Examen de Virus PDF

Laboratorio clínico y biomédico Microbiología clínica UNIDAD DE TRABAJO 9: Virología 🦠 1. Los virus ¿Qué es un virus? Los virus son partículas orgánicas acelulares, compuestas por ácidos nucleicos y proteínas, generalmente protegidas...

Laboratorio clínico y biomédico Microbiología clínica UNIDAD DE TRABAJO 9: Virología 🦠 1. Los virus ¿Qué es un virus? Los virus son partículas orgánicas acelulares, compuestas por ácidos nucleicos y proteínas, generalmente protegidas por una envoltura, que necesitan la participación de cualquier ser vivo (eucariota o procariota) para realizar su ciclo vital. Son por lo tanto, parásitos intracelulares obligados y, dada su naturaleza y composición, insensibles a los antimicrobianos habituales. Aunque tienen material genético independiente, son incapaces de realizar actividades necesarias para su multiplicación. 1.1 Estructura de los virus Tamaño: entre 20 y 300 nm. Las bacterias tienen un tamaño que oscila entre los 600 y los 2000 nm, aunque algunas bacterias como Mycoplasma (250 nm) son más pequeñas que algunos virus. Están constituidos por: - Por material genético denominado core o genoma, el cual está compuesto por una o varias moléculas de ADN o ARN. Nunca llevan los dos a la vez (aunque algunos tipos de virus pueden alternar ARN o ADN en sus diferentes fases. - El material genético se encuentra protegido por una cubierta proteica llamada cápside, cuyas estructuras morfológicas son los capsómeros. Al conjunto de genoma y cápside se le llama nucleocápside. - Pueden estar provistos de una envoltura, que está compuesta por glucoproteínas asociadas a una capa bilipídica (bicapa lipídica). A los virus que presentan esta envoltura se les conoce como virus envuelto y si carecen de ella, virus desnudos. Los virus envueltos son muy sensibles a la desecación, al pH ácido, a los solventes lipídicos y a las sales biliares por lo que su transmisión fecal-oral no es posible. Los virus desnudos son resistentes al medio externo, a la desecación y a los solventes lipídicos, por lo que pueden penetrar por vía digestiva. En cuanto a su morfología, pueden tener simetría helicoidal, simetría icosaédrica (aunque en ocasiones no presentan poliédrica sino que adoptan una estructura completamente esférica), simetría compleja o simetría mixta. Virus de simetría mixta Virus con: cabeza, cuello, cola y placa basal. La cabeza es de simetría cúbica y la cola helicoidal. Algunos bacteriófagos presentan esa estructura. 1 Laboratorio clínico y biomédico Microbiología clínica La característica más importante de los virus es la presencia de material genético constituido por un solo tipo de ácido nucleico: - ARN: Ribovirus - ADN: Desoxirribovirus El ARN de los ribovirus suele ser monocatenario, excepto los reovirus (bicatenario). El ADN de los virus suele ser bicatenario, excepto fagos y parvovirus (monocatenario). Los virus cuyo genoma está formado por ARN pueden clasificarse en dos grupos: 1. Su ácido nucleico puede actuar como mensajero y directamente es traducido por los ribosomas, denominados por convención de polaridad positiva. 2. Poseen una secuencia de bases complementarias del mensajero (polaridad negativa) y no pueden actuar como tal. La molécula de ácido nucleico puede ser: - Lineal: continua o fragmentada. - Circular: plana o superenrollada. La fracción en peso más importante de los virus es la proteica. Constituye del 50 al 90% del total. Pueden ser: - Proteínas de superficie (cápside y envuelta). - Proteínas internas (estructurales). El contenido glucídico y lipídico es muy escaso o nulo. Replicación Los virus son parásitos intracelulares, ya que carecen de la maquinaria metabólica necesaria para realizar por sí mismos la replicación. El ciclo de vida de los virus es variado y complejo y se puede esquematizar así: 1. Fijación/adsorción. 2. Penetración. 3. Replicación. 4. Ensamblaje. 5. Liberación. 1. Fijación/adsorción del virus a los receptores de superficie que tiene la célula diana, mediante unos elementos de fijación que presenta el virus. 2. Penetración: una vez que se ha adherido, tiene que entrar en el interior de la célula y lo puede hacer por: - proceso semejante a la fagocitosis - fusión del virus con la membrana celular - interacción del virus con los sitios receptores 3. Replicación (Síntesis de ácidos nucleicos y proteínas): El virus necesita crear sus propios componentes. Requerirá formar ARN mensajero a partir de su genoma (ADN o ARN). 2 Laboratorio clínico y biomédico Microbiología clínica 4. Ensamblaje: consiste en la unión de las proteínas y el material genético sintetizado para dar lugar a copias iguales al virus inicial. 5. Liberación: el virus completo sale de las células, pudiendo hacerlo por: - destrucción de la pared celular, provocando la lisis de la célula. - modificación de la membrana celular, quedando el virus envuelto por ella. El ciclo de la multiplicación que termina la lisis celular recibe el nombre de ciclo lítico, y los virus que lo llevan a cabo son los virus virulentos. Sin embargo, hay otros virus capaces de permanecer en estado latente en la célula que parasitan, gracias a la integración de ADN vírico en el ADN celular; en este caso el ciclo se llama lisogénico. Estos últimos se llaman virus atemperados, y la forma integrada, provirus (o profago en el caso de los virus bacterianos). Los virus con ciclo lisogénico mejor conocido son los bacterianos. 1.2 Clasificación de los virus Los virus se pueden clasificar atendiendo a diferentes criterios (morfología, composición química y modo de replicación). Clasificación de Baltimore Organiza los virus en siete grupos fundamentales según la base química del genoma y el mecanismo de producción de ARNm (que se traduce en los ribosomas y da lugar a las proteínas de la cápside). 3 Laboratorio clínico y biomédico Microbiología clínica Clasificación del Comité Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV) Aplica un sistema de clasificación en árbol equivalente al que se aplica para clasificar a los seres vivos, e incluso utiliza las mismas denominaciones: - Orden: el nombre acaba en -virales. Existen cinco órdenes: Caudovirales, Herpesvirales, Mononegavirales, Nidovirales y Picornavirales. - Familia: el nombre acaba el -viridae. - Subfamilia: el nombre acaba en -virinae. - Género: el nombre acaba el -virus. - Especie. 1.3 Virus de importancia clínica 2. Técnicas de identificación de virus Grandes diferencias con respecto a métodos para identificar bacterias: - El virus solo se replica en la célula hospedadora: Se requieren cultivos celulares. - No forman colonias: Se necesitan otros sistemas de detección. - No es visible con el microscópio óptico: Solo con el microscopio electrónico. 2.1 Las muestras La toma y el procesamiento correctos de una muestra clínica adecuada es el primer paso para conseguir el diagnóstico de laboratorio de una enfermedad vírica. Las mejores muestras son las que se obtienen en las primeras fases de la enfermedad, preferentemente dentro de las primeras 72 horas, ya que contienen concentraciones elevadas de virus que todavía no se han unido a anticuerpos. Transcurridos 7 días del inicio de la infección en hospedadores inmunocompetentes, habitualmente ya no vale la pena intentar cultivos virales y se debe recurrir a otras técnicas de diagnóstico. 2.2 Estudio directo de las muestras Técnicas de cribado (screening): - Tiene la ventaja de proporcionar un diagnóstico rápido. - Se basan en la detección de antígenos, ácidos nucleicos o en la detección de la respuesta inmunológica. 2.3 Técnicas de cultivo Los virus se pueden cultivar y posteriormente realizar técnicas de identificación de los virus aislados. Estos cultivos deben realizarse en sistemas celulares. 4 Laboratorio clínico y biomédico Microbiología clínica Sistemas celulares para el cultivo: Los sistemas celulares utilizados preferentemente son cultivos celulares artificiales. Pero, con autorización y bajo la supervisión del comité ético de experimentación animal del laboratorio, los cultivos se deben realizar en animales de experimentación o en embriones celulares. Los cultivos celulares se preparan a partir de un tejido u órgano. Cabe diferenciar entre: - Cultivo primario: Se prepara a partir de un tejido u órgano. Las células mantienen la viablilidad por un periodo limitado y no se reproducen en el cultivo. - Línea primaria: Cultivo establecido a partir de un tejido u órgano que se mantiene por un periodo limitado; en este caso existe reproducción de las células en el cultivo. Se suelen preparar a partir de fibroblastos dérmicos, queratinocitos, células endoteliales de aorta bovina (BAEC) o células endoteliales de cordón umbilical (HUVEC). - Línea celular continua: Cultivo establecido a partir de un tejido u órgano, en muchos casos de un tumor, que se mantiene en cultivo un tiempo ilimitado. Se trata de células “inmortales”. Los distintos cultivos celulares varían en cuanto a susceptibilidad a los diferentes virus, ya que existe una relación especifica hospedador-virus. En función de los datos clínicos y del tipo de muestra, se elige el tipo de cultivo más adecuado para inocular el material. La muestra se inocula en el tipo de sistema celular escogido y se incuba a 35-37ºC durante unos 14 días, observando el cultivo al microscopio óptico a las 24, 48 y 72 horas, y luego dos veces por semana. Se observarán los efectos sobre las células hospedadoras. Cultivo acelerado Shell vial Esta técnica mejora la adherencia y la penetración del virus en la célula receptora, lo que permite que al cabo de 48 horas de incubación ya se pueda proceder a la identificación de proteínas del virus mediante anticuerpos monoclonales específicos marcados con fluoresceína. Los cultivos celulares que se utilizan consisten en monocapas de células metabólicamente activas, que se adhieren a la superficie de un tubo, frasco o cubreobjetos contenido en un shell vial de fondo plano. Para cada identificación vírica se requiere una línea celular diferente. La muestra se deposita en estos tubos y se realiza una centrifugación, que acelera la adherencia y la penetración del virus. 2.4 Técnicas de identificación Los métodos de identificación se pueden clasificar según que persigan demostrar la presencia del virus o de alguno de sus constituyentes, en: - Directos - Indirectos Algunos de ellos requieren un aislamiento previo, mientras que otros se aplican directamente sobre muestras biológicas (generalmente suero, para aplicar técnicas inmunológicas). 5 Laboratorio clínico y biomédico Microbiología clínica Muchas de las técnicas que se aplican entran en el campo de la inmunología o de la biología molecular. Técnicas de microscopia electrónica: - Permiten visualizar el virus, y estudiar su estructura y tamaño. - También hay técnicas para cuantificar las partículas víricas presentes. - En los análisis de rutina solo se aplican técnicas sencillas de microscopia electrónica. Otras técnicas más complejas (citoquímica e inmunohístoquimica ultraestructural, inmuno-microscopia electrónica, etc.), solo se aplican en investigación. Una de las técnicas más utilizadas es la tinción negativa. La forma de la cápside, la presencia o no de cubierta y de espículas en ésta, o la forma del ácido nucleico son características observables que permiten una aproximación al tipo de virus presente en la muestra. Detección en cultivos: En los cultivos de virus, la detección de su presencia no se basa en la observación de colonias como ocurre con los microorganismos que hemos estudiado en unidades anteriores, sino en la observación de los efectos que producen sobre las células del sistema celular. Se observa la aparición del efecto citopático, que es la visualización de cambios morfológicos en las células inoculadas. Estos cambios pueden ser más o menos característicos, según el tipo de cultivo y el virus. Cuando no se detecta efecto citopático, se aplican técnicas que pueden poner en evidencia la presencia del virus en el cultivo, como la hemadsorción, la hemaglutinación o tinciones con anticuerpos monoclonales. 3. Diagnóstico de algunas enfermedades víricas 3.1 Virus de la hepatitis 3.2 Virus del SIDA 3.3 Herpesvirus 6