Enzymologie: Přednáška 4 PDF

ie ra og če ol Ku ym Enzymologie: přednáška 4 or nz Ig E Mechanismy enzymových reakcí 60 Evoluce enzymů 81 C  Štěpení chemických vazeb ie Příklad: ra og če ol HO...

ie ra og če ol Ku ym Enzymologie: přednáška 4 or nz Ig E Mechanismy enzymových reakcí 60 Evoluce enzymů 81 C  Štěpení chemických vazeb ie Příklad: ra og če ol HOMOLYTICKÉ. Ku ym C H C H radikály or nz Ig E HETEROLYTICKÉ C H C H proton přenostransfer protonu 60 carbanion karbanion 81 C hydride transfer C H C H přenos hydridu carbocation karbokation Acidobazická katalýza: hydrolýza N-acetylimidazolu ie katalyzovaná imidazolem (W.P. Jencks) ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 81 C  Hydrolýza N-acetylimidazolu: specifická a obecná ie kyselá katalýza ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 81 C Specifická kyselá katalýza - katalyzátorem je H+ (z vody). Obecná kyselá katalýza - katalyzátorem je jiný donor H+.  Hydrolýza N-acetylimidazolu: specifická a obecná ie bazická katalýza ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 81 C Specifická bazická katalýza - katalyzátorem je OH- (z vody). Obecná bazická katalýza - katalyzátorem je jiná báze. Hydrolýza N-acetylimidazolu: nukleofilní katalýza ie ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 Vzniká kovalentní meziprodukt. V daném systému se neprojeví, protože meziprodukt je 81 shodný s výchozím reaktantem (N-acetylimidazolem). C  Experimentální rozlišení mezi jednotlivými typy katalýzy ie Reakční rychlost = kobs. [acetylimidazol] ra og kobs = Při konstantním pH če ol kH2O } nezávisí na celkové Ku ym koncentraci imidazolu. + kH [H+] + kOH [OH-] or nz Roste se vzrůstající celkovou + kHI [HI+] Ig E + kI [I] koncentrací imidazolu. 60 kobs pH=7,9 Vzrůst směrnice se vzrůstem 81 pH, který způsobuje zvýšení pH=7,3 podílu formy I, svědčí o C uplatnění obecné bazické katalýzy. c Mutarotace glukosy: ustavení rovnováhy mezi α a  anomerem je provázeno změnou optické otáčivosti ie ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 81 C  ie ra og če ol Ku ym or nz 2,3,4,6-O-tetramethyl-α-D-glukosa Ig E TM-α-D-glukosa v aprotních rozpouštědlech typu 60 dimethylsulfoxidu nebo dimethylformamidu nepodléhá 81 mutarotaci. Reakci však lze katalyzovat směsí fenolu (slabá kyselina) a pyridinu (slabá báze). Pro rychlost C platí: v = k[fenol][pyridin][TM-a-D-glukosa] Výrazně lepším katalyzátorem je α-pyridon, který nese jak kyselou, tak i bazickou skupinu: ie ra og α-pyridon če ol Ku ym or nz Ig E 60 81 glukosa C v=k'[a-pyridon][TM-α-D-glukosa] k' = 7000M  k Galaktosamutarotasa (1-epimerasa) z Lactococcus lactis ie ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 81 C Thoden, J.B., Holden, H.M., J. Biol. Chem. 2002, 277, 20854–20861  L-laktátdehydrogenasa Protonací kyslíku se snižuje elektronová ie hustota na sousedním uhlíku. ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 81 C C 81 60 Ig E or nz Ku ym če ol Kyselé proteasy ra og ie  Ribonukleasa A: transfosforylace a hydrolýza ie ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 A = His-119 81 C B = His-12 Triosafosfátisomerasa ie ra og dihydroxyaceton-P (endiol) glyceraldehyd-3-P (glyceron-P) če ol Fosfátová skupina je vodíkovou Ku ym vazbou fixována v pozici bránící vzniku toxického methylglyoxalu. or nz Ig E 60 81 C  Enolasa 2-fosfo-D-glyceráthydrolyasa (tvořící fosfoenolpyruvát) ie HOOC-Glu211 - OOC-Glu211 ra og H2O Lys345 H Lys345 + H OH O O če ol H2N: H2NH+ H2C H - - O P O O P O Ku ym O - O - O O O- O- or nz 2-fosfoglycerát fosfoenolpyruvát Ig E 60 81 HOOC-Glu211 Lys345 H C H OH O + H2NH - O P O - - O O O-  Kovalentní katalýza ie ra og Nukleofilní skupiny a příklady enzymů če ol - Ku ym Ser (O ) serinové proteinasy α-fosfoglukomutasa or nz - Cys (S ) thiolové proteinasy Ig E Lys (NH2) aldolasa (typ I) 60 PLP enzymy 81 Asp (COO-) lysozym -fosfoglukomutasa C His (imidazol N) fosfoglycerátmutasa Serinové proteasy: mechanismus působení ie ra og če ol Ku ym katalytická triáda Asp-His-Ser or nz Ig E 60 81 C  Aldolasa D-fruktosa-1,6-bisfosfát-D-glyceraldehyd-3-fosfátlyasa (tvořící glyceronfosfát) Protonovaná ie Lys Schiffova báze - ra og elektrofilní centrum če ol umožňující Ku ym štěpení C-C or nz Ig E Rezonanční 60 stabilizace karbaniontu. 81 C  Glykosidasy ie ra og inverze konfigurace če ol Ku ym or nz Ig E 60 retence konfigurace 81 C  Lysozym (1) Lysozym narušuje bakteriální stěnu hydrolýzou (1-4) glykosidové ie vazby mezi kyselinou N-acetylmuramovou (NAM) and N- ra og acetylglukosaminem (NAG). Vazebné místo enzymu má tvar štěrbiny, do které se vejde hexasacharid (NAG-NAM)3. Štěpí se če ol vazba mezi čtvrtým (NAM) a pátým (NAG) zbytkem. Ku ym or nz Ig E 60 81 C Lysozym (2) Kruh D je po vazbě v ie položidličkové konformaci. ra og Glu35 protonuje kyslík mezi D a E. Původní Phillipsův če ol mechanismus předpokládal Ku ym vznik oxoniového kationtu v kruhu D stabilizovaného or nz elektrostatickou interakcí s Ig E karboxylem Asp52. V r. 2001 byla prokázána tvorba 60 kovalentního intermediátu, 81 který posléze hydrolyzuje. Dvě po sobě probíhající SN2 C reakce vysvětlují pozorovanou retenci konfigurace. Fosfoglukomutasy: D-glukosa-1-P D-glukosa-6-P α - běžný výskyt, X=Ser ie  - některé bakterie, prvoci, X=Asp ra og AKTIVACE FOSFORYLACÍ če ol Ku ym or nz Ig E 60 81 REORIENTACE C Fosfoglycerátmutasa: 3-fosfoglycerát 2-fosfoglycerát 2 typy: závislé a nezávislé na 2,3-bisfosfoglycerátu ie ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 81 C 2,3-BPG se může vázat ve dvou orientacích: v blízkosti His se pak nachází buď 2-P nebo 3-P (struktury c, d).  Thiamindifosfát (TPP) ie možnosti rotace ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 pKa  12 81 aminoskupina na pyrimidinovém kruhu disociací vzniká C je nezbytná pro funkci stabilizovaný ylid Reakce s účastí TPP: obecné schéma ie ra og Cδ+ C če ol Ku ym or nz Ig E 60 81 C Reakce s účastí TPP: „aktivní acetaldehyd“ ie ra og pyruvátdekarboxylasa ethanolová fermentace če ol Ku ym pyruvátdehydrogenasa (1. krok) or nz oxidační dekarboxylace Ig E pyruvátu na acetylCoA acetolaktátsynthasa 60 syntéza rozvětvených aminokyselin Val, Leu, Ile 81 u mikroorganismů a rostlin 1-deoxy-D-xylulosa-5- C fosfátsynthasa syntéza isoprenoidů u eubakterií, zelených řas a vyšších rostlin (v plastidech) mevalonátová dráha methylerythritolfosfátová (MEP) dráha ie ra og če ol Ku ym or nz Ig E PLASTID 60 81 C CYTOPLAZMA  Reakce s účastí TPP: transketolace („aktivní glykoaldehyd“) ie ra og če ol Ku ym glyceraldehyd-3-fosfát or nz xylulosa-5-fosfát Ig E 60 81 C ribosa-5-fosfát sedoheptulosa-7-fosfát  Pyridoxalfosfát (PLP) ie Tvoří Schiffovy báze s aminokyselinami. Vazba PLP na enzym přes -NH2 lysinu. ra og Enzym inhibován redukcí Schiffovy báze. če ol Ku ym Tvorba H-můstku udržuje Schiffovu or nz bázi v planární Ig E konformaci. 60 81 C Elektronakceptorní skupina stabilizující přechodový stav. V modelových experimentech aktivní i p-nitrobenzen. Při heterolytickém štěpení jedné z vazeb na Cα vzniká ie chinoidní meziprodukt ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 81 C Reakce s účastí PLP: dekarboxylace, transaminace ie ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 81 C amin oxokyselina Reakce s účastí PLP: serinhydroxymethyltransferasa (5,10-methylentetrahydrofolát:glycin-hydroxymethyltransferasa) ie ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 81 N5,N10-methylentetrahydrofolát C glycin  Reakce s účastí PLP: 5-aminolevulátsynthasa sukcinyl-CoA:glycin-C-sukcinyltransferasa (dekarboxylující) ie ra og če ol Kondenzace glycinu se Ku ym sukcinylkoenzymem A or nz Ig E 60 81 C 5-aminolevulát  Zn2+ ie Elektrofilní centrum: polarizace navázaných substrátů ra og δ- δ+ če ol Zn2+ SUBSTRÁT Ku ym Generování báze OH- z vody or nz Zn – OH + H+ Zn – OH2 Ig E 60 81 C 2+ 1+ 1+ 1+ 0 1- 2- pKa = 7.0 pKa = 8.26 pKa = 8.9 pKa = 11.2 Zn enzymy: alkoholdehydrogenasa ie ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 81 C C 81 60 Ig E or nz Ku ym če ol ra og ie Zn enzymy: karboxypeptidasa Zn enzymy: karbonátanhydrasa (H2CO3-hydrolyasa) ie ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 81 C C 81 60 Ig E or nz Ku ym če ol Ni enzym: ureasa ra og ie Co(I) jako nukleofil: methioninsynthasa ie (5-methyltetrahydrofolát:homocystein-S-methyltransferasa) ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 81 C Redoxní reakce: hydroxylace cytochromem P450 ie ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 81 C Redoxní reakce: superoxiddismutasa ie ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 81 C  Radikály v enzymových reakcích ie ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 1 - tyrosyl (ribonukleotidreduktasa typ 1, prostaglandin H synthasa, fotosystém II) 81 2 - tryptofanyl (DNA fotolyasa, cytochrom c peroxidasa) 3 - glycyl (pyruvátformiátlyasa, ribonukleotidreduktasa typ 3) C 4 - thiyl (pyruvátformiátlyasa, všechny ribonukleotidreduktasy) 5 - topa (Cu-dependentní aminoxidasa) 6 - tryptofantryptofanyl (methylamindehydrogenasa) 7 - modifikovaný tyrosyl (galaktosaoxidasa) 8 - 5´-deoxyadenosyl (methylmalonylCoA mutasa, ribonukleotidreduktasy, biotinsynthasa) Ribonukleotidreduktasy ribonukleosiddi(tri)fosfát + 2e-+2H+  ie 2´-deoxyribonukleosiddi(tri)fosfát + H2O ra og Přeměna substrátu vždy zahájena odtržením H z 3´-C če ol ribosy pomocí Cys-S. Jednotlivé Ku ym typy enzymů se liší způsobem generování reaktivního thiylu. or nz Ig E 60 81 C  ie ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 Mechanismus ribonukleotid- 81 reduktasové reakce u E. coli C Isomerasy s adenosylkobalaminem jako koenzymem ie ra og 1,2-posuny skupin C, OH, NH2 (X) če ol Ku ym or nz Ig E Příklad: methylmalonylCoA mutasa methylmalonylCoA  sukcinylCoA 60 81 C  Evoluce enzymů ie ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 A, B, … představují rodiny (stejná funkce a trojrozměrná 81 struktura), které jsou členy nadrodin 1, 2 …(stejná topologie elementů sekundární struktury a architektura aktivního místa). C LUCA = last universal common ancestor. E, F – vznik divergentní evolucí, A v 1 a 2 konvergentní nebo paralelní evolucí (podle toho, je-li znám společný LUCA).  Divergentní evoluce Homologní geny = odvozené z jednoho společného (ancestrálního) ie genu. ra og Dělí se na dva typy: če ol paralogní = výsledkem duplikace ancestrálního genu Ku ym ortologní = výsledkem speciace (vzniku druhů) or nz Ig E 60 81 C  Divergentní evoluce serinových proteas (1) ie ra og Párové srovnání sekvencí chymotrypsinu, trypsinu a elastasy če ol chymotrypsin vs. trypsin elastasa vs. trypsin Ku ym or nz Ig E 60 81 C  Divergentní evoluce serinových proteas (2) ie Superpozice struktur: ra og CHYMOTRYPSIN če ol TRYPSIN Ku ym ELASTASA or nz Ig E 60 81 C Divergentní evoluce serinových proteas (3) ie ra og če ol Ku ym or nz Ig E 60 81 C chymotrypsin trypsin elastasa P1 = Phe, Trp P1 = Lys, Arg P1 = Ala, Ser Divergentní evoluce serinových proteas (4) Fylogenetický strom ie serinových proteas ra og (program: Clustal W) če ol ELA = elastasa Ku ym CTRP = chymotrypsin or nz TRP = trypsin Ig E KAL = kalikrein 60 81 C Male, R. et al. : Eur. J. Biochem. 1995, 232, 677-685 Konvergentní evoluce vede ke vzniku stejné funkce u nepříbuzných struktur. Ty pak označujeme jako analogické (nepříbuzně podobné). ie (živočišná a ra og bakteriální serinová proteasa, če ol obě mají Ku ym katalytickou triádu se serinem) or nz chymotrypsin Ig E subtilisin 60 81 C karbonátanhydrasa α karbonátanhydrasa  karbonátanhydrasa γ Homo sapiens Porphyridium purpureum Methanosarcina thermophila  Promiskuitní aktivity enzymů Reakce se substráty bez vztahu k fyziologické funkci. V evoluci vznikají náhodně, nepodléhají selekčnímu tlaku. ie Sérová paraoxonasa (PON1) je lipolaktonasa asociovaná s HDL-apolipoproteinem A-I, která má ra og úlohu v prevenci aterosklerózy (kornatění tepen v důsledku ukládání lipidních látek do stěny tepny). laktonizace a hydrolýza laktonů hydrolýza oxonových metabolitů insekticidů če ol Ku ym PON1 or nz + Ig E PON1 60 hydrolýza nervově paralytických bojových látek (X = F nebo CN) 81 C hydrolýza aromatických (thio) esterů  Sekvenční prostor 1D ie 1 aminokyselina ra og 20 bodů če ol 2D Ku ym dipeptid 20 × 20 = 202 = 400 bodů or nz Ig E 60 Pro řetězec s N aminokyselinovými zbytky 20N = 10N.log20 ≐ 101,3N. 81 Např. pro N = 100 vychází 10130. Pro srovnání: ve viditelné části C vesmíru je celkem asi 1082 protonů (1023 hvězd o hmotnosti 1035 g). V přírodní evoluci proteinů se uplatnila pouze nepatrná část možných sekvencí, jejich počet se odhaduje na 1021-1043. Krajina zdatnosti (fitness landscape) ie ra og Sekvenční prostor je komprimován do če ol 2 dimenzí (rovina). Ku ym „Zdatnost“ (fitness) na přidané svislé or nz ose vyjadřuje Ig E funkčnost proteinu. Blízkost rozdílných 60 funkčností umožňuje evoluci v 81 důsledku mutací. C  Řízená evoluce metoda napodobující přírodní výběr k získání proteinu požadovaných ie vlastností ra og VYBĚR VÝCHOZÍ SEKVENCE če ol Ku ym DIVERZIFIKACE náhodné mutace – např. k chybám náchylná PCR or nz Ig E (error prone PCR) rekombinace genů – např. míchání DNA (DNA shuffling) 60 81 FUNKČNÍ TEST vysoce výkonný skríning nebo selekce C APLIKACE