EcoCitoTossicologia PDF

Esame articolo a scelta che riprende tutti i campi + interrogazione corso. Prima e Seconda lezione L’ Ecotossicologia è una disciplina che unisce i principi della chimica ambientale, tossicologia ed ecologia così da produrre indici e parametri con cui possiamo migliorare l’ambiente. Prima di veder...

Esame articolo a scelta che riprende tutti i campi + interrogazione corso. Prima e Seconda lezione L’ Ecotossicologia è una disciplina che unisce i principi della chimica ambientale, tossicologia ed ecologia così da produrre indici e parametri con cui possiamo migliorare l’ambiente. Prima di vedere perchè sono importanti questi indici de niamo cosa si intende per Ecotossicologia: - È la branca della tossicologia che si occupa dello studio degli e etti tossici, causati da inquinanti naturali o sintetici, sui costituenti degli ecosistemi, animali, vegetali e microbi, in un contesto integrale (Truhaut, 1969) - Essa studia gli e etti tossici degli agenti chimici e sici su popolazioni o comunità all’interno di un ecosistema de nito, individuando i diversi tipi di trasporto di questi agenti e la loro interazione con l’ambiente (Butler, 1978) - Integra gli e etti dei fattori di stress attraverso tutti i livelli di organizzazione biologica, da quello molecolare a intere comunità ed ecosistemi Quindi perchè è importante che l’ Ecotossicologia produca questi indice? Perchè la funzione principale è quella di fornire dati in ambito legislativo così che da poter prendere in atto vari precauzioni. Tossicologia nella storia: Essa è una scienza in evoluzione passando dalla percezione del danno alla prevenzione e protezione dell’ambiente. Dal greco tossicologia signi ca “relativo alla freccia”, allude al veleno utilizzato sulla punta di questa per avvelenare il nemico. La tossicologia passa da una scienza dei veleni (mirata) ad una scienza della prevenzione, poichè si occupa della valutazione dei rischi e della sicurezza d’uso delle sostanze di origine naturale o antropica, nel rispetto della tutela della salute dell’uomo e dell’ambiente. (Approfondimenti vedi slide). L’ecotossicologia ingloba la tossicologia di base ma cambia i principi e gli scopi. Vediamo adesso i principi della Tossicologia e poi dell’Ecotossicologia. Tossicologia: - Studia i meccanismi con i quali gli inquinanti producono e etti dannosi nei sistemi biologici - Studia la singola sostanza - Studia solo l’e etto tossico di una sostanza su un organismo - Valuta il grado di tossicità per poter de nire il margine di sicurezza e l’entità del rischio derivante dall’esposizione - Valuta la tossicità a livello di individuo ff ff ff fi fi fi fi fi ff ff  Ecotossicologia: - individua i percorsi degli inquinanti nell’ambiente - Studia gli e etti sinergici (miscele) - Studia gli e etti tossici su molte specie (saggi multispecie) - Caratterizza e quanti ca la dose di inquinante che è in grado di raggiungere i bersagli biologici - Valuta la tossicità a livello di comunità biologica, utilizzando appropriate scale spazio-temporali Quindi cosa fa l’ecotossicologia? Vede se la matrice crea un danno, senza osservare quale inquinante nel dettaglio crea il danno, per quello esiste la chimica ambientale. Ciò avviene perchè a noi interessa sapere la porzione della miscela che nell’ambiente raggiunge l’organismo e lo altera. Scopo avvicinarsi a quello che troviamo nell’ambiente. Scopi Ecotossicologia: - Quanti care gli e etti dei contaminanti su popolazioni, comunità o ecosistemi - Individuare il destino dei contaminanti nell’ambiente - Identi care le sostanze pericolose - Supporto decisionale nella stima del rischio e management ambientale - Supporto normativo per la regolazione della produzione e commercio di sostanze chimiche (Regolamente REACH) - Lo scopo ultimo è predire gli e etti dell’inquinamento in modo che possano essere identi cate le azioni più e cienti ed e caci per prevenire o porre rimedio ad ogni e etto dannoso (Principio di Previsione). Scopi in comune con tossicologia ma cambia target. Regolamento Reach: Regolamento concernente la registrazione, valutazione, autorizzazione e restrizione delle sostanza chimiche, necessario per mettere in commercio sostanze chimiche (tutto ciò che viene prodotta in Europa deve passare per questo regolamento). Lo studio ecotossicologico si rivolge alla stima della tossicità per prevedere gli e etti indesiderati sull’ambiente dovuti all’immissione di una singola sostanza o di una miscela di sostanze potenzialmente tossiche (per gli e uenti). Gli studi ecotossicologici possono essere parte integrante del biomonitoraggio, consentendo di veri care gli e etti indesiderati che sono avvenuti o che avvengono nell’ambiente. In senso più pratico, essa è stata descritta come l’esecuzione in laboratorio di test di tossicità su uno o più componenti di un ecosistema, allo scopo di proteggerlo interamente. Supporto chimico-ambientale e aspetto bioindicazione. Inquinamento: Un’alterazione dell’ambiente, naturale o dovuto ad antropizzazione, da parte di elementi inquinanti. Esso viene de nito per: - Frequenza intesa per temporale: intermittente o continuo - Dosaggio: acuto o cronico - Sorgente: localizzata o di usa (bacino lago) - Origine: civile (scarichi civili, liquami, detersivi), industriale (sostanze chimiche, metalli, farmaci), agricolo (concimi chimici, pesticidi, erbicidi) ma anche sico (temperatura, colore, torbidità), chimico (sali, gas, prodotti chimici) e biologico (parassiti, infezioni, specie invasive) - Cause: composti organici, metalli pesanti, pesticidi, sostanze acide, temperatura, altro L’inquinamento produce un danno rilevabile a livello di ecosistema -> comunità -> popolazione -> organismo -> porzione di un organismo. Il tipo di risposta varia in relazione al livello di organizzazione biologica e al tempo di esposizione. Bioaccumulo: Bioaccumulo è la concentrazione dell’inquinante rispetto all’ambiente in un organismo (applicabile a qualsiasi tipo di sostanza). - È la conseguenza diretta della presenza di contaminanti nelle matrici abiotiche. fi fi ff ff ffi ff fi ff ffi ff fi ffl fi fi ff ff ff fi  - È il trasferimento (per assunzione di cibo e/o acqua, respirazione e contatto) di contaminanti dall’ambiente esterno all’interno di un organismo. - È l’incapacità di espellere/degradare il contaminante accumulato. L’incapacità di non espellere dipende anche dalla natura della sostanza (ex lipo la si accumula, liposolubile no). - Permette quindi la valutazione dei livelli di contaminanti nell’organismo. Più alto è il valore e più la sostanza è stata accumulata nell’organismo. Il bioaccumulo permette di: superare il problema di rilevabilità strumentale (nell’organismo livelli > al mezzo); capire quali sono le sostanze biodisponibili; ottenere informazioni di tipo storico. Esso può determinare la tossicità per gli organismi esposti e la contaminazione delle reti tro che (biomagni cazione). Biomagni cazione l’inquinante aumenta man mano che salgo catena tro ca. Due tipi di contaminanti: - Contaminanti normati: sostanze riportate nelle normative europeo o nazionale, in ambito acquatico la regina è la direttiva quadro sulle acque, per le acque marine maristrategy - Contaminanti emergenti: non sono incluse nelle legislazioni ne programmi monitoraggio ma non signi ca che non siano allarmanti, sono emergenti quando si intravede pericolosità ma di coltà di analitico o scarsa conoscenza. Direttiva Quadro Acque 2000/60/CE: - Agevolare utilizzo sostenibile risorse idriche - Ridurre immissioni inquinanti ed eliminare scarichi di sostanze pericolose - Raggiungere lo stato di fi fi fi fi fi fi ffi  qualità “buono” - Entro il 2020 eliminare le sostanze prioritarie pericolose dagli scarichi - Principale aspetto innovativo è l’importanza riconosciuta agli elementi biologici Regolamento Reach: Istituito 2007, quadro normativo per le emissioni in commercio per tutte le sostanze prodotte o importate nell’unione europea. Obiettivi: - Migliorare la conoscenza dei pericoli e rischi derivanti da prodotti chimici già esistenti (introdotti sul mercato prima di settembre 1981) e nuovi (dopo settembre 1981) - Mantenere e ra orzare la competitività e le capacità innovative dell’industria chimica - Assicurare un maggiore livello di protezione della salute ambientale e umana Costituito da 141 articoli e 17 allegati tecnici, oltre alla registrazione delle sostanze prevede: ✓Valutazione delle sostanze considerate ‘’prioritarie’’ ✓Valutazione della sicurezza chimica e relativa relazione per le sostanze prodotte o importate in quantità superiore a 10 tonnellate/anno ✓Autorizzazione, solo per usi speci ci e controllati, delle sostanze ‘’estremamente preoccupanti’’ ✓Classi cazione ed etichettatura dei prodotti secondo regolamento CLP (Regolamento CE N. 1272/2008) per uniformarsi al sistema mondiale armonizzato GHS (Globally Harmonized System) Come funziona: Il REACH stabilisce le procedure per la raccolta e la valutazione delle informazioni sulle proprietà delle sostanze e sui pericoli che derivano da esse. Le aziende sono tenute a registrare le sostanze e a tale ne devono collaborare con le altre aziende che stanno eseguendo la registrazione della stessa sostanza. L’ECHA riceve le singole registrazioni e ne valuta la conformità normativa, mentre gli Stati membri dell’UE valutano le sostanze selezionate al ne di chiarire le preoccupazioni iniziali per la salute umana e per l’ambiente. Le autorità e i comitati scienti ci dell’ECHA valutano se è possibile gestire i rischi che derivano dalle sostanze. [ECHA: agenzia europea per le sostanze chimiche con compiti tecnico-scienti ci e di coordinamento] Le autorità possono vietare le sostanze pericolose se i rischi derivanti non sono gestibili e possono anche decidere di limitare un uso o di renderlo possibile solo previa autorizzazione. Le aziende hanno l’obbligo di presentare all’ECHA una serie di informazioni di base sulle caratteristiche delle sostanze e, in mancanza di dati disponibili, l’obbligo di eseguire test sperimentali per caratterizzare le proprietà sico-chimiche, tossicologiche e ambientali. Ciò si lega alla qualità in ambito eco tossicologico. Qualsiasi sostanza deve rispettare dei canoni di qualità che assicura quel prodotto (qualsiasi prodotto commercializzato). Qualità in Ecotossicologia: - ‘’QUALITÀ è l’insieme delle proprietà e caratteristiche di un prodotto o di un servizio che conferiscono ad esso la capacità di soddisfare esigenze espresse o implicite’’ (UNI EN ISO 8402 : 195) - ‘’QUALITÀ è il grado in cui un insieme di caratteristiche intrinseche soddisfa i requisiti’’ (UNI EN ISO 9000 : 2005) I laboratori di analisi, per assicurare la qualità del processo e la competenza, agiscono secondo normative de nite da enti di normazione (internazionali e nazionali) e si sottopongono a periodiche veri che da parte di enti preposti. Il laboratorio, operando in un Sistema di Qualità e sottoponendosi alle opportune veri che, può ottenere delle certi cazioni (speci che) e/o l’accreditamento. Obiettivi di Normazione: 1) Creare uno standard, ovvero un modello a cui ci si uniforma e chi viene preso come termine di riferimento; 2) O rire un riferimento per quanto riguarda l’uni cazione dei prodotti, la terminologia e la simbologia utilizzate, le metodiche di misurazione e monitoraggio; 3) Costituire un supporto continuo per migliorare l’e cacia e l’e cienza del lavoro; 4) Trovare soluzioni a problemi che si ripetono in diversi settori di attività; 5) Salvaguardare gli interessi delle parti interessate. fi ff fi fi ff fi fi fi fi fi fi ffi fi ffi fi fi fi  Organismi di normazione: (ISO vedi slide per approfondimento) Regolamento per uso animali: vertebrati e cefalopodi non possono essere utilizzati senza apposito permesso!!! Per gli animali da laboratorio quando applicabile si usa il Principio delle 3 R: ridurre al minimo numero animali usati, ridurre so erenze, tutti organismi in vivo se posso li devo sostituire in vitro. Per gli animali il REACH dice: “Nel caso in cui siano disponibili metodi alternativi scienti camente validati, che includano test non animali, test su cellule o tessuti coltivati in vitro, nonché altre alternative, nonché l'uso di dati derivati da test sui prodotti niti, le prove sugli animali devono essere sostituite in tutto o in parte.” Test ecotossicologico: Li e ettuiamo su un’ampia varietà di organismi e che prendono in considerazione gli endpoints (parametro misurato e valutato) qualcosa che si può misurare e quanti care. Questi endpoints possono essere: - Letali -> morte/soppravvivenza - Sub-letale -> mobilibtà -> dimensione o crescita (tempi di sviluppo e anomalie morfologiche) -> numero di uova o gli (riproduzione) -> alimentazione -> riduzione della ventilazione -> riduzione della bioluminescenza -> e etti sul DNA -> qualsiasi variabile biochimica o siologica che può essere attendibilmente quanti cata Le osservazioni possono essere periodiche o nali. Scopo rilevare l’azione causa-e etto misuro endpoint-concentrazione sostanza. Un “test ecotossicologico” è un saggio di durata variabile e con un protocollo de nito in cui si misura l’e etto di sostanze su molecole, cellule, organismi, popolazioni e comunità. Nei test devo avere sempre: - controllo negativo - esperimento - controllo positivo (condizioni estreme) condizione che so per certo che avrò un e etto (prese dalla letteratura) così so per certo che quello che osservo è l’e etto del contaminante. Gli organismi vengono esposti a di erenti concentrazioni o dosi di: - sostanze pure - miscele note - e uenti, prodotti di ri uto, miscele ignote - campioni ambientali in senso stresso ffl ff fi ff ff fi fi ff fi ff fi fi fi ff fi fi ff ff  Caratteristiche buon test: - Organismi allevabili - Semplice - Poco costoso - Breve durata - Rilevante dal punto di vista ecologico - Sensibile - Preciso - Riproducibile in altri laboratori - Standardizzato Endpoints: - morfologici - siologici - biochimici - biologici - basati su alterazioni comportamentali - teratogenesi Tempo del test: - Acuto: stimano gli e etti avversi che si manifestano in un breve tempo (non superiore ad un terzo del tempo medio tra nascita e raggiungimento della maturità sessuale e durante il quale l’organismo può essere mantenuto in buone condizioni in assenza di alimentazione) dopo la somministrazione di una singola dose di una sostanza. Il parametro più tipicamente utilizzato è la mortalità. - Sub-letali: stimano gli e etti avversi che si manifestano dopo l’esposizione ad una sostanza per un periodo ≤ 10 % vita dell’organismo (e durante il quale gli organismi vengono alimentati). - Cronici: stimano gli e etti avversi che si manifestano dopo l’esposizione ad una sostanza per un periodo > 50 % vita dell’organismo. Di solito si valutano e etti sub-letali. La misura della risposta biologica (o danno) può avvenire solo dopo l’identi cazione dell’e etto dovuto all’esposizione all’agente tossico. Spesso accade che ci si riferisca, erroneamente, all’e etto come quanti cazione del danno (risposta) subito da un sistema biologico. Misuro il danno, misura risposta biologica!!! E etto si indica tipo di danno funzione biologica compromessa. Risposta quanti cazione e etto espressa in % di incidenza in una certa popolazione. !!!Chiedono gra ci e casi studio all’esame quindi vedili!!!! Gra co risposta di un individuo ad una sostanza tossica (concentrazione-Stato di salute- omeostasi) fi ff fi ff fi fi ff ff fi ff ff ff fi ff  Curva dose-risposta: LD50 morte del 50% degli individui EC50 malattia, 50% individui mostrano e etto diverso dalla morte LT50 tempo in cui sono morte 50% individui NOEC no e etti LOEC concentrazione bassa a cui ho un e etto. Curva log: Quella di prima ma in scala logaritmica. La trasformazione della % di risposta biologica in scala logaritmica si de nisce PROBIT = Probability units La trasformazione delle concentrazioni in scala logaritmica de nisce i LOGIT Le curve di tossicità costruite utilizzando in ascissa le concentrazioni trasformate in Logit e in ordinata i dati trasformati in Probit si de niscono LOG-PROBIT e si avvicinano molto a rette Modelli dose-risposta: - lineare: risposta diretta già a basse concentrazione ho la risposta - a soglia: a basse concentrazione non ho risposta (condizione statica, plateau) mentre ad alte concentrazioni ho la risposta - ormetico: nelle prime fasi a concentrazioni basse ho come una risposta positiva (organismo bene cia della situazione) ma ad un certo punto (alte dosi) della concentrazione si comporta simile alla lineare ed ho e etto (risposta bifasica). Fenomeno ormesi (tipica dei vegetali selenastrum capricornutum) I risultati possono essere espressi come: - percentuale inibizione - concentrazione e cace ff ff fi fi ff fi ffi fi ff Vantaggi: - Forniscono misure sulla pericolosità di una sostanza (o sinergie) per organismi animali, vegetali, oltre che per la salute umana. - Restituiscono una valutazione del rischio ambientale (protezione dell’ecosistema). - Forniscono una base scienti ca per le decisioni di regolamentazione. - Sono semplici, in genere poco costosi e forniscono risposte facilmente comprensibili. Svantaggi: - Valutano l’e etto inquinante, ma non identi cano la causa (se miscela ignota). - Valutano solo un limitato numero di specie, non considerando tutte le specie ambientalmente esposte e tutte le possibili vie di esposizione. - Impossibilità di riprodurre in laboratorio la complessità degli ambienti naturali. Test Hydra: È un test di teratogenesi. Piccolo cnidario d’acqua dolce (classe Hydrozoa). Ottimo organismo modello grazie alla sua semplicità nella struttura , al suo alto tasso di riproduzione asessuale, alle elevate capacità di rigenerare la porzione di corpo rimossa, la facilità e bassi costi di allevamento e alla sua elevata sensibilità a diversi inquinanti. Essa è formata da: - columna (piede, gemma, regione gastrica) - hypostoma (tentacoli e bocca) Caratteristiche mantenimento: frigo termostatato 18°C, medium con acqua distillata sali carbonato sodio e cloruro di calcio, alimentata con naupli di Artemia salina (prima di somministrarli vengono sciacquati con acqua distillata) un’altra preda Daphia magna. Saggio: Tramite bisturi bisogna e ettuare un taglio netto al di sotto della bocca (molto precisi), gli organismi che vengono usati sono quelli privi di gemme perchè se no in 96h rischiamo di avere due individui che però non sono coinvolti nel test (riproduzione). Bisogna selezionare organismi morfologicamente di erenti. In una petri mettiamo 5 individui con repliche, condizione che testiamo per 3 volte (tot 15 individui). Il test prevede l’osservazione di come l’Hydra rigenera la parte mancante, si può fare anche osservando come dall’hypostoma rigenera la columna ma si preferisce osservare il contrario. Osservazioni tramite stereoscopio, durata test 96h, osservazione ogni 24h. Osserviamo tasso rigenerazione e frequenza di aberrazioni. Nel tasso di rigenerazione abbiamo 5 endpoints (0-4), nelle tipologie di aberrazioni abbiamo 8 endpoints (a-h). Posso svolger anche altri tipi di test: test comportamentali alimentazione e se tentacoli reattivi (reattivi o no) (stimolato con ago li tira verso la bocca come se avesse predato). Il tutto va inserito in una scheda di osservazione. ff ff fi ff fi  Alla ne delle osservazioni calcolo l’Indice di Rischio Teratogenico (TRI), colorazione simile alla direttiva quadro. 3 casi studi su Hydra: (li chiede all’esame vedi anche le iPad) A. Studio su acque correnti ( umi) nel Lazio: testare campioni ambientali d’acqua in 19 siti di erenti su 10 diversi umi della regione Lazio, punto sorgente e punto a valle per vedere come la parte in prossimità della foce sia più impattante. Per ogni punto 500 ml di acqua. Il primo sito entro 5 km sorgente il secondo in prossimità della foce. Ritardo rigenerazione e presenza aberrazione solo questi due. I risultati hanno evidenziato che il sistema Liri-Sacco- Garigliano più impattato, sul Liri più impattato. Si può osservare che quasi il 50% hanno un rischio anche se basso. [The Hydra regeneration assay reveals ecological risks in running waters: a new proposal to detect environmental teratogenic threats] B. Applicazione del saggio per rilevare gli impatti delle micro-nanoplastiche: in questo test implementazione di test alimentazione e reattività tentacoli. Ad ogni Hydra esposta 10 nauplii per osservarli meglio. Si è trattato di polimeri del polistirene [poli(stirene-co-metilmetacrilato)] che viene usato in oggetti di uso quotidiano (telefoni, lenti a contatto, protesi, ect); obiettivo era simulare una condizione di inquinamento da micro-nanoplastiche (da 0,1µg/l a 10000 µg/l) che posso osservare anche in ambiente. In laboratorio sono state prodotte queste particelle di plastiche, proprio a simulare condizioni esterne. Nei risultati è stato osservato come il tasso di rigenerazione è stato impattato alla concentrazione più bassa; alla frequenza di aberrazione è stato visto che vi erano ma non erano signi cativi; per l’implementazione i risultati signi cativi sono solo all’esposizione più bassa, possibile spiegazione è dovuta che a concentrazioni più alte le plastiche si aggregano e non era possibile ingerirle dall’organismo a di erenza di quelle a concentrazioni più basse in cui le particelle rimanevano separate e avevano un e etto. Le implementazioni sono importanti perchè si possono legare alla neurotossicità. Anche in questi campioni si calcola TIR e si osserva che l’impatto più evidente era alla concentrazione più bassa con uno score intorno all’8. [Assessing teratogenic risks of gadolinium in freshwater environments: Implications for environmental health] C. Applicazione del saggio per rilevare impatti del Gadolinio: in questo test implementazione di test alimentazione e reattività tentacoli. Ad ogni Hydra esposta 10 nauplii per osservarli meglio. Questa sostanza viene utilizzata per pazienti sottoposti a radiogra e. Duplice approccio sia testando in situazioni di laboratorio che ambientali (campo), in quelle di laboratorio è stato valutato la Gadodiamide e Omniscan (farmaci/agenti di contrasto, vietato in Europa ma in USA ancora utilizzato). Per quanto riguarda i campioni ambientali è stato sviluppato lo studio su alcuni siti visti prima, oltre a questi studi anche quelli chimici per osservare la presenza o meno della sostanza. Siti scelti in prossimità di scarichi di questa sostanza, acque re ue. Risultati osserviamo che se sia per le soluzioni di laboratorio l’indice TRI non ha evidenziato di erenze di rischio nonostante di erenze nella reattività ed alimentazione. Per i campioni in campo invece per la reattività dei tentacoli e per il tasso di alimentazione è stata mostrata una di erenza signi cativa Necessità di inserire endpoints ff fi fl fi fi ff ff fi fi fi ff ff fi ff fi  comportamentali nel calcolo del TRI, per renderlo più completo ed esaustivo. Scoperta di un Hydra a due teste. [Assessing teratogenic risks of gadolinium in freshwater environments: Implications for environmental health] Un test simile si può svolgere sulla Planaria Girardia tigrina, poichè anch’essa ha la capacità rigenerativa. Conclusioni e prospettive future: - Utilizzo del saggio di Hydra e dell’TRI come sistema di allarme rapido per identi care le aree ad alto rischio - Elaborazione di mappe di rischio teratogenico per identi care le fonti antropiche di disturbo - Valutazione di sostanze emergenti, utilizzare strumenti prima di metterli in commercio - Approccio multidisciplinare e Ecotossicologia è uno strumento che parla con altri settori, approccio “One Health” Terza lezione L’Ecotossicologia è una scienza ad ampio respiro che valuta destin, comportamento ed e etti biologici di sostanze potenzialmente pericolose per l’ambiente, in genere utilizzando organismi appartenenti a diverse classi tassonomiche. In particolare, l’ecotossicologia acquatica utilizza organismi acquatici con un focus su tale ambiente. Il principio secondo il quale organismi acquatici potevano essere utilizzati per rilevare la presenza di agenti tossici ignoti è anteriore al 1900: infatti, già a metà ‘800 Penny e Weigelt descrivono gli e etti tossici di scarichi industriali su organismi selvatici, mediante l’esecuzione di studi di tossicità acuta della durata di qualche minuto od ora ed occasionalmente 2/4 giorni. Organismo acquatico aspetto innovativo. Nel 1924 Carpenter pubblica il suo primo lavoro riguardante la tossicità di ioni di metallo pesanti, provenienti da miniere di piombo e zinco, su alcune popolazioni ittiche. La maggior parte degli studi condotti negli anni ‘30 e ‘40 ha lo scopo di fornire una maggiore comprensione nell’interpretazione dei test chimici, quale primo passo per la successiva incorporazione degli studi biologici nel processo di trattamento delle acque di scarico, o di approfondire le informazioni basilari su tolleranza, metabolismo, processi energetici delle varie specie sino a quel momento acquisite.Ad esempio, Ellis nel 1937 determina l’uso di Daphnia magna per misurare l’inquinamento dei corsi d’acqua, mentre nel 1944 Anderson ne amplia il lavoro e pone le basi per giungere a procedure standardizzate per test di tossicità con Daphnia magna (grande utilizzo per le sue caratteristiche). La prima procedura standardizzata viene, però, pubblicata nel 1951 da Doudoro (Doudoro et al., 1951) e, in un secondo momento, incorporata in una procedura ASTM (American Society for Testing and Materials International). La Daphnia magna ha una semplicità morfologica ed ha anche un mantenimento delle caratteristiche target per un buon test di laboratorio. A tutti gli e etti è stata riconosciuta una normativa a livello globale univoca con procedure speci che. Tuttavia nella storia L’Ecotossicologia delle acque ha subito diversi cambi di paradigma: - Paradigma della diluizione: anni 40-50, si pensava che gli inquinanti nell’ambiente non avessero impatto poichè andavano incontro a fenomeni di diluizione. Tuttavia questa ideologia si può considerare in piccola parte vera ma non tutte le sostanze si diluiscono. - Paradigma della ritorsione: boomerang di paradigma, ogni azione dell’uomo può avere delle conseguenze indesiderabili. innescate conseguenze irreversibile perchè creano impatto. Il concetto dei criteri delle qualità delle acque (WQA) fu formulato sommariamente dopo il secondo con itto mondiale da McKee (1952) e successivamente de nito con maggiore precisione: “un criterio di qualità acquatica è de nito come un dato scienti co utilizzato per giudicare quali limiti di variazione o alterazione dell’acqua non avranno e etti avversi sull’utilizzo della stessa da parte dell’uomo o degli organismi acquatici”; in questa de nizione oltre alla componente ambientale c’è sempre l’uomo. Le conoscenze acquisite circa i test ecotossicologici portarono in ne, negli Stati Uniti, alla stesura di manuali EPA (Environmental Protection Agency), fi fl ff ff fi fi ff ff fi fi fi fi fi ff ff  nonché, nel 1976, di linee-guida per l’ambiente acquatico, riviste poi nel 1986 sempre ad opera di EPA. Essa come le altre discipline ha bisogno di una società di riferimento SETAC (Society of Environmental Toxicology and Chemistry) più antiche (1981), convegno internazionale che viene svolto ogni anno in cui si parla delle nuove linee guida e dei traguardi nella disciplina. Permette di avere un publico molto variegato. Andando all’aspetto che riguarda il biomonitoraggio tramite animali acquatici un organismo può essere utilizzato come bioinidcatore o bioaccumulatore. Bioindicatore parola neutra che va a ancato alla qualità di un ambiente in base ad una matrice speci ca; inoltre si intende per buon bioindicatore la sensibilità di alcune specie animali a determinati inquinanti o condizioni di alterazione idromorfologiche. Per i bioaccumulatori di contaminanti ambientali, abbiamo invece la tolleranza alla presenza ambientale di inquinanti e di accumularli al loro interno, ciò è importante in quanto può darci un’indicazione del progresso dell’ambiente e a valutare concentrazioni di sostanze che a volte con la semplice misurazione tramite strumento non vengono percepite. Alcune scuole di pensiero uniscono i due concetti altre scuole le separa. Queste proprietà degli organismi acquatici sono importanti ed utilizzate anche nell’ambito ecotossicologico. Scelti in base allo scopo dello studio, parto dall’obiettivo dello studio e in base a quello scelgo l’organismo che voglio usare e osservo anche il suo gra co risposta-tempo di esposizione. Il destino di una sostanza è determinato dalla proprietà chimico siche intrinseche della sostanza stessa, dalle proprietà chimico- siche e biologiche dell’ambiente e dalla quantità in cui è rilasciato nell’ambiente stesso (determinante per capire destino che si attende). Vi sono diversi processi che alterano la qualità di una sostanza, che magari risulta essere inerte ma in acqua può o diventa tossica e viceversa. Questi processi possono essere: - Diluizione: operazione per cui a una sostanza viene aggiunto un liquido per diminuirne la concentrazione; chimico- sico; riduzione e etto solo se si diluisce al massimo - Adsorbimento: fenomeno in virtù del quale la super cie di una sostanza solida, detta adsorbente, ssa molecole provenienti da una fase gassosa o liquida con cui è a contatto; per esempio le microplastiche tendono ad adsorbire altre sostanze nell’ambiente, arma a doppio taglio è vero che adsorbendo la sostanza viene accumulata in una fase solida e concentrazione minore nell’ambiente ma se un organismo accumula o ingerisce la sostanza solida avrà concentrazione alta rispetto all’ambiente - Idrolisi: reazione chimica di scissione di un composto nella quale interviene l'acqua; dipende dalla caratteristica chimica di quella sostanza non tutte sono soggette ai processi ambientali che stiamo vedendo - Ionizzazione: processo in virtù del quale un atomo o un gruppo atomico acquistano una carica elettrica pari a una o più cariche elementari il suo stato varia e anche la sua tossicità) - Fotolisi: reazione nella quale ha luogo la rottura di un legame chimico in una molecola a seguito di irraggiamento con radiazione elettromagnetica (non si sa la trasformazione che potrà avere questa molecola) - Degradazione microbiologica: degradazione di un composto (a prescindere che sia di origine naturale o sintetico) attraverso processi enzimatici, in genere per azione di microrganismi quali batteri e funghi; per esempio le microplastiche possono essere prodotte anche come bioplastiche (daò carapace del granchio blu) così non restano composizione polimerica ma si possono degradare - Volatilizzazione: passaggio di un liquido allo stato di vapore - Ripartizione: Legge secondo la quale il generico componente di un sistema eterogeneo costituito da due, o più fasi a contatto (per es., due liquidi tra loro non miscibili e quindi formanti due strati sovrapposti), si distribuisce tra le fasi secondo un rapporto costante di concentrazioni; se ho due liquidi che non si possono mescolare in realtà si possono andare a distribuire seguendo questa reazione Nel comparto acquatico, le sostanze organiche generalmente si legano ai sedimenti, con un conseguente miglioramento della qualità delle acque e un peggioramento della qualità dei msedimenti dovuto all’adsorbimento (importanza di studiare specie bentoniche). Tutti i saggi di ecotossicità possono essere e ettuati o per valutare commercio o miscela composti o acque re ue. I saggi di tossicità con animali acquatici vengono e ettuati per valutare se un dato composto, una miscela di composti o un campione d’ acqua di scarico sono tossici e, in caso positivo, per de nire il grado di tossicità o i valori di diluizione compatibili con la vita acquatica. Nel passato sono stati condotti saggi con organismi di una sola specie allo scopo di aumentare il grado di protettività del dato ottenuto; oggi si tende a sviluppare saggi “multispecie”, condotti con organismi di livelli tro ci diversi (batteri, alghe, crostacei, pesci). A di erenza della fi fi fi fl fi fi fi ffi ff ff fi fi ff ff fi  tossicologia, l’ecotossicologia ha la necessità di utilizzare più organismi, seguendo la rappresentatività ecologica ma anche la catena tro ca, così da donare una risposta più o meno simile, per esempio organismo unicellulare produttore (alga) -> organismo unicellulare decompositore (batterio) -> organismo pluricellulare consumatore (invertebrato). Caratteristiche organismi animali in ecotossicologia: - Sensibilità: alterazione biochimica e siologica; modi cazione anatomico-morfologica; alterazione comportamentale - Molti organismi presentano produzione asessuale: elevato numero di individui geneticamente identici in poco tempo - Costi di mantenimento: soprattutto con organismi di ridotte dimensioni - Alcuni organismi sono bioaccumulatori - Importante ruolo e rappresentanza nella catena tro ca: consumatori primari e nali - Ampia scelta di organismi acquatici e metodi: normati e non; di erenti matrici; ricordare che alcuni organismi normati e linee guida standard altri organismi non normati e quindi standardizzati a livello normative e direttive, matrice che testiamo importante E da li la scelta organismo. Matrici testate in ecotossicologia: Dati italiani ISPRA ambiente (2010) (sito buono ambito ecotossicologico) riportate percentuali panoramica italiana anche per matrici più investigate, 63% di acque dolci t r a c u i a c q u e re u e , s o t t e r r a n e e , super ciali, ect buona fetta per una volta ambiente marino non fa da padrone, le acque re ue per de nizione devono esssere testate prima di rilasciarle. Organismi utilizzati il 43% è animale nello speci co 40% invertebrati (crostacei, mollusco, rotifero) altra fetta pesci. Altra componente 21% piante tra cui equiripartito tra piante e alghe, batteri e cellule. Strategia animale importante più cellulare in vitro che in vivo come avevamo visto. Organismi usati in ambito acquatico dolce: Salmonella Pseudomonas putida Arthrobacter globiformis Vibrio sheri Primi sono patogeni anche direttiva monitorati anche quelli di origine fecale, monitorati acque super ciali e di balneazione (pari a 0). Rotiferi Crostacei Nematodi Anellidi Insetti acquatici (molti insetti fase larvale in acqua anche quella più sensibile) Pesci (zebra sh si ricorre in alcuni casi alle uova; alcune specie autoctone quindi di cile in lab oltre che permessi per lavorare) si può utilizzare specie aliene per specie di accumulo An bi e altre volte rana toro (aliena Italia) oltre a quella slide. In ambiente marino: Crostacei Anellidi policheti fi fi fi fi fi fl fi fl fi fi fi fi fi ff fi ffi  Echinodermi Molluschi più in ambito marino che dolce ma si possono usare (cozze, ltratore accumula grande quantità di sostanze si massa d’acqua che sedimento) Pesci Come facciamo a scegliere la specie? La scelta delle specie da utilizzare nei test di tossicità dipende dall’obiettivo che si vuole conseguire. Per studiare l’e etto dell’immissione di sostanze tossiche nell’ambiente si scelgono alcune specie come indicatrici dello stato dell’ambiente, in grado di riassumere le caratteristiche generali del fenomeno ambientale. Nei test ecotossicologici, organismi viventi in condizioni ottimali vengono posti a contatto con la matrice da testare per un determinato tempo e si valuta la risposta mostrata dall’organismo. Organismo test deve essere vivente che in condizioni ottimali non hanno alterazione siologico e una volta a contatto con matrice da testare possono avere una risposta. Dallo stato ottimale alla morte io devo avere una risposta. Come facccio a capire che parto da una condizione ottimale? Devo avere anche organismi a controllo in un test così so caratteristiche ottimali. Poiché non esiste una singola specie adatta ad esprimere gli e etti di tutti i possibili tossici, è necessario utilizzare una serie di organismi test, con sensibilità di erente alle sostanze tossiche (BATTERIE DI TEST). I componenti della batteria vengono solitamente scelti in base alla loro rappresentatività ed in base alle loro relazioni con la catena tro ca. Se voglio vedere e etto su una specie autoctona ma non posso utilizzarla allora uso una specie non endemica o con caratteristiche simile così mi rappresenta senza utilizzare quella determinata specie, massima somiglianza. La scelta delle specie da utilizzare nei test di tossicità dipende dall’obiettivo che si vuole conseguire. Se l’obiettivo è proteggere una specie minacciata dalla presenza di determinate sostanze si potrà decidere di analizzare l’ambiente dove si trova impiegando una specie che la sostituisca, scelta con il criterio della massima somiglianza ma anche dell’economicità e comodità operativa. Nell’ambito dell’ecotossicologia acquatica, a nché un organismo test possa essere considerato rappresentativo del corpo idrico recettore, non deve necessariamente svolgere il suo ciclo vitale al suo interno. L’organismo test prescelto deve comunque essere in grado di vivere senza problemi in un campione non contaminato del corpo recettore in esame, senza mostrare alcun segno di disturbo. Se l’obiettivo è coprire la maggior parte degli stressori potenzialmente presenti in un campione, sarà opportuno applicare il criterio della massima diversità componendo una batteria di organismi, in cui ciascuno dei membri dovrà correlarsi con le specie rappresentate e complementarsi con le altre specie che compongono la batteria Per chiarire quale sia lo spettro di sensibilità di una serie di specie occorre eseguire dei test utilizzando composti puri. Infatti, nel caso di miscugli di composti o di campioni ambientali (ad esempio un re uo) non è possibile evincere dal test quale sia l’agente causativo, e quindi sarà molto di cile rilevare le individuali carenze di sensibilità di ciascuna specie: nella maggior parte dei casi le specie saggiate daranno risposte positive, anche se in realtà dovute ad agenti causativi diversi. A tutto ciò va aggiunto l’e etto delle sinergie, che uniformano ulteriormente i risultati contribuendo ad occultare le di erenze. Ci avviciniamo ai principi della ecotossicologia testare sostanza nota step che faccio a priori della scelta della specie, nella fase di scelta applico step o in letteratura o in lab se non vi sono. Quando testo un campione ambientale non so l’agente e ettivo e quindi non so qual è la sensibilità della specie ai diversi composti, posso avere anche risposte positive ma con cause di erenti. Specie risposta di una sostanza in una miscela altra specie altra risposta ma magari non a quella sostanza ma un’altra nella miscela ma non so di preciso le sostanze e quindi si parla di e etto sinergico, altera risposta di test. Test Vibrio scheri: Usato anche per testare test di acque dolci nonostante sia marino, non viene compromessa i suoi stati ottimali e quindi si può usare. Organismo unicellulare decompositore. Endpoint è l’inibizione della bioluminescenza. È un test acuto (15-30 minuti). Batterio marino che vive in simbiosi con Euprymna scolopes, calamaro delle Hawaii. La produzione di luce scaturisce da una reazione enzimatica in cui l’enzima luciferasi ossida un’aldeide alifatica ad acido carbossilico con emissione luminosa (reazione che converte l’energia chimica in energia luminosa). La simbiosi permette al batterio di ricevere nutrizione e protezione mentre l’animale sfrutta la bioluminescenza per la predazione, l’accoppiamento o per sfuggire ai predatori tramite un processo di ff ff ffi fi fl fi ff ff ff ff ff ffi fi fi ff ff  controilluminazione. La seppia è in grado di controllare l’intensità della luce agendo sul numero di batteri presenti nel suo organo e i termini della simbiosi sono i seguenti: i batteri ricavano nutrimento, il calamaro usa la luce che emettono per mimetizzarsi nell’ambiente (tramite controilluminazione) → eguagliare esattamente la luminosità dello sfondo, fornendo un camu amento. I batteri dentro la provetta trasparente inserite nei pozzetti e misurazione in più tempi con T°C ottimale e si misura intensità. Insieme ai batteri anche campione che testo (acqua ect). Attraverso uno speci co strumento, il luminometro (Microtox), vengono e ettuate delle misure di luminescenza ad un tempo de nito. La presenza di sostanze inibenti si manifesta mediante una riduzione della bioluminescenza, proporzionale alla tossicità del campione in esame. La tossicità del campione viene misurata in termini di inibizione % o di EC50, che rappresenta la concentrazione per la quale si ha la diminuzione del 50% della luce emessa dai batteri. Caso studio slide o le se vuoi approfondire. Test Daphia magna: È molto utilizzata. Organismo pluricellulare consumatore. Endpoint immobilizzazione. Test acuto (24 h). Le antenne vengono usate non solo per muoversi ma anche per convogliare risorse e ossigeno nell’acqua quando invece smette di muovere antenne allora immobile, qui immobile signi ca morte. Il genere Daphnia (più di 100 specie) è classi cato nel sott'ordine dei Cladoceri, protetti da un carapace chitinoso semitrasparente (facile così da vedere cosa accade dentro). La D. magna è una delle specie più grandi (5 mm). Possiede due antenne rami cate esterne usate per nuotare e cinque appendici toraciche all'interno del carapace. Queste producono una continua circolazione d'acqua che procura ossigeno e nutrienti. Le femmine producono solitamente covate partenogenetiche (senza fecondazione maschile). Quando le condizioni ambientali divengono sfavorevoli (temperature limitanti, scarsità di cibo) le D. magna modi cano il loro ciclo vitale producendo una generazione in cui sono presenti i maschi. Segue una vera riproduzione sessuale con uova fecondate che vengono racchiuse in una apposita capsula protettiva, l'e ppio (capsula che si può ritrovare anche dopo tantissimo tempo si conservano nel tempo). Vengono utilizzati neonati di età inferiore a 24 h provenienti da femmine allevate in laboratorio e da riproduzione partenogenetica (condizioni ottimali). I risultati possono essere espressi o come percentuale di individui morti/immobilizzati o come valore di EC50, cioè come concentrazione della sostanza tossica che determina la morte/immobilizzazione del 50% degli individui impiegati nel test. Oppure si può svolgere anche un test cronico (21 gg). Il test è condotto su quasi l’intero ciclo vitale della Daphnia magna, permettendo di individuare meglio gli e etti sull’organismo test di basse concentrazioni di xenobiotici (21 giorni). Per capire se un organismo sta bene e non subisce danni è vedere se si riproduce in maniera sessuale o no. Segnale che anche in lab c’è qualcosa che non va bene. Si può utilizzare sia acuto che cronico cambia metodica standard. Perchè così so che sono organismi che vengono da condizioni ottimali. Anche nel cronico solo partenogenico, arrivi ad una Daphia adulta. Con F si intende la rigenerazione (F0 femmine partenogenesi con le altre le generazioni successive). Un altro parametro può essere la dimensione corporea. Caso studio slide o le se vuoi approfondire. Test Chironomus: Organismo pluricellulare consumatore. Endpoint emergenza degli adulti. Test cronico (28 gg). Viene utilizzata fase larvale. Chironomidi sono insetti che assomigliano alle zanzare, ma che a di erenza di queste non pungono, non sono quindi di interesse sanitario. Le larve sono comunemente chiamate dagli anglosassoni blood worms ("vermi sanguigni") e, in italiano, vermi rossi dei pescatori. Nomi dovuti al colore rosso dell'emolinfa e al fatto che le larve essiccate sono impiegate come esche dai pescatori e come mangime per i pesci. Costituiscono un anello importante della catena alimentare degli ecosistemi di acque dolci. Nei laghi, in particolare, la biomassa costituita da questi insetti è parte signi cativa della produttività. Alle nostre latitudini i Chironomidi tendono ad avere due generazioni annuali: una generazione invernale (uova deposte a ne estate e sfarfallamento nella primavera successiva); una generazione estiva (temperature più elevate, tempi più brevi e sfarfalla al termine della stagione calda con sciami). Larve al primo stadio di sviluppo di chironomidi bentonici del genere Chironomus sp. (C. riparius, C. dilutus, C. yoshimatsui) provenienti da allevamenti, vengano esposti al campione in un sistema (sedimento arti ciale + sostanza di prova) – acqua ricostituita per 28 giorni (C. riparius, C. yoshimatsui) o 65 giorni (C. dilutus) a 20 °C ± 2°C con fotoperiodo di 16 ore luce / 8 ore buio. L’endpoint è rappresentato dall’emergenza degli adulti. Addizionali endpoint possono essere la crescita e la sopravvivenza. Ciclo varia a seconda delle latitudini in cui si trovano. Allevamenti perchè non ff ff fi fi fi ff fi fi fi fi fi fi fi fi ff fi  organismi abituati a vivere in condizioni già stressati ho bisogno di fare prima cicli normali senza studio. Se uso organismi bentonici è più probabile che stia testando condizioni benthoniche. Caso studio slide o le se vuoi approfondire. Test Danio rerio: Organismo pluricellulare consumatore. Endpoint mortalità-eventuali anomalie. Test acuto (96 h). Organismi con dimensioni contenute. Pesce teleosteo, cioè dotato di scheletro osseo, della famiglia dei Ciprinidi di dimensioni minute, noto come zebra sh. Vertebrato: utilizzo vincolato da legislazione. E’ uno dei vertebrati maggiormente utilizzati come modello in vivo per lo studio di patologie umane (patologie neurodegenerative, patologie muscolari e tumori), nonché per studi di genetica, biologia dello sviluppo e tossicologia. Patologie umane testate perchè target nale uomo, non posso usare l’uomo e quindi uso organismi simili. Le caratteristiche principali di tale modello sono: elevata fecondità, fecondazione esterna, sviluppo rapido, trasparenza degli embrioni, conservazione della morfologia e della funzione degli organi interni.In realtà non è tipico dei nostri mari ma si usa perchè comunque non ha impatto negativo sulla sua crescita. Pesci di allevamento, isolati almeno 7 giorni prima dell’inizio del saggio, vengono esposti al campione acquoso a 23 °C ± 1°C, con fotoperiodo da 12 a 16 h. L’endpoint è rappresentato dalla mortalità, rilevata a 24, 48, 72 e 96 h. Oppure si può svolgere anche un test cronico (10-14 gg). Embrioni di Danio rerio, ottenuti da uova di pesci di allevamento fertilizzate di recente, vengono esposte per 10 giorni (estendibili a 14) al campione acquoso a 26 °C ± 2 °C, con fotoperiodo di 12, 14 o 16 h. Gli endpoint sono costituiti dalla schiusa delle uova e dal numero di sopravvissuti, rilevati giornalmente. L’intera procedura richiede 4 settimane. Possono essere usate altre specie di pesci di acqua dolce, apportando appropriate modi che nella procedura. Caso studio slide o le se vuoi approfondire. Test Xenopus laevis: Organismo pluricellulare consumatore. Endpoint genotossicità. Test acuto (12 gg). Lavorare su an bi è più di cile a causa delle sue dimensioni elevate, però molto buono nella fase embrionale per il suo tasso riproduttivo; 8 giorni fase di acclimatazione poi esposizione. Più facile lavorare con gli embrioni piuttosto che con gli adulti. Rana acquatica dell’Africa centro meridionale. Molto di usa nei negozi di animali, di solito nella forma albina. Raggiunge dimensioni abbastanza importanti: 8 cm i maschi e 13 cm le femmine. Potenziale riproduttivo molto alto e raggiunge la maturità sessuale intorno all’anno d’età. Ciclo vitale completamente acquatico → allevamento e riproduzione abbastanza semplice in laboratorio. È stato uno dei primi vertebrati ad essere clonato, nel 1958 da John Bertrand Gurdon e collaboratori. Il metodo è basato sull’uso di larve allo stadio 50 (tavole di sviluppo cronologico di Nieuwkoop e Faber) di X. laevis. Le larve devono essere mantenute nelle condizioni del saggio per almeno 8 giorni prima dell’inizio della prova. Gli organismi di prova vengono esposti per 12 giorni ad un campione acquoso a 22 °C ± 1 °C con fotoperiodo di 12 h, con rinnovo giornaliero del mezzo e del cibo. L’endpoint considerato è rappresentato dalla genotossicità, valutata per esame istologico al microscopio a immersione di vetrini ematologici. Caso studio slide o le se vuoi approfondire. Quando si tratta di test cronici gli organismi vanno anche alimentati!!! Test teratogenesi: Test che vanno a valutare tossicità sostanza durante i primi stadi di sviluppo, considerando parametri speci ci, quali ritardo di sviluppo e malformazioni. Organismi hanno o l’impiego di embrioni nei test oppure hanno caratteristiche tali che quando l’adulto viene tagliato può rigenerarsi e quindi si possono usare in questi test. Quarta lezione Stress: Condizione per cui l’equilibrio dinamico (omeostasi) di un organismo o biocenosi è minacciato o alterato da stimoli intrinseci o estrinseci (stressori). Stressore è la causa, il fenomeno, che origina uno stress. Molte sono le cause di stress, quali: - cause biotiche: infezioni, parassiti, competizione ff fi ffi fi fi fi fi fi fi fi - cause abiotiche: temperatura, acqua, radiazione, sostanze chimiche (più studiati in ecotossicologia), agenti sici Gli stressori chimici possono agire a livello Sub individuale -> individuale -> popolazionale -> comunitario. L’intensità di risposta dell’organismo allo stress dipende dalla “intensità”, dalla durata d’esposizione, sinergie, ontogenesi e condizioni salutari. Dividiamo lo stress in “EUSTRESS” e “DISTRESS”: il primo è reversibile mentre il secondo, caratterizzato da una durata e da una intensità elevata, è irreversibile. Lo stress di erisce dal disturbo in quanto il primo è un fattore ambientale che riduce la tness mentre il secondo è dannoso in quanto porta alla distruzione della biomassa; in un ambiente un diverso grado di disturbo o di stress selezionerà una specie con strategie vitali di erenti (r, K o stress tolleranti). Specie strategia R: capaci di rigenerare rapidamente tra una perturbazione e l’altra: presentano bassa resistenza e alta resilienza (specie ruderali*) (Papaveraceae, batteri, insetti) Specie strategia K: sviluppano una serie di adattamenti speci ci: presentano buona resistenza e bassa resilienza (specie competitive*) (Quercus sp.pl., uccelli, mammiferi) Specie stress tolleranti: in grado di sopravvivere anche in condizioni limitanti o in presenza di scarse risorse ambientali, risultando altamente e cienti e capaci di colonizzare ambienti preclusi ad altre specie (es. deserti, calanchi, terreni salati, ecc.): presentano alta resistenza e bassa resilienza (specie stress tolleranti*) (Salicornia sp., crostacei an podi). Resistenza speci ca rappresenta la capacità di un organismo di resistere ad una perturbazione; Resilienza invece è la capacità di recupero del sistema b i o l o g i c o d o p o e s s e re s t a t o m o d i c a t o d a u n a ff fi fi fi ffi fi fi ff fi  perturbazione. I principali stressori sono Inquinamento chimico sico -> se ne occupa l’ecotossicologia Alterazioni morfologiche ambientali Variazione d’uso del suolo Inquinamento biologico L’inquinamento chimico sico è un’alterazione dovuta a fenomeni di origine antropica che alterano le matrici chimico- siche ambientali e di conseguenza l’abbondanza delle biocenosi. Le principali cause di inquinamento sono l’introduzione nell’ambiente di energia o sostanze che sono nocive sia per la loro intrinseca tossicità sia perchè immesse in dosi eccedenti la normale capacità di tolleranza degli organismi. Inquinante -> sostanza che supera i normali livelli ambientali e che è dannosa per l’ambiente. Può essere atmosferico, acquatico o eda co. L’inquinamento atmosferico riguarda l’immissione di gas nell’ambiente e sono originati solitamente da tra co veicolare e da attività industriale. I contaminanti più pericolosi sono CO2, NOX, Metalli pesanti. Oltre agli inquinanti primari vi sono anche gli inquinanti secondari spesso indotti dalle reazioni d e l l o s m o g f o t o c h i m i c o , c h e p ro d u c o n o perossiacetilnitrato o perossibenzoilnitrato assieme ad ozono. Queste reazioni sono frutto dell’attività ultravioletta su ossidi di azoto e idrocarburi. A livello vegetale gli inquinanti gassosi provocano danni a livello della respirazione cellulare e della fotosintesi, oltre a poter degradare la cloro lla e al collasso del meso llo con comparsa di clorosi e necrosi dei tessuti fogliari. L’inquinamento acquatico è tra i compartimenti ambientali più esposti a fenomeni di inquinamento di tipo chimico e/o sico. Esso riguarda ri uti organici che innescano i processi di decomposizione batterica causando la deossigenazione dell’acqua e talora l’eutro zzazione; ri uti inorganici tossici come sostanze radioattive o metalli pesanti; sostanze nutrienti che portano ad eutro zzazione (fosfati e nitrati) e sostanze xenobiotiche come tensioattivi, solventi, tofarmaci, combustibili ecc.…. Le sostanze che provocano quindi un e etto inquinante indiretto sono i ri uti organici e le sostanze nutrienti, mentre sostanze inorganiche tossiche e xenobiotici portano ad un inquinamento diretto. L’eutro zzazione è un fenomeno che si manifesta in sistemi acquatici in cui aumenta notevolmente il livello di produzione vegetale, soprattutto al gale, a seguito di un arricchimento delle acque di nutrienti (in particolare di nitrati e fosfati), che in condizioni normali si comportano come fattori limitanti. Tale input nutritivo può essere dovuto a processi naturali (dilavamento). Ma più spesso è legato ad attività antropiche “cultural eutrophication”. L’eutro zzazione è un processo dinamico che si articola in diverse fasi: ❖ aumento della disponibilità di nutrienti ❖ aumento della produttività ❖ aumento eccessivo di biomassa vegetale (sopratutto algale e cianobatteri) ❖ aumento della necromassa vegetale ❖ progressiva riduzione di ossigeno disponibile no a condizioni di anossia ❖ accelerazione dei processi di decomposizione batterica che richiedono molto ossigeno ❖ scomparsa di organismi aerobi e progressiva alterazione della fauna e ora acquatica ❖ produzione di H2S, NO2, NH3, CH4, PH3 fi fi fi fi fi fi fi fi ff fi fi fi ffi fl fi fi fi fi fi  Prodotti di decomposizione in diverse condizioni di disponibilità di O2. Per indicare lo stato tro co delle acque si usano in generale i termini: - Oligotro co: acque limpide, fresche, povere di nutrienti, con bassa produttività algale (pochi nutrienti, produttività bassa) - Mesotro co: acque mediamente ricche di nutrienti, con oritura algale moderata (abbastanza nutrienti, produttività media) - Eutro co: acque poco limpide, con forti variazioni di ossigeno e alta disponibilità di nutrienti, elevate oriture algali e variazioni nella struttura e composizione nelle comunità animali e vegetali (eccesso di nutrienti, produttività elevata) I metalli pesanti si dividono in 2 categorie, i micronutrienti essenziali (medio-alte concentrazioni tossiche) ed i tossici anche a basse concentrazioni. Le principali fonti di inquinamento da metalli pesanti sono: agricoltura, industrie (metallurgica, meccanica, petrolchimica, elettronica), urbanizzazione, ri uti “tecnologici”. L’e etto tossico dei metalli pesanti risulta nell’attivazione di reazioni redox con la formazione di radicali liberi dell’ossigeno e anche nell’interazione delle macromolecole biologiche come il DNA o le proteine (legame con le basi nucleotidiche o spiazzamento dei metalli essenziali dai siti attivi). I metalli pesanti non sono biodegradabili, né possono essere metabolizzati, ma gli organismi hanno sviluppato meccanismi di risposta per evitare/ridurre i loro e etti tossici. Le piante rispondono in modo specie speci co ai metalli pesanti mediante le ferritine o le metallotioneine, agenti chelanti che formano complessi stabili idrosolubili trasportabili nei vacuoli cellulari e isolarli metabolicamente. Gli xenobiotici possono bioaccumularsi mediante 2 processi: ❖ Bioconcentrazione: captazione diretta dall’ambiente delle sostanze tossiche (tessuti epidermici, branchie, tallo lichenico, etc.). ❖ Biomagni cazione: accumulo crescente di inquinanti lungo la catena tro ca (piante, erbivori, carnivori) attraverso l’ingestione di cibo contaminato. Ampli cazione biologica. Casi emblematici sono i pesticidi clorurati nei Grandi Laghi del Nord America. Alterazione di tipo sico: re ui di acque calde da impianti industriali: aumento T, minore [O2]; bio-e etti → accelerazione metabolismo organismi acquatici, inattivazione enzimatica, stress termico captazione risorsa idrica: aumento T e [inquinanti], minore [O2]; bio-e etti → diminuzione della produttività biologica radioattività: bio-e etti → diminuzione della produttività biologica, aumento indice di mortalità accumulo di detriti in sospensione, tensioattivi, sostanze oleose, derivati petroliferi (materiali non bioreagenti); bio-e etti → anche se inerti biologicamente, causano problemi di tipo sico (occlusione di branchie nei pesci, assorbimento di radiazioni solari, e riduzione fotosintesi, riduzione degli scambi di gas tra atmosfera e super cie d’acqua, ricoprimento di fondali da cui riduzione di microhabitat e biodiversità). Quinta lezione Le piante acquatiche sono utilizzate in ecotossicologia per la valutazione del livello di contaminazione ecosistemica. L’uso di piante acquatiche nell’ecotossicologia ha trovato impiego solo negli ultimi decenni, poiché tradizionalmente i phyla comprendono unicamente crostacei, pesci e batteri. Perché? Perché oltre alla credenza erronea secondo la quale le piante sarebbero meno sensibili ai contaminanti, da una visione antropocentrica si è passati ad una ecocentrica, in cui le piante svolgono un ruolo ecosistemico e strutturale e hanno sensibilità specie speci che a diversi fi fl fi fi fi fi fi ff ff ff fi fi fi fi fi fi ff ff ff fi fi fi  contaminanti come altri phyla. In ogni caso, l’uso delle piante è diventato uno strumento importante anche nelle indagini eco tossicologiche per valutare e monitorare la qualità e lo stato di salute degli ecosistemi acquatici, dal momento che le piante svolgono un ruolo o centrale a livello sia strutturale che funzionale (determinano gran parte dei caratteri strutturali dell’ambiente dove gli altri organismi vivono e si riproducono; sono produttori primari; regolano usso dell’energia solare, ciclo dell’acqua e dei minerali). Vi sono specie sensibili e specializzate: Bioindicatori dello stato qualitativo idrico Bioindicatori delle alterazioni idromorfologiche degli ecosistemi acquatici Si sfrutta la sensibilità di alcune specie vegetali a determinati contaminanti o condizioni di alterazione. E specie tolleranti o generaliste: Agenti di torimedio per la rimozione degli inquinanti Si sfrutta la capacità di alcune specie di tollerare la presenza di contaminanti e di bioaccumularli nei loro tessuti. Queste proprietà rendono le specie vegetali che le posseggono ideali per essere utilizzate anche nell’ambito dell’Ecotossicologia per valutare lo stato di contaminazione delle acque. Gli organismi vegetali presentano una serie di caratteristiche che li rendono adatti per essere utilizzati nell’ambito delle valutazioni ecotossicologiche: 1. Sensibilità: alcuni taxa vegetali sono risultati molto sensibili a vari tipi di inquinanti (tensioattivi, biocidi, composti organici, metalli, eutro zzanti) e di più degli animali* 2. Alcuni organismi vegetali presentano alta capacità di bioaccumulare. 3. Coltivazione: è semplice, poco costosa e permette di produrre elevata biomassa. 4. Propagazione vegetativa: permette di avere “cloni” di piante eliminando il problema della variabilità genetica. 5. Rapporto sup/vol elevato (per autotro a): essendo autotro , assorbimento > di aria ed acqua degli animali dal mezzo ambiente* 6. Base della catena alimentare: prima interfaccia fra la componente abiotica e biotica di un ecosistema e per questo rispondono per primi alle alterazioni ambientali.* Molti contaminanti entrano nell'ecosistema attraverso gli organismi vegetali che sono il primo passo obbligato delle principali catene tro che. Gli organismi vegetali sono tra i primi che rispondono a fenomeni di contaminazione, assumendo il ruolo di sistemi di allerta precoce (Early Warming System - EWS). Se gli organismi vegetali bioaccumulano sostanze tossiche presenti in acqua, prima gli erbivori e poi i carnivori verranno contaminati lungo la catena alimentare seguendo un processo di biomagni cazione che può arrivare no all'uomo. 7. Ampia scelta di organismi vegetali utilizzabili e di metodi di analisi applicabili a diverse contesti e matrici. Tra i modelli vegetali che possono essere utilizzati nelle indagini ecotossicologiche negli ecosistemi d'acqua dolce, vi è un'ampia varietà di organismi vegetali acquatici che vanno dalle alghe, alle brio te, alle pterido te e alle angiosperme. In ecotossicologia vengono usate circa il 25% delle specie vegetali presenti di questo 25% il 65% sono specie di acqua dolce mentre il restante 35% sono specie di acqua marina o salmastra. Le caratteristiche che hanno esaltato il ruolo dei vegetali sono diverse tra cui La possibilità di propagazione vegetativa L’alto rapporto super cie volume e quindi un maggior assorbimento Una bassa posizione nella catena tro ca, grazie alla quale rispondo per prime agli inquinanti Ampia scelta di organismi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fi fl  Specie microalgali: Pseudokirchneriella subcapitata Chlorella vulgaris Specie angiosperme ryzo e pleusto te Lemna spp. Myriophyllum spp. Fontinalis antipyertica Azolla spp. Salvinia spp. L'uso di test basati sulle piante inizia ad essere più signi cativo solo negli ultimi du decenni quando le piante sono state maggiormente riconosciute come utili biomonitor in tossicologia ambientale. Numero crescente di direttive e regolamentazioni ambientali e sviluppo di linee guida metodologiche speci che per questi test. Test ecotossicologici basati su piante secondo agenzie ISO (international standards organization) e OECD (Organisation for Economic Cooperation and Development). Sono state sviluppate procedure standardizzate nell’esecuzione dei test, confrontabili utilizzando specie vegetali simili che vengono esposte durante la fase di crescita a diverse concentrazioni di contaminanti. ➔ Test ISO: si concentrano sulla risposta delle piante a campioni prelevati dall’ambiente ➔ Test OECD: si concentrano sulla valutazione degli e etti di speci che sostanze sulle piante Test basati su microalghe: Primi test ecotossicologici ad essere sviluppati e standardizzati. La crescita vegetale è il parametro che si valuta entro 72 ore come risposta all’esposizione del contaminante su Pseudochirkneriella o Desmodemus subspicatus o, in alterativa, sulle diatomee Navicula pelliculosa. Le norme ISO non considerano le diatomee, ed hanno procedure simili a quelle dell’OECD. Test su macro te galleggianti: Le linee guida OECD e ISO prevendo l’esposizione in 7 gg della pianta ed il conteggio del numero di fronde, il numero ed il peso secco o fresco. Le specie testate sono Lemna minor o L. gibba. Test su rizo te: Il SETAC evidenzia come gli inquinanti possano sedimentare e quindi si necessita di piante radicanti per poter essere studiati. Le norme ISO e OECD prevedono il test su Myriophyllum spicatum per OECD e M. acquaticum per ISO. Il test analizza il peso fresco e secco oltre alla presenza di clorosi e necrosi e alla variazione della lunghezza dei germogli o malformazioni cauline. Il tempo è di 14gg. Criticità dei protocolli proposti dalle linee guida standardizzate ISO E OECD: ❖ I test non considerano la complessità ecosistemica in quanto condotti su individui in condizioni standardizzate di laboratorio, limitando la capacità di estrapolare lo stato reale di un sistema naturale da esperimenti controllati. ❖ La durata espositiva potrebbe essere troppo breve per considerare delle risposte chiare. L’esposizione per tempi prolungati può ampli care l’intensità della risposta fornendo ulteriori prove sulla tossicità del contaminante. ❖ La tipologia di terreni di coltura standard non diluiti può interferire con la tossicità del contaminante. ❖ Gli endpoints si rivelano talvolta riduttivi, in quanto è possibile prendere in considerazione anche la quantità di cloro lla a e b, la presenza di carotenoidi o antociani e di MDA. Test totossicologici: A. Metalli Pesanti: Una volta che i metalli pesanti sono rilasciati nell'ambiente acquatico, possono essere assorbiti dalle piante e trasferiti agli animali, bioaccumulandosi lungo la catena alimentare, trasformandosi in un rischio elevato per l'ecosistema e per la salute umana. fi fi fi fi fi fi fi ff fi fi  Metalli pesanti più frequentemente testati: Cr, Zn, Cu, Cd. Specie vegetali testate: la maggior parte delle specie vegetali usate in Ecotox. E etti totox più comuni: riduzione tasso di crescita, aumento tasso di necrosi e clorosi, stress ossidativo e inibizione fotosintesi, aumento di MDA e risposte antiossidanti. B. Prodotti Farmaceutici e per la cura della persona: Prodotti sempre più utilizzati in medicina e veterinaria, di cilmente biodegradabili, persistenti nell’ ambiente e con attività biologica. Specie vegetali testate: poche specie microalgali (Chlorella, Pseusokirchneriella) e di angiosperme (Lemna). E etti totox più comuni: attivazione CAT, diminuzione tomassa, inibizione crescita vegetale. C. Pesticidi: Crescente uso di pesticidi (erbicidi, fungicidi, insetticidi) per aumento di pratiche agricole intensive. Rilascio periodico. Il loro potenziale tossico varia in base a solubilità e persistenza in acqua e tasso di assorbimento da parte delle piante. Specie vegetali testate: specie algali, piante vascolari. E etti totox più comuni: minore produzione di tomassa, alterazione della struttura fogliare, inibizione parziale o completa della crescita, alterazione delle vie metaboliche. D. Idrocarburi: Categoria di contaminanti che includono idrocarburi policiclici aromatici (PAHs) e idrocarburi aromatici eterociclici a base di azoto, zolfo o ossigeno (NSO-HETs). Negli ultimi 40 anni, l'interesse per gli idrocarburi si è si è concentrato sui PAHs sulla base di un elenco prioritario di 16 PAHs pericolosi stabilito dall’EPA. Molti pochi studi sugli e etti tossici dei PAHs sulle piante d'acqua dolce e ancora meno dei NSO-HETs. Specie vegetali testate: poche specie microalgali (Pseusokirchneriella). E etti totox più comuni: risposte croniche genotossiche e mutagene, inibizione della crescita delle piante, alterazione fotosintesi e respirazione (al crescere della concentrazione di idrocarburi corrisponde una diminuzione del tasso di crescita delle piante e della cloro lla). E. Tensioattivi: Tensioattivi, composti organici presenti in tutti i detergenti e vengono rilasciati nell'ambiente in grande quantità. Alcuni sono metabolicamente e chimicamente inerti, resistendo sia alla degradazione sica che biologica, diventando così persistenti e bioaccumulabili nell'ambiente ( uorosurfattante non biodegradabile, l'acido per uoroottanoico-PFOA). I per uoroalchili (PFAS) sono tra i tensioattivi più utilizzati. Specie vegetali testate: piante terrestri, pochissime acquatiche Lemna. E etti totox più comuni: inibizione crescita, clorosi, necrosi, riduzione numero foglie. F. Plastiche: Le plastiche sono materiali sintetici di cilmente biodegradabili. L’emergenza dell’inquinamento da plastiche è esploso negli ecosistemi marini ma studi recenti sottolineano come sia altrettanto grave negli ecosistemi d'acqua dolce. Specie vegetali testate: pochissime tra cui microalghe (Chlorella, Scenedesmus), angiosperme (Lemna minor, Myriophyllum spicatum). E etti totox più comuni: inibizione fotosintesi, crescita germogli e radici. fl ff ffi fi ff fi fl ff fi fl fi fi ff ff ffi fi fi ff fi ff fi fi  Sesta lezione Tradizionalmente utilizzo di biomarker nel biomonitoraggio diretto (attivo). Utilizzo di organismi selezionati e posti arti cialmente nel mezzo ambiente da monitorare. Utilizzo di materiale biologico, ma le misurazioni della risposta sono di tipo quantitativo attraverso l’uso di strumentazione speci ca. Con i test ecotossicologici si misura la tossicità di una sostanza ovvero la quantità minima che produce un e etto dannoso a carico di un sistema biologico. Tipologie di test: Le tipologie di test possono variare in base a: ➔ Matrice ambientale ➔ Modalità di somministrazione ➔ Tempo di somministrazione ➔ Tipo di risposta Test matrici acqua: Il maggiore impiego di questi test è nell’analisi tossicologica di acque provenienti da impianti di depurazione o industriali. Il grado di inquinamento viene stabilito a seconda dell’uso che si fa dell’acqua. Infatti un’acqua contenente una sostanza tossica è decisamente non buona per un allevamento ittico, ma potrebbe essere adatta come refrigerante negli impianti di ra reddamento di un’ industria. Introduzione di organismi-test nel campione d’acqua da esaminare e confronto con test di controllo privi di contaminanti. In base alla modalità somministrativa ➔ Test statici: allestimento di una serie di soluzioni con concentrazioni note, senza ulteriori aggiunte di contaminante sino al termine del saggio ➔ Test periodici: ripristino periodico della concentrazione iniziale del contaminante con cadenza nota ➔ Test a usso continuo: somministrazione continua della concentrazione iniziale nota In base al tempo di somministrazione ➔ Test di tossicità acuta, con un’esposizione al contaminante di 24-96 ore, e ettuati per una prima stima di tossicità degli inquinanti sull’attività biologica. Si determina la K di sostanze tossiche a cui si manifesta la risposta dell’organismo-test. ➔ Test di tossicità cronica, con un’esposizione di settimane, e ettuati per valutare la potenziale tossicità di sostanze contaminanti, individuando concentrazioni e caci ma inferiore a quelle determinate nei test di tossicità acuta. ➔ Test di teratogenesi, che valutano la tossicità di un contaminante per i primi stadi ontogenici. In base al biomaker ➔ Biochimico ➔ Fisiologici ➔ Morfologico ➔ Fenologico (riproduzione) ➔ Etologici Organismi principalmente usati nei test: Pseudokircheneriella subcapitata -> inibizione crescita, alterazione fotosintesi Daphnia magna -> immobilità Xenopus laevis -> inibizione cres