Ejercicio 9 Western Blot PDF

UNIVERSIDAD INTERAMERICANA DE PUERTO RICO RECINTO DE ARECIBO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR Ejercicio 9. Western Blot OBJETIVOS 1. Realizar la transferencia de las proteínas totales del citoplasma de las células PANC-1 separadas en un gel de poliacr...

UNIVERSIDAD INTERAMERICANA DE PUERTO RICO RECINTO DE ARECIBO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR Ejercicio 9. Western Blot OBJETIVOS 1. Realizar la transferencia de las proteínas totales del citoplasma de las células PANC-1 separadas en un gel de poliacrilamida (SDS PAGE) a una membrana de nitrocelulosa. 2. Confirmar la transferencia de proteínas totales de mayor y menor peso molecular del gel de poliacrilamida a la membrana mediante la tinción de Ponceau. 3. Detectar la presencia de GAPDH humano en las muestras utilizando un anticuerpo primario y secundario específico. 4. Conocer cómo se realiza la técnica de Western Blot y la inmunodetección. INTRODUCCIÓN La técnica de Western blot se refiere a la transferencia de proteínas separadas en un gel de poliacrilamida (SDS PAGE, Electroforesis de 2D) a una membrana de nitrocelulosa, nilón o de difluoruro de poli vinilideno (PVDF). Luego de que las proteínas se hayan transferido a una membrana se pueden realizar la técnica de inmunodetección para detectar proteínas específicas o diferencias en la expresión genética de una proteína determinada. También se puede evaluar cambios químicos y modificaciones post-traduccionales en la proteína. El primer paso en un Western blot se conoce como electrotransferencia (electroblotting). Las proteínas con carga negativa son transferidas del gel de poliacrilamida a una membrana a través de un campo eléctrico. Las proteínas migran del polo negativo (cátodo) hacia el polo positivo (ánodo) y se inmovilizan en la membrana. Las proteínas pueden transferirse a la membrana mediante dos métodos: transferencia semi-seca (semi-dry blot) (requiere menor cantidad de buffer y toma menos tiempo) o mojada (wet tank blot) (requiere más buffer y toma más tiempo). Para realizar la transferencia se requiere preparar un montaje (sándwich) con los siguientes componentes: Electrodo con carga negativa (cátodo); blotting paper; gel de poliacrilamida; membrana de nitrocelulosa; blotting paper; electrodo con carga positiva (ánodo). Las proteínas pueden ser transferidas del gel a una membrana de nitrocelulosa, nilón o difluoruro de poli vinilideno (PVDF). Sin embargo, las membranas de nitrocelulosa y las de PVDF son las que se utilizan con mayor frecuencia. Las membranas de nitrocelulosa son económicas, bloquean con mayor facilidad y no requieren un pretratamiento con metanol. En este ensayo se usarán membranas de nitrocelulosa.La eficiencia de la transferencia del gel de poliacrilamida a la membrana depende de varios factores. Se requiere un proceso de optimización para una transferencia exitosa. Entre los factores están: tiempo de transferencia voltaje utilizado composición del buffer porcentaje de poliacrilamida grosor del gel peso molecular de la proteína Para comprobar la transferencia de las proteínas del gel de poliacrilamida a la membrana se puede usar tintes tales como Ponceau S y Amido Black. En este laboratorio se estará utilizando Ponceau S. Con Ponceau S las bandas son de color rojo o rosa. La tinción es rápida y no es permanente ya que desaparece rápidamente. Este es compatible con casi todos los procedimientos de detección usando anticuerpos (inmunodetección). 2 Con Amido Black las bandas aparecen negras. Después de la tinción se destiñe con una solución de metanol/ácido acético. La tinción es permanente y la membrana no puede ser reutilizada ya que el tinte interviene y previene la inmunodetección posterior. INMUNODETECCIÓN DE PROTEÍNAS Los anticuerpos (primario, secundario) al igual que la proteína de interés pueden unirse a la membrana directamente. Para prevenir interacciones no específicas entre la membrana y el anticuerpo se realiza el paso de bloqueo. Esto evita la unión del anticuerpo a la superficie de la membrana. Cualquier área que no esté cubierta en la membrana será un punto donde el anticuerpo ya sea el primario o el secundario podrá enlazarse de forma no específica a ella causando un trasfondo (background). Existen diferentes opciones de soluciones bloqueadoras. Cada opción tiene que ser evaluada y optimizada para su procedimiento. Las dos soluciones de bloqueo que son compatibles con casi cualquier sistema de detección son: leche desnatada (caseína) y albúmina de suero bovino (BSA por sus siglas en inglés). También puede utilizarse el detergente no iónico Tween-20. Se estará utilizando leche desnatada y Tween 20. El trasfondo (background) puede ocurrir debido a: 1. Bloqueo inadecuado de la membrana 2. Lavado inadecuado para remover la solución bloqueadora y anticuerpos 3. Cantidad muy alta de la proteína de interés o de los anticuerpos Posterior a la transferencia de las proteínas y el bloqueo se realizan los procesos de detección de la proteína de interés. Para esto se utilizan anticuerpos primarios, anticuerpos secundarios (policlonal o monoclonal) y sustratos dependiendo del método que se esté realizando. La desventaja de usar anticuerpos secundarios policlonales es que pueden reaccionar con otras proteínas (cross- react) presentes en la membrana. 3 El anticuerpo primario reconoce la proteína de interés (protein specific) GAPDH (Gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa) de 37 KDa. Esta se unirá únicamente en aquellos lugares donde la proteína de interés se encuentre. En este laboratorio, se estará trabajando con el anticuerpo primario: Anti-GAPDH producido en conejo (developed in rabbit) Reconoce GAPDH en ratón (mouse), rata (rat) y humano. El anticuerpo primario es eventualmente detectado por un anticuerpo secundario acoplado a una enzima que sirve para la detección. El anticuerpo secundario seleccionado debe haberse desarrollado contra inmunoglobulinas de la misma especie (species specific) del cual procede el anticuerpo primario, es decir, si el anticuerpo primario se desarrolló en conejo, el anticuerpo secundario debe ser un anti-conejo (antirabbit). Los anticuerpos primarios y secundarios se preparan en la solución bloqueadora para evitar reacciones no específicas. El anticuerpo secundario puede estar acoplado (conjugated) a la fosfatasa alcalina (alkaline phosphatase-AP) o a la peroxidasa de rábano (horseradish peroxidase-HRP). En este laboratorio se utilizará los anticuerpos secundarios: Anti-Rabbit IgG (whole molecule)- Alkaline Phosphatase developed in goat Anti-Rabbit IgG (H +L) Horseradish Peroxidase developed in goat Entre los sustratos colorimétricos en caso de usar el anticuerpo secundario con la fosfatasa alcalina está nitroblue tetrazolium/bromocloroindolil fosfato (NBT/BCIP). Forma un precipitado violeta. Entre los sustratos quimio luminiscentes en caso de usar peroxidasa de rábano, está luminol con peróxido de hidrógeno. En este caso ocurre emisión de luz. Se estará realizando el método colorimétrico y quimio luminiscente en el laboratorio. MATERIALES Trans Blot Turbo Transfer System Maxi Rotator CHEMI DOC Touch Imaging System Gel de SDS-PAGE con proteínas totales Trans-blot Turbo Transfer System Pack (mini nitrocelulosa) Rodillo o Varilla de cristal Pinzas Tijeras Envase de lavados Tris Buffer Saline (TBS) (150 mm, low salt) Ponceau S (0.01% Ponceau/ 5% Acetic Acid) Tween Tris Buffer Saline (TTBS) – (Solución de lavados) (150 mm, Low and 500 mM, high salt) Blocking Solution (TBS1X, Tween 0.1% leche desnatada) 4 Sustrato NBT/BCIP (colorimétrico) Sustrato Pierce ECL Western Blotting substrate (luminol con peróxido de hidrógeno) (quimio luminiscente) Anticuerpo Primario- Anti-GAPDH produced in Rabbit Dilución 1:2000 y 1:5000 Anticuerpo Secundario- Anti-Rabbit IgG (whole molecule)- Alkaline Phosphatase, developed in goat (método colorimétrico) Dilución 1:2000 Anti-Rabbit IgG (H + L) Horseradish peroxidase, developed in goat (método quimio luminiscente). En caso de Actina- Dilución 1:000 y en caso de GAPDH Dilución 1:2000. Marcador Precision Plus Protein Kaleidoscope PROCEDIMIENTO Electroforesis sds-page 1. Utilizar 5 µL del marcador kaleidoscope y 10 µL de cada muestra de proteínas que se extrajeron de PANC-1. 2. Precision Plus Kaleidoscope incluye 10 proteínas preteñidas. Para utilizarse descongelar a temperatura ambiente y mezclar completamente antes de usarse. No calentar. ¿Cuál de los kDa y color de las proteínas del marcador son importantes para poder identificar su proteína de interés GAPDH (37 kDa)? Transferencia 1. Remueve el gel entre los dos cristales con la espátula verde. 2. Abrir uno de los “Mini transfer pack”. Colocar sobre el anodo (+) (inferior) y en el centro del cassette el “blotting paper” humedecido y la membrana de nitrocelulosa. Utilizando el rodillo remueva las burbujas atrapadas entre blotting paper y membrana. 3. Coloque el gel sobre la membrana de transferencia. Es importante que membrana y gel estén a la par. El marcador Precision Plus Kaleidoscope localizado en cada extremo del gel debe quedar dentro de la membrana. Remueva las burbujas con el rodillo. 4. Coloque el “blotting paper” sobre el gel, remueva las burbujas con el rodillo. 5 5. Coloque la tapa superior del cassette (cátodo) (-) y cierre girando en dirección a las manecillas de reloj. 6. Introducir el cassette en uno de los compartimientos del instrumento. 7. Presione TURBO y seleccione su tipo de gel. Presione A: RUN (compartimiento superior) o B: RUN (inferior) para comenzar la transferencia. El voltaje máximo es de 25 voltios, 1.3 A (1 gel) o 2.5 A (2 geles). 8. Dejar correr 7 minutos. El tiempo puede variar dependiendo de las condiciones en el sistema. 9. Al final de la transferencia, en el instrumento aparece RUN COMPLETE. Remueve el cassette del compartimiento. 10. Abrir el cassette, remueve la membrana con pinzas y coloque la misma en un envase de lavados o en una caja de puntas vacía. 11. Teñir la membrana añadiendo 4 mL de la solución color rojo, Ponceau S (0.1% w/v, 5% ácido acético) y dejar por 15-30 minutos sobre la plataforma giratoria. Vertir el tinte en el recipiente designado. Nunca añadir el tinte directamente sobre la membrana. 12. Lavar la membrana tres veces con 15 mL de agua ultrapura para visualizar mejor las bandas. Colocar los desechos en el recipiente asignado. 13. Retratar la membrana. La tinción con Ponceau S permite confirmar la transferencia de las proteínas totales de mayor y menor peso molecular del gel de poliacrilamida a la membrana de nitrocelulosa. 14. Cortar con una tijera la membrana por la mitad. Cada grupo trabajará con la mitad asignada. 15. Lavar la membrana tres veces con 15 mL de TTBS low salt (150mM) (Tween Tris Buffer Saline). Cada lavado debe ser 5 minutos y sobre la plataforma giratoria. Se lava hasta que la membrana se observe lo más blanca posible. 16. Dejar secar la membrana completamente y guardar hasta que se vaya a utilizar nuevamente. 17. Mantenimiento instrumento. Vacíe cualquier residuo de líquido del cassette. Si no se va a realizar otra transferencia lavar el cassette y la tapa con agua desionizada y secar con kimwipes. Apagar el instrumento. Inmunodetección 1. Lavar la membrana una sola vez con 15 mL de TTBS low salt por 5 minutos. Coloque el envase de lavados sobre la plataforma giratoria. 2. Descarte el TTBS. Bloquear la membrana con 15 mL de 5% solución bloqueadora (leche desnatada, TBS 1X, 0.1% Tween) por un período de 1 hora o “overnight” a 4oC con agitación. La solución bloqueadora se utiliza para reducir las reacciones no específicas del anticuerpo. Esto evita que el anticuerpo secundario se pegue a la membrana reduciendo el “background”. 3. Descartar la solución de bloqueo. Realizar tres lavados con 15 mL de TTBS low salt de 5 minutos sobre la plataforma giratoria. 4. Incubar la membrana con 10 mL del anticuerpo primario. Dejar “overnight” a 4oC. Anti-GAPDH - Dilución 1:2000 y 1:5000 6 5. Realizar 3 lavados con 15 mL de TTBS low salt de 5 minutos sobre la plataforma giratoria. Es importante el paso de lavado para evitar interacciones no específicas (high background). 6. Cada grupo se encargará de preparar el anticuerpo secundario asignado. Los pasos para preparar el mismo son: a. Calcular el volumen a utilizar del anticuerpo secundario. El volumen para preparar son 10 mL. Hacer la conversión de mL a µL. Utilizar la fórmula: Volumen final/dilución = 10,000 µL/20,000 = 0.5 µL b. Añadir 5 mL del blocking buffer a un tubo de centrifuga de 15 mL. c. Añadir el volumen calculado del anticuerpo. d. Completar a volumen con el blocking buffer. e. Mezclar por inversión. f. Mantener en hielo hasta que se vaya a utilizar. 7. Incubar la membrana con 10 mL del anticuerpo secundario. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 1 hora en la plataforma giratoria (Maxi rotator). a. Anti-Rabbit IgG whole molecule Alkaline Phosphatase developed in goat (método colorimétrico). Dilución 1:2000. b. Anti-Rabbit IgG (H+L) Horseradish peroxidase, developed in goat (método quimio luminiscente). Dilución 1:2000. 8. Realizar 3 lavados con 15 mL de TTBS low salt de 5 minutos sobre la plataforma giratoria. Es importante el paso de lavado para evitar interacciones no específicas (high background). Método colorimétrico 1. Prepare el sustrato NBT/BCIP (COLORIMÉTRICO) en un tubo de centrífuga de 15 mL. Añada una tableta a 12 mL de agua ultrapura. Debe verificar que la tableta sea de color amarillo. 2. Agite en el vortex hasta disolver la tableta (toma alrededor de 15 minutos disolverse completamente). 3. Lavar la membrana una sola vez con 15 mL de TTBS high salt buffer (500mM). El lavado debe ser de 5 minutos. Descarte el TTBS high salt buffer. 4. Lavar la membrana una sola vez con 15 mL de TBS 1X. El lavado debe ser de 5 minutos. Este lavado remueve el detergente Tween 20. Descarte el TBS 1X. 5. Añadir 5 mL del sustrato NBT/BCIP a la membrana. Coloque la membrana sobre la plataforma giratoria. Descartar el sustrato en el recipiente indicado por su profesor. 6. Tan pronto como observe que las bandas adquieren un color violeta (BCIP/NBT), lavar con 15 mL de agua ultrapura. El lavado debe ser 5 minutos. Descarte el agua y retrate la membrana. El agua ultrapura debe estar localizado cerca de la plataforma giratoria. 7 Método quimio luminiscente 1. Lavar la membrana una sola vez con 15 mL de TTBS high salt buffer (500mM). El lavado debe ser de 5 minutos. Descarte el TTBS high salt buffer. 2. Lavar la membrana una sola vez con 15 mL de TBS 1X. El lavado debe ser de 5 minutos. Este lavado remueve el detergente Tween 20. Descarte el TBS 1 3. Este paso se debe realizar cerca del CHEM DOC. Añadir 3 mL de Peróxido de hidrógeno (reactivo 1) (QUIMIO LUMINISCENTE) en una esquina del envase de lavado. 4. Añadir 3mL de Luminol (reactivo 2) (QUIMIO LUMINISCENTE) en la otra esquina. Mezclar ambos reactivos moviendo el envase de lavados con la tapa cerrada. 5. Incubar la membrana por 1 minuto a RT. 6. Remover el exceso de la solución en el mismo envase antes de colocar la membrana sobre bandeja Chemi/UV/Stain Free del CHEM DOC Touch Imaging System (Bio Rad). 7. Para retratar la membrana. EN APPLICATION Marcar BLOT, CHEMILUMINESCENCE y AUTO OPTIMAL. 8. Descartar el peróxido de hidrógeno y el luminol en el recipiente indicado por su profesor. Preparación Anticuerpos Anticuerpo Primario- Anti-GAPDH produced in rabbit (37 KDa) Concentración 1 mg/mL Contiene 100 µL (10,000 µL) (0.2µg/mL)/ 1,000 µg/mL = 2 µL 8 V2/V1 = 10,000 µL/ 2 µL = dilución 1:5000 C1/C2 = 1,000 µg/mL/0.2 µg/mL = dilución 1:5000 (10,000 µL) (0.5µg/mL) / 1000 µg/mL = 5 µL V2/V1 = 10,000 µL/5 µL = dilución 1:2000 C1/C1 = 1,000 µg/mL/ 0.5 µg/mL = dilución 1:2000 Anticuerpo Secundario Método Colorimétrico: Anti-Rabbit IgG (whole molecule)- Alkaline Phosphatase, Developed in goat (Sigma A3812) Método Quimio luminiscente: Anti-Rabbit IgG (H +L)- Horseradish peroxidase, Developed in goat (Sigma AP 307P) DILUCIÓN 1:1000 y 1: 2,000 10,000 µL (volumen final a preparar) / 1000 dilución =10 µL 10,000 µL/ 2000= 5 µL Añadir 5 mL del blocking buffer en un tubo de centrifuga de 15 mL. Añadir el volumen calculado del anticuerpo secundario. Completar a un volumen final de 10 mL. Mezclar por inversión. RESULTADOS Se debe incluir la imagen de la membrana de nitrocelulosa teñidas con Ponceau después de la transferencia del gel de poliacrilamida a la membrana. Solamente se tiene rotular las bandas más importantes del marcador en el lado izquierdo o derecho. La descripción debe ser completa (oración inicial y la segunda oración con muestras y carriles. Se debe incluir la imagen de la membrana de nitrocelulosa para la detección de GAPDH usando el método colorimétrico. Recuerde la rotulación y la descripción completa. Debe incluirse en la descripción: sustrato, nombre completo del anticuerpo primario y dilución, nombre completo del anticuerpo secundario y dilución. Recuerde nombre de muestras y carriles. Se debe incluir la imagen de la membrana de nitrocelulosa para la detección de GAPDH usando el método quimio luminiscente. Recuerde la rotulación y la descripción completa. Debe incluirse en la descripción: sustrato, nombre completo del anticuerpo primario y dilución, nombre completo del anticuerpo secundario y dilución. Recuerde nombre de muestras y carriles. Revisado por: Prof. Arlyn Pérez (2020)/ Dra. Lizbeth Romero (2024) 9