questo vale solo per un canale a quattro subunità (voltaggio-dipendenti). Per uno ione esiste più di una tipologia di canale a seconda della cellula e a seconda della tipologia di risposta che deve fornire. I canali ionici sono estremamente selettivi nei confronti dei vari ioni e la selettività può essere conferita da una combinazione dei seguenti fattori: presenza di cariche elettriche fisse sulla parete interna del canale raggio anidro dello ione grado di idratazione dello ione (più lo ione è idratato e maggiore è il ∆G con cui lo ione abbandona l’ambiente acquoso, cioè l’ambiente esterno per passare all’interno) Acquaporine In passato si pensava che l’acqua passasse attraverso le membrane solo tramite un processo di osmosi ma questo non è sufficientemente rapido per spiegare la velocità di assorbimento dell’acqua di una cellula, infatti sono coinvolte le acquaporine che sono canali sempre aperti per consentire il movimento dell’acqua secondo gradiente attraverso la membrana plasmatica. Esistono dieci isoforme di acquaporine e in generale le acquaporine possono essere divise in due classi: acquaporine classiche: consentono solo il passaggio dell’acqua acquagliceroporine: consentono il passaggio dell’acqua e del glicerolo La struttura molecolare delle acquaporine è rappresentato dal “modello a clessidra”. Inoltre le molecole d’acqua passano una alla volta all’interno del canale creato dalle acquaporine. In generale la cellula separa un ambiente interno da un ambiente esterno, quindi la membrana presenta non solo macromolecole biologiche diverse tra ambiente interno ed esterno ma anche molecole inorganiche diverse. Per esempio all’interno della cellule sono contenute moltissime proteine che, a pH fisiologico, hanno cariche negative, quindi l’interno della cellula è carico negativamente mentre l’esterno è carico positivamente. Tutte le cellule, per essere vive, devono avere separazione di cariche a livello della membrana che scompare quando la cellula muore. Le cariche di segno opposto, anche se separate dalla membrana plasmatica, tendono comunque a essere attirate l’una verso l’altra, quindi sono localizzate immediatamente all’interno e all’esterno della membrana; mentre quello che è al centro della cellula o molto al di fuori della cellula è elettricamente neutro. Quindi le cariche negative sono immediatamente sotto la membrana e quelle positive immediatamente sopra, di conseguenza la membrana plasmatica separa anche ioni. In tutte le cellule a riposo esiste una popolazione di canali del K + sempre ‘aperti’ attraverso i quali il K+ è libero di muoversi a seconda del gradiente di concentrazione e del gradiente elettrico (la membrana è permeabile al K+).Al contrario, nelle cellule a riposo, il numero di canali per il Na+ aperti è ridotto (la membrana è poco permeabile al Na+). In ogni momento il numero, il tipo e lo stato di apertura/chiusura dei canali determina la permeabilità della membrana ai diversi ioni, infatti la membrana è in grado di modulare continuamente il passaggio degli ioni. Tecnica patch-clamp Si tratta di una tecnica per studiare i canali ionici e si usa una micropipetta di vetro con un elettrodo all’interno che per suzione crea una zona in cui la membrana plasmatica è isolata dal resto, quindi si può studiare uno specifico canale.  Si può avere un patch in cui viene distaccata una porzione della membrana e quindi si studia il canale o i canali presenti in quella porzione (membrane cell- configuration) oppure l’elettrodo entra nella cellula, quindi si osserva quello che succede all’interno della cellula (whole-cell configuration). Viene imposto un voltaggio tra un elettrodo all’interno della pipetta e un elettrodo di riferimento in contatto con una soluzione salina, quindi la corrente viene generata dagli ioni in movimento attraverso la membrana. Se il patch contiene un singolo canale con due stadi conformazionali (aperto/chiuso) la corrente si muove tra due livelli a seconda che il canale sia aperto o chiuso; l’intensità della corrente tra lo stato aperto e chiuso riflette la velocità del flusso degli ioni attraverso un canale. Trasporti attraverso le membrane biologiche I trasporti attraverso le membrane biologiche sono divisi innanzitutto in base all’utilizzo o meno di energia. Se non richiedono energia si parla di diffusione semplice o, se non si forma un legame con nessuna proteina, si parla di canali ionici. Se invece richiedono la formazione di un legame intervengono proteine dette carriers (sono proteine trasportatrici che trasportano il soluto secondo gradiente di concentrazione, ma il termine indica anche molecole che nel sangue trasportano molecole lipofile, come le globuline leganti gli ormoni sessuali). Il trasporto che richiede ATP viene diviso in due categorie, nella prima viene coinvolta una molecola o uno ione trasportati contro gradiente di concentrazione da proteine che funzionano come carriers o pompe tramite consumo di ATP. Esistono anche meccanismi come endocitosi, esocitosi, fagocitosi e pinocitosi con cui possono essere trasportate anche molecole più grandi. Se un soluto passa da solo in unica direzione si parla di uniporto; se invece passano due soluti nella stessa direzione si parla di simporto e se passano due soluti in direzioni opposte si parla di antiporto. Trasporto attivo o diffusione facilitata Per questa tipologia di trasporto non è richiesta energia metabolica sotto forma di ATP perché avviene secondo gradiente di concentrazione, quindi la driving force del processo è il gradiente di concentrazione; inoltre i soluti si muovono lungo un gradiente di concentrazione legati a un carrier. I carrier sono dotati di un legame specifico a un soluto, quindi il soluto si lega a un carrier che subisce un cambiamento conformazionale che consente il trasferimento del soluto attraverso la membrana plasmatica, quindi è come se il carrier si “aprisse dall’altra parte” della membrana. Un carrier quindi esiste in due stati, uno poco affine al soluto e uno molto affine e quindi il carrier, quando deve legare un soluto, è presente nella sua forma molto affine, ma quando deve rilasciarlo è presente nella conformazione poco affine. L’affinità del carrier è reversibile, quindi dipende dal gradiente di concentrazione del soluto, di conseguenza il carrier è più affine al soluto dal lato della membrana in cui il soluto è presente in concentrazione maggiore (siccome il soluto è trasportato secondo gradiente, a seconda della sua concentrazione, il soluto può entrare o uscire e quindi la conformazione del carrier – molto affine o poco affine – dipende dalla concentrazione del soluto). I trasportatori hanno le caratteristiche degli enzimi. Si può parlare di modello del flip flop, infatti cambiano conformazione per rilasciare il substrato dall’altro lato e poi ritornano alla conformazione originale per legare un’altra molecola di substrato. Ma la velocità di trasporto è più lenta rispetto ad altre tipologie di canali, come per esempio un canale ionico. I carriers agiscono cataliticamente in modo identico agli enzimi, infatti: sono soggetti a saturazione possono essere bloccati dagli inibitori competitivi e non competitivi hanno un’elevata dipendenza termica e dal pH seguono una cinetica del tipo Michaelis-Menten Sulle ordinate si trova il flusso, cioè la velocità di trasporto di un soluto, mentre sulle ascisse la concentrazione del soluto trasportato. Anche in questo caso la curva ha un andamento iperbolico che tende alla saturazione (curva verde) come tipico degli enzimi. La Km è la concentrazione di soluto per cui si ha ½ Jmax. In questo caso la saturazione a cui tende la cinetica di Michaelis Menten, indica che quando si raggiunge la velocità massima, tutte le proteine carrier presenti sulla membrana di quella cellula sono impegnate nel trasporto. Ma in realtà si può aumentare la velocità di trasporto aumentando il numero di proteine sulla membrana, quindi in questo caso si va a saturazione più tardi (nel grafico la curva sarebbe un po’ più al di sopra). GLUT Si tratta di una famiglia di dodici trasportatori: GLUT (glucose transporter); in particolare GLUT1 è stato il primo ad essere caratterizzato, infatti possiede dodici segmenti transmembrana, estremità N e C terminali citoplasmatiche, inoltre presenta due siti putativi di N-glicosilazione. L’insulina è un ormone ipoglicemizzante, quindi ha il compito di diminuire la concentrazione di glucosio nel sangue. In assenza di insulina non si ha necessità di rimuovere glucosio dal sangue, quindi GLUT4 – presente nelle cellule adipose e muscolari – è contenuto all’interno di vescicole citoplasmatiche e quindi non funziona. In presenza di insulina invece questa molecola si lega a un suo recettore specifico, con conseguente attivazione di una via cellulare che porta alla fusione delle vescicole contenenti GLUT4 con la membrana plasmatica. GLUT4 viene quindi esposto in membrana e può trasportare glucosio dal sangue alla cellula secondo gradiente di concentrazione. GLUT2 invece è costitutivo di membrana, quindi è sempre presente (indipendentemente dalla concentrazione di insulina è sempre aperto e quindi funzionante). In questo caso l’insulina viene comunque secreta e lega un suo recettore, quindi attiva una via in cui il glucosio, una volta entrato nella cellula, viene fosforilato a G6P. Di conseguenza si ha un continuo gradiente del glucosio dall’esterno verso l’interno della cellula epatica. LEZIONE 5 – 20/10/2022 Trasporti attivi I trasporti attivi avvengono contro gradiente di concentrazione e usano in modo diretto o indiretto l’ATP, infatti vengono suddivisi in primari o secondari. I trasporti attivi primari accoppiano all’idrolisi di ATP il trasporto di uno ione, quindi la stessa proteina idrolizza ATP e trasporta gli ioni, come nel caso della sodio-potassio ATPasi; in questo caso la driving force necessaria per il trasporto contro gradiente dello ione è fornita dal legame ad alta energia del fosfato in posizione γ dell’ATP. I trasporti attivi secondari coinvolgono sempre minimo due soluti, quindi si accoppia al trasporto secondo gradiente, generalmente di Na+, il trasporto di un altro soluto, infatti il trasporto secondo gradiente di Na+ cede energia sufficiente per trasportare contro gradiente un altro soluto. I trasporti secondari vengono definiti secondari ai primari perché Na+, il cui passaggio secondo gradiente viene sfruttato nel trasporto attivo secondario (Na+ entra nella cellula), è stato precedentemente trasportato contro gradiente nel trasporto attivo primario, quindi si è generato un gradiente di Na+ che viene poi utilizzato nel trasporto attivo secondario per trasportare contro gradiente un altro soluto. Quindi si avranno antiporti o simporti ma Na+ entra sempre all’interno della cellula. L’ATP sintetasi funziona come tale se gli H+ passano dallo spazio intermembrana alla matrice mitocondriale, mentre funziona come ATPasi quando gli H+ si muovono dalla matrice mitocondriale allo spazio intermembrana, quindi funziona come una pompa. La sodio-potassio ATPasi è ubiquitaria e genera un gradiente che viene sfruttato per il trasporto di altri soluti, quindi funziona come l’H+-ATPasi. CFTR è un trasportatore degli ioni cloro nei polmoni, la cui mutazione è alla base della fibrosi cistica. I lisosomi contengono un elevato numero di enzimi in grado di distruggere varie componenti cellulari, ovvero idrolasi acide (hanno optimum di pH tra 5 e 5.5; cioè massima attività catalitica) e il pH acido nei lisosomi è garantito da una H+-ATPasi che trasporta gli ioni contro gradiente, quindi all’interno del lisosoma si crea l’ambiente adatto per il funzionamento ottimale delle idrolasi. Se il lisosoma si rompe le idrolasi incontrano un ambiente basico (pH = 7.4), quindi la loro azione degradativa viene rallentata perché lontane dal loro optimum di pH. Il Ca2+ è presente in bassissime concentrazioni nel citosol e in altissime concentrazioni nell’ambiente extracellulare e nel reticolo endoplasmatico grazie a due pompe che idrolizzano ATP e che pompano Ca2+ nell’ambiente extracellulare o nel reticolo endoplasmatico. Na+/K+ ATPasi La sodio potassio ATP-asi è un tetramero, quindi è formata da quattro subunità uguali a due a due (di cui due subunità α che attraversano la membrana e due subunità β). La subunità α è responsabili del passaggio del Na+ e del K+, inoltre presenta un lato citoplasmatico che lega Na+ e ATP e un lato extracellulare che lega il K+ e la ouabaina (contenuta nella Digitalis purpurea); la subunità β sembra invece essere coinvolta nel corretto posizionamento della subunità α. La sodio potassio ATPasi è responsabile del mantenimento del gradiente di concentrazione di sodio e potassio. Infatti la pompa lega ATP e tre Na+, poi l’ATP viene idrolizzato e la pompa passa attraverso un intermedio fosforilato, quindi trasporta Na+ fuori dalla cellula. Poi si legano due K+ con conseguente auto defosforilazione, quindi K+ entra nella cellula e infine la pompa lega di nuovo l’ATP per iniziare un nuovo ciclo. La pompa sodio potassio ATP-asi trasporta nettamente una carica positiva all’esterno, quindi consente il mantenimento del potenziale di membrana e quindi mantiene la separazione di cariche a livello della membrana, cioè si ha a disposizione un potenziale elettrico. I gradienti per Na+ e K+ sono infatti necessari per: potenziale di membrana potenziali d’azione potenziali sinaptici potenziali generatori Il gradiente del sodio è importante, non solo per generare e mantenere cariche positive all’esterno della membrana, ma anche perché il trasporto del sodio è usato come trasporto secondario secondo gradiente, quindi è coinvolto nel trasporto attivo secondario di altri soluti. In una cellula la concentrazione di calcio è 10-7 M, quindi il calcio è molto presente nello spazio extracellulare e nel reticolo endoplasmatico. A livello della membrana plasmatico si trovano le PMCA (Plasma Membrane Calcium ATPase) che viene utilizzata per espellere all’esterno della cellula il Ca2+ attraverso la membrana cellulare, mentre sul reticolo endoplasmatico si trovano le SERCA (Smooth Endoplasmic Reticulum Calcium ATPase) che sono fondamentali per sequestrare il Ca2+ del reticolo endoplasmatico/sarcoplasmatico I trasporti attivi secondari sono abbinati a quelli primari, inoltre spessissimo utilizzano il gradiente elettrochimico di Na+ come fonte energetica. Un esempio è il cotrasporto (simporto/antiporto) in cui il substrato si muove contro gradiente e il Na+ si muove secondo gradiente. Un esempio è SGLT: la pompa sodio-potassio ATPasi genera un gradiente di Na+ che rientra nella cellula secondo gradiente e fornisce l’energia sufficiente per il trasporto contro gradiente del glucosio. Quindi il trasporto di una molecola di glucosio corrisponde al trasporto di due ioni Na+. SGLT è presente in tutte le cellule perché il glucosio deve entrare in una cellula anche contro gradiente. Ogni ione ha in generale più di un meccanismo di trasporto. La sodio potassio ATP-asi porta Na+ all’esterno, inoltre a livello del lume intestinale il glucosio è molto più diluito rispetto all’ambiente intracellulare, quindi serve un trasporto attivo secondario che coinvolge SGLT, quindi una molecola di glucosio e due Na+ entrano nella cellula. Ma a questo punto il glucosio è molto concentrato all’interno della cellula, quindi serve un trasporto passivo, cioè GLUT, in modo che il glucosio possa uscire dall’enterocita ed entrare in circolazione attraverso i capillari localizzati a livello della parte basale dell’enterocita. Il movimento del glucosio dall’enterocita al sangue avviene secondo gradiente mentre il movimento dal lume intestinale all’ambiente intracellulare avviene contro gradiente. Il trasporto attivo secondario coinvolge anche lo iodio, fondamentale per sintetizzare gli ormoni tiroidei, oppure esiste anche il trasporto sodio-bicarbonato che serve per controllare il pH. Il numero I è un simporto in cui viene trasportato il sodio e il glucosio o gli amminoacidi; mentre il numero II indica il simporto di sodio e altri ioni; il terzo invece è un antiporto sodio dipendente, quindi il sodio entra e l’altra molecola esce; infine nel numero IV è coinvolto il trasporto della CO2. Le acquaporine sono molto veloci nel trasporto delle molecole, mentre un canale ionico è più lento e i carrier hanno un intervallo di tempo ancora maggiore perché passano attraverso un intermedio con legami covalenti che rallentano quindi il trasporto. Nella via transcellulare il passaggio della molecola avviene attraverso il corpo della cellula, mentre nella via paracellulare le molecole passano attraverso gli spazi lasciati liberi dalle giunzioni e questo è fondamentale a livello renale, in cui sono presenti i podociti, infatti il primo passaggio della filtrazione a livello renale avviene attraverso le interdigitazioni dei podociti (passano soluti di piccolo peso molecolare, come urea o ioni). Quindi i podociti sono il primo passaggio di filtrazione del sangue. Endocitosi, esocitosi e pinocitosi Il primo evento che innesca l’endocitosi è il legame tra il recettore e il ligando, quindi la membrana si invagina e viene reclutata la clatrina formando la fossetta di clatrina che poi si distacca dalla membrana e diventa una vescicola endocitica grazie alla dinamina. La vescicola perde il rivestimento di clatrina che viene riciclata sulla membrana plasmatica, poi la vescicola si fonde con il lisosoma e il recettore viene riciclato sulla membrana, mentre il ligando va al Golgi per essere elaborato.. L’endocitosi può essere di tre tipologie: fagocitosi, pinocitosi oppure endocitosi mediata da recettore. La fagocitosi avviene per esempio ad opera di amebe per catturare cibo oppure nel caso di organismi pluricellulari, infatti è un meccanismo di difesa contro microrganismi e serve anche per l’eliminazione di cellule vecchie o danneggiate (leucociti, macrofagi e neutrofili). Le proteine SNARE, nell’esocitosi, sono accoppiate, infatti l’interazione tra v-SNARE e t-SNARE consentono il rilascio del contenuto vescicolare durante il processo di esocitosi. Dal sangue al tessuto periferico le molecole passano tramite transcitosi, infatti le proteine plasmatiche sono concentrate nelle caveole, cioè invaginazioni delle cellule endoteliali (dette endoteliociti), e subiscono endocitosi; poi il trasporto della vescicola endocitica attraverso la cellula endoteliale avviene grazie al citoscheletro e poi la vescicola si fonde con la membrana plasmatica con conseguente esocitosi. LEZIONE 6 – 21/10/2022 La membrana è una barriera biologica che isola due differenti ambienti con composizione diversa, non solo da un punto di vista di molecole chimiche ma anche da un punto di vista elettrico, quindi a cavallo della membrana è presente un gradiente elettrochimico generato e mantenuto dalla sodio potassio ATP-asi che idrolizza ATP e trasporta all’esterno tre ioni sodio e all’interno due ioni potassio, quindi genera un gradiente elettrico perché trasporta all’esterno una carica netta positiva e un gradiente chimico perché trasporta contro gradiente sodio e potassio. Il caso a si osserva solo in caso di cellule morte, infatti una cellula viva ha sempre una differenza di potenziale a cavallo della membrana perché produce ATP e quindi la pompa sodio potassio ATP-asi funziona, di conseguenza crea un gradiente elettrochimico. Nel caso b il liquido intracellulare ha più cariche negative mentre il liquido extracellulare ha più cariche positive, quindi si osserva una differenza di cariche e questo implica una differenza di potenziale tra il liquido intracellulare ed extracellulare, e quindi a cavallo della membrana. Le cariche di segno opposto tendono ad attrarsi, quindi le cariche si trovano immediatamente sopra e sotto la membrana mentre nel liquido immediatamente circostante le cariche sono equamente distribuite e quindi è un ambiente neutro. Quindi a cavallo della membrana è presente un gradiente elettrochimico e questo implica disponibilità di energia per compiere un lavoro. La differenza di potenziale è maggiore tanto maggiore è il numero di cariche presenti a cavallo della membrana. La membrana, avendo una separazione di cariche, è polarizzata e ha quindi un potenziale per compiere un lavoro. La differenza di potenziale a cavallo della membrana è di -70 mV, in cui il meno indica che l’eccesso di cariche negative è all’interno della cellula. La membrana cellulare si comporta come un circuito con quattro componenti: condensatore, resistenza del bilayer fosfolipidico (Rm), generatore di elettricità (separazione di cariche tra un lato e l’altro della membrana) e resistenza da parte di proteine all’interno della cellula (Ri). La membrana può essere vista come una componente fisica ambivalente, in particolare è un isolante perché non consente il passaggio di ioni, ma quando i canali si aprono, gli ioni, e quindi le cariche, possono passare, di conseguenza la membrana ha la capacità di accumulare cariche. La capacità della membrana consiste nella sua capacità di accumulare cariche a 𝑄 cavallo del doppio strato fosfolipidico e ha formula 𝐶 = ∆𝑉. La membrana è caratterizzata anche da un’altra proprietà detta conduttanza, infatti è formata da canali ionici che si possono aprire e può quindi essere attraversata da cariche elettriche, quindi può condurre elettricità in entrambi i sensi. La permeabilità è la capacità di una membrana di far passare una molecola mentre la conduttanza è il flusso effettivo di una molecola attraverso una membrana (dipende dalla permeabilità e ne costituisce una misura). Tutte le cellule a riposo presentato una differenza di potenziale con l’interno della cellula carico negativamente rispetto all’esterno e questo viene definito potenziale di membrana a riposo; la quantità di cariche totali separate è piccola e le differenze di potenziale sono misurate in millivolt [mV]. L’origine del potenziale è legato a: ineguale distribuzione degli ioni tra il mezzo intracellulare ed extracellulare  permeabilità selettiva della membrana per gli ioni, dovuta alla presenza di canali ionici di diverso tipo, ciascuno dei quali permeabile solo ad alcune, e spesso ad una sola, delle specie ioniche presenti in soluzione (la permeabilità di K+ è circa 50-100 volte più elevata della permeabilità di Na+, quindi l’entrata di Na+ è inferiore all’uscita di K+ (dipende dal numero e dal tipo di canali ionici aperti) presenza di anioni proteici nel liquido intracellulari non diffusibili Nel disegno a lato viene rappresentato in arancione l’interno della cellula e in verde l’ambiente extracellulare. Si considera un caso ideale in cui si tiene conto solo il potassio. Il potassio tende a uscire dalla cellula secondo gradiente di concentrazione (si parla di Fc = forza chimica), quindi mano a mano che il potassio esce l’esterno della cellula diventa sempre più positivo, quindi una forza elettrica (Fe) spinge il potassio verso l’interno della cellula perché nell’ambiente intracellulare ci sono più cariche negative. Quindi all’equilibrio Fe e Fc si eguagliano, di conseguenza il flusso netto di K+ è 0, infatti il flusso in uscita e in entrata di K+ sono uguali, ma il potenziale a cavallo della membrana è -90 mV. Quindi il potenziale di equilbrio di K+ è -90 mV. La forza chimica di K+ è una pressione con formula indicata * e si sostituiscono i valori riportati nell’immagine sopra. La forza elettrica invece comprende la valenza dello ione. All’equilibrio si parla di potenziale elettrochimico che è dato dalla somma della forza elettrica, Fe, e della forza chimica, Fc. Quindi il potenziale elettrochimico del potassio è uguale a 0. * Quindi -90 mV, cioè il potenziale di equilibrio del potassio (Ek), è il valore di potenziale di membrana per cui K+ sono in equilibrio elettrochimico e la concentrazione interna di K+ è molto maggiore della concentrazione esterna (150 mM/5 mM). Nelle cellule Vm è meno negativo del potenziale di equilibrio del potassio, ma ci si avvicina. Se la differenza di potenziale misurata a cavallo della membrana è differente dal potenziale di equilibrio del potassio esiste una forza elettromotrice data dalla differenza dei due potenziali. Per esempio -70 mV -(-90 mV)= +20 mV che tende a far uscire il potassio, quindi in una cellula in condizione di riposo il potassio tende a uscire dalla cellula per un gradiente elettrochimico. Le cellule però non sono permeabili solo al potassio e quando nella membrana ci sono canali aperti per più specie ioniche bisogna tener conto, oltre alla differenza di concentrazione, anche delle permeabilità relative. Nel disegno a lato viene rappresentato in arancione l’interno della cellula e in verde l’ambiente extracellulare. Si considera un caso ideale in cui si tiene conto solo di sodio e cloro. Il sodio tende a entrare nella cellula secondo gradiente di concentrazione, detto forza chimica (Fc), quindi mano a mano che entra nella cellula si accumulano cariche positive all’interno. Di conseguenza un forza elettrica (Fe) spinge il sodio a uscire dalla cellula. Quindi, svolgendo i calcoli, si osserva che il potenziale di equilibrio de Na+ è di +60 mV. Considerando le reali concentrazioni del sodio (15 mM/150 mM) il potenziale di Na+ è pari a +60 mV, un valore molto lontano da quello di Vm, per cui Fem per Na+ è -70 mV - (+60 mV) = -130 mV che tende a fare entrare il sodio. Quindi il sodio tende a entrare molto più velocemente rispetto al potassio che tende però a entrare, perché la differenza di potenziale è molto maggiore. Il potenziale di membrana di una cellula, detto potenziale di azione, è generato prima dal passaggio di sodio e poi di potassio, quindi oscilla tra +60 mV e -90 mV. Le cellule però non sono permeabili solo al potassio e al sodio e quando nella membrana ci sono canali aperti per più specie ioniche bisogna tener conto, oltre alla differenza di concentrazione, anche delle permeabilità relative. Ogni cellula avrà un potenziale di riposo (Em) dato dalla somma dei potenziali di equilibrio di ogni ione, calcolabile in base all'equazione di Nernst, ma corretto per la conduttanza (gi ) della membrana allo stesso ione. La conduttanza (G) è il flusso effettivo di una molecola attraverso una membrana (dipende dalla permeabilità e ne costituisce una misura). Quindi in un caso reale si prendono in considerazione tutti gli ioni, quindi anche la permeabilità di ogni singolo ione. Dopo aver svolto i calcoli si ottiene un valore di Vm = -70 mV. Vm è in gran parte dovuto al movimento di potassio verso l’esterno della cellula, secondo il suo gradiente di concentrazione. Inoltre è importante sottolineare che il potenziale di membrana non corrisponde al potenziale di equilibrio del potassio perché sono aperti anche un piccolo numero di canali del sodio e alcuni ioni sodio diffondono verso l’interno, annullando in piccola parte l’effetto del potassio. Normalmente il cloruro si trova in equilibrio elettrochimico (ECl = Vm) e può essere ignorato. Il 20% della Vm è dovuto alla diretta azione della pompa Na+/K+ ATPasi perché è elettrogenica e trasporta una carica netta positiva fuori dalla membrana plasmatica (3 Na+ out / 2 K+ in); l’80% è dovuto alla diffusione passiva degli stessi due ioni Na+ e K+. Ma la differenza di concentrazione tra il liquido intracellulare e il liquido extracellulare è dovuta sempre al lavoro della pompa Na+/K+ ATPasi che quindi fornisce un contributo indiretto. Quindi la pompa Na+/K+ ATPasi trasporta sodio all’esterno della cellula e potassio all’interno, mantenendo un potenziale elettrochimico. Il potassio, essendo molto permeabile, fornisce un contributo maggiore rispetto al sodio, quindi il potenziale di membrana è molto più vicino al potenziale di equilibrio del potassio rispetto a quello del sodio. Il potenziale di membrana tuttavia non arriva a -90 mV perché il sodio in parte tende a entrare all’interno della cellula, quindi la diffusione netta degli ioni sodio neutralizza alcune cariche e quindi il potenziale di membrana arriva a -70 mV. Il potenziale di membrana è determinato quindi dal movimento di cariche positive. Posto che in un neurone a riposo la permeabilità a K+ è 1 e a Na+ è 0.04, ciascuno ione si muoverà secondo gradiente e sarà K+ a fornire il contributo maggiore. Quindi il potenziale di riposo di una cellula è determinato dall’asimmetrica distribuzione degli ioni nell’ambiente intracellulare ed extracellulare dalla differente conduttanza alle diverse specie ioniche. Non solo i neuroni, ma tutte le cellule viventi hanno una differenza di potenziale elettrico tra il lato esterno e quello interno della membrana di circa -70 mV (dipende dal tipo cellulare). LEZIONE 7 – 27/10/2022 Riassumendo La membrana è un oggetto che separa un ambiente interno da un ambiente esterno che hanno quindi differente composizione di ioni e molecole organiche. Di conseguenza all’interno della cellula sono presenti molti anioni proteici, quindi l’ambiente intracellulare è carico negativamente mentre l’esterno è carico positivamente perché si ha preponderanza di cationi, soprattutto di Na+; per questo motivo la membrana presenta un gradiente elettrochimico. Gli ioni possono passare attraverso la membrana in vari modi, per esempio attraverso un processo di diffusione semplice oppure attraverso un canale ionico o con una proteina carrier, mentre i trasporti attivi comprendono pompe e trasporti attivi secondari. La sodio-potassio ATPasi è una pompa che genera un gradiente elettrochimico perché trasporta all’esterno una carica netta positiva (tre Na+ e due K+) e genera un gradiente chimico di sodio e potassio; quindi la pompa sodio-potassio ATPasi energizza tutti gli altri trasporti secondari. Inoltre la sodio-potassio ATPasi è responsabile del potenziale di membrana della cellula a riposo, ma questo è dato anche dal fatto che la membrana sia selettiva, infatti passano solo certi ioni e i canali ionici possono aprirsi e chiudersi. Una cellula morta ha potenziale di membrana pari a 0 perché la pompa sodio-potassio non funziona, mentre in una cellula viva è pari a -70 mV. Se arriva uno stimolo si aprono i canali ionici, quindi il potenziale di membrananon è più - 70 mV perché sono passate delle cariche; quindi qualunque sia lo stimolo determina l’apertura di un canale con conseguente cambiamento del potenziale di membrana. Gli eventi in sequenza sono quindi stimolo, apertura del canale e variazione del potenziale di membrana. Gli stimoli avvengono nelle cellule eccitabili, cioè cellule che possono produrre segnali elettrici in risposta a uno stimolo (come neuroni, muscolo striato, muscolo liscio e cardiaco); mentre il potenziale di riposo è un potenziale costante che viene mantenuto in condizioni di riposo (è -70 mV), ma il valore del potenziale di membrana può essere variato in risposta a uno stimolo, tuttavia una cellula tende comunque a tornare verso il potenziale di riposo. Se il potenziale di membrana aumenta, per esempio verso il potenziale del sodio (+60 mV), la cellula va incontro a depolarizzazione* e si aprono quindi canali ionici che consentono il passaggio del sodio secondo gradiente (entra all’interno) quindi il potenziale di membrana diventa sempre più positivo. Se invece si parte da un valore positivo del potenziale di membrana e si torna verso il potenziale di riposo si parla di ripolarizzazione. Se il potenziale di membrana diminuisce, quindi si va verso un valore più negativo, si parla di iperpolarizzazione. * per esempio se si passa da - 70 mV a +30 mV si parla di depolarizzazione In una cellula eccitabile le variazioni di flussi ionici sono variazioni di permeabilità in risposta ad un evento. Per esempio uno stimolo sensoriale (come un’onda sonora che stimola le terminazioni nervose dell’orecchio), oppure una variazione del campo elettrico (come in prossimità di un canale ionico di una cellula eccitabile) o un’interazione con un messaggero chimico (per esempio un recettore della membrana plasmatica di una cellula eccitabile) Nel potenziale di azione si ha in sequenza depolarizzazione, ripolarizzazione e iperpolarizzazione. Nel potenziale graduata questi tre eventi non sono successivi. SEGNALI ELETTRICI I segnali elettrici possono essere condotti da due diversi potenziali, detti: potenziali graduati potenziali d’azione Potenziali graduati Il potenziale graduato è il primo potenziale che avviene dopo lo stimolo. Variazioni localizzate della Vm (in seguito ad uno stimolo), che possono assumere ampiezze variabili Stimolo èapertura dei canali ionici (generalmente per il Na+)èNa+ entra nella cellula secondo gradiente èdepolarizzazione L’intensità dello stimolo è proporzionale al ê numero di canali che si aprono è proporzionale alla ê ampiezza del potenziale graduato Il segnale avviene a livello di un punto preciso della membrana ma poi il potenziale si propaga in tutte le direzioni a livello di una regione della membrana, quindi viene definito locale o graduato. I potenziali graduati sono variazioni localizzate della differenza di potenziale a cavallo della membrana in seguito a uno stimolo che possono assumere ampiezze variabili. Vengono definiti graduati perché sono proporzionali all’intensità dello stimolo (la variazione dell’ampiezza è direttamente proporzionale all’intensità dello stimolo, quindi l’ampiezza indica l’intensità del potenziale) mentre vengono definiti locali perché si realizzano solo a livello di una regione precisa della membrana. L’intensità dello stimolo è proporzionale al numero di canali che si aprono, quindi più lo stimolo è intenso più elevata è la variazione del potenziale a cavallo della membrana e maggiore è l’ampiezza del potenziale graduato. I potenziali graduati possono essere depolarizzanti o iperpolarizzanti, quindi nel primo caso il potenziale di membrana tende a essere più positivo. La variazione di un potenziale graduato si misura in mV in funzione del tempo. Uno stimolo induce l’apertura di canali meccano-dipendenti per Na+ e l’entrata di Na+ nella cellula implica una depolarizzazione (il potenziale diventa più positivo) che dura fino a 1 microsecondo dopo la fine dello stimolo. I canali ionici per Na+ si chiudono e il potenziale di membrana torna al valore di riposo grazie all’intervento della pompa sodio-potassio ATPasi (se si chiudessero i canali ionici e non intervenisse la pompa sodio-potassio ATPasi il valore del potenziale di membrana non cambierebbe, infatti la pompa sodio-potassio ATPasi funziona sempre ma il suo effetto non è visibile perché si ha entrata massiva di Na+ nella cellula). Nel caso dell’iperpolarizzazione si ha una diminuzione del potenziale di membrana e lapompa sodio-potassio ATPasi ripristina il potenziale di riposo. I potenziali graduati hanno tre fasi: generazione (instaurarsi di uno stimolo) propagazione fine La durata del potenziale graduato è proporzionale alla durata dell’evento che lo ha generato, cioè lo stimolo. Nei potenziali graduati variazioni locali del potenziale si propagano dal punto in cui sono generati con decadimento a distanza breve: eventi circoscritti a una regione precisa e non troppo grande, quindi mano a mano che ci si allontana dal punto in cui si genera lo stimolo l’ampiezza del potenziale di membrana diminuisce fino ad arrivare al potenziale di riposo. I potenziali graduati diffondono limitatamente e la variazione del voltaggio diminuisce in modo esponenziale all’aumentare della distanza dall’origine della fonte che l’ha prodotta (propagazione passiva con decremento o conduzione elettrotonica), quindi i potenziali graduati si propagano con decremento. Nel disegno a lato il sito iniziale della variazione di potenziale ha un valore di potenziale pari a -55 mV e mano a mano che ci si allontana dal punto di origine del potenziale graduato l’ampiezza del potenziale di membrana diminuisce fino a raggiungere il potenziale di riposo di -70 mV. Nel disegno a lato è presente un assone a riposo in cui le cariche negative sono all’interno della membrana plasmatica e all’esterno sono presenti cariche positive, quindi il potenziale di membrana è pari a -70 mV. A un certo punto a metà dell’assone arriva uno stimolo che determina per esempio l’apertura di un canale per Na+ che quindi entra nella cellula a livello della zona attiva, quindi in quel punto si hanno cariche positive che vengono attirate da cariche di segno opposto, di consenguenza si muovono lungo l’assone. La propagazione è quindi dovuta agli anioni proteici, cioè alle cariche negative, che attirano le cariche positive e mano a mano che le cariche si spostano diminuisce l’intensità del potenziale. Se lo stimolo è forte l’ampiezza è maggiore e quindi il potenziale graduato si propaga su una superficie maggiore della membrana, quindi la superficie di propagazione di uno stimolo graduato dipende dall’intensità dello stimolo. Riassumendo I potenziali graduati sono cambiamenti di Vm confinati a piccole zone della membrana e destinati ad estinguersi a 1-2 mm dalla zona di origine, quindi sono segnali a breve distante. Il decadimento è esponenziale. Possono propagarsi lungo l’assone in entrambe le direzioni. Sono detti anche potenziali locali perché la loro ampiezza decade a distanza a partire dal punto di generazione (area attiva) e possono propagarsi lungo l’assone in entrambe le direzioni. Sono depolarizzazioni o iperpolarizzazioni a seconda dello stimolo e della tipologia di canale che viene aperto. Inoltre l’ampiezza del cambiamento è variabile ed è proporzionale all’intensità dello stimolo che li ha generati (dipende dal numero di canali aperti) mentre la durata del potenziale graduato è proporzionale alla durata dello stimolo. Esempi: potenziale sinaptico, potenziale di placca, potenziale “pacemaker”. I potenziali graduati sono mediati da canali ionici di vario tipo e si instaurano correnti locali. Inoltre i potenziali graduati possono sommarsi, non presentano soglia e non presentano periodo refrattario, ma presentano decremento. Sono evocati da uno stimolo esterno o da un neurotrasmettitore o spontaneamente. Potenziale d’azione Il potenziale d’azione si genera in seguito a una depolarizzazione grazie alla presenza di canali ionici voltaggio dipendenti nella membrana e gradienti elettrochimici di ioni tra cellula e ambiente extracellulare. Il potenziale d’azione è innescato e ottenuto solo da canali ionici voltaggio dipendenti del sodio e del potassio, quindi avviene per l’apertura dei canali del sodio e poi del potassio. Uno stimolo meccanico innesca l’apertura di un canale ionico depolarizzante (aumentano le cariche positive all’interno della cellula perché entra Na+), quindi la depolarizzazione determina l’apertura dei canali per Na+ voltaggio dipendenti, quindi il potenziale graduato innesca il potenziale d’azione. Nel caso del potenziale d’azione si ha depolarizzazione, ripolarizzazione e iperpolarizzazione in sequenza temporale e poi si ritorna al potenziale di riposo. Quindi il potenziale d’azione è sia depolarizzante sia iperpolarizzante, perché si muove in entrambe le direzioni. Il potenziale d’azione è la prima espressione dell’eccitamento della cellula eccitabile; è innescato da uno stimolo, è un fenomeno con soglia, cioè la depolarizzazione deve superare un certo valore, definito soglia, per innescare il potenziale d’azione; inoltre è un fenomeno tutto o nulla. È inoltre un fenomeno che si propaga rigenerandosi. Caratteristiche del potenziale d’azione: è la prima espressione dell'eccitamento della cellula eccitabile è innescato da uno stimolo è un fenomeno con soglia è un fenomeno tutto-o-nulla è un fenomeno che si propaga rigenerandosi è un fenomeno con un preciso decorso temporale Il potenziale d’azione è un fenomeno con soglia (un valore pari a circa -55 mV), quindi lo stimolo che lo innesca deve superare un certo valore perché altrimenti non si innesca. Se il potenziale graduato si propaga decrementa mentre il potenziale d’azione si propaga sempre alla stessa ampiezza, quindi è un fenomeno che si propaga rigenerandosi e senza decremento. Lo stimolo è un fenomeno (generalmente elettrico), naturale o artificiale, che può eccitare la cellula, e provoca comunque una variazione del suo potenziale di riposo. Quindi uno stimolo è sempre una depolarizzazione ed è un potenziale graduato. Uno stimolo sotto soglia provoca variazioni locali del potenziale, che si propagano con decremento e diminuiscono nel tempo (costanti di spazio e di tempo), quindi non si ha potenziale d’azione. Nel grafico sull’asse delle ascisse sono indicati i millisecondi e sulle ordinate i mV. Nel punto 1 si iniettano cariche negative ma il potenziale graduato è sotto soglia, quindi il potenziale d’azione non si innesca; lo stesso accade per il punto 2 (nel caso 2, anche se il potenziale graduato non raggiunge la soglia, ha comunque un’ampiezza maggiore rispetto al caso 1). Se si supera la soglia l’apertura dei canali voltaggio dipendenti 1 - 2 del sodio e l’entrata di sodio nella cellula sono processi molto veloci (il suo potenziale infatti è molto lontano dal potenziale di riposo). Se il potenziale graduato arriva sopra soglia si ha depolarizzazione (è molto veloce) e attiva a +30 mV (molto vicino al potenziale del sodio). Il potenziale d’azione arriva sempre alla stessa ampiezza, cioè +30 mV. Quando si ha una depolarizzazione a un certo punto si oltrepassa lo zero, quindi si raggiungono valori positivi del potenziale di membrana e questo significa che all’interno della cellula sono presenti più cariche positive e non negative (quindi entra molto Na+ molto velocemente, quindi ci si avvicina al punto di equilibrio di Na+). Fasi del potenziale d’azione Il primo step è il potenziale di riposo, quindi la cellula è in standby (potenziale di membrana = -70 mV), poi si ha uno stimolo efficace (stimolo sopra soglia dato da un potenziale graduato dato dall’apertura dei canali ioni per Na+) e poi salita rapida con inversione del potenziale (da negativo diventa positivo). Infine, una volta raggiunto un potenziale +30 mV, si ha arresto della polarizzazione e poi si ha ripolarizzazione (il potenziale di membrana ritorna al valore del potenziale di riposo), con conseguente iperpolarizzazione con fase finale di ritorno al potenziale di riposo. Per quanto riguarda il concetto “tutto o nulla” si può dire che: il potenziale d'azione per una stessa cellula, a parità di condizioni ambientali, è sempre uguale e per questa ragione viene definito “impulso”, cioè la funzione della cellula dipende dalla presenza o assenza del potenziale d'azione, non dalla sua ampiezza. La funzione è modulata dal numero di impulsi nell'unità di tempo (frequenza di scarica). Nel potenziale d’azione la codifica dello stimolo non è commisurata all’ampiezza del potenziale come nel caso del potenziale graduato, ma è codificata in modo binario. I canali ionici sono proteine intrinseche di membrana, il cui comportamento (che regola la permeabilità) dipende dal voltaggio della membrana (canali voltaggio-dipendenti); in particolare a riposo (-80 mV) i canali per il potassio sono prevalentemente aperti e quelli per il sodio prevalentemente chiusi. Al potenziale di riposo i canali voltaggio dipendenti di Na+ e K+ sono chiusi, ma K+ entra tramite un suo canale sempre aperto (è più permeabile 1 rispetto a Na+). A un certo punto arriva un prepotenziale, quindi aumenta l’intensità di corrente di Na+ e, quando si arriva allo spike (potenziale = +30 mV) si ha apertura dei canali voltaggio dipendenti di Na+ che poi si chiudono. A questo punto si aprono i canali per K+ e quindi K+ esce, di conseguenza il potenziale di membrana torna a essere negativo; K+ continua a uscire quindi il potenziale di membrana supera il valore di riposo e si ha iperpolarizzazione. In questo punto si attiva la pompa sodio potassio ATPasi ristabilisce l’omeostasi elettrochimica della membrana plasmatica. 2 3  4 5 6 Quindi l’entrata di Na+ è molto veloce, mentre quella di K+ è più lenta; lo stimolo vero e proprio è l’entrata di Na+ mentre i restanti eventi servono per ripristinare le condizioni di partenza. Quando si aprono i canali per Na+ la permeabilità della membrana cambia, infatti diventa più permeabile al Na+. Il flusso effettivo di una molecola attraverso una membrana dipende dalla permeabilità e si parla di conduttanza. Nel grafico a lato è riportato il tempo sulle ascisse e sulle ordinate il potenziale di membrana. La permeabilità di Na+ aumenta quando si ha depolarizzazione, quindi entra nella cellula, e si osserva una sovrapposizione tra i grafici di depolarizzazione e permeabilità di Na+; quando si ha ripolarizzazione i canali di Na+ si chiudono e quindi la permeabilità diminuisce. Nel caso di K+ la permeabilità aumenta quando si chiudono i canali per Na+, quindi è alta fino all’iperpolarizzazione e poi sia la permeabilità di Na+ sia la permeabilità di K+ tornano a essere costanti. LEZIONE 8 – 28/10/2022 Riassumendo Il potenziale d’azione è la prima espressione di eccitamento di una cellula eccitabile ed è innescato da uno stimolo. N.B. Nel caso di un potenziale d’azione lo stimolo è sempre un potenziale graduato depolarizzante! Il potenziale d’azione è un fenomeno con soglia, quindi avviene solo se il potenziale graduato supera una soglia (fenomeno tutto o nulla); si propaga rigenerandosi e ha un decorso di circa un millisecondo. Nel caso di un assone in condizioni di riposo le cariche negative sono all’interno e quelle positive all’esterno, ma se vengono iniettate cariche positive (si innesca una depolarizzazione) che non raggiungono la soglia (-60 mV) non si innesca il potenziale d’azione. In un secondo momento si inietta una quantità maggiore di cariche positive ma anche in questo caso non si raggiunge la soglia, quindi sia il primo sia il secondo stimolo sono stimoli sotto soglia (il potenziale graduato si propaga con decremento). Se invece si iniettano sufficienti cariche positive da raggiungere la soglia si verifica lo spike, cioè l’apertura dei canali voltaggio dipendenti del sodio con conseguente ingresso massivo di sodio (il sodio è lo ione più lontano dal suo potenziale di equilibrio e quindi la sua entrata nella cellula è molto veloce). Quando si supera lo zero si ha inversione delle cariche, quindi quando si arriva a +30 mV significa che all’interno dell’assone sono presenti più cariche positive che negative. La prima fase è una fase di riposo in cui la cellula non è eccitata e quindi il potenziale è -70 mV; in questa fase i canali voltaggio dipendenti del sodio e del potassio sono chiusi, quindi è presente solo una piccola corrente data dai canali sempre aperti del potassio presenti sulla membrana plasmatica. La depolarizzazione data da un potenziale graduato aumenta la corrente ionica del sodio, quindi il sodio entra fino al raggiungimento di un valore pari a +30 mV (quindi in questa fase aumenta la corrente del sodio e la quantità di sodio nella cellula), poi si arriva allo spike e a questo punto si chiudono i canali del sodio e si aprono i canali del potassio che passa nell’ambiente extracellulare, quindi si ha ripolarizzazione fino al raggiungimento del potenziale di riposo che viene però superato nella fase di iperpolarizzazione per poi tornare al potenziale di riposo. Questi eventi sono determinati dalla variazione di permeabilità della membrana per gli ioni, infatti la permeabilità è la capacità di una membrana di far passare o no uno ione. La variazione di permeabilità deriva dall’apertura o dalla chiusura dei canali. Nel grafico a lato la linea rosa rappresenta l’andamento del potenziale d’azione. La permeabilità del sodio è quasi sovrapposta al potenziale d’azione perché all’aumentare della permeabilità del sodio questo entra nella cellula e la membrana si depolarizza. Quando i canali del sodio si chiudono il sodio esce attraverso la sodio potassio ATPasi e contemporaneamente si aprono i canali del potassio, quindi si ha ripolarizzazione e iperpolarizzazione.  L’equazione di Goldman rappresenta cosa succede a cavallo di una membrana, in particolare questo valore può essere misurato in funzione della permeabilità di sodio e potassio, ma le permeabilità degli ioni cambiano e quindi anche questo valore cambia (cambia quando si aprono i canali). Variando le permeabilità degli ioni varia anche il potenziale di membrana. Il canale per il sodio ha due porte, cioè una porta di attivazione e una di disattivazione, e presenta tre conformazioni (la conformazione in cui sono entrambe chiuse non esiste perché se una porta è chiusa l’altra non può chiudersi), tra cui una conformazione chiusa ma capace di aprirsi in cui la porta di attivazione è chiusa e la porta di inattivazione è aperta, una conformazione aperta o attivata in cui entrambe le porte sono aperte (il sodio entra) e poi una conformazione chiusa e incapace di aprirsi in cui la porta di inattivazione è chiusa. Quando la cellula è a riposo il canale voltaggio dipendente per il sodio è presente come conformazione chiusa ma capace di aprirsi, quindi quando arriva uno stimolo (depolarizzazione sopra soglia) il canale si apre e la porta di attivazione cambia conformazione (si apre), quindi il canale passa nella conformazione aperta che consente l’entrata di sodio (aumenta la permeabilità) e si arriva allo spike, poi nella fase di ripolarizzazione il canale passa nella conformazione chiusa incapace di aprirsi (frazione di millisecondo) e poi il canale del sodio torna nella conformazione chiusa ma capace di aprirsi in modo da rispondere a un altro stimolo. La depolarizzazione stimola l’apertura della porta di attivazione (processo veloce) e stimola anche la chiusura della porta di inattivazione ma è un processo lento, quindi c’è una frazione di tempo in cui il canale resta aperto e il sodio può fluire. Quindi lo stimolo è lo stesso ma la velocità di apertura delle due porte è diversa. Il canale per il potassio ha due conformazioni, conformazione aperta e conformazione chiusa, perché ha una sola porta e lo stimolo che determina l’apertura del canale è una depolarizzazione, ma è un processo lento. La depolarizzazione induce quindi l’apertura della porta di attivazione del sodio (evento veloce), la chiusura della porta di inattivazione del sodio (evento lento) e l’apertura della porta del canale del potassio (evento lento). Questi tre eventi avvengono in maniera sequenziale nel tempo e rispecchiano il decorso del potenziale d’azione. La variazione del potenziale d’azione è data dalla variazione della permeabilità di sodio e potassio. La permeabilità del sodio a -70 mV è 1× mentre quella del potassio è 50- 75×, quindi il potassio è più permeabile del sodio. Una volta arrivato uno stimolo, cioè un potenziale graduato depolarizzante sopra soglia, la permeabilità del sodio aumenta e arriva a 600×, quindi si ha spike, mentre quella del potassio è sempre uguale. Allo spike (+30 mV) la permeabilità del sodio ritorna nelle condizioni di riposo, quindi il canale del sodio si inattiva, e la permeabilità del potassio aumenta e arriva a 300×. Quindi il potenziale d’azione è indotto da una variazione della permeabilità di sodio e potassio. Il periodo refrattario assoluto è un particolare punto del potenziale d’azione in cui non si può innescare un altro potenziale d’azione, mentre nel periodo refrattario relativo si può indurre un altro potenziale d’azione solo se il potenziale graduato depolarizzante ha un’intensità maggiore rispetto alla soglia. Quindi quando si ha depolarizzazione i canali voltaggio- dipendenti del sodio sono aperti e nel caso di ripolarizzazione sono in uno stato inattivato, quindi restano chiusi perché nessuna depolarizzazione può aprirli. Nel periodo refrattario relativo i canali del sodio non tornano tutti contemporaneamente nella conformazione chiusa ma capace di aprirsi, infatti alcuni sono ancora nello stato inattivato e quindi serve un segnale più forte per aprire i canali del sodio perché sono molti meno. Al potenziale di -70 mV il canale per il sodio è chiuso ma capace di aprirsi e quello del potassio è chiuso, mentre quando si arriva alla soglia il canale del sodio è aperto e quello del potassio è chiuso. Quando si arriva allo spike il canale del potassio è aperto e quello del sodio è inattivato. Il feedback positivo amplifica una situazione perché tende al disequilibrio, mentre il feedback negativo si autolimita infatti tende a tornare verso l’omeostasi. Lo stimolo depolarizzante induce l’apertura dei canali per il sodio, la corrente per il sodio aumenta e questo aumenta la depolarizzazione della membrana che induce l’apertura di altri canali per il sodio e questo a sua volta aumenta la depolarizzazione e così via; quindi la depolarizzazione induce l’apertura della porta di attivazione di attivazione (feedback positivo). Ma il feedback positivo si conclude quando si chiude la porta di inattivazione. Nel feedback negativo la depolarizzazione stimola anche l’apertura dei canali del potassio che induce una ripolarizzazione, annullando lo stimolo che è una depolarizzazione e quindi annullando lo stimolo per l’apertura dei canali del potassio. Il potassio esce e il potenziale di riposo è ripristinato, ma nella cellula è presente più sodio del normale e tramite la pompa sodio-potassio ATPasi viene ripristinato l’equilibrio (senza pompa il gradiente elettrochimico si esaurirebbe).  I potenziali graduati si possono sommare, quindi due potenziali graduati generati da due stimoli diversi possono complessivamente raggiungere la soglia, mentre singolarmente no. La codifica dell’intensità dello stimolo è il numero di potenziali d’azione per unità di tempo, cioè la frequenza, quindi l’intensità induce una frequenza maggiore di potenziali d’azione. L’aumento dell’intensità del potenziale graduato induce quindi un aumento della frequenza del potenziale d’azione. I potenziali graduati si propagano con decremento mentre il potenziale d’azione si propaga rigenerandosi. Una cellula β del pancreas secerne insulina; in caso di glicemia bassa il metabolismo della cellula pancreatica diminuisce e quindi diminuisce l’ATP, quindi un canale chemio-dipendente da ligando intracellulare è aperto e di conseguenza il potassio esce, quindi il potenziale di membrana è vicino al potenziale di equilibrio del potassio. Quando invece aumenta il glucosio nel sangue questo entra attraverso GLUT e quindi l’ATP aumenta perché aumenta il metabolismo. L’aumento di ATP induce la chiusura del canale del potassio, quindi la quantità di potassio che esce dalla cellula è minore con conseguente depolarizzazione che induce l’apertura dei canali del calcio voltaggio dipendenti che induce la secrezione di insulina. Normalmente la depolarizzazione avviene tramite l’apertura di un canale per il sodio, mentre in questo caso la depolarizzazione è data dalla chiusura di un canale infatti è un caso particolare. I neuroni sono formati da dendriti, soma e assone. I potenziali graduati vengono innescati a livello dei dendriti dei neuroni e, viaggiando in tutte le direzioni, raggiungono il punto in cui si genera l’assone, detto cono d’emergenza (o trigger zone), cioè il punto in cui sono presenti i canali per il sodio e per il potassio voltaggio dipendenti (a livello dei dendriti sono invece presenti canali chemio- dipendenti). I potenziali graduati raggiungono il cono d’emergenza sopra soglia e inducono un potenziale d’azione. Nella porzione dendritica del neurone si trovano canali chemio-dipendenti, quindi si ha generazione di un potenziale graduato che si propaga in tutte le direzioni e arriva al cono di emergenza sopra soglia, infatti qui si tr