Sebenta de Biologia Molecular e Celular - PDF

SEBENTA DE BIOLOGIA MOLECULAR E CELULAR - RESUMO DO ALBERTS - MÓDULO I.I MÓNICA RODRIGUES ANO LETIVO 2017+1/2019 ...

SEBENTA DE BIOLOGIA MOLECULAR E CELULAR - RESUMO DO ALBERTS - MÓDULO I.I MÓNICA RODRIGUES ANO LETIVO 2017+1/2019  2 - PREFÁCIO - Allô coleguinhassssss!!!!! ^.^ Bem… Não sei muito bem o que dizer nesta parte da sebenta a não ser que fui obrigada a escrevê-la ahah Como se o facto de ter escrito as 185 páginas que a constituem já não fosse suficientemente mau para me fazer não querer olhar mais para ela, vamos lá escrever mais uma página que não tem utilidade nenhuma, só porque sim xD “It’ll be fun” – they said… -.-‘ Eu disse 185 páginas? :o Pois… Sim... Mas não te preocupes! As minhas 185 páginas são praí umas 100 ou menos de outras sebentas construídas a partir daqueles blocos de texto dos quais dá dó só de olhar e pensar que temos de estudar [tipo mata-me já], porque tem IMENSAS IMENSAS imagens. Tem praticamente todas as imagens dos capítulos recomendados do Alberts, num tamanho razoavelmente grande para que não fiques com fadiga ocular só de tentar ler as legendas desfocadas ;) Porque toda a gente adora ficar uns 5min só a tentar descobrir a palavra daquela legenda, quem não?  Esta sebenta é uma versão atualizada e um pouquinho menos confusa da Sebenta da Madeira, mas ela não faz milagres minha gente, por isso nada de faltares às aulas da disciplina! Em primeiro lugar porque a professora Arosa explica muito bem mesmo e em segundo lugar porque eu vou agora pro primeiro ano, portanto ainda não tive as aulas práticas, logo não vão encontrar pormenores importantes dessas aulas nesta sebenta. Se não fores às teóricas nem aqui o nosso Einstein te safa ¯ \ _ (ツ) _ / ¯. Este exame é chatinho mas se fores às aulas, exercitares esses poucos neurónios que te restaram de anatomia lendo esta sebenta e fizeres exercícios dos anos anteriores passas com um pé atrás das costas! Chegando lá à parte dos agradecimentos para acabar com isto, quero agradecer ao meu fofinho Gonçalo Sá, agora no 2ºano, porque foi quem me motivou para começar e acabar isto e quem fez a capa fofinha desta sebenta ^^ (e quem me obrigou a escrever o prefácio só para que aparecesse nos agradecimentos) e ao meu amiguinho Rodrigo Teixeira, que vai agora para o 1º ano de Medicina Dentária, que tirou um pouquinho do seu tempo para rever alguns capítulos. E é isto… xD Espero que gostes destas cores e destes bonequinhos gays porque para deprimir já basta a altura do exame, e tu não precisas de estudar num clima deprimente por uma sebenta mais deprimente ainda. Estuda, diverte-te também porque a vida não é só estudar, estuda mais um pouquinho e ARRASA! Ps.: Só para dizer que nunca mais encontram uma sebenta minha, primeira e última vez xD sabe de nada inocente. Ah! E desculpem alguns erros de palavras repetidas, letras omitidas, erros ortográficos, etc. As vezes passa-nos ao lado. Kiss Kiss Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  3 Capítulo 5 – DNA e Cromossomas o Sumário: 1. Estrutura e função do DNA 2. Estrutura dos cromossomas das células eucarióticas 3. Regulação da estrutura dos cromossomas 1. Estrutura e Função do DNA Os cromossomas são constituídos tanto por proteínas (ex.: histonas e não histonas) como por DNA. DNA carrega a informação hereditária da célula Proteínas controlam e enrolam as longas moléculas de DNA Antigamente os cientistas pensavam que o material genético seriam as proteínas e não o DNA devido à sua simplicidade. Mais tarde, este foi reconhecido como portador da informação genética, tendo sido a sua estrutura determinada por Watson e Crick (1953), pelo método da difração por raios-X 1.1. Uma molécula de DNA consiste em 2 cadeiras complementares de nucleótidos A molécula de DNA é constituída por 2 longas cadeias cadeiras de nucleótidos. o Nucleótido: base azotada (A, T, C, G) + grupo(s) fosfato (PO43-) + pentose (açúcar de 5 carbonos) As duas cadeias estão dispostas em hélice e ligadas pelas bases azotadas através de pontes de hidrogénio enquanto que os nucleótidos de uma cadeia estão ligados entre si por ligações fosfodiéster (mais estáveis e, por sua vez, mais fortes). (A) Cada nucleótido é composto por 1 açúcar-fosfato ligado covalentemente a uma base azotada: adenina (A), guanina (G), citosina (C) ou timina (T) (B) Os nucleótidos ligam-se entre si por ligações fosfodiéster formando assim 1 das 2 cadeias nucleotídicas da molécula de DNA. (C) As duas cadeias nucleotídicas juntam-se pelas bases através de pontes de hidrogénio. A citosina emparelha sempre com a guanina e a timina com a adenina (G≡C; A=T) (D) A molécula de DNA enrola-se sobre si tomando a forma de uma hélice para maior estabilidade Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  4 Para os nucleótidos do DNA (ácido desoxirribonucleico), a pentose é uma desoxirribose enquanto que o açúcar do RNA é uma ribose. O que as diferencia é a presença ou ausência de um oxigénio na posição carbono 2’ da pentose. No que toca à estrutura da molécula de DNA, as bases azotadas estão sempre voltadas para dentro da dupla hélice fazendo com que o “esqueleto” seja formado pelo açúcar-fosfato. Esta conformação é favorável visto que as bases azotadas, hidrofóbicas, são protegidas do contacto com a água. Para além disso, isto faz com que a molécula apresente uma polaridade negativa, visto que fica revestida pelos ácidos fosfóricos (PO43-). As ligações fosfodiéster (ligações entre nucleótidos da mesma cadeia) são sempre estabelecidas entre o grupo fosfato (carbono 5’) e a pentose (grupo hidroxilo do carbono 3’). Ou seja, a polimerização do DNA ocorre sempre no sentido 5’3’ (assim como a polimerização do RNA). Sendo assim, é compreensível que, numa extremidade da cadeia teremos um fosfato e na extremidade oposta um grupo hidroxilo, o que confere à cadeia uma polaridade química. As duas cadeias ligam-se pelas bases azotadas, mas de forma anti-paralela. Quer isto dizer que, à extremidade 5´ de uma cadeia corresponderá a extremidade 3’ da outra (orientam-se com polaridades inversas), permitindo assim a formação de uma dupla hélice mais estável. A adenina e a guanina são bases púricas/purínicas/de duplo anel enquanto que a citosina e a timina são bases pirimídicas/de anel simples. O emparelhamento de bases acontece sempre entre uma púrica e uma pirimídica. A adenina emparelha-se sempre com a timina por 2 pontes de hidrogénio (A=T) e a citosina sempre com a guanina por 3 pontes de hidrogénio (G≡C, ligação mais forte). Daí se retira a Regra de Chargaff: 𝑨+𝑮 ≈𝟏 𝑻+𝑪 1.2. A estrutura do DNA como um mecanismo para a hereditariedade A informação genética é hereditária pois é copiada e transmitida de geração em geração. Sendo que esta está armazenada nos genes. Gene Unidade fundamental da hereditariedade. É um segmento de DNA que codifica informação que leva à produção de uma proteína/polipéptido/péptido ou RNA não codificante – qualquer molécula de RNA que não é traduzida em proteína, como por exemplo, RNA ribossomal e RNA de transferência. Inclui regiões que antecedem e que sucedem a região codificante, sequências que não são traduzidas (intrões) e segmentes codificantes (exões). São os segmentos codificantes (exões) que constituem o RNA maduro, RNA este que sofreu processamento, e que poderão ser traduzidos. Existem, no ser humano, cerca de 25.000 genes. Após vários estudos concluiu-se que os nucleótidos que constituem a dupla cadeia de DNA funcionam como letras do alfabeto e que são utilizados para transmitir informação. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  5 O DNA armazena informação a partir de várias sequências de nucleótidos. Ou seja, cada base – A, C, G ou T – pode ser considerada uma letra num “alfabeto biológico”, que podem ser usadas para soletrar mensagens ou transmitir informação pela estrutura química do DNA. São estas sequências de nucleótidos que constituirão os genes, e os organismos diferem uns dos outros porque as suas moléculas de DNA têm diferentes sequências de nucleótidos e, consequentemente, transmitem diferentes mensagens biológicas. Teria sido estabelecido antes da descoberta a estrutura do DNA que os genes continham instruções para a produção de proteínas. A função de uma proteína é determinada pela sua estrutura tridimensional, que, por sua vez, é determinada pela sequência de aminoácidos da sua cadeia polipeptídica. O conjunto completo de informação no DNA de um organismo é designado de genoma. Genoma Sequência nucleotídica completa presente nos 46 cromossomas, no caso do Homem, 22 pares de autossomas e 1 par de heterossomas/cromossomas sexuais. É constituído por cerca de 3.2*109 nucleótidos, sendo que apenas 1.5% a 2% da cromatina é composta por exões e sequências reguladoras. Sequência reguladora Segmento de DNA onde as proteínas de união, tais como fatores de transcrição, RNA/DNA polimerase, entre outras, se ligam preferencialmente a fim de regular um certo gene. Cariótipo Disposição do genoma de um organismo organizadamente. No nosso caso, disposição de todos os 46 cromossomas humanos. Escrito a partir de 4 letras do alfabeto nucleótido, a sequência nucleótida de um gene muito pequeno de humanos pode ocupar até cerca de ¼ de uma página de texto. A completa sequência do genoma humano era capaz de preencher mais de 1000 livros iguais ao Alberts. Por sua vez, um núcleo de uma célula eucariótica possui cerca de 5-8m de diâmetro. 2. Estrutura dos cromossomas eucarióticos É necessária uma grande quantidade de DNA para codificar toda a informação de um ser multicelular e apenas é possível “empacotá-la” no núcleo de uma célula por se encontrarem sobre a forma de estruturas extremamente condensadas designadas de cromossomas. Cromossoma Estrutura condensada do DNA encontrando-se este associado a proteínas: histonas e proteínas não histonas (proteínas responsáveis pela expressão génica, pela replicação e reparação do DNA). O complexo de histonas (H2A, H2B, H3 e H4 juntamente com a H1 – histona “linker”) é responsável pela formação dos nucleossomas, que por terem carga positiva, uma vez que são constituídas por arginina e lisina, têm grande afinidade com o DNA. As regiões que contêm genes expressos estão menos compactadas.  Heterocromatina: Forma mais condensada da cromatina, geralmente associada aos telómeros e centrómeros. Resulta de uma modificação sobretudo na cauda da histona H3 que compacta genes que não são ou são menos expressos, impedindo ou dificultando a sua transcrição. A condensação é promovida, por exemplo, por histona-deacetilases (HDAC ou HD) – processo designado de desacetilação  Eucromatina: Forma descondensada da cromatina. Permite uma maior acessibilidade a proteínas e fatores de transcrição. A descondensação é promovida, por exemplo, por histona- acetiltransferases (HAT), que adicionam grupos acetil a resíduos de lisina – processo designado de acetilação. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  6 A acetilação da lisina na terminação N das histonas remove cargas positivas, desse modo reduzindo a afinidade entre histonas e DNA. Isto faz com que a cromatina fique menos condensada fazendo com que a RNA polimerase e os fatores de transmissão possam mais facilmente aceder a região propiciada. Portanto a acetilação da histona promove a transcrição enquanto a desacetilação da histona reprime-a. As bactérias carregam os seus genes numa única e circular molécula de DNA – o plasmídeo. Esta molécula, apesar de mais simples, também está associada a proteínas que condensam DNA, mas que diferem daquelas que condensam o DNA eucariótico. Porém, apesar de ser mais simples em termos de estrutura sabe-se menos acerca da sua compactação logo o que se referir acerca de compactação de cromossomas apenas diz respeito aos eucarióticos! 2.1. DNA eucariótico é “empacotado” sob a forma de múltiplos cromossomas Nos eucariontes, o DNA está distribuído por vários pares de cromossomas diferentes no núcleo. À exceção das células da linha germinativa (espermatozoides e oócitos) e das células altamente especializadas que perdem o seu DNA (tal como as hemácias/glóbulos vermelhos), todas as outras células humanas possuem duas cópias de cada cromossoma, uma proveniente do pai e outra da mãe. Os cromossomas do pai e da mãe do mesmo par designam-se de cromossomas homólogos. Os únicos cromossomas não homólogos são os cromossomas sexuais nos indivíduos do sexo masculino, onde é herdado um Y do pai e um X da mãe. Para além dos diferentes tamanhos, os cromossomas humanos podem ser distinguidos por uma grande variedade de técnicas. Por exemplo:  Cada cromossoma, aleatoriamente, ou simplesmente uma sequência de genes, pode ser “pintado” com uma cor qualquer, usando-se moléculas de DNA combinadas com um corante fluorescente. A esta técnica dá-se o neme de “Fish”.  Outro método mais tradicional para distinguir cromossomas é através da utilização de corantes que marcam certos tipos de sequências. Estes corantes permitem distinguir o DNA rico em adeninas e timinas do DNA rico em citosinas e guaninas, formando assim um padrão de bandas característico de cada cromossoma, permitindo-nos distingui-los e identificar uma possível anormalidade. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  7 2.2. Cromossomas e Genes A função predominante dos cromossomas é armazenar os genes – a unidade fundamental da hereditariedade. Embora os genes sejam definidos como segmentos de DNA que contêm informações para a produção de proteínas, existem genes que apenas se destinam à produção de moléculas de RNA. Como as proteínas, estes RNA’s realizam um conjunto de funções estruturais e catalíticas na célula. No caso do genoma humano, para além dos genes, existem ainda outros segmentos de DNA cuja função ainda não está completamente esclarecida, estes segmentos designam- se de “junk DNA” Geralmente os organismos mais complexos apresentam um genoma maior. Mas atenção! Nem sempre a uma maior complexidade genómica corresponde um ser mais complexo! Por exemplo, existem plantas cujo o genoma é 30x maior que o nosso, mas isso não significa que elas sejam mais complexas que nós. Portanto, genomas enormes nem sempre dão origem a seres mais complexos, não está diretamente relacionada uma coisa com a outra. 2.3. Os cromossomas e os seus diferentes estados ao longo do ciclo celular Para que um cromossoma seja totalmente funcional, a molécula de DNA tem que fazer mais do que carregar simplesmente os genes. Tem que ser capaz de se replicar e as cópias resultantes têm que ser repartidas equitativamente pelas células-filha em cada divisão celular. Este processo ocorre seguindo uma ordem de acontecimentos – o ciclo celular (capítulo 18). Neste capítulo serão apenas abordadas duas fases do ciclo celular, nomeadamente a interfase e a mitose. Interfase quando os cromossomas são duplicados. Mitose/ Fase M quando os cromossomas duplicados são distribuídos para os núcleos de cada célula-filha. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  8 Durante a interfase, os cromossomas podem estar o máximo descompactados, finos e embaraçados no núcleo e, consequentemente, não podem ser distinguidos facilmente ao microscópio. Mesmo assim, sequências de DNA especializado encontradas em todos os eucariotas garantem que os cromossomas em interfase são capazes de serem replicados eficientemente. A replicação tem origem numa determinada sequência de nucleótidos – a origem de replicação. Os cromossomas eucarióticos contêm muitas origens de replicação para assegurar que o cromossoma seja todo replicado rapidamente. Durante a interfase, a replicação do DNA começa nestas origens e procede-se bidireccionalmente ao longo do cromossoma. Existem 3 sequências nucleotídicas específicas importantes para a divisão celular: as presentes nas várias origens de replicação, nos dois telómeros e no centrómero. Um cromossoma pode ser composto por 1 cromatídeo (neste caso será designado de cromossoma simples) ou por dois cromatídeos-irmãos unidos por um centrómero (designado de cromossoma duplo). Os telómeros formam “capuchos” especiais em cada extremidade dos cromatídeos que impedem o desgaste do material genético. Os telómeros podem ser vistos como um relógio biológico. Isto porque cada vez que a célula se duplica também se duplicam os cromossomas, mas os telómeros são levemente reduzidos. Dado que os telómeros não têm capacidade de se regenerar, a determinada altura do processo, os cromossomas não conseguirão fazer réplicas de si mesmos e a célula fica incapaz de se voltar a dividir. Quando o ciclo celular atinge a fase M, o DNA condensa-se, sendo possível visualizar os cromossomas facilmente ao microscópio. Quando atingem o estado de máxima condensação os cromossomas são rapidamente separados entre as células filhas. Note-se que, neste grau de condensação, os cromossomas apresentam uma sequência específica – o centrómero – que terá um papel importante na metafase e anafase. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  9 2.4. Os cromossomas da interfase ocupam diferentes territórios dentro do núcleo O núcleo está envolvido por 2 membranas concêntricas que juntas darão origem ao invólucro nuclear. Este está altamente perfurado por estruturas que transportam ativamente moléculas específicas para e do citosol – os poros nucleares. Além disso, ainda é suportado por lâminas nucleares, uma rede de filamentos proteicos que formam uma fina camada subjacente à membrana externa e a própria membrana interna. Dentro do núcleo, os cromossomas interfásicos, apesar de mais longos e finos que os mitóticos, também estão organizados de uma forma/ordem específica. Cada cromossoma tende a ocupar uma região particular para que não haja o risco de diferentes cromossomas se enrolarem. Além disso, regiões específicas destes cromossomas estão agarradas a certas partes do invólucro nuclear. O mais óbvio exemplo desta organização dentro do núcleo interfásico é o nucléolo. Aqui é onde as partes dos diferentes cromossomas que carregam genes para a produção de RNA ribossomal ficam. RNA’s ribossomais são assim sintetizados e combinados com proteínas a fim de formar ribossomas, as máquinas sintetizadoras de proteínas da célula. Por curiosidade, as subunidades dos ribossomas apenas se juntam no citosol, para não haver o risco de traduzir RNA que ainda não sofreu processamento. 2.5. Os nucleossomas são a unidade básica da estrutura dos cromossomas eucarióticos A condensação dos cromossomas deve ser flexível o suficiente para permitir o rápido e localizado acesso sob demanda ao DNA. As proteínas que se ligam ao DNA para formar cromossomas eucarióticos são divididas em dois grupos: 1. Proteínas Histonas – presentes em enormes quantidades (mais de 60 milhões de diferentes tipos de moléculas) 2. Proteínas Não Histonas Ao conjunto formado pelas duas classes destas proteínas com o DNA nuclear dá-se o nome de cromatina. A massa total das histonas presentes nos cromossomas é praticamente igual à própria massa do DNA. As histonas são responsáveis pelo primeiro e mais fundamental nível de empacotamento da cromatina, o nucleossoma (descoberto em 1974, aprox. 20 anos após ser descoberta a estrutura helicoidal do DNA). Se a cromatina for sujeita a tratamentos que causem o seu desdobramento parcial, é possível ver através de microscopia eletrónica uma série de “contas numa corda”. A corda é o DNA e cada conta ou esfera é um nucleossoma. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  10 Nucleossoma DNA associado a um octâmetro de histonas [(H2A, H2B, H3 e H4) x2]. Existe também a histona H1 “linker” que serve para “prender” o fio de DNA às histonas anteriormente referidas e consequentemente aproximar os nucleossomas, condensando a cromatina um pouquinho mais. Estas histonas são proteínas relativamente pequenas e são constituídas maioritariamente por arginina e lisina, o que lhes confere uma carga positiva. O facto de terem carga positiva ajuda-as a terem uma ligação forte ao esqueleto açúcar-fosfato de carga negativa do DNA, o que explica o porquê das histonas se poderem ligar a qualquer sequência de DNA. Cada histona do núcleo de um nucleossoma possui uma longa cauda, um terminal N- aminoácido. Estas caudas prolongam-se para fora do nucleossoma ficando assim sujeitas a vários tipos de modificações químicas covalentes que controlam muitos aspetos da estrutura da cromatina. 2.6. Existem vários níveis de condensação cromossómica A cromatina na célula viva raramente adota este nível de compactação de “contas num fio”. Em vez disso, os nucleossomas são ainda embalados uns sobre os outros para gerar uma estrutura ainda mais compacta – a fibra de 30 nm. Este nível irá depender da quinta histona H1, que serve para puxar os nucleossomas uns para perto dos outros numa matriz repetitiva. Esta histona “linker” muito basicamente muda o trajeto que o DNA seguiria após dar a volta ao octâmetro de histonas, aproximando consequentemente os nucleossomas uns para outros. Ainda assim, esta fibra de 30-nm pode ser compactada ainda mais. Esta é dobrada numa série de “loops” (espécie de alças de uma camisola) que por sua vez são também condensados a fim de produzir o cromossoma interfásico. Finalmente, acredita-se que esta cadeia compacta de alças suba, pelo menos, mais um nível de embalagem/condensação para formar o cromossoma mitótico. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  11 3. Regulação da estrutura dos cromossomas 3.1. Mudanças na estrutura dos nucleossomas permitem o acesso ao DNA As células eucarióticas têm diferentes maneiras de regular a estrutura local da sua cromatina rapidamente. Uma dessas maneiras é através de “chromatin-remodeling complexes”, “máquinas” proteicas que usam a energia da hidrólise do ATP para mudar a posição do DNA enrolado envolta dos nucleossomas, modificando assim a sua estrutura nas proximidades dos mesmos. Este complexo descondensa a cromatina, tornando-a mais acessível a outras proteínas. Este processo está inativo durante a mitose, o que ajuda os cromossomas mitóticos a manter a sua estrutura extremamente condensada. Outra maneira de alterar a estrutura da cromatina baseia-se na modificação química reversível das histonas. A cauda das 4 histonas centrais está sujeita a modificações covalentes. Por exemplo, grupos acetil, fosfato ou metil podem ser adicionados ou removidos do nucleossoma por enzimas que residem no núcleo – nucleases. Estas modificações na cauda das histonas têm um pequeno efeito direto na estabilidade do nucleossoma individual, mas algumas modificações parecem afetar diretamente a estabilidade da fibra de 30-nm e até os níveis de compactação seguintes. Diferentes tipos de modificações de histonas atraem diferentes proteínas que irão favorecer ou impedir a condensação, permitindo, ou não, uma maior acessibilidade à cadeia de DNA, de acordo com a fase do ciclo celular em que a célula se encontra. Note-se que, específicas combinações de modificações na cauda das histonas, juntamente com as proteínas que se ligam a elas, podem ter vários significados para a célula. Por exemplo, um padrão pode indicar que um específico trecho de cromatina foi recentemente replicado enquanto que outro padrão indica que os genes daquele segmento de cromatina devem ser expressos. Como os “chromatin-remodeling complexes” as enzimas que modificam as caudas das histonas também são firmemente reguladas. Estas são trazidas para uma região particular de cromatina através de sinais, particularmente por interações com proteínas que se ligam a sequências específicas no DNA. As histone-modifying enzymes e os chromatin-remodeling complexes trabalham em simultâneo. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  12 3.2. Durante a interfase os cromossomas possuem diferentes graus de condensação A alteração localizada da cromatina por complexos remodeladores (chromatin-remodeling complexes) e através de modificação das histonas tem efeitos importantes na estrutura em larga escala dos cromossomas interfásicos. A cromatina nestes cromossomas não está uniformemente condensada. Em vez disso, regiões dos cromossomas que contêm genes que estão a ser expressos estão ligeiramente mais descondensadas. Portanto, a estrutura detalhada de um cromossoma interfásico pode diferir de um tipo de célula para outra, ajudando a determinar quais os genes que devem ser expressos. A cromatina que se encontra no seu grau máximo de condensação é denominada de heterocromatina e corresponde a cerca de 10% de um cromossoma em interfase. Encontra-se especialmente na região dos telómeros e no centrómero num cromossoma de um mamífero. A formação de heterocromatina é induzida a partir de um conjunto de modificações na cauda das histonas, incluindo a metilação da lisina na posição 9 da histona H3. Estas modificações por sua vez atraem um conjunto de proteínas especificas responsáveis pela formação de heterocromatina, que irão induzir as mesmas modificações nas caudas das histonas no nucleossoma seguinte e assim sucessivamente, tal como uma onda de modificações. A maioria do DNA que está permanentemente condensado em heterocromatina na célula não contém genes. Como a heterocromatina é tão compacta, genes que acidentalmente fiquem compactados daquela maneira normalmente falham em se expressar corretamente, o que pode causar doenças. Por exemplo, nos humanos, o gene que codifica a β-globina – que faz parte da molécula de hemoglobina responsável pelo transporte de oxigénio – está situado perto a uma região de condensação de cromatina. Se, devido a uma eliminação herdada de DNA, essa região de heterocromatina se estender, o gene da β-hemoglobina é mal expresso e a pessoa desenvolve uma forma severa de anemia. A heterocromatina é, portanto, uma forma de silenciar determinados genes, como é o caso do cromossoma X nas mulheres, que apesar de terem dois cromossomas X um deles é silenciado e condensado permanentemente desde o desenvolvimento embrionário, pois a dupla dosagem dos produtos deste cromossoma pode ser letal. A restante cromatina é denominada de eucromatina. 3.3. Mudanças na estrutura da cromatina podem ser herdadas Certos tipos de estrutura da cromatina podem ser transmitidos de uma célula para os seus descendentes. Por exemplo, a descendência de uma célula na qual a cópia materna do cromossoma X está condensada e inativa na célula-mãe, (ou seja, apenas o cromossoma X paterno está funcional) irá também condensar e inativar o mesmo cromossoma X materno. Mas como será possível herdar a estrutura da cromatina? Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  13 Quando a célula replica o seu genoma, cada hélice do DNA da célula-filha recebe apenas metade das histonas parentais. Com essas histonas vêm também as modificações covalentes nas suas caudas que revelam o estado que a cromatina se encontrava naquela zona particular do cromossoma parental. Portanto, cada cromossoma-filho irá inicialmente conter uma mistura de dois tipos de nucleossomas:  Aqueles que contêm as histonas modificadas herdadas a partir do cromossoma parental  Aqueles que contêm novas histonas sintetizadas, que ainda não foram modificadas Neste ponto, as proteínas que reconhecem as histonas modificadas podem se ligar às histonas-parentais e induzir depois as mesmas modificações nas histonas-virgens, reestabelecendo assim o padrão da estrutura da cromatina encontrada no progenitor. A habilidade de herdar a estrutura de cromatina ajuda as células eucarióticas a “relembrar” qual gene estava ativo na célula parental, um processo que parece ser crítico para o estabelecimento e manutenção de diferentes tipos de células, tecidos e órgãos durante o desenvolvimento e crescimento de um organismo multicelular complexo. Este tipo de herança não envolve transmitir sequências específicas de DNA de uma geração celular para a outra, mas, em vez disso, depende de passar especificamente proteínas histonas modificadas. Este é um exemplo de herança epigenética (do grego epi-, “on”), porque é sobreposto à herança genética baseada apenas no DNA. Em suma, a estrutura da cromatina de uma célula pode ser transmitida aos seus descendentes, produzindo uma forma de herança epigenética que ajuda a célula a lembrar o estado da expressão génica em sua célula-mãe. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  14 Capítulo 6 – Replicação, Reparação e Recombinação de DNA o Sumário: 1. Replicação de DNA 2. Reparação de DNA 1. Replicação de DNA A capacidade da célula se conseguir manter em equilíbrio depende da precisão com que duplica o seu material genético. Este processo designa-se de replicação e ocorre antes da divisão celular. A replicação e a correção de erros que poderão ocorrer durante esta, garantem a sobrevivência da célula e o seu bom funcionamento. A cada divisão celular, a célula copia o seu genoma com imensa precisão e com uma rapidez extraordinária, cerca de 1000 nucleótidos por segundo. Ao fim de oito horas, não tem mais que uma letra ou duas erradas. Quem disse que a pressa era inimiga da perfeição? 1.1. O emparelhamento de bases permite a replicação do DNA No capítulo anterior vimos que cada cadeia de DNA continha uma sequência de nucleótidos que se complementavam com os nucleótidos da cadeia homóloga. Assim sendo, cada cadeia poderá servir como um molde para a síntese de uma nova cadeia complementar. Quer isto dizer que, se nós marcarmos as duas cadeias, uma de cadeia S e outra de cadeia S’, a cadeia S poderia servir de molde para formar uma nova cadeia S’, ou vice- versa. Portanto, durante a replicação do DNA dá-se a separação das suas 2 cadeias antiparalelas, que serão usadas como moldes para produção de novas cadeias complementares. As novas cadeias irão ser idênticas à cadeia complementar da cadeia molde que as deu origem. A este processo de replicação dá-se o nome de replicação semiconservativa, visto que metade da molécula de DNA se conserva na molécula nova. 1.2. A síntese de DNA inicia-se nas Origens de Replicação A molécula de DNA é extremamente estável devido ao grande número de pontes de hidrogénio que existem entre as bases das cadeias. Apenas temperaturas próximas à temperatura de água a ferver providenciam energia termal suficiente para a desnaturação da molécula. O processo de replicação inicia-se com proteínas iniciadoras que se ligam ao DNA e separam as duas cadeias, quebrando as pontes de hidrogénio presentes entre as bases azotadas. Individualmente as pontes de hidrogénio são fracas, portanto, separar um pequeno segmento de DNA – alguns pares de bases de cada vez – não requer muita energia. Pelo que, com a ajuda destas proteínas, pode ocorrer a temperaturas normais de uma célula viva. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  15 Estas pequenas zonas onde o DNA é separado o suficiente para iniciar a replicação são denominadas de origens de replicação e elas geralmente estão marcadas por uma sequência particular de nucleótidos. Vimos no capítulo 5 que o par de bases A=T é mais fraco que o C≡G. Assim sendo, é compreensível que as origens de replicação estarão mais ricas em A=T que em C≡G. Estas também são ricas em sequências de nucleótidos capazes de atrair proteínas iniciadoras. O genoma bacteriano, contido tipicamente numa molécula circular de DNA com vários milhões de pares de nucleótidos, tem apenas uma origem de replicação. Por sua vez o genoma humano possui cerca de 10.000 origens, o que torna o processo muito mais rápido. Assim que uma proteína de iniciação se liga ao DNA, na origem de replicação, abre localizadamente a dupla-hélice. Tal ação atrai outro grupo de proteínas que realizam a replicação. Este conjunto de proteínas formam uma “máquina”, onde cada membro do grupo realiza uma função específica. 1.3. A síntese de DNA ocorre nas Forquilhas de Replicação Cada molécula de DNA, durante o processo de replicação, contém junções em forma de Y denominadas de forquilhas de replicação. São nestas forquilhas que a “máquina” da replicação se move. Duas forquilhas de replicação são formadas em cada origem de replicação, uma de cada lado da mesma, e movem-se para lados opostos da origem, abrindo a molécula à medida que se deslocam. As forquilhas movem-se muito rápido (cerca de 1000 nucleótidos/s nas bactérias e 100 nucleóticos/s nos humanos). A replicação de DNA em cromossomas bacterianos e eucarióticos é, portanto, denominada de bidirecional. No coração da máquina de replicação encontra-se uma enzima – DNA polimerase. Esta enzima sintetiza novo DNA usando apenas uma das “velhas” cadeias como molde e ainda catalisa a adição de novos nucleótidos à extremidade 3’ da nova cadeia em crescimento, formando uma ligação de fosfodiéster entre esta extremidade e o 5’-fosfato do próximo nucleótido. Os nucleótidos entram na reação inicialmente como trifosfatos de nucleosídeo (com 3 fosfatos), o que providencia a energia necessária à polimerização. O pirofosfato (PPi) é depois hidrolisado a fosfato (Pi), o que faz com que esta polimerização seja efetivamente irreversível.  Nucleótido: base + açúcar + fosfato  Nucleosídeo: base + açúcar Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  16 1.4. A forquilha de replicação é assimétrica Na forquilha de replicação, uma nova cadeia de DNA é feita num molde que corre na direção 3’5’, enquanto que outra é feita num molde que corre na direção oposta (5’3’). A forquilha de replicação torna-se, deste modo, assimétrica. À primeira vista, ambas as novas cadeias de DNA parecem estar a crescer na mesma direção, o que sugere que uma cadeia estará sendo sintetizada de maneira errada, de 3’ para 5’, algo impossível para a DNA polimerase. Como nenhuma outra enzima é capaz de o fazer desta maneira, o prolema é resolvido pela polimerase pelo uso de uma manobra de “backstitching” (=pesponto). Assim sendo, para que cresça no sentido 5’3’ o DNA tem que ser criado aos bocados – fragmentos de Okazaki. Uma vez que a direção da forquilha, neste caso de 3’ para 5’, tem que ser respeitada, a única solução encontrada foi que a DNA polimerase teria de “andar de costas” e ir produzindo aos poucos pequenos segmentos 5’3’ até ao final da forquilha. Por fim estes pequenos segmentos descontínuos são unidos a fim de formar uma nova cadeia de DNA contínua.  Cadeia lagging: cadeia de DNA sintetizada descontinuamente  Cadeia leading: cadeia de DNA sintetizada continuamente Apesar de diferirem em pequenos detalhes, as forquilhas de replicação de todas as células, sejam elas procarióticas ou eucarióticas, têm cadeias lagging e leading. Esta característica comum surge do facto de todas as DNA polimerases trabalharem na direção 5’3’. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  17 1.5. A DNA polimerase é autocorretiva DNA polimerase é tão precisa que apenas faz um erro em cada 107 pares de nucleótidos que copia. Apesar de A-T e C-G serem de longe os mais estáveis bases de pares, outros, menos estáveis, como por exemplo, G-T e C-A, podem também ser formados. Estes, se não forem detetados e corrigidos, matariam a célula devido ao grande número de mutações. Esta catástrofe é evitada porque a DNA polimerase tem duas qualidades especiais que aumentam significativamente a precisão da replicação do DNA. 1. É capaz de monitorizar os pares de bases entre cada nucleótido de entrada e a cadeia molde 2. Quando erra, adicionando um nucleótido errado, consegue corrigir o erro através de uma atividade denominada de proofreading O fenómeno de proofreading ocorre em simultâneo com a síntese do novo DNA. A polimerase, enquanto polimeriza a cadeia, verifica se o emparelhamento de bases para trás está correto. Portanto, a DNA polimerase possui uma capacidade de polimerização de alta precisão no sentido 5’3’, bem como uma atividade de revisão (de proofreading) no sentido 3’5’, sendo que ambas as atividades ocorrem em diferentes domínios da molécula. Este mecanismo de revisão é realizado por uma nuclease que cliva as ligações fosfodiéster. A polimerase apenas consegue polimerizar a cadeia de DNA no sentido 5’3’, pois uma hipotética polimerase que adicionasse nucleótidos no sentido 3’5’ não seria capaz de realizar proofreading. 1.6. Pequenas cadeias de RNA atuam como Primers para a síntese de DNA Apesar da DNA polimerase conseguir adicionar um nucleótido não quer dizer que consiga começar uma cadeia completamente nova de DNA do zero. Uma nova enzima é precisa, uma que consiga simplesmente começar uma nova cadeia polinucleotídica sem ser necessário ter um par emparelhado antes do novo nucleótido a adicionar. Esta enzima, contudo, não consegue sintetizar DNA! Em vez disso, é capaz de sintetizar RNA, com cerca de 10 nucleótidos. Esta pequena cadeia é emparelhada com a cadeia molde e funciona como uma ajuda para que a polimerase consiga começar a sintetizar DNA. É, portanto, um RNA primer na medida que inicia a nova cadeia de DNA e a enzima que o sintetiza é conhecida como primase. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  18 A primase é um exemplo de RNA polimerase – enzima que sintetiza RNA usando DNA como molde. Uma cadeia de RNA é muito parecida com uma única cadeia de DNA. Apenas diferem uma da outra em um nucleótido (U em vez de T, no RNA), e no açúcar (uma ribose em vez de uma desoxirribose, no RNA). Contudo, como o U emparelha bem com a A, o primer consegue ser sintetizado no DNA por complementaridade de bases.  Cadeia leading: apenas é necessário 1 primer numa origem de replicação  Cadeia lagging: São necessários vários primers uma vez que a cadeia de DNA é descontínua, assim sendo a polimerase começa a polimerizar onde encontra a extremidade 3’ de um primer e continua a alongar a nova cadeia até encontrar um novo primer de RNA. Para juntar os diferentes fragmentos de Okazaki são necessárias 3 enzimas. A primeira remove o RNA primer (uma nuclease), a seguinte substitui-o por DNA, usando como primer a ponta do fragmento de Okazaki anterior (uma DNA polimerase chamada de repair polimerase) e a outra junta os fragmentos todos num só (a DNA ligase). 1.7. As proteínas em conjunto formam uma máquina de replicação A replicação de DNA requer a cooperação de um grande número de proteínas. O primeiro problema a enfrentar tem a ver com o acesso aos nucleótidos, que se encontram no centro da dupla hélix. 1º. A dupla hélix tem que ser separada para que os novos nucleósidos trifosfato consigam formar pares com cada cadeia molde. Para este passo são necessárias 2 grupos de proteínas de replicação: DNA helicases e single-strand DNA-binding proteins. A DNA helicase usa a energia proveniente da hidrólise de ATP para se propulsionar para a frente, separando assim a dupla cadeia de DNA à medida que se move. As single-strand DNA-binding proteins agarram-se à cadeia exposta pela DNA helicase para que esta não se emparelhe consigo mesma (como o RNA de transferência) e para que fique o máximo esticada para que seja um molde eficiente. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  19 A abertura localizada do DNA apresenta um problema. Como duas linhas enroladas, se apenas puxarmos as pontas para as desenrolar, as linhas enovelam-se ainda mais. O mesmo acontece com o DNA. À medida que a helicase abre o DNA ao longo da forquilha, o DNA do outro lado da mesma enovela-se cada vez mais. É compreensível que depois se torne impossível para a forquilha se mover, porque à frente da mesma o DNA fica excessivamente enrolado. Para que tal não aconteça, as células usam proteínas chamadas de DNA topoisomerases que aliviam esta tensão existente para lá da forquilha. Estas enzimas fazem “cortes” no esqueleto do DNA que aliviam temporariamente a tensão. Elas depois reparam o corte antes de caírem do DNA. Existe uma outra proteína na máquina de replicação cuja função é de assegurar que a DNA polimerase não cai da cadeia molde – as sliding clamps. Somente por sua conta, a DNA polimerase apenas consegue sintetizar pequenas sequências de DNA antes de cair da cadeia molde. Estas sliding clamps formam anéis à volta da cadeia do novo DNA formado e, ao segurarem firmemente a polimerase, permitem que a enzima se mova ao longo do molde sem cair sempre que sintetiza novo DNA. Por sua vez, a ligação das sliding clamps ao DNA requer atividade de outra proteína, a clamp loader. As clamp loaders hidrolisam ATP sempre que ligam uma sliding clamp à nova cadeia de DNA. Isto processo apenas precisa de ocorrer uma vez por ciclo na cadeia leading, e várias vezes, sempre que um novo fragmento de Okasaki é feito, na cadeia lagging. Máquina de Replicação (tabela): 1. DNA helicase Abre a dupla hélix de DNA Impedem que a cadeia molde se ligue entre si e 2. Sigle-strand DNA-binding proteins esticam-na ao máximo 3. DNA polimerase Sintetiza a nova cadeia de DNA Ligam-se à nova cadeia de DNA e evitam que a 4. Sliding clamps polimerase caia da cadeia molde Hidrolisam ATP para ligarem as sliding clamps à 5. Clamp loaders nova cadeia de DNA 6. Primase Sintetiza os primers de RNA 7. Nuclease Retira os primers de RNA da cadeia nova de DNA 8. Repair polimerase Preenche os espaços dos primers por novo DNA 9. DNA ligase Liga fragmentos de DNA Alivia a tensão que existe para lá da forquilha de 10. DNA topoisomerase replicação Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  20 1.8. A telomerase replica as extremidades dos cromossomas eucarióticos Neste campo surge-nos um sério problema: apesar da cadeia leading conseguir ser replicada todo o caminho até à ponta do cromossoma, a cadeia lagging não. Quando o último primer da cadeia lagging é retirado não há maneira da polimerase o substituir por DNA. Se assim fosse, a cadeia lagging tornar-se-ia cada vez mais curta a cada replicação do DNA, e, após várias divisões celulares, os cromossomas iriam encolher e eventualmente perder informação genética valiosa. As bactérias resolveram este problema simplesmente por terem moléculas circulares de DNA como cromossomas, logo não existem extremidades. Os eucarióticos resolveram-no incorporando sequências repetitivas de nucleótidos, não importantes, nas extremidades dos cromossomas – os telómeros. Este DNA telomérico atrai uma enzima chamada de telomerase. Usando um molde de RNA, que faz mesmo parte da conformidade desta enzima, a telomerase estende a extremidade da cadeia lagging, adicionando várias cópias da mesma sequência curta de DNA à cadeia molde. Esta extensão permite que a cadeia lagging seja complemente replicada. Os telómeros formam estruturas que marcam o verdadeiro término do cromossoma. Isto permite que a célula distinga as extremidades naturais do cromossoma daquelas que resultam da quebra acidental de DNA 2. Reparação de DNA A diversidade de organismos e o seu sucesso em colonizar quase toda a superfície da Terra depende de mudanças genéticas acumuladas gradualmente ao longo de milhões de anos. Contudo, a curto prazo, e tendo em vista apenas 1 organismo, alterações genéticas podem ser prejudiciais. Para sobreviverem e se reproduzirem, os indivíduos devem ser geneticamente estáveis. Esta estabilidade atinge-se não só a partir de uma replicação de DNA correta, mas também a partir de uma procura e correção de erros. Apesar de algumas mutações aparecerem devido a erros de replicação, a maioria dos erros no DNA é uma consequência não intencional das reações químicas que ocorrem dentro de uma célula. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  21 A maioria dos danos no DNA é apenas temporária visto que são imediatamente corrigidos – reparação de DNA. Por exemplo, humanos com a doença genética xeroderma pigmentose não conseguem emendar os danos feitos pela radiação UV, uma vez que herdaram um gene defeituoso para uma das proteínas envolvidas nesse processo de reparo. Tais indivíduos desenvolvem lesões dermatológicas severas, incluindo cancro da pele, devido à acumulação de erros no DNA das células que são expostas à luz solar e, de consequentes mutações que aparecem nestas células. 2.1. Danos no DNA surgem continuamente nas células Como qualquer outra molécula, o DNA está continuamente passando por colisões térmicas com outras moléculas, o que muitas vezes resulta em grandes mudanças químicas nele mesmo. Durante o tempo que leva ler esta nota, um total de cerca de um trilião (10 12) de bases púricas (A e G) desaparecerão do DNA nas células do nosso corpo a partir de uma reação espontânea denominada de depurinação. A depurinação não quebra o esqueleto de DNA, apenas remove a base púrica de um nucleótido. Outra reação comum é a perda espontânea de uma citosina para produção de um uracilo – deaminação. A radiação UV da luz solar é também prejudicial ao DNA pois promove a ligação covalente entre duas bases pirimidínicas adjacentes, formando, por exemplo, o dímero de timina. É o fracasso em reparar os dímeros de timina que resulta em problemas para os indivíduos que sofrem de xeroderma pigmentose. Se estes erros não forem corrigidos podem originar DNA mutado. A nova molécula de DNA pode surgir com um par de bases diferente ao do DNA paternal (no caso da deaminação, se a cadeia molde for a que tem o U em vez de uma C), ou sem par de bases algum (no caso da depurinação se a cadeia molde for aquela que com uma base púrica em falta). Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  22 Além disto tudo, alguns tipos de danos no DNA (dímeros de timina, por exemplo) conseguem parar a máquina de replicação do DNA no sítio do erro. 2.2. A célula possui uma variedade de mecanismos de reparação de DNA Quase todos os mecanismos de reparo do DNA dependem da estrutura do mesmo. É de ter em conta que se a sequência de uma cadeia é danificada, a informação não é perdida fatalmente visto que se encontra uma versão de backup – uma versão original correta – na cadeia complementar à danificada. A maior parte dos danos criam estruturas que nunca são encontradas numa cadeia de DNA não danificada. Assim, a cadeia saudável é facilmente distinguida da má. O básico caminho para reparação de DNA danificado: (quase igual à retirada dos primers na replicação) 1. O DNA danificado é reconhecido e removido. Isto envolve nucleases que clivam as ligações covalentes que ligam o nucleótido “estragado” ao resto da cadeia, deixando um pequeno espaço na mesma. 2. Uma repair DNA polimerase liga-se à extremidade hidroxilo-3’ da cadeia cortada de DNA para depois preencher o espaço deixado lá pela nuclease. Ela preenche o espaço a partir de complementaridade com as bases da cadeia não danificada. 3. Uma DNA ligase liga os esqueletos dos segmentos de DNA. Os passos 2 e 3 são praticamente os mesmos em quase todos os tipos de DNA danificado. Contudo, o passo 1 usa uma série de diferentes enzimas consoante o dano de DNA ocorrido (seja ele devido reações químicas, radiação, má replicação…) 2.3. A DNA Mismatch repair remove os erros de replicação que escapam ao proofreading A célula possui um sistema de backup que se dedica a corrigir os erros que possam ocorrer na replicação do DNA chamado de Mismatch repair.  Taxa de erro da polimerase: 1 por 107 nucleótidos copiados.  DNA Mismatch repair corrige 99% desses erros, aumentado a precisão geral para 1 em 109 nucleótidos copiados. Sempre que ocorre um erro de cópia, fica para trás um nucleótido mal emparelhado (ao que chamamos de Mismatch). Se não for corrigido, este Mismatch irá resultar numa mutação permanente na próxima ronda de replicação do DNA. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  23 Para ser considerado efetivo, o mecanismo de Mismatch repair tem que reconhecer qual das cadeias de DNA contém o erro, remover um segmento de DNA que contenha o erro e depois ressintetizar o DNA em falta. Ele apenas trabalha com cadeias filhas. O Mismatch repair representa um importante papel na prevenção da célula contra o cancro. A predisposição genética para cancro (especialmente alguns tipos de cancro no cólon) é causada por mutações em genes codificadores de proteínas do Mismatch repair. Os humanos herdam duas cópias de um gene (uma de cada progenitor). Indivíduos que apenas possuem um gene Mismatch repair danificado (uma das cópias) não são afetados até que a cópia saudável deste gene seja aleatoriamente mutada numa célula somática. Esta célula mutada e toda a sua descendência serão deficientes no mecanismo de Mismatch repair. todas as células 1 cópia de um acumulação mutação aleatória célula somática descendentes gene mismatch extraórdinária de na segunda cópia deficiente no mutadas e repair mutada mutações (mais célula cancerigena deste gene (célula mecanismo deficientes no (célula somática rápido que em somática mutada) mismatch repair mecanismo saudável) células normais) mismatch repair Cancros apenas surgem em células não com 1 nem 2 mutações, mas com uma acumulação de várias! Portanto, herdar um Mismatch repair gene danificado predispõe fortemente um indivíduo a um cancro. 2.4. Quebras da dupla-cadeia de DNA requerem uma diferente estratégia para reparação O mecanismo de Mismatch repair baseia-se muito na redundância do DNA. Se os nucleótidos forem danificados podem ser reparados usando a informação presente na cadeia complementar. Mas e se ambas as cadeias estiverem danificadas? Este tipo de dano é especialmente difícil de reparar e é muito perigoso pois pode levar à fragmentação de cromossomas e subsequente perda de genes. Para lidar com este problema as células desenvolveram duas estratégias básicas: A) Juntar de forma rápida as pontas dos fragmentos novamente antes que estes derivem e se percam. Nome do mecanismo: Nonhomologous end joining B) Como a primeira estratégia pode ser arriscada, as células têm uma alternativa que normalmente não traz problemas. Nome desta estratégia: Recombinação homóloga (homologous recombination). Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  24 O mecanismo (A) ocorre em muitos tipos de células e é realizado por um grupo espacializado de proteínas que “limpam” as pontas fragmentadas e rejuntam-nas por ligação do DNA. Este mecanismo rapidamente repara o dano, mas, ao “limparem” o fragmento, estas proteínas podem perder facilmente alguns nucleótidos localmente, e se este mecanismo interrompe a atividade de um gene, a célula poderá sofrer sérias consequências. Pelo que esta estratégia é um tanto arriscada. 2.5. A recombinação homóloga é capaz de reparar quebras de dupla cadeia de DNA sem falhas O problema de reparar uma fratura de dupla cadeia é encontrar um molde intacto que guie a reparação. Se a fratura ocorrer depois de uma cadeia ter sido replicada, a célula é capaz de usar a informação correta da cadeia filha como molde para reparar a cadeia mãe fraturada. Uma vez que estas duas moléculas de DNA são homólogas, este mecanismo é chamado de recombinação homóloga. (A) Este mecanismo acontece pouco tempo depois de uma célula replicar o seu DNA, antes da divisão celular, quando as moléculas filhas de DNA ainda estão próximas das moléculas progenitoras. (B) Para iniciar a replicação, uma nuclease “mastiga” as pontas 5’ das duas cadeias fraturadas. (C) Com a ajuda de enzimas especializadas, uma das pontas 3’ invade o DNA homólogo intacto e percorre a dupla cadeia à procura de uma sequência complementar através do emparelhamento das bases. (D) Quando uma extensa correspondência precisa é encontrada, a cadeia invasora é alongada pela Repair polimerase, usando a cadeia filha complementar como molde. (E) Depois da Repair polimerase passar o ponto onde a fratura ocorreu, o novo fragmento de DNA junta-se à cadeia mãe fraturada, emparalhelhando-se com a ponta 3’ (F) Uma vez que na cadeia fraturada já existe um trecho de DNA que possa servir de molde ao buraco na cadeia oposta, agora é só sintetizar DNA por complementariedade de bases (G) O DNA é por fim ligado num só. 2.6. Uma falha na reparação de danos do DNA pode causar severas consequências numa célula ou num organismo Se a célula não conseguir reparar DNA danificado pode originar uma mutação que pode levar a graves consequências. Uma mudança permanente num único nucleótido pode comprometer um organismo, uma vez que a proteína que codificar poderá funcionar muito mal ou nem funcionar de todo. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  25 Um exemplo disto será a doença anemia falciforme. A hemoglobina falciforme é menos solúvel que a hemoglobina normal e forma precipitados intracelulares fibrosos, que conferem à célula a forma de uma foice. Uma vez que estas células são mais frágeis e rompem-se frequentemente à medida que viajam pela corrente sanguínea, pessoas com esta doença têm menos hemácias que as outras pessoas – são anémicos. Sintomas:  Fraqueza  Tonturas  Dores de cabeça  Falta de ar Ainda mais, as células anormais podem se agregar e bloquear pequenos vasos, causando dor e falência de órgãos. Apenas temos o conhecimento de que a anemia falciforme existe porque os indivíduos com esta mutação sobrevivem. A mutação até fornece um benefício – uma maior resistência à malária. O exemplo da anemia falciforme (uma doença hereditária) ilustra a importância da proteção das células germinativas contra mutações. A mutação numa célula germinativa iria dar a origem a um organismo com todas as células do seu corpo mutadas, incluindo as suas células germinativas responsáveis pela produção de uma próxima geração e assim sucessivamente. Por sua vez, mudanças nucleotídicas nas células somáticas podem originar células variadas, algumas, por acumulações de várias mutações, crescem e se dividem descontroladamente à custa das outras, o que resulta em cancro. 2.7. Um registo da fidelidade de replicação e de reparo de DNA é preservado no genoma Embora a maioria das mutações não seja nem prejudicial nem benéfica a um organismo, aquelas que têm consequências prejudiciais são geralmente eliminadas da população por meio da seleção natural – indivíduos que carregam o DNA alterado podem morrer ou sofrer uma diminuição de fertilidade. Por outro lado, mudanças favoráveis tendem a persistir e a se espalhar. Humanos e chimpanzés, após certa de 5 milhões de anos de evolução divergente, ainda têm sequências de DNA que são, pelo menos, 98% idênticas. Até humanos e baleias, após 10 ou 20 vezes essa quantidade de tempo, têm cromossomas que são extremamente semelhantes na sua sequência de DNA. Isto leva a crer que, o nosso genoma, e aquele dos nossos relativos, contém uma mensagem de um passado distante. Graças à fidelidade da replicação e reparação do DNA. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  26 Capítulo 7 – De DNA a proteínas. Como é que as células leem o genoma o Sumário: 1. De DNA a RNA 2. Do RNA às Proteínas 3. RNA e as origens da vida As proteínas são os principais constituintes das células e determinam não só a sua estrutura, mas também a sua função. Cada tipo de proteína é formado por uma sequência única de aminoácidos que ditam a estrutura e as propriedades químicas da molécula. Quando uma proteína particular é necessária, a sequência nucleotídica do segmento apropriado de DNA – gene – é primeiramente copiada para outro tipo de ácido nucleico – RNA. Seguidamente, o RNA resultante é usado para direcionar a síntese da proteína. Todas as células, desde bactérias a humanos, expressam a sua informação genética neste sentido: DNARNAPROTEÍNA. Um princípio tão fundamental que foi denominado de dogma central da biologia Molecular 1. Do DNA a RNA As células copiam o DNA em RNA a partir de um processo denominado de transcrição e depois usam a informação do RNA para fazer as proteínas, um processo denominado de tradução. Ter em conta que:  Todo o RNA é obtido por transcrição  Muitas cópias de RNA podem ser feitas a partir de um único gene  Muitas proteínas podem ser sintetizadas da mesma molécula de RNA o Esta sucessiva amplificação faz com que a célula consiga rapidamente sintetizar grandes ou poucas quantidades de proteínas sempre que necessário 1.1. Genes são transcritos em RNA Tal como o DNA, o RNA é um polímero linear composto por 4 diferentes subunidades nucleotídicas, unidas entre si por ligações fosfodiéster. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  27 Principais diferenças entre: RNA DNA Contém uma ribose Contém uma desoxirribose Contém 4 bases azotadas: A, G, C, U (uracilo) Contém 4 bases azotadas: A, G, C, T (timina) É mais instável e fácil de degradar porque, para além de ser de fita simples, apresenta um oxigénio no Dupla cadeia e não tem oxigénio no carbono 2’ carbono 2’ o que o torna mais reativo com enzimas degradativas. Como a cadeia de RNA é simples, ou seja, formada apenas por uma fita, esta pode-se dobrar sobre si mesma em várias formas tridimensionais. Isto permite alguns RNA’s tenham papéis estruturais, regulatórios ou catalíticos, enquanto que as funções do DNA se resumem a armazenar informação apenas. Emparelhamento convencional (G-C; A-U) Emparelhamento não convencional (G-A; C-U) 1.2. O RNA transcrito é complementar a uma cadeia de DNA - Transcrição do RNA: A) Uma pequena porção da cadeia de DNA é aberta para que as bases de cada fita fiquem expostas B) Uma destas cadeias age como um molde para a síntese de RNA C) Ribonucleótidos são adicionados pela RNA polimerase um por um, por complementaridade de bases. A cadeia de RNA produzida é então denominada de RNA transcrito (RNA transcript) Principais diferenças entre: Transcrição de RNA Replicação de DNA A cadeia de RNA não permanece ligada ao molde de DNA. Em vez disso, mesmo atrás da região onde os A cadeia fita de DNA permanece ligada por pontes de Ribonucleótidos estão sendo adicionados, a fita hidrogénio ao molde até ao final da replicação desprende-se do molde e a dupla hélix de DNA reforma-se Apenas é copiado um gene necessário à célula = A molécula é toda copiada= DNA’s longos RNA’S curtos Tal como a DNA polimerase, a RNA polimerase catalisa a formação de ligações fosfodiéster que ligam os ribonucleótidos, formando assim o esqueleto açúcar-fosfato da cadeia do RNA. Os ribonucleósidos trifosfato de entrada (ATP, CTP, UTP, GTP) fornecem a energia necessária à reação. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  28 O imediato desprendimento da molécula de RNA da cadeia de DNA significa que muitas cópias de RNA podem ser feitas a partir do mesmo gene num curto espaço de tempo. A síntese do próximo RNA é usualmente começada antes da do primeiro RNA ter sido completa. Principais diferenças entre: RNA polimerase DNA polimerase Usa ribonucleósidos trifosfato Usa desoxirribonucleósidos trifosfato Consegue começar uma cadeia de RNA sem ser necessário um primer (esta transcrição não é tão Necessita de um primer para começar uma cadeia de rigorosa quanto a replicação de DNA pois o RNA não DNA irá ser permanente) Esta enzima também abre a dupla cadeia de DNA para Apenas adiciona os desoxirribonucleósidos trifosfato, além de adicionar os ribonucleósidos trifosfato quem abre a cadeia de DNA é a helicase Taxa de erro: 1 em cada 104 Taxa de erro: 1 em cada 107 1.3. As células produzem vários tipos de RNA As moléculas de RNA que direcionam a síntese de proteínas são denominadas de RNA’s mensageiros (mRNAs). Nos eucariotas, cada mRNA carrega informação transcrita de apenas um gene, que codifica uma única proteína. Nas bactérias, um conjunto de genes adjacentes é transcrito como um único mRNA que, por sua vez, carrega a informação para a produção de diferentes proteínas. Contudo, existem genes que se destinam simplesmente à criação de outros RNA’s como produtos finais. Estes RNA’s terão papéis importantes na célula (reguladores, estruturais, catalíticos), tais como: o A tradução da mensagem genética em proteínas – RNA’s ribossomais (rRNAs) – que formam a estrutura e o núcleo catalítico dos ribossomas o A escolha, transporte e colocação dos corretos aminoácidos nos ribossomas – RNA’s de transferência (tRNAs) o A regulação da expressão genética eucariótica – micro RNA’s (miRNAs) Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  29 Expressão genética processo pelo qual a informação codificada no DNA é traduzida num produto que tem algum efeito numa célula ou organismo. Quando o produto final é uma proteína a expressão genética inclui a transcrição e a tradução. Quando o produto final é uma molécula de RNA, a expressão genética não inclui a etapa de tradução. 1.4. Sinais no DNA dizem à RNA polimerase onde começar e acabar a transcrição Para começar a transcrição, a RNA polimerase tem que: - ser capaz de reconhecer o início de um gene específico - se segurar com firmeza ao DNA neste local – no local de início de transcrição (transcription start site). A maneira como a polimerase distingue este sítio é diferente nos eucariontes das bactérias. i. Nas bactérias: Quando a RNA polimerase colide aleatoriamente com a molécula de DNA prende-se a esta, mas de forma fraca. A enzima seguidamente desliza rapidamente ao longo da molécula até encontrar uma região do gene chamada de promotor e aí trava e prende-se firmemente. o Promotor – região de um gene que se encontra imediatamente antes do ponto de início da transcrição, contém uma sequência específica de nucleótidos. O promotor não é transcrito para o RNA. Uma vez agarrada firmemente ao promotor, a RNA polimerase abre a dupla hélix (imediatamente à frente do promotor) e começa a sua transcrição de RNA. A cadeia é alongada continuamente até a enzima encontrar um local de terminação no DNA, formado por uma sequência específica de nucleótidos. O local de terminação é transcrito para o RNA, dando origem à terminação 3’ da molécula. Nas bactérias existe uma subunidade na RNA polimerase conhecida como o fator sigma (σ). Este fator é responsável por reconhecer o promotor. Caso não reconhecesse, a polimerase não se ligaria com força à região e consequentemente não transcreveria o gene. Após reconhecer o promotor dissocia-se da enzima, deixando que esta transcreva sozinha (quando a molécula de RNA é libertada, a polimerase dissocia-se e o fator sigma liga-se de novo a ela). Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  30 Mas como é que este fator consegue “ver” o promotor, dado que os pares de base estão situados dentro da dupla cadeia de DNA? R: uma vez que cada base apresenta características únicas exteriores, este fator não necessita de abrir o DNA a não ser na região de iniciação. Como é que RNA polimerase sabe qual das duas cadeias de DNA usar como molde? Visto que cada cadeia tem uma sequência nucleotídica diferente, o que irá produzir um diferente RNA transcrito… A resolução a este problema assenta na estrutura do promotor. Todo o promotor tem uma polaridade: contém duas sequencias nucleotídicas diferentes a montante do local de iniciação da transcrição que posicionam a polimerase e asseguram que apenas transcreve numa única direção. Além disso, uma vez que a polimerase apenas consegue sintetizar RNA na direção 5’3’ tem que usar como molde a cadeia de DNA que corre no sentido 3’5’. ii. Nos eucariotas: A iniciação da transcrição nos eucariotas difere significativamente da dos procariontes:  1ª diferença: enquanto as bactérias apenas têm um tipo de RNA polimerase, nos eucariotas existem três tipos – RNA polimerase I, RNA polimerase II e a RNA polimerase III. o RNA polimerase I e III – transcrevem genes que codificam RNA de transferência, RNA ribossomal e outros RNA’s o RNA polimerase II – transcreve a grande maioria dos genes eucarióticos, incluindo os que codificam RNA mensageiro e micro RNA (miRNAs)  2ª diferença: enquanto que nos procariotas a polimerase é capaz de reconhecer o promotor e iniciar a síntese sozinha, a polimerase dos eucariotas necessita da ajuda de proteínas acessórias: fatores de transcrição gerais, que se aglomeram no promotor  3ª diferença: os mecanismos que controlam o início da transcrição são muito mais elaborados (cap. 8). Isto tem a ver com a quantidade de DNA não transcrito que existe entre os genes, porque os genes estão muito próximos uns dos outros nos procariontes, mas estão muito afastados uns dos outros nos eucariontes e por isso existem sequências reguladoras espalhadas pelo DNA.  4ª diferença: A transcrição nos eucariotas tem que tomar em conta o empacotamento do DNA em nucleossomas e outras formas compactas de cromatina. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  31 1.5. A RNA polimerase eucariótica requer fatores de transcrição gerais A descoberta inicial de que, ao contrário da RNA polimerase bacteriana, a RNA polimerase II eucariótica purificada não poderia iniciar a transcrição sozinha num tubo de ensaio levou à descoberta e purificação dos fatores gerais de transcrição. Os fatores de transcrição gerias têm um papel similar ao fator sigma da RNA polimerase bacteriana. Esta imagem mostra como os fatores de transcrição aglomeram-se num promotor usado pela RNA polimerase II. Este processo de aglomeração normalmente inicia-se com a ligação do fator de transcrição TFIID a um pequeno trecho de DNA composto essencialmente por T e A, daí o nome de TATA box. (A) Muitos promotores eucarióticos contêm uma sequência de DNA denominada de TATA box (B) A TATA box é reconhecida por uma subunidade do fator de transcrição TFIID, denominada de TATA-binding protein (TBP). (A distorção do DNA neste passo não está mostrada por simplicidade*.) (C) A ligação do TFIID permite a ligação adjacente do fator TFIIB. (D) O resto dos fatores gerais de transcrição como também a RNA polimerase ligam-se ao promotor, formando assim um completo complexo de iniciação da transcrição. (E) O TFIIH separa a dupla cadeia no local de iniciação a partir da energia da hidrólise do ATP (não mostrado na figura por simplicidade). O TFIIH contém uma cinase como uma das suas subunidades que serve para fosforilar a polimerase a fim de libertá-la dos fatores transcrição, para que possa começar a transcrição. A fosforilação da molécula toma lugar na sua cauda. *Passo (B): O fator TFIID causa uma distorção local dramática na dupla hélice do DNA quando se liga ao promotor, o que ajuda a servir um marco para a montagem subsequente dos outros fatores. Quando a RNA polimerase II termina o seu trabalho dissocia-se do DNA, os fosfatos da sua cauda são retirados por fosfatases e a polimerase fica pronta para encontrar um novo promotor e repetir a sua função. Apenas a versão desfosforilada da polimerase II consegue iniciar a síntese de RNA. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  32 1.6. Os mRNAs eucarióticos são produzidos no núcleo Nos procariontes, o DNA bacteriano encontra-se diretamente exposto ao citosol, que contém os ribossomas, nos quais ocorre a síntese de proteínas. Consequentemente, quando uma molécula de mRNA começa a ser sintetizada numa bactéria, os ribossomas ligam-se imediatamente à extremidade 5’ livre do RNA transcrito e começam a traduzi-la, enquanto a cadeia ainda está a ser polimerizada do outro lado. Nos eucariotas, o DNA está preso dentro do núcleo. Por isso, a transcrição ocorre dentro do núcleo, mas a tradução ocorre no citosol, onde se encontram os ribossomas. Portanto, antes que mRNA eucariótico possa ser traduzido, ele tem que atravessar os poros pequenos do invólucro nuclear. Para isso, o RNA eucariótico tem de ser processado. Destes passos de processamento fazem parte o capping, o splicing e a polyadenylation. Estes passos tomam lugar enquanto o RNA está a ser sintetizado. As enzimas responsáveis pelo processamento do RNA residem na cauda da polimerase II. Existem duas etapas de processamento que apenas acontecem naqueles RNA’s transcritos que se destinam a ser mRNAs (chamados de pré-mRNAs) 1. RNA Capping (= boné): ocorre uma modificação na extremidade 5’ do pré-mRNA (na ponta que é sintetizada primeiro). O “boné” adicionado consiste numa guanina ligada a um grupo metil. 2. Polyadenylation (= poliadenilação): consiste na adição de uma cauda com muitas adeninas (cauda poli-A) ao pré-mRNA. Quando este acaba de ser transcrito, a extremidade 3’ (a última a ser sintetizada) é cortada por uma enzima numa sequência nucleotídica particular e são-lhe adicionadas muitas adeninas por outra enzima. Esta adição de uma cauda poli-A ocorre durante ou depois do splicing. Estas duas modificações – Capping e Poliadenilação – aumentam a estabilidade do mRNA eucariótico facilitando a exportação da molécula para o citosol, e marcam o RNA transcrito como um Mrna, indicando ao ribossoma se a molécula de RNA está completa (com toda a informação) Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  33 1.7. Os genes codificadores de proteínas eucarióticos são interrompidos por sequências não codificadoras chamadas de intrões Nos procariontes, a maioria das proteínas é codificada por um trecho contínuo de DNA que é transmitido num mRNA que pode ser traduzido numa proteína sem sofrer qualquer processamento. Nos eucariontes, a maioria dos genes codificadores de proteínas têm a sua sequência codificadora interrompida por sequências não codificadoras longas, denominadas de intrões. Por isso, a maioria dos RNA’s eucarióticos têm de sofrer mais uma etapa de processamento até se tornarem funcionais: remoção dos exões.  Intrões: Sequências não codificantes de DNA (In de interior, ficam sempre no interior do núcleo)  Exões/sequências expressas: Sequências codificantes de DNA – geralmente mais curtas que os intrões. (Ex de exterior, saem do núcleo para o exterior/citosol) 1.8. Os intrões são removidos dos prés-MRNAs através do RNA splicing o pré-mRNA Enquanto a o pré-mRNA Os intrões e os Saída da sofre molécula sofre exões são molécula de molécula para O pré-mRNA poliadenilação continua a ser poliadenilação ambos mRNA o citosol onde sofre capping (recebe uma transcrita o (recebe uma transcritos em funcional será traduzida cauda com mts pré-mRNA cauda com mts pré- mRNA numa proteína adeninas) sofre spliccing adeninas)  RNA splicing: processo pelo qual os intrões do pré-mRNA são removidos e os exões são ligados uns aos outros, dando origem ao RNA maduro. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  34  Mas como é que as células distinguem os intrões dos exões? Embora exista pouca semelhança entre os diferentes intrões, todos eles têm uma sequência quase idêntica nas suas terminações que atua como um sinal, indicando que aquele segmento é para ser retirado da molécula de RNA transcrito. Assim sendo, guiado por estas sequências, o spliceossoma (máquina que realiza o splicing) corta os intrões da molécula na forma de uma estrutura de “corda de cowboy”, formada pela reação de um nucleótido de Adenina. Etapas do splicing: 1. A adenina que constitui o ponto de ramificação, interage com a extremidade 5’ da sequência de intrões, quebrando a ligação neste local 2. A extremidade cortada 5’ do intrão liga-se covalentemente ao grupo 2’-OH da ribose de adenina, formando uma estrutura ramificada 3. A extremidade livre 3’-OH do exão vai-se ligar ao início do próximo exão na extremidade 5’. Assim forma-se uma molécula de mRNA sem intrões. 4. A sequência de intrões forma uma estrutura em forma de “lariat/corda de cowboy” que vai ser depois degradada O splicing de RNA é realizado em grande parte por outras moléculas de RNA – small nuclear RNAs (snRNAs) – em vez de proteínas. Os small nuclear RNAs são associados a outras proteínas formando small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs pronuncia-se “snurps”). Os snRNPs fazem parte do centro do spliceossoma e reconhecem as sequências que indicam onde cortar o pré-mRNA através de emparelhamento das bases do RNA transcrito e do seu próprio RNA, removendo-as e lingando covalentemente os exões. Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  35  Benefícios importantes deste arranjo intrão-exão: 1. Os genes transcritos podem sofrer vários tipos de splicing e assim produzir diferentes tipos de proteínas – splicing alternativo – o que permite que diferentes proteínas possam ser produzidas a partir do mesmo gene, o que aumenta o já enorme potencial de codificação dos seus genomas. 2. Está na origem da variação genética pois a existência de intrões facilita a recombinação génica entre os exões de diferentes genes 1.9. Apenas os mRNAs maduros (= corretamente processados) são exportados do núcleo O transporte de mRNA do núcleo para o citosol é altamente seletivo: apenas os mRNAs corretamente processados são exportados, os restantes são degradados. Este transporte seletivo é mediado pelos complexos dos poros nucleares, que ligam o nucleoplasma ao citosol e agem como portões que controlam quais macromoléculas podem, ou não, sair, ou entrar, no núcleo. Mas como é que a célula distingue quais as moléculas corretamente processadas das outras? Para estar pronta a ser exportada, uma molécula de mRNA tem que estar ligada a um conjunto específico de proteínas, que reconhecem as diferentes partes de um mRNA maduro sinalizando que aquela molécula foi corretamente processada. Este conjunto de proteínas inclui:  Proteínas de ligação à poli-A (poly-A-binding proteins)  Complexos de ligação Cap (Cap binding complexes)  Proteínas que se ligam aos mRNAs que sofrerem um splicing correto Mónica Rodrigues SEBENTA BMC | 2018/2019  36 1.10. As moléculas de mRNA são eventualmente degradadas no citosol Uma vez que uma única molécula de mRNA pode ser traduzida em várias proteínas, a quantidade de tempo que esse RNA ficar na célula irá afetar a quantidade de proteínas que serão produzidas. Por essa razão, cada mRNA é eventualmente degradado em nucleótidos por ribonucleases (RNAses). O tempo de vida dos mRNAs difere de uns para os outros, dependendo da sua sequência nucleotídica e da importância da proteína que ele traduz para a célula. Normalmente, o tempo de vida destas moléculas nos procariontes (3min) dura muito menos que nos eucariontes (até 10h). Esta diferença de tempos de vida é controlada por uma sequência do próprio mRNA, situada numa porção denominada de região 3’ não traduzida (3’ untranslated region), que fica entre a extremidade final 3’ da molécula e a cauda poli-A. Quando a célula precisa de grandes quantidades de uma certa proteína ela faz mRNAs com um tempo de vida longo, os de tempo de vida curto são usados para sintetizar proteínas em pequenas quantidades e proteínas cujas quantidades se al