FC12a Enzymology Past Paper PDF 2023-2024

Enzymologie Professeur : GONZALO FC N° 12a Date : 25/09/2023 SOMMAIRE I. HISTORIQUE ET DEFINITIONS ................................................................................................................................................... 0 II. MECANISME GENERAL DE FONCTIONNEMENT ..........

Enzymologie Professeur : GONZALO FC N° 12a Date : 25/09/2023 SOMMAIRE I. HISTORIQUE ET DEFINITIONS ................................................................................................................................................... 0 II. MECANISME GENERAL DE FONCTIONNEMENT ....................................................................................................................... 2 1. OBJECTIFS DU COURS ................................................................................................................................................................ 2 2. DIFFICULTES DE L’ENZYMOLOGIE .................................................................................................................................................. 2 3. DIFFERENTS INTERETS ............................................................................................................................................................... 3 4. STRUCTURE DES PROTEINES ET MECANISMES D’ACTION DES CHAPERONNES ............................................................................................. 5 A. Structure des protéines globulaires solubles ................................................................................................................... 5 B. Quelques rappels sur les liaisons intra-protéiques ........................................................................................................... 6 C. Le repliement des protéines ............................................................................................................................................ 9 D. Les protéines chaperones ............................................................................................................................................. 11 E. Bilan sur le plan énergétique ........................................................................................................................................ 13 5. LA CATALYSE......................................................................................................................................................................... 14 6. SPECIFICITE DE LA CATALYSE ENZYMATIQUE .................................................................................................................................. 15 7. NATURE DES ENZYMES ............................................................................................................................................................ 15 8. LA CHIMIE DES REACTIONS ENZYMATIQUES ................................................................................................................................... 15 III. CONSTITUANTS DES REACTIONS ENZYMATIQUES................................................................................................................ 17 1. SUBSTRAT ............................................................................................................................................................................ 17 2. PRODUIT ............................................................................................................................................................................. 17 En cas de questions sur ce cours, vous pouvez écrire à l’adresse suivante : [email protected] Les règles de courtoisies sont à respecter lors de l’envoi d’un mail. L’équipe des tuteurs se réserve le droit de répondre ou non à un mail. En cas de questions récurrentes, les tuteurs pourront faire un point lors des colles hebdomadaires. I. Historique et définitions HISTORIQUE ET DEFINITIONS La découverte des enzymes • Anselme Payen (1795-1871), chimiste et industriel français, est le découvreur de la première enzyme en décomposant l’amidon en glucose qu’il a appelé diastase puis il a découvert la cellulose à partir de la dégradation du glucose. C’est avec ces découvertes que les enzymes ont un suffixe en « ase » et les sucres ont un suffixe en « ose ». L’hypothèse catalytique • Jöns Jacob Berzelius (1779-1848) décrit, en 1835, la catalyse comme des réactions chimiques accélérées par des substances qui demeurent inchangées. Il s’agit d’une conception purement catalytique de la fermentation qui exclut le rôle des organismes vivants. On utilise encore cette conception en chimie organique. • Louis Pasteur (1822-1895) est un chimiste, physicien, réfutateur de l’idée de la génération spontanée. Cette idée de la génération spontanée consistait à penser que la vie pouvait naître spontanément et Pasteur a démontré le contraire avec l’observation des microbes et la « contamination » des microbes sur un milieu sans vie au microscope. Pasteur est aussi un pionner de la microbiologie et de l’immunité avec le développement du vaccin contre la rage. Principe vitaliste et controverse sur la nature des « ferments » • Il a travaillé sur la fermentation du sucre par les levures, qui sont des êtres vivants, entre 1857 et 1860 mais il confondait le caractère vivant des levures et la fermentation qui est un processus chimique. • En 1881, le principe vitaliste, auquel il croit, lui fait refuser d’admettre qu’un vaccin sans êtres vivants contre le charbon puisse être efficace. Le vaccin contre le charbon a été élaboré par le vétérinaire français Henry Toussaint et est constitué d’une toxine inactivée et d’une bactérie morte (vaccin atténué). Pasteur refuse le fait que la catalyse puisse être un processus strictement chimique. Selon lui, pour avoir des réactions biologiques et catalytiques, il faut forcément avoir des êtres vivants. Ce qu’il faut retenir en enzymologie, ce sont ces fabuleux travaux sur la fermentation même s’il n’a jamais vraiment compris comment fonctionnait cette fermentation. 1 Synthèse des théories physiologiques et catalytique • D’après Marcellin Berthelot (1827-1907), la fermentation n’est pas produite directement par les êtres vivants qui en sont responsables (levure…) mais par des substances non vivantes. Ces « ferments solubles » sont eux-mêmes sécrétés par les êtres vivants (1860). Pasteur s’opposa vigoureusement à cette théorie « conciliatrice ». Définition du mot enzyme • Wilhelm Kühne (1837-1900) est le découvreur en 1876 de la première enzyme protéolytique : la trypsine. C’est en 1877 que le terme enzyme a été utilisé pour la première fois. Il vient du grec « énzymon » signifiant dans le levain, dans les levures en référence à Pasteur. Démonstration du caractère non vivant des enzymes • Eduard Buchner (1860-1917) démontre, en 1897, que des extraits acellulaires de levures sont catalytiquement actifs (c’est le principe de la fermentation). Il montre que le caractère « vivant » et « biologiquement actif » sont distincts. Pour cette découverte, il obtient en 1907 le Prix Nobel. C’est la naissance de la biochimie. 1 II. Mécanisme général de fonctionnement 1. Objectifs du cours L’objectif du cours est d’expliquer comment une réaction est catalysée en biologie. Les enzymes sont des catalyseurs (la catalyse est un phénomène thermodynamique). ✪✪✪ La description cinétique d’une réaction chimique la plus simple suit le schéma suivant : S (Substrat) → P (Produit) En réalité, la plupart des réactions biologiques du monde vivant font intervenir au moins 2 substrats. En enzymologie, l’intervention d’un enzyme (E) (souvent une protéine) modifie le schéma cinétique de la réaction et la rend plus complexe, qui devient alors : E + S ⇋ ES → E + P ✪✪✪ L’enzyme interagit avec le substrat : la formation du complexe enzyme-substrat (ES) est une action réversible (double flèche), et l’enzyme est régénéré à l’identique et dans son intégralité à la fin de la réaction enzymatique en libérant le produit. On ne s’intéresse qu’à un sens de la réaction, mais il est aussi possible de considérer le sens de retour (dans une réaction qui relie paramètres thermodynamiques et cinétiques). Sur le plan de la vitesse de réaction, chacune de ces étapes influe sur la vitesse de réaction finale. Peuvent être cible thérapeutique ou toxiques 2. Difficultés de l’enzymologie • La chimie (schéma réactionnel) • La thermodynamique (catalyse) Discipline conceptuelle qui touche à des supports différents • La biologie structurale • Les mathématiques (équations concernant la vitesse de réaction, équation différentielle) • La physiologie L’enzymologie est très appliquée, c’est une approche basée sur des sciences expérimentales. Elle n’est pas une science isolée et elle s’appuie sur des expériences et des observations. 2 3. Différents intérêts INTERETS COMME SCIENCES Les enzymes sont des caractéristiques du vivant. Sans enzyme la vie est impossible. ✪✪ Les enzymes sont à l’origine de réactions couplées qui permettent des réactions normalement impossibles car défavorable sur le plan thermodynamique. ✪✪✪ Ainsi on distingue • Plusieurs milliers d’enzymes sont codées dans le génome d’un être simple • Elles permettent de catalyser des réactions et de rendre possibles ces réactions à des températures, des pressions, des concentrations en réactifs usuelles • Sur le plan thermodynamique, les enzymes récupèrent l’énergie de réactions favorables pour réaliser des réactions défavorables. • Par exemple, elles récupèrent de l’énergie venant de l’oxydation des sucres pour réaliser la synthèse de protéines à partir d’acides aminés : ce qui est favorable c’est de décomposer les protéines en acides aminés et non le contraire. Réactions cataboliques = dégradation/décomposition✪✪✪ Réactions anaboliques = synthèse ✪✪✪ 3 APPLICATIONS INDUSTRIELLES Hémisynthèse • Fabrication du médicaments, modification de stérols végétaux, en orientant la stéréospécificité par réaction enzymatique pour fabriquer des stéroïdes et beaucoup d’autres médicaments Fermentation • Fabrication de la bière, du pain, du vin, du bioéthanol • Permettent d’éliminer les tâches alimentaires Lessives avec les enzymes gloutons Biocapteurs Défi : • Enzymes très robustes capables de résister au chaud et à la poudre détergente. • Fort impact environnemental : même si ce sont des enzymes dérivées de composés vivants, elles continuent leur activité après leur utilisation dans la machine à laver donc elles continuent leur activité dans l’environnement ! • Électrodes greffées (glucose) sur un composé électronique et rendre capables ce composé de mesurer la concentration de molécules → tests de glycémie • Fabriquer des enzymes moins fragiles, résistant à des conditions plus drastiques (température plus élevée pour augmenter les rendement, température plus basse pour ne pas chauffer les composés et économiser de l’énergie, etc. …). • Les applications industrielles des enzymes reposent donc sur l’utilisation d’enzymes plus robustes • Thermophiles (actives à haute température) • Mésophiles (actives à température intermédiaire) Ces enzymes peuvent être : • Psychrophiles (actives à basse température) • Non « naturelles » en « immunisant » contre des substrats. À ce moment-là, c’est l’interaction anticorps avec le substrat qui transforme le substrat en produit, c’est ce qu’on appelle des anticorps catalytiques. Mais cela fonctionne moins bien 4 4. Structure des protéines et mécanismes d’action des chaperonnes A. Structure des protéines globulaires solubles STRUCTURE DES PROTEINTE GLOBULAIRES SOLUBLES • Caractérisées par une chaîne protéique d’acides aminés se repliant pour former un ensemble compact • La compaction signe que la protéine est bien repliée (il ne faut pas qu’elle se débobine) • Les protéines enzymatiques sont faites pour fonctionner dans un milieu aqueux comme le corps humain. Elles doivent donc être solubles et avoir des interactions avec l’eau : elle reste associée à l’eau • Regroupé au centre (protéine est dans un milieu hydrophile (aime l’eau)) Cœur hydrophobe • Strictement hydrophobe (n’aime pas l’eau) car s’il y a des résidus polaires/hydrophiles au centre, la protéine sera déstabilisée, trop flexible et ces résidus vont se diriger vers l’extérieur pour interagir avec les molécules d’eau changeant donc la conformation protéique et l’action de l’enzyme = dénaturation • Entoure le cœur hydrophobe avec des résidus polaires • 1ère couche étroitement liée aux résidus hydrophiles Périphérie polaire = 7 couches d’hybridation • Eau = solvant structuré avec des liaisons hydrogène/oxygène/hydrogène avec d’autres molécules d’eau ⇒ réseau d’eau qui environne la protéine et qui la « dissimule » au sein de cette couche d’eau • Cette « dissimulation » explique la solubilité de la protéine alors qu’elle est plus dense que l’eau (elle devrait couler et précipiter ⇒ c’est ce qui se passe quand la protéine est mal repliée, les résidus hydrophobes sont à l’extérieur ⇒ les protéines vont se coller les unes aux autres jusqu’à former un ensemble tellement gros et peu hydraté qu’il précipite et sédimente, c’est un agrégat) • Mobilité qui augmente avec la température 5 B. Quelques rappels sur les liaisons intra-protéiques LES DIFFÉRENTES LIAISONS Très forte énergie, de l’ordre de 100 kcal/mol (entre l’état libre et lié, différence de 100 Liaisons covalentes kcal/mol) et par liaison impliquant une très grande stabilité. ✪✪✪ • Très fortes contraintes structurales angulaires et de distance = contraintes stériques très importantes qui donnent structure tridmensionnelle • Le type et la force dépendent du solvant • Liaison = stabilisation ➔ plus il y a de liaisons plus la molécule est stable Énergie de l’ordre de 1 a 2 kcal/mol → peuvent être rompues à température physiologique (37°C) = liaisons thermolabiles ✪✪✪ • Très nombreuses dans les macromolécules → permettent une structure 3D de ces macromolécules car les liaisons simples autorisent les rotations. Liaisons faibles • Dépendent du solvant, dont la nature va modifier la solubilisation de la macromolécule et sa couche d’hydratation → existence de contraintes d’angles : plus on est proche de l’angle idéal de la liaison et plus cette liaison sera forte. Elles représentent donc un capital énergétique flexible, avec plusieurs conformations possibles • On peut se décaler en fonction de l’angle idéal Plusieurs types de liaisons faibles, caractérisées par leur distance et leurs angles : les liaisons hydrogènes (liaisons H), les liaisons ioniques, les liaisons de Van der Waals et les liaisons hydrophobes. ✪✪✪ 6 LES DIFFÉRENTES LIAISONS FAIBLES • Entre des dipôles permanents Liaisons hydrogènes (liaisons H) Liaisons ioniques Avec une distance optimale de 1,2Å (Angström) : 1 à 7 kcal/mol (selon l’angle et la distance) ✪✪✪ • Possible dans un cône de 30° autour de l’axe de valence (plus on s’éloigne de ces contraintes optimales plus l’énergie de liaison est faible) • Type de liaison H où le partage de charge est total, c’est à dire qu’il y a un gain d’électron pour un atome et une perte d’un électron pour l’autre • Extrêmement fort (100kcal/mol) mais considéré comme faible car ions peuvent être substituable Liaisons faibles avec des énergies de l’ordre de 1 à 2 kcal/mol, très abondantes. ✪✪✪ • Énergies optimales au rayon de Van der Waals c’est-à-dire quand elles sont significativement importantes, les chaines s’imbriquent les unes dans les autres avec une grande complémentarité Liaisons de Van der Waals • Très puissantes en étant renforcées par d’autres types de liaisons comme le complexe Ag-Ac (antigène-anticorps) dans lequel l’Ag est reconnu sur une distance de 5 à 7 acides aminés, l’énergie de liaison est d’environ 30 kcal/mol ✪✪✪ ➔30/1,5 = 20 • Rôle majeur dans l’interaction protéine-protéine, dans le cœur hydrophobe des protéines (imbrication de 700 ea 1200 å) → cet ensemble parfaitement imbrique est compact et correspond à une énergie de liaison considérable = énergie de structuration • Effet hydrophobe résulte d’une attraction des résidus apolaire les uns pour les autres et énergie de répulsion de l’eau qui fait entre 2/3 et 3/4 de l’énergie totale Effet hydrophobe considérable → tension de surface de 70 cal/mol/ Ų ✪✪✪ Liaisons hydrophobes • Rôle majeur dans la structuration des protéines • Élément important pour les chaperonnes qui sont des protéines capables d’aider des protéines à se conformer correctement en aidant les acides aminés hydrophobes à se situer à l’intérieur de la protéine et en aidant les résidus hydrophiles à s’exposer à la surface • Attraction de vdw et repoussement de l’eau Plus les interactions se font sur une surface faible, c’est ce qui se passe avec les petites molécules (petits ligands transformés en enzymes ou qui ont des propriétés hormonales), plus il faut de liaisons faibles « fortes » comme les liaisons hydrogènes. Par exemple, la fixation du GTP se fait par des liaisons H, ioniques et hydrophobes. 7 Le repliement des protéines est gouverné par l’eau. Importance des liaisons ligands : une protéine est un ensemble de chaînes qui se structurent en hélices, en feuillet, en parties déstructurées, en coudes… qui se replie sur elle-même pour arriver à un ensemble cohérent. L’énergie interne totale de structuration des protéines est faible (0,1 kcal/mol/acide aminé). On définit le terme de domaine (= structure) qui correspond à 70-200 acides aminés ✪✪. Il est très difficile de replier une protéine qui fait moins de 70 acides aminés. Une protéine contient rarement une seule structure : on a 2-3 domaines en moyenne et chaque domaine arrive à immobiliser 7 à 20 kcal/mol d’énergie interne ✪✪. En enzymologie, l’attachement d’un substrat est en moyenne de 5 à 10 kcal/mol. ✪✪✪ • La fixation d’un ligand représente une variation d’énergie interne forte qui modifie donc de façon importante la structure tridimensionnelle de la protéine sur laquelle le ligand se fixe. • L’énergie de liaison étant forte, la liaison est spécifique. • Le ligand se fixe, la protéine se réarrange et trouve d’autres interactions avec son milieu. • Ce changement de conformation fait que le ligand est capable de se lier, éventuellement si c’est une enzyme d’être transformée (on passe d’un substrat à un produit), et le ligand modifié pourra quitter rapidement la protéine. Si le ligand se fixe de façon ultra stable, il ne va pas être modifié puisque l’affinité pour la structure est très forte (et donc très faible pour le produit). Donc il ne quittera pas la protéine et il n’y aura pas d’efficacité catalytique. Grâce aux enzymes, les transformations se font de l’ordre de 106 transformations/s à 1015 transformations/s. Les enzymes permettent donc une grande efficacité catalytique. ✪✪✪ 8 C. Le repliement des protéines REPLIEMENT DES PROTEINES • Statistiquement, les différentes liaisons peuvent se positionner les unes par rapport aux autres dans toutes les positions autorisées. C’est ce qu’a calculé le scientifique Levinthal : si statistiquement il y a une seule conformation possible stable alors le temps théorique de repliement des protéines est supérieure à l’âge de l’univers ! • Une question en découle : pourquoi les protéines sont capables de se replier en quelques millisecondes ou secondes maximums ? Paradoxe de Levinthal • La solution : introduire le 2ème niveau du code génétique c’est-à-dire que seules certaines structures protéiques (ou domaines) ont été sélectionnées par l’évolution car elles étaient capables de se replier seules et correctement en étant fonctionnelles. Plus la synthèse protéique est intense, plus le repliement des chaînes naissantes doit être efficace (chaperonnes). État natif = protéine correctement repliée = conformation native = N État dénaturé = protéine mal repliée = U Attention : en biologie cellulaire on utilise le terme de natif quand la protéine sort du ribosome ! ✪✪✪ Lors de la synthèse d’une protéine • Apparition d’interactions prématurées sans l’action de chaperonnes, à l’état dénaturé (sous forme de chaine polypeptidique) • Dénaturée mais pas totalement débobinée Protéine « U » o Pour minimiser son énergie interne, il faut que les liaisons et interactions hydrophobes viennent se coller les unes sur les autres pour être au minimum en contact de l’eau. • Possède déjà quelques structures intra-chaînes. Sa stabilité est de 30 nanosecondes (ns). Après 30 ns Après 25 ns • Repliement partiel • Possède ensuite une stabilité de 25 ns • Création de structures internes supérieures • La protéine est dans un état intermédiaire (I) avec une stabilité de 15 ns 9 • Des transitions et des interactions ont lieu et la structuration est presque idéale. Après 15 ns A partir de la structure TS en 0,26 ns Molten globules • L’organisme fabrique l’état natif N avec la structure définitive. • Stade intermédiaire entre la structure TS et la protéine N • La protéine ne se structure donc pas n’importe comment, il y a un chemin de repliement, que les protéines acquièrent spontanément ou avec l’aide des chaperonnes. • En effet, plus une molécule est stable thermodynamiquement, plus l’énergie potentielle est faible. Dans ce cas-là, il n’y a pas besoin de chaperonne pour atteindre la forme native de la protéine. Dans d’autres cas, lorsqu’un mauvais état est obtenu, les chaperonnes les aident à acquérir leur forme native. La plupart des protéines nécessitent l’action de protéines chaperonnes. SUR LE PLAN TEHRMODYNAMIQUE • Les parties hautes vertes sont des états d’instabilité des chaînes naissantes • Les parties basses bleues sont les états de stabilité des protéines natives (stabilité la plus forte) • Le chemin jaune est le chemin idéal le plus rapide et sans problème • Le chemin rose est celui où la protéine à des difficultés et a besoin de l’aide de la chaperonne • Skieur expérimenté = protéine se repliant spontanément de manière correcte vers son état natif (chemin jaune). • Skieur amateur/inexpérimenté = protéine ayant besoin d’une chaperonne pour se replier (chemin rose) Comparaison avec une piste de ski avec plusieurs chemins de repliement et un seul point d’arrivée • Si la pente est bien incurvée et les skieurs expérimentés, tous les skieurs arrivent forcément en bas de la pente, à la station (la protéine se plie seule et acquiert sa structure native) = chemin jaune • En revanche s’il y a une crevasse (sortie de piste du skieur inexpérimenté), correspondant à une forme de protéine un peu structurée mais qui ne peut pas aboutir, l’aide d’un pisteur (en ski) ou d’une chaperone (en enzymologie) est nécessaire, la protéine est dans une conformation stable mais elle est dans un piège conformationnel • Attention, la chaperonne sort juste la protéine du « trou » en arrangeant sa conformation mais elle ne l’accompagne pas jusqu’à l’état natif, elle ne sait pas faire. La chaperonne est un « pisteur » mais pas un « secouriste » 10 D. Les protéines chaperones Schéma de Netzer et Hartl : « Tenues sur mesure » : • En haut (1), la protéine nait au sein du ribosome puis se libère dans un état non correctement replié. Ces petites protéines simples vont alors parvenir à trouver leur conformation toute seule pour former des gants, des chaussettes, des chapeaux, des parapluies. • Au milieu (2), la chaperonne Dna J aide à la conformation de la protéine qui est légèrement plus compliquée (chemise) en consommant de l’énergie (ATP) et avec l’intervention d’une autre chaperonne. • En bas (3), la protéine est encore plus compliquée, la protéine chaperonne HSP70 aide la protéine à rentrer dans la machine qui est le système groES (couvercle)/grosEL (tonneau) mais ce système ne marche pas à tous les coups donc on dépense de l’énergie supplémentaire (ATP) et on renvoie la protéine dans le tonneau et la protéine acquièrent sa conformation. LES 2 TYPES DE PROTÉINES CHAPERONES Famille des Hsp 70 Attention erreur sur le schéma : La dernière conformation (closed) n’existe pas : les deux côtés d’une HSP70 ne peuvent pas être tous les deux fermés à la fois, l’un doit être ouvert et l’autre fermé (et ils alternent). La mâchoire supérieure se lie à un bras hydrophobe, la mâchoire inférieure en lie un autre, ce qui déplie la mauvaise conformation de la protéine, lui laissant une possibilité (statistique) de se replier correctement. • Fonctionnent sous forme de dimères accrochées par un bras souple • Subissent une alternance entre états ouverts et fermés → lorsqu’une sous-unité est ouverte l’autre est fermé = oscillations de conformations. Ce mécanisme fonctionne par une transition de domaine, un repliement soit spontané soit en consommant de l’ATP. • Protéines qui fonctionnent en équilibre et qui aident à replier les protéines. Quand une protéine est mal repliée, elle expose des résidus hydrophobes permettant aux résidus hydrophobes de la protéines mal repliée de s’y coller. • La protéine mal repliée se re-débobine grâce à l’action de la chaperone → la chaperone la lâche → la protéine mal repliée a une certaine chance de se replier correctement. Une fois repliée correctement, elle n’a plus de résidu hydrophobe exposé donc elle arrête d’interagir avec la chaperone 11 • Concernent les protéines de tailles beaucoup plus grandes et plus complexes Chaperonines • Ce complexe protéique a une forme de deux « tonneaux » dont l’intérieur est hydrophobe → conformation dimérique • 2 tonneaux donc 14 sous-unités de GroEL (L pour large). Le « couvercle » du tonneau est constituée par 7 sous-unités GroES (S pour small) avec des résidus hydrophobes exposés Attention erreur sur le schéma : Les deux cavités ne peuvent pas accueillir des protéines simultanément comme dans la 3ème étape en haut. Il s’agit bien d’une alternance entre états contractés et relâchés, si ce n’était pas le cas la protéine ne pourrait pas travailler car l’énergie utilisée n’est suffisante que pour le changement de conformation d’une des 2 parties de la boîte. Ce qui est faux également c’est que les 2 étages de la boîte GroEL sont délimitées et la communication n’est pas aussi ouverte que sur le schéma. • Fonctionnement (on a une alternance entre état contraint(ATP) /relâché(ADP): au départ on a 2 tonneaux sans couvercle. Les protéines mal repliées vont venir se coller à l’intérieur du tonneau (car il y a des résidus hydrophobes exposés) → le couvercle se met en place → consommation ATP → le tonneau du haut se dilate, celui du bas s’écrase : la protéine est étirée donc le piège conformationnel est rompu → hydrolyse de l’ATP → inversion de conformation : le tonneau du haut se retrouve en bas et le tonneau du bas se retrouve en haut → compression → si la protéine est bien repliée, elle a des résidus hydrophiles à l’extérieur, donc elle expose des résidus hydrophiles et donc elle quitte la chaperonine. Sinon elle refait un tour • Au final la chaperonine ne déplie que partiellement la protéine pour lui permettre de retrouver son chemin de repliement (énergie d’activation). Attention : elle ne replie pas la protéine !! La réaction de repliement est spontanée mais la probabilité que la protéine, dans une conformation piège, sorte sans chaperonine est nulle. 12 SCHEMA REPRENANT LE FONCTIONNEMENT DES CHAPERONES : La boîte (= chaperonine) est en bleu et au centre c’est la protéine : • La chaperonine est en conformation relâchée, le système est à l’équilibre (symétrie des 2 « tonneaux »). 1 : Étape initiale • Les résidus hydrophiles sont masqués dans les zones d’interaction entre les sous-unités. • La protéine à l’intérieur de la chaperonine est mal structurée, car les résidus hydrophobes sont exposés à l’extérieur 2 : Étape d’expansion • Hydrolyse de l’ATP et agrandissement de la cavité dans la chaperonine sur la totalité du volume (contrairement aux HSP70 qui n’écartent les zones hydrophobes qu’en 2 points, les chaperonines les écartent en de nombreux points d’attache, sur toute la surface de l’intérieur du « tonneau »). • Les résidus hydrophobes de la protéine se « collent » aux résidus hydrophobes de la chaperonne. La protéine se déstructure à l’intérieur. • Inversion de la polarité des parois : contraction. Les sous-unités pivotent les unes par rapport aux autres. 3 : Étape de conversion • Modification de la conformation de la protéine par inversion de la position des résidus hydrophiles et hydrophobes. • Par répulsion les AA hydrophobes de la protéine vont passer au centre et les AA hydrophiles de la protéine sont attirés par les AA hydrophiles du tonneau. 4 : Étape d’expulsion • La protéine adopte une structure très compacte et être expulsée. Si elle se replie correctement, elle peut être libérée. Sinon le cycle recommence • Cette reaction peut être ATP dependante ou indépendante E. Bilan sur le plan énergétique Reconnaissance de surfaces apolaires (hydrophobes) État initial = chaperone + substrat → résidus hydrophobes exposés État intermédiaire = chaperone + substrat → résidus hydrophobes masqués État final = chaperone : résidus hydrophobes exposés mais substrat : résidus hydrophobes masqués Bilan énergétique global = favorable et état intermédiaire qui apporte l’énergie d’activation = neutre voire favorable. ✪✪✪ 13 Catalyse et chimie des enzymes Les enzymes accélèrent la vitesse des réactions. Cependant, elles ne modifient pas les équilibres des réactions. Cela signifie que Keq ne change pas avec l’ajout d’enzyme, l’équilibre est seulement atteint plus rapidement. Ce sont des catalyseurs biologiques. Pour expliquer le fonctionnement des enzymes on utilise la thermodynamique, elle permet d’expliquer : • L’origine et le sens des équilibres réactionnels (c’est le deuxième principe de thermodynamique) • Le rôle de la catalyse (notion d’état de transition et d’énergie d’activation) • Le rôle des remaniements de conformation des enzymes (cycle catalytique) = mécanisme par lequel les enzymes réalisent la catalyse. Les enzymes réalisent cela grâce à une flexibilité interne due au fait qu’elles sont des macromolécules. • Le concept de liaison riche en énergie (découvert à partir du coenzyme A) 5. La catalyse LA CATALYSE Vitesse des réactions catalysées Vitesse = nombre de molécules de S transformées en P par seconde. Les enzymes accélèrent les vitesses de réactions : ce sont des catalyseurs. • Kcat /kun est le facteur d’accélération (rapport de la vitesse catalysée sur la non catalysées) Notion d’efficacité catalytique • Les enzymes accélèrent les vitesses de réaction mais ne rendent pas favorables des réactions qui ne le sont pas. Lorsque Kcat /kun ≥ 106on a une efficacité catalytique. • La stabilité de S influe sur la stratégie catalytique de E. Durée du cycle = temps mis par une molécule de E pour catalyser SP dépend de la complexité du cycle • Un enzyme diminue le temps nécessaire pour qu’une réaction se fasse Temps du cycle enzymatique ou « turn over » o Par exemple, si Kcat = 39 (dans le cas de l’orotidine MP-DC), l’enzyme peut transformer jusqu’à 39 molécules de substrat par seconde. Sans enzyme, la réaction a lieu mais elle est infiniment lente (1/2 vie = 78 000 000 ans). L’enzyme accélère donc la réaction d’un facteur 1,4.1017. o Autre exemple : bien que la réaction d’anhydrase carbonique soit déjà rapide (1/2 vie = 5s), elle est accélérée par un enzyme d’un facteur 7,7.106, sans cela la réaction ne serait pas assez rapide pour le milieu vivant. 14 6. Spécificité de la catalyse enzymatique SPÉCIFICITÉS DE LA CATALYSE ENZYMATIQUE Spécificité de substrat (et de produit) Spécificité de perte • Fabrication du produit qu’on souhaite • Un enzyme ne permet qu’un seul type de réaction • Pas de sous-produit non désiré et pas de perte ou de détournement 7. Nature des enzymes Un enzyme est TOUJOURS une macromolécule NATURE DES ENZYMES • Des protéines (majoritairement car répertoire de susbtituants), des ribozymes Types • Des ARN, plus rarement • Des ADN très rarement, aléatoirement en laboratoire mais pas in vivo Site actif • Lieu où se fixe le substrat et où il sera transformé en produit • En réalité il n’y a pas que dans le site actif • Permet des perfectionnements mécanistiques : Complexité o Rendement énergétique : (dans l’ATPase F0/F1) → permet que moins d’énergie soit perdue (énergie convertie sous forme d’ATP) o Editing = capacité de correction (DNA polymérase ou l’enzyme RS) 8. La chimie des réactions enzymatiques MÉCANISMES RÉACTIONNELS SIMILAIRES Caractérisés par l’état de transition = Intermédiaire instable limitant le passage de S→P • Pour passer de S à P sont toujours similaires (les réactions sont les mêmes avec ou sans enzymes) et caractérisés par des conformations particulières qui sont les états de transition (étapes) entre l’état initial (substrat) et l’état final de la réaction (produit). • Entre un état S et un état P, il peut y avoir plusieurs chemins possibles. 15 PARTICULARITÉS DE LA CHIMIE ENZYMATIQUE Diversité des liaisons interatomiques : Couplage des réactions • Faibles (+++) et fortes • Afin de permettre des réactions normalement impossibles : l’énergie de la 1ère réaction (qui est favorable), va être utilisée pour que la réaction défavorable puisse avoir lieu • De natures différentes (chimiques, électriques, mécaniques, thermiques, lumineuses) : o ATPase Conversions d’énergie o Muscles (énergie physique devient de l’énergie mécanique) o Protéines de découplage mitochondrial • Transformation d’ATP (énergie chimique) en lumière (énergie lumineuse) chez les lucioles ou vers luisants... 16 III. Constituants des réactions enzymatiques 1. Substrat Le substrat = molécule transformée par la réaction enzymatique. S’il y a plusieurs substrats pour une même réaction, on parle alors de co-substrats de la réaction. Les substrats et co-substrats sont transformés par la réaction. Ainsi, pour les descriptions cinétiques de réactions enzymatiques, on utilise des modèles à un seul substrat. Le substrat à étudier est alors en concentration limitante et les autres substrats potentiels sont en concentrations saturantes : Le substrat saturant n’influence pas la vitesse de la catalyse. Le substrat limitant est celui qui influe sur la vitesse de la réaction. 2. Produit Les produits = molécules apparaissant lors de la réaction catalysée par l’enzyme 17